JP2011520808A - 正常細胞の保護 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、2002年11月26日に提出した米国仮特許出願第60/429,269号の優先権を主張している2003年11月26日に提出した米国特許出願第10/723,809号(現在は米国特許第7,129,374号)の分割出願である2006年8月29日に提出した米国特許出願第11/512,616号(現在は許可された)の一部継続出願である2008年5月5日に提出した米国特許出願第12/115,331号にの優先権を主張する。これらの全体がここで言及することによって組み込まれている。
本発明に従ってここで用いられているように、明示的に別段の定めがない限り、以下の用語は、以下の意味で定義される。
従来の化学現象、細胞生物学及び分子生物学技術に関する方法は、本明細書に記載されている。そのような技術は、当業界において一般に知られており、「Total Synthesis. Targets, Strategies, Methods, K.C. Nicolaou and E.J. Sorensen, VCH, New York, 1996」、及び、「The Logic of Chemical Synthesis, E.J. Coney and Xue-Min Cheng, Wiley & Sons, NY, 1989」などの古典的文献などの方法論において詳細に記載されている。分子生物学的方法及び細胞生物学的方法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol.1-3, ed.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001」及び「Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992(定期的アップデートを含む)」などの論文に記載されている。
本発明は、少なくとも1個(例えば1個、2個又は3個以上)のメチルスルホキシド基又はメチルスルフィド基を含む小分子であって、細胞内に入ることができ、触媒抗酸化機構によって酸化ダメージを防ぐことができる小分子を提供する。この化合物のメチルスルフィド基は、ROSと反応してメチルスルホキシドを生じる。次いで、メチルスルホキシド含有化合物は、Msr酵素及び/又はその他の酵素の基質として作用し、これらの酵素は、この化合物を還元することによって抗酸化特性を再生する。これらの化合物を細胞又は動物に投与することによってROSによって生じる細胞ダメージを軽減することができる。
一態様においては、本発明は、メチオニン部位又はメチオニン類似化合物を有する触媒抗酸化化合物を提供する。そのような化合物は、メチオニン(例えばMsrA及びMsrB)のメチルスルホキシド官能基を認識するMsr酵素、及び/又は、スルホキシド部位をスルフィドに還元することができるその他の酵素のための基質になり得る。その化合物のメチオニン含有実施形態においてみられるメチオニン部位又は類似化合物は、下記一般的構造:
を有する。
炎症及び酸化ダメージは、多数の病状及び退行性病状において共通に存在していることがわかっている。従って、本発明のメチオニン含有化合物の特に好ましい実施形態は、COX阻害剤などの抗炎症剤の誘導体である。いくつかのCOX阻害剤をベースとする骨格を用いたそのような化合物の非限定な例及びその合成方法を、下記の例において提供する。例示的化合物は:スリンダク、スリンダクのR−エピマー及びS−エピマーの両方;アセチルサリチル酸(オルトアセトキシ安息香酸)、メフェナム酸(2−[(2,3−ジメチルフェニル)アミノ]安息香酸);イブプロフェン(α−メチル−4−(2−メチルプロピル)−ベンゼン酢酸;インドメタシン(1−(p−クロロベンゾイル)−5−メトキシ−2−メチル−インドール−3−酢酸);並びに、ロフェコキシブ(4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−3−フェニル−2(5H)−フランオン、例えばMerck社が販売するバイオックス(登録商標))、及び、セレコキシブ(4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]−ベンゼンスルホンアミド、例えばPfizer社が販売するセレブレックス(登録商標))といった骨格に由来するものを含む。
好ましい実施形態において、インビボ及びインビトロの両方の対象において正常細胞をダメージから保護する方法は、スリンダク、スリンダクのR−エピマー、スリンダクのS−エピマー、これらの誘導体、これらの変異体、これらの構造的類似化合物、及び、これらの混合物を有効量で含む組成物を動物に投与するステップ具える。
溶液として製剤される本発明の医薬品/化粧品組成物は、典型的には、薬学的に又は美容的に許容可能な有機溶媒を含む。「薬学的に許容可能な有機溶媒」及び「美容的に許容可能な有機溶媒」という用語は、スリンダク、スリンダクのR−エピマー、スリンダクのS−エピマー、これらの誘導体、これらの変異体、これらの構造的類似化合物及びこれらの混合物を含む組成物をその有機溶媒中に分散又は溶解させることができることに加えて、許容可能な安全性(例えば刺激及び感作特性)及び美的特性(例えば、ベタベタしていないか又は粘着性でない)を有する有機溶媒を意味する。そのような溶媒の最も典型な例は、イソプロパノールである。その他の適切な有機溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール(200−600)、ポリプロピレングリコール(425−2025)、グリセロール、1,2,4−ブタントリオール、ソルビトールエステル、1,2,6−ヘキサントリオール、エタノール、ブタンジオール、水及びこれらの混合物が含まれる。これらの溶液は、約0.001%から約100%、好ましくは約0.001%から約80%のスリンダク、スリンダクのR−エピマー、スリンダクのS−エピマー、これらの誘導体、これらの変異体、これらの構造的類似化合物及びこれらの混合物を含む組成物と、約0.001%から約50%、約1%から約99%の許容可能な有機溶媒と、を含む。
少なくとも1個のメチルスルホキシド及び/若しくはスルフィドメチル含有部位、又は、少なくとも1個のメチオニン及び/若しくはメチオニンスルホキシド部位を含む化学構造を有する所定のあらゆる分子が触媒抗酸化剤として作用する能力は、経験的に決定可能である。例えば、試験されるメチルスルホキシド基を含む分子(すなわち試験分子)を、その試験分子がMsrA、MsrB又はMsrファミリーの他のメンバーの基質として機能し得るか否かを示す酵素分析に供することができる(例えば、実施例1に記載されている下記NADPH分析、及び、実施例2に記載されている抽出分析を参照されたい。)。インビトロの細胞(例えば、MPP+による損傷を受けたPC−12細胞)において、又は、例えばショウジョウバエ若しくは酸化ダメージの哺乳類モデルといった動物対象において、酸化ストレスに対する抵抗性を増大させるその分子の能力を示す分析に試験分子供することもできる。例えば、下記実施例7、実施例8及び実施例9に記載されている分析を参照されたい。
本発明の触媒抗酸化化合物は、細胞(例えば動物中の細胞)の酸化ダメージを軽減、予防、又は、逆行させるために使用可能である。この方法においては、天然に存在しない触媒抗酸化化合物を細胞に接触させる。細胞内に入った後に、この化合物は、還元された(スルフィド)形態であれば、ROSによってスルホキシドに酸化される(すなわち、ROS捕捉剤として作用する)。その後のMsr酵素によって触媒された還元は、元のスルフィドを再生する。その試験分子がメチルスルホキシド部位を含んでいれば、細胞内のMsr系によってスルフィドに還元され、次いで、抗酸化剤として作用する。図1に示すように、試験分子のようなスルフィド又はスルホキシドが存在すれば、酸化/還元サイクルは、化合物がROSを触媒的に破壊することができる。
細胞に対する酸化ダメージは普遍的な現象であるので、本発明はあらゆる動物対象に適合すると考えられる。そのような動物の具体例の網羅的ではないリストには、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、並びに、サル、類人猿及びヒトなどの霊長類といった哺乳動物が含まれる。酸化ダメージに関係した疾病又は病状を有する動物対象は、これらの動物がその疾病の症状を軽減又は回復する可能性があるので、本発明における使用に好ましい。特に、炎症、気腫などの慢性閉塞性肺疾患、心臓発作又は脳卒中の後の再潅流ダメージ、神経変性疾患(例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病及びALS)、慢性関節リウマチ、狼瘡及びクローン病などの自己免疫性疾患、早産に関係した病状、紫外線暴露によって引き起こされる病状、並びに、加齢関連病状(一例としては、加齢黄斑変性及び白内障形成を含む目の加齢関連性退行的病状)に罹患したヒト患者は、本発明における使用のための適切な動物対象である。ここに記載されている試験において、ROSダメージからの本発明の化合物による保護の有益な効果の実証に用いた動物は、ミバエ及びマウスである。それにもかかわらず、本明細書において教示されている方法を、医学又は獣医学において知られているその他の方法に適応させることによって(例えば、投与する物質の用量を対象動物の体重に従って調節することによって)、本発明の化合物及び組成物を、その他の動物における使用のために容易に最適化することができる。
本発明の化合物は、医薬品組成物として製剤されてもよい。次いで、そのような組成物を、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸から、又は、局所的に、従来の薬学的に許容可能な非毒性の担体、添加物及び媒体を望ましく含む投与単位製剤として投与することができる。局所的投与は、ゲル及びローションの使用、並びに、経皮パッチ又はイオントホレシス装置などの経皮的投与を含んでいてもよい。ここで用いられている非経口投与という用語は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、吸入又は注入技術を包含する。
本発明の触媒抗酸化組成物を、ヒトを含む動物にあらゆる適切な製剤として投与してもよい。この組成物を、例えば、生理食塩水又は緩衝食塩水などの薬学的に許容可能な担体又は希釈剤中に製剤してもよい。投与の態様及び経路並びに標準的薬学的手順に基づいて、適切な担体及び希釈剤を選択することができる。その他の典型的な薬学的に許容可能な担体及び希釈剤並びに医薬品製剤の説明は、この分野の標準的なテキストであるRemington's Pharmaceutical Sciences及びUSP/NFにおいて見つけることができる。組成物を安定化させ及び/若しくは保持するために、又は、Msr系の活性を強めるために、その他の物質を組成物に加えてもよい。そのような活性を強める物質の1つは、Msrファミリーのメンバーによって触媒される反応に還元力を供給する分子であるNADPHの一部であるニコチン酸アミドであってもよい。
有効用量は、治療を行う動物又は細胞に所望の結果(例えば、動物又は細胞中の細胞に対する酸化ダメージの現象)をもたらすことができる量である。医学及び獣医学の分野において知られているように、任意の動物一頭のための用量は、特定の動物の大きさ、体表面積、年齢、投与する特定の組成物、投与の時間及び経路、健康状態、及び、同時に投与するその他の薬剤を含む多くの要因に応じて変わる。本発明の組成物の非経口又は経口投与のための適正な用量は、ヒトの体重1kg当たり約1μg乃至100mgの範囲内であると予想され、本発明の組成物は、ヒトの体重1kg当たり約0.1mg乃至10mgの範囲内であろう。培養中の細胞に使用するための有効用量は、変わるであろうが、(例えば、様々な濃度で細胞に加えて、所望の結果を最大限に生じさせる濃度を選択することによって)経験的に容易に決定することができる。適正濃度は約0.0001mM〜100mMの範囲内であると予想され、好ましくは適正濃度が約0.001mM〜5mMの範囲内である。以下に述べる方法によってさらに詳細な用量を決定することができる。
以下の詳細な実施例によって本発明をさらに説明する。いかなる態様においても本発明の範囲又は内容を限定するものとしてこれらの実施例を解釈してはならない。
酵素メチオニンスルホキシド還元酵素(MsrA)は、S配置にメチルスルホキシド基を含む基質に対して特異性を示すことがわかっている。この実施例は、メチルスルホキシド部位を含むことがわかっている抗酸化剤であるスリンダクがMsrAの基質として作用し得るという証拠を提供する。
精製したMsr酵素を用いて、改良されたNADPH酸化分析によってスリンダク還元を測定することができる。50mMのトリス−Cl,pH7.4、15μgの大腸菌チオレドキシン、1μgの大腸菌チオレドキシン還元酵素、100ナノモルのNADPH、1μモルのスリンダク、及び、100〜400ナノグラムののMsrAを含む最終容積が500μlの反応混合物を調製した。インキューベーションを37℃において様々な回数で行った。
この実施例は、スリンダクが、大腸菌中のMsrA及び膜結合Msr、並びに、哺乳類組織中のMsrA及びおそらくはその他のMsr酵素の基質であることを実証する。
別段の定めがない限り、スリンダク(S)、スリンダクスルフィド(SS)、及び、他のすべての化合物及び大腸菌チオレドキシン還元酵素を、Sigma Chemicals(セントルイス、ミズーリ)から入手した。チオレドキシン(大腸菌由来)をPromega(マディソン、ウィスコンシン)から購入した。N−アセチル−3H−met−R、S−(O)、met−R−(O)、met−S−(O)、DABS−met−R−(O)、及び、DABS−met−S−(O)を以前に説明されているように調製した(Brot N. et al., Anal. Biochem. 122 (1982) 291-294; Lavine, F.T. J. Biol. Chem. 169 (1947) 477-491; Minetti G. et al., Ital. J. Biochem. 43 (1994) 273-283)。
大腸菌由来の組換えのMsrA及びMsrBを以前に説明されているように得た(Grimaud, R.et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 48915-48920; Rahman, M. A. et al., Cellular & Molecular Biology 38 (1992) 529-542)。free−S−Msr(fSMsr)、free−R−Msr(fRMsr)及びMsrA1並びに膜小胞関連Msr(mem−R,S−Msr)の部分的に精製されたDEAE画分を、大腸菌MsrA/B二重突然変異体から、(Etienne, F. et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm. 300 (2003) 378-382;Spector, D. et al, Biochem.& Biophys.Res.Comm.302 (2003) 284-289)に説明されているように調製した。これらの酵素製剤は、以前に報告されているのと類似の比活性を有していた。
4℃において子ウシ肝臓、腎臓及び脳抽出物を調製した。250mMのスクロース、10mMのトリス−Cl,pH7.4及び1mMのEDTAを含む緩衝液Aの5体積中において携帯型ホモジナイザを用いて、子ウシの各30グラムの組織(肝臓、腎臓、脳)を破砕した。この破砕物を加圧(6工程)し、1,500×gで10分間回転させ、ペレットを廃棄した。その上澄み(S−10)を10,000×gで10分間回転させた。S−10上澄みを100,000×gで12時間遠心分離機し、得られたペレット及び上澄み(S−100)を保存した。S100ペレットを冷却した緩衝液A中に懸濁し、100,000×gで4時間遠心分離した。洗浄したマイクロソームペレット(すべてのリボソームを含む)を、2mlの緩衝液A(S−100ペレット)に懸濁した。
未処理の細胞画分を用いると、多量のNADPH酸化がある場合に、上記実施例1に記載されているNADPH分析を用いることはできない。未処理の細胞画分を使用するために、スリンダクスルフィドがベンゼン中に抽出される能力に基づいて抽出分析を開発した。スリンダクからスリンダクスルフィドへの還元のための反応混合物は、30μlの全体積中に:100mMのトリス−Cl,pH7.4;0.6μモルのグルコース−6−フォスフェート;50ナノグラムのグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ;30ナノモルのNADPH;2.5μgのチオレドキシン、1μgのチオレドキシン還元酵素、50ナノモルのスリンダク及び様々な量のMsr酵素を含んでいた。別段の定めがない限り、37℃でインキューベーションを1時間行った。インキューベーションの終了時に、370μlの25mMのトリス−Cl,pH8.0、100μlのアセトニトリル及び1mlのベンゼンを各チューブに加えた。30秒間攪拌し、室温において1分間回転させた後に、ベンゼン相を除去し、350nmにおいて光学濃度を読み取った。50ナノモルのスリンダク(S)又はスリンダクスルフィド(SS)は、抽出手順を実行すると、それぞれ0.910及び0.030の光学濃度測定値を与えた。これらの条件下では、約2.5%のスリンダクが抽出された一方で、実質的にすべてのスリンダクスルフィドがベンゼン中に抽出された。子ウシ組織抽出液を用いたいくつかの試験においては、統計的に有意な値を得るために、標準的な30μlの反応混合物体積を3倍(90μl)にした。トリス緩衝液の体積を310μlに減らしたことを除き、抽出分析を変更しなかった。
括弧は非常に弱い活性を示している。
活性の単位は、1時間当たりに生じたSSのナノモルをとして定義されている。以下の酵素濃度:250ナノグラムのMsrA;10μgのMsrB;290μgのfRMsr;200μgのfSMsr;40μgのMsrAl;50μgの膜画分を用いた。
スリンダクのRエピマーは、Sエピマーを除去する方法に記載されているように、過剰なMsrAと共にスリンダク(R、S)をインキュベートすることによって得た。35μgの膜画分を用いた。
表5に示されている結果は、子ウシ肝臓、腎臓及び脳の未加工の破砕物(S−10画分、「方法」参照)がスリンダクを還元することができることを明らかにしている。試験を行った組織のうち、腎臓が最も高い特異的活性を有しており、脳が最も低い特異的活性を有していた。
様々なS−10画分の調製が「方法」に記載されている。特異的活性は、1時間当たりに生じるタンパク1mg当たりの生成物のナノモルとして与えられる。
「方法」に記載されているように示されている肝臓画分を調製した。特異的活性は、1時間当たりに生じるタンパク1mg当たりの生成物のナノモルとして与えられる。
上に示されているように、スリンダクは、MsrBの基質ではなく、MsrAの基質である。スリンダクは、MsrA酵素によって認識されるメチルスルホキシド部位を含んでいるが、MsrA及びMsrB酵素のいずれによっても認識される基質であるN−メチオニンスルホキシド部位(図2参照)を含んでいない(表2)。この実施例は、メチオニンアミノ基がペプチド結合又はアミド結合中に存在するようにN−置換されたメチオニンを含むように修飾することによって、MsrBを含む複数のMsr酵素の基質として改良されたスリンダク誘導体の化学合成機構を説明する。
この実施例は、触媒酸化防止剤及び抗炎症剤(COX阻害剤)のいずれとしても機能することができる二官能性化合物を調製するのに適した化学合成機構を説明する。
図7には、イブプロフェン(図7A)、インドメタシン(図7B)及びロフェコキシブ/バイオックス(登録商標)(図7C)のそれぞれが、中間体1−8a及び中間体1−10aについて示されているカルボキシルに隣接したメチレン基又はエノラートに容易に変換されるスルホニル基を含んでいる。リチウムジイソプロピルアミド(LDA)は、エノラートを形成するために用いられる典型的な塩基である。中間体1−8a、1−9a及び1−10aは、ブロモアセチルメチオニンスルホキシドと反応して、中間体2−8a、2−9a及び2−10a中の新しい炭素−炭素結合を形成することが示されている。水酸化リチウムによってこれらの中間体を加水分解することによって、対応するカルボン酸誘導体(化合物8a、9a及び10a)が得られる。
上に示されているように、スリンダクは、MsrBの基質ではなく、MsrAの基質である。図4Aを参照すると、修飾されていないスリンダクは、メチルスルホキシド部位を含んでいるが、その構造内にMsrB酵素に必要とされる基質であるメチオニンスルホキシド部位を含まない。上記実施例4に記載されていているスリンダクのN−アセチルメチオニンスルホキシド誘導体であるスリンダクメチオニンスルホキシド(SMO)は、メチルスルホキシド及びメチオニンスルホキシドの両方を含む(例えば、図4Aの化合物2aを参照されたい)。この実施例は、SMOがMsrA及びMsrB酵素の両方の基質として機能することができることを実証する。
実施例3に説明されている合成経路に従ってスリンダクメチオニンスルホキシド(SMO)を合成した。化合物2aをこれらの試験に用いた。
スリンダク(S)及びスリンダクメチオニンスルホキシド(SMO)の還元の分析のために、反応混合物を重複して調製した。混合物は、30μlの全体積中に:100mMトリス−Cl,pH7.4、15mMのDTT、100ナノモルのS又はSMO、3μgのMsrA酵素、又は、21μgのMsrB酵素を含んでいた。37℃において2時間のインキューベーションを行い、それが終了した時に、重複したサンプルを混合して高速真空装置中において室温で乾燥させた。残留物を50μlのエタノール中に懸濁し、次いで、それをシリカゲルTLCプレート上に載せた。ブタノール:酢酸:水(60:15:25)を溶媒としてこのプレートを現像した。化合物をそれらの黄色によって視覚化した。
この実施例は、メチルスルホキシド部位を含む抗酸化剤であるスリンダクが、ROSの生成によってハエを殺すことが知られている薬剤を接種したハエの寿命を延ばすことができることを実証する。
この実施例は、インビトロにおいて及びパーキンソン病のインビボ動物モデルにおいてドーパミン作動性ニューロンを選択的に破壊する毒性化合物であるMPP+による損傷を受けた後のPC−12細胞に対するスリンダクの保護効果を実証する。
神経毒素である1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)は、ヒト及び霊長類に与えると、いずれにおいてもパーキンソン病に非常に似た臨床的症候群を生じさせる。この化合物は、モノアミン酸化酵素Bによって1−メチル−4−フェニルピリジニウム(MPP+)に代謝され、次いで、ドーパミン作用性末端によって選択的に取り込まれ、黒質内の神経ミトコンドリア中に濃縮される。MPP+は、電子伝達連鎖の複合体1を抑制し、フリーラジカルの生成によってこの複合体を不可逆的に不活性化すると考えられている(Hartley A., Stone J.M., Heron C, Cooper J.M., and Schapira A.H.V. J. Neurosci. 63:1987-1990, 1994)。MPP+は、インビボ及びインビトロにおいて超酸化物合成を増加させる。超過酸化物分解酵素を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいてMPP+ダメージが軽減されることは、フリーラジカルがその神経毒性に関与していることを示している。
まず、9cmのディッシュ内において、PC−12細胞を、高グルコース(Gibco#11195−065)、5%ウシ胎仔血清及び10%ウマ血清を含むダルベッコ修飾イーグル培地中において一晩培養した。次いで、その細胞を6cmのディッシュに移し、グルコースを含まない同じ溶媒中において、唯一のエネルギー源としてナトリウムピルベート(Gibco#11966−025)を用いることによって増殖させた。これらの細胞を、0.1mM、0.2mM又は0.5mMの濃度のスリンダク(Sigma)で48時間にわたって予備的に処理し、スリンダクを含む培地を除去し、新しい溶媒で置換した。その後、0.2mMの最終濃度でMPP+を含む培地中でこの細胞を24時間培養した。コントロール細胞をMPP+を含まない培地中で培養した。24時間の期間の終わりに、トリパンブルー排除によって細胞の生存率を分析した。
この実施例は、MsrA酵素の基質として作用するメチルスルホキシド含有化合物であるスリンダクが、有意に寿命を延ばし、運動ニューロン細胞数を増加させ、超過酸化物不均化酵素(SOD1)の突然変異をベースとしたALSのマウスモデルにおいて運動能力を改善することができるという証拠を与える。
G93Aマウスを、生後30日に開始した飼料中に混ぜた2つの異なる用量、すなわち300PPM、450PPMのスリンダクで処理した。3つのグループ(すなわち、300PPM、450PPMのスリンダク及びコントロール)を検討した。各グループの運動能力をロータロッド試験によって評価し、生存期間を記録した。
ロータロッド装置(Columbus instruments社、コロンバス、オハイオ)に習熟するようにマウスを2〜3日間訓練した。G93Aマウスにおいて60日齢から開始してロータロッドパフォーマンスを評価した。12rpmで回転するロッド上にマウスを配置することからこの試験を始めた。マウスがロッド上に残った落ちるまでの時間を、そのマウスの運動機能の能力の測定値として記録した。3回のトライアルを行い、その3回のトライアルのうちの最良の結果を、運動パフォーマンスの状態を表すものとして記録した。作業を行うことができなくなるまでマウスを週2回試験した。
G93Aのトランスジェニックマウスにおける疾病の初期兆候は休止時振戦であり、これは、末期において歩行障害、後肢の非対称的若しくは対称的な麻痺並びに究極的に完全な麻痺に進行する。側面を押した後に20秒以内に転がることができなかった時点でマウスを屠殺した。マウスを屠殺したこの時点を生存期間として決定した。
マウスに、冷却した0.1Mのリン酸塩緩衝食塩水(PBS)を1分間で経心臓的にかん流させ、次いで、4%パラホルムアルデヒドを含む冷却したPBS中を10分間で経心臓的にかん流させた。脊髄を素速く除去し、冠状にブロックし、4%パラホルムアルデヒドを含むPBS中において後固定を6時間行った。ブロックを、30%スクロース中で24時間凍結保護し、低温保持装置上において35マイクロメートルの厚さに切断した。すべてのプロトコルは、動物研究用NIHガイドライン内で実行され、Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって承認された。
測定した生後の生存期間についてカプラン−マイヤー試験を用い、死亡分析の平均年齢についてフィッシャー試験を用い、及び、運動能力についてシェフェ検定を用いて、生存期間の統計分析を行った。
スリンダクのR−エピマー及びS−エピマーは、キラルカラム及びHPLCを用いて分離可能である。スリンダクエピマーは、分取キラルカラムを用いて、本研究用にスケールアップされた充分な量でラセミ混合物から分離及び単離された。キラルカラム(R,R)−Welk−01キラルのカラム(25cm×4.6mm)をRegis Technologies社(ミルトングローブ、イリノイ)から購入した。図15に示すように、スリンダクの2つのエピマーは、図15の凡例に記載されている条件下でかなり充分に分離された。22.5分後及び28分後に溶出する2つのピークが観察された。ピークチューブを混合し、溶媒を蒸散させた。次いで、分離されたエピマーを、1MのトリスCl,pH7.4に溶解させた。どのエピマーが各ピーク中に存在しているかを決定するために、各ピーク中の物質を、大腸菌MsrA及び15mMのDTTと共にインキュベートした、これによってS−エピマーがスリンダクスルフィドに変換される。インキューベーションの終了時に、還元された生成物をベンゼン中に抽出し、前に説明されているように350nmにおいて光学濃度を読み取った。28分に溶出したピークがスリンダクのS−エピマーであると決定された。
正常な肺細胞を500μMのスリンダク(R+S;それぞれ約50%)、500μMのスリンダク−R(>99%のR;<1%のS)又は500μMのスリンダク−S(>99%のS;<1%のR)で48時間処理した。エピマーのラセミ混合物から、上記プロセスに類似したキラルカラムを用いて、スリンダク−R及びスリンダク−Sサンプルを得た。それらの細胞を、洗浄し、次いで、示されている濃度のtert−ブチルヒドロペルオキシド(TBHP)に2時間暴露させた。標準的なMTS分析を用いて細胞の生存率を測定した。4回の反復試験サンプルの平均値から0.12のバックグラウンド吸光度を引いた。濃度が等しい時間間隔で存在していないので、データは棒グラフとしてプロットされている。誤差バーは、4回の反復試験サンプルの標準誤差である。そのプレートから得た処理を行っていないサンプルを用いて、このデータを3個の別々のグラフで与える。
この明細書は、どのようにして本発明の組成物及び方法を考案し、実行することができるかを例示するものである。その他の詳細な実施形態に到達するときに様々な詳細を修正してもよく、それらの実施形態の多くは本発明の範囲内となるであろう。従って、本発明の範囲及び本発明に包含されている実施形態を公衆に知らせるために、特許請求の範囲を添付する。
Claims (11)
- 対象において正常細胞をダメージから保護する方法において:
スリンダク、R−エピマースリンダク、S−エピマースリンダク、これらの誘導体、これらの代謝産物及びこれらの構造的類似化合物を含む組成物であって、前記のスリンダク、R−エピマースリンダク、S−エピマースリンダク、これらの誘導体、これらの代謝産物及びこれらの構造的類似化合物が少なくとも約0.010重量対重量%の濃度を有する組成物を提供するステップと;
少なくとも1つの生細胞を治療的有効用量の前記スリンダクに接触させるステップと;
対象において正常細胞をダメージから保護するステップと、を具えることを特徴とする方法。 - 前記スリンダク、R−エピマースリンダク、S−エピマースリンダク、これらの誘導体、これらの代謝産物及びこれらの構造的類似化合物が、およそ0.001重量対重量%から100重量対重量%の濃度範囲で存在することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- スリンダク、R−エピマースリンダク、S−エピマースリンダク、これらの誘導体、これらの代謝産物及びこれらの構造的類似化合物を含む前記組成物を、全身に、腹膜内に、静脈内に、皮下に、筋肉内に、及び、局所的に投与することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、スリンダク、スリンダク、その誘導体、その代謝産物及びその構造的類似化合物を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、R−エピマースリンダク、その誘導体、その代謝産物及びその構造的類似化合物を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、S−エピマースリンダク、その誘導体、その代謝産物及びその構造的類似化合物を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、スリンダク、R−エピマースリンダク、S−エピマースリンダク、これらの誘導体、これらの代謝産物及びこれらの構造的類似化合物の1つ以上を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、可変比率のスリンダク、R−エピマースリンダク、S−エピマースリンダク、これらの誘導体、これらの代謝産物及びこれらの構造的類似化合物を含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記スリンダクの比率:R−エピマースリンダク:S−エピマースリンダクが、およそ0〜1000であることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記組成物が、環境的ダメージ、病状、微生物又は太陽光線を含むダメージから正常細胞を保護することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が正常細胞を酸化ダメージから保護することを特徴とする請求項1に記載の方法。
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