JP2011521637A - 対象のレポーター融合タンパク質の遺伝子及び光学撮像を使用した監視及び治療送出 - Google Patents
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Abstract
Description
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法が提供される。
a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、細胞内の対象の遺伝子の発現を体内で非侵襲性で監視する方法を記述する。
a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法を記述する。
本発明の他の実施例は、
a)メチル化プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する前述の方法のために使用できる単離された核酸分子に関する。
a)メチル化プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、CADM1(SEQ ID No.2)、Rb(SEQ ID No.1)、ZMYND10(SEQ ID No.3)、RASSF5(SEQ ID No.4)、PTEN(SEQ ID No.5)、SERPINB5(SEQ ID No.6)、EPB41L3(SEQ ID No.7)、及びDAPK1(SEQ ID No.8)を有するポリペプチドのグループから選択されたポリペプチドをコード化する配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した、蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記b)及び前記c)から成るコード配列が、5’末端で単一の開始コドンと、3’末端で単一の停止コドンとを有する前述の方法のために使用できる単離された核酸分子に関する。
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の前記遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたRNAiと接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記RNAiにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する生体内の細胞内の対象の遺伝子の発現の減少を非侵襲性で監視する方法を記述する。
a)プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する斯様な方法に使用できる核酸分子に関する。
a)プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、VEGF(SEQ ID No.10)、RAS(SEQ ID No.11)、Wnt(SEQ ID No.12)、MYC(SEQ ID No.13)、ERK(SEQ ID No.14)及びTRK(SEQ ID No.15)を有するポリペプチドのグループから選択された機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記b)及び前記c)から成るコード配列が、5’末端で単一の開始コドンと、3’末端で単一の停止コドンとを有する、前述の方法のために使用できる単離された核酸分子に関する。
a)プロモーター配列と、
b)機能的でないポリペプチドを得るために、少なくとも一つの挿入、少なくとも一つの核酸交換、若しくはこれらの組み合わせを含むHer−2neu(SEQ ID No.9)の機能的でないポリペプチドをコード化する、動作的に前記プロモーター配列とリンクされた配列であって、停止コドンを有さない当該配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記b)及び前記c)から成るコード配列が、5’末端で単一の開始コドンと、3’末端で単一の停止コドンとを有する、核酸分子に関する。
a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたRNAiと接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記RNAiにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する、対象の遺伝子の発現の減少が人体外又は動物の体外の細胞内で非浸襲性で監視される方法が開示される。
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する方法に関する。
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法を記述する。
a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、細胞内の対象の遺伝子の発現を非浸襲性で監視する方法を有する。
a)メチル化プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
c)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子を述べる。
a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、細胞内の対象の遺伝子の生体内での発現を非浸襲性で監視する方法に関する。
a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をHDAC抑制剤と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記HDAC抑制剤により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を人体外又は動物の体外にある細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をHDAC抑制剤と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記HDAC抑制剤により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
a)プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有し、前記b)及び前記c)から成るコード領域が、少なくとも一つの5’末端で開始コドンと、3’末端で単一の停止コドンとを有する、本発明の生体内での方法の核酸分子を述べる。
1 30−50%のグアニン−シトシン内容物
2 センス鎖の15乃至19の位置に少なくとも3個のアデニン又はウラシル
3 分子間のヘアピン構造の欠如
4 センス鎖の位置19でのアデニン
5 センス鎖の位置3でのアデニン
6 センス鎖の位置10でのウラシル
7 センス鎖の位置19でグアニン又はシトシンがない
8 センス鎖の位置13でグアニンがない
(i)基準1、3、4、5及び6に対して1ポイント
(ii)少なくとも3つの対応ベース、位置15乃至19の位置の各アデニン又はウリジンに対して1ポイント(基準2)
(iii)基準7−8の達成がない場合は各1ポイント。
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に対して調整されたRNAiと接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいてRNAiにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたRNAiと接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいてRNAiにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
1.細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法であって、
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。
a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、前記1に記載の方法。
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の前記遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたRNAiと接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記RNAiにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたRNAiと接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記RNAiにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、前記1に記載の方法。
DNA構成物が準備される。前記構成物は、胸部癌組織内で活性していると知られているヒト・プロモーターを有する。動作的にリンクされた前記プロモーターは、コード領域である。このコード領域は、蛍光タンパク質(例えば、GFP)の遺伝子に融合されたHer−2neu遺伝子から成る。Her−2neu配列は、Her−2neuの機能的でないポリペプチドが、例えばフレームシフト変異により発現されるように変形される。3’末端では、蛍光タンパク質遺伝子の配列は、結果のタンパク質が一つの融合タンパク質として転写され、結果の蛍光ポリペプチドが機能的であるようにHer−2neu配列に融合される。これは、現在の例において、Her−2neu配列に誘発されるフレームシフト変異が、機能的蛍光タンパク質、例えばGFPをコード化するために、蛍光タンパク質に対する配列コード化の始まりで誘導される他のフレームシフト変異により補償されることを意味する。
上述のような構成物は、例えば、当該構成物を坦持するリポソームのバッグ、好ましくはターゲットの手段のために胸部癌細胞の抗原に向けられる抗体を注入することにより、胸部癌組織へ遺伝子移入される。このターゲットステップは、癌にかかった組織だけが検出されるので、次の視覚化ステップに対して有益であることに留意されるべきである。しかしながら、これは、上述のプロモーターが胸部癌細胞内でのみ機能的であり、よって、コード領域(従って、蛍光タンパク質)がこれらの細胞内だけで発現される場合にも達成される。何れの場合でも、融合遺伝子は、機能的蛍光タンパク質ドメイン、例えばGFPだけでなくHer−2neuの機能的でないドメインを有する癌にかかった細胞内で発現される。
蛍光タンパク質ドメインは、視覚化され、よって、胸部癌組織は光る。これは、対応する波長で放射された光の検出によりフォローされる特定の波長で蛍光タンパク質を励起する光学撮像装置を使用することによりなされる。紫外線光が、緑色として放射される光の検出によりフォローされるGFPを励起するために使用される。好ましくは、赤外線により励起される化合物及び/又は近赤外の蛍光タンパク質のような化合物を使用してもよい(例えば、シェラボ デーらによる「Nature Methods 4、 741−746(2007)」に開示されている)。
Her−2neuに対して調整された2重鎖のRNAiが、胸部癌組織へ遺伝子移入される。これは、RNAi構成物を坦持するリポソームのバッグ、好ましくはターゲットの手段のために胸部癌細胞の抗原に向けられる抗体を注入することにより、再びなされる。
内在性Her−2neu遺伝子の発現と同様にステップ2で紹介された融合遺伝子の発現がブロックされる。これは、対応するmRNAからの翻訳を選択的にブロックするRNAiにより達成される。Her−2neu遺伝子を蛍光タンパク質に対する配列コード化へ融合するため、蛍光タンパク質の発現もブロックされる。よって、RNAiの遺伝子移入の際に胸部癌組織内に、蛍光タンパク質が全く存在しないか、又はほんの少量の蛍光タンパク質が存在する。
再び、蛍光タンパク質ドメインが、対応する組織内で視覚化される。上述のように、紫外線光が、緑色として放射される光の検出によりフォローされるGFPを励起するために使用される。好ましくは、赤外線により励起される化合物を使用してもよい。導入されたRNAiにより融合遺伝子から転写されるmRNAの全体の翻訳ブロックの場合、蛍光タンパク質は検出できない。よって、胸部癌組織はもはや視覚化できない。疾患の場合、信号がステップ3で検出された光と比較して弱い。全体的には、このことは、内在性Her−2neuもブロックされ、よって、腫瘍の退行が達成されたことを強く示唆する。
Claims (15)
- 細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法であって、
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。 - 細胞内の対象の遺伝子の発現を体内で非侵襲性で監視する請求項1に記載の方法であって、
a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。 - a)
aa)メチル化プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、請求項1に記載の方法。 - 細胞内の対象の遺伝子の生体内での発現を非侵襲性で監視する請求項1に記載の方法であって、
a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の前記遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたRNAiと接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記RNAiにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。 - a)
aa)プロモーター配列と、
bb)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
cc)動作的に前記bb)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
b)非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
c)前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたRNAiと接触させるステップと、
d)前記ステップc)の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
e)前記ステップb)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップd)で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
f)前記ステップe)での比較に基づいて前記RNAiにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する、請求項1に記載の方法。 - 前記核酸分子及び/又は前記RNAiが、正しいターゲッティング、識別及び位置決定又はこれらの混合のため、ソノポレーション、局在注入、又は抗体を宿主細胞抗原へ搬送するリポソームバッグの助けを借りて遺伝子移入により前記細胞へ導入される、請求項1乃至5の何れか一項に記載の方法。
- a)メチル化プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、CADM1(SEQ ID No.2)、Rb(SEQ ID No.1)、ZMYND10(SEQ ID No.3)、RASSF5(SEQ ID No.4)、PTEN(SEQ ID No.5)、SERPINB5(SEQ ID No.6)、EPB41L3(SEQ ID No.7)、及びDAPK1(SEQ ID No.8)を有するポリペプチドのグループから選択されたポリペプチドをコード化する配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した、蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記b)及び前記c)から成るコード配列が、5’末端で単一の開始コドンと、3’末端で単一の停止コドンとを有する、核酸分子。 - a)プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、VEGF(SEQ ID No.10)、RAS(SEQ ID No.11)、Wnt(SEQ ID No.12)、MYC(SEQ ID No.13)、ERK(SEQ ID No.14)及びTRK(SEQ ID No.15)を有するポリペプチドのグループから選択された機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記b)及び前記c)から成るコード配列が、5’末端で単一の開始コドンと、3’末端で単一の停止コドンとを有する、核酸分子。 - VEGF(SEQ ID No.10)、RAS(SEQ ID No.11)、Wnt(SEQ ID No.12)、MYC(SEQ ID No.13)、ERK(SEQ ID No.14)及びTRK(SEQ ID No.15)を有するポリペプチドのグループから選択された機能的でないポリペプチドをコード化する配列は、機能的でないポリペプチドを得るために、全配列の一部、又は少なくとも一つの挿入、少なくとも一つの削除、少なくとも一つのヌクレチオド交換、若しくはこれらの組み合わせを含む全配列の何れかを有し、前記配列が停止コドンを有さない、請求項8に記載の核酸分子。
- a)プロモーター配列と、
b)動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、機能的でないポリペプチドを得るために、少なくとも一つの挿入、少なくとも一つの核酸交換、若しくはこれらの組み合わせを含むHer−2neu(SEQ ID No.9)の機能的でないポリペプチドをコード化する配列であって、停止コドンを有さない当該配列と、
c)動作的に前記b)の配列と融合した、蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記b)及び前記c)から成るコード配列が、5’末端で単一の開始コドンと、3’末端で単一の停止コドンとを有する、核酸分子。 - 細胞を対象の遺伝子の発現に影響する化合物と接触させる時間にわたって前記細胞内の対象の前記遺伝子の発現を監視し、よって前記化合物の効果を監視するための請求項7乃至10の何れか一項に記載の核酸分子又は請求項1乃至6の何れか一項に記載の方法の使用。
- 細胞内の対象の遺伝子の発現に影響する化合物を送出し、同時に、前記化合物により誘発される対象の前記遺伝子の発現での影響を監視するだけでなく前記化合物の送出を監視するための請求項7乃至10の何れか一項に記載の核酸分子又は請求項1乃至6の何れか一項に記載の方法の使用。
- 対象の遺伝子の発現での他の変化を得るために、対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物の量を調整するための請求項7乃至10の何れか一項に記載の核酸分子又は請求項1乃至6の何れか一項に記載の方法の使用。
- 別々に又は組み合わせて、最も有力なデメチル化薬を識別するために、種々異なるデメチル化薬をテストするための請求項7に記載の核酸分子又は請求項2及び3に記載の方法の使用。
- 別々に又は組み合わせて、最も有力なRNAiを識別するために、対象の一つの遺伝子に対して調整される種々異なるRNAiをテストするための請求項8乃至10の何れか一項に記載の核酸分子又は請求項4及び5に記載の方法の使用。
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