PL237474B1

PL237474B1 - Nowe zastosowanie kwasu 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowego

Info

Publication number: PL237474B1
Application number: PL421491A
Authority: PL
Inventors: Mikołaj TOMULEWICZ; Mikołaj Tomulewicz
Original assignee: Wyzsza Szkola Medyczna W Bialymstoku
Priority date: 2017-05-04
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2021-04-19
Also published as: EP3618823A4; CA3073146A1; US20200129459A1; EP3618823A1; WO2018203762A1; CA3073146C; CN110740726A; PL421491A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) o wzorze 1 do zastosowania w leczeniu trudno gojących się ran u pacjentów z cukrzycą.

Podstawę opracowania wynalazku, stanowi oddanie do dyspozycji pacjentów jak i lekarzy (diabetologów, chirurgów) nowych preparatów, które wywierają korzystny wpływ na przebieg procesu gojenia się ran (różnego pochodzenia) u pacjentów z cukrzycą.

Preparaty farmaceutyczne zawierające kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) są dostępne w handlu jako niesterydowe leki przeciwzapalne hamujące enzym cyklooksygenazę 1 (COX-1), a tym samym zmniejszające wytwarzanie prostaglandyn, co przekłada się na ich działanie przeciwbólowe. Preparaty dostępne na rynku farmaceutycznym, to Klinoril, Clinoril, Sudaclin. Związki te można wytwarzać typowymi sposobami.

Według definicji Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organisation - WHO) cukrzyca (łac. Diabetes mellitus, dosł. miodowe przeciekanie) jest przewlekłą chorobą metaboliczną, charakteryzującą się wysokim poziomem glukozy we krwi tzw. hiperglikemią. Jest wynikiem bezwzględnego bądź względnego niedoboru insuliny. Jak podaje WHO, obecnie na świecie na cukrzycę choruje 422 mln ludzi, z czego połowa, to przypadki nie zdiagnozowane. W Polsce liczbę chorych szacuje się na ok. 3,5 mln, z czego 1/3 to przypadki jeszcze nie zdiagnozowane. Wszystkie światowe i polskie raporty wskazują na dalszy wzrost liczby zachorowań. W Polsce cukrzyca jest ciągle główną przyczyną ślepoty u osób dorosłych, niewydolności nerek i amputacji kończyn. Patologia ta jest także głównym czynnikiem ryzyka choroby niedokrwiennej serca i zawału serca oraz bardzo częstą przyczyną udarów mózgu, zespołu stopy cukrzycowej i amputacji, a także wad wrodzonych noworodków.

Klasyfikacja cukrzycy obejmuje kilka typów w zależności od przyczyny i przebiegu choroby. Wyróżnia się zatem cukrzycę typu 1, gdzie deficyt insuliny jest wynikiem destrukcji komórek β wysp Langerhansa trzustki, z reguły w następstwie choroby autoimmunologicznej; cukrzycę typu 2, która jest najpowszechniej występującym typem cukrzycy, w której obserwuje się względny niedobór insuliny lub insulino oporność; inne specyficzne typy cukrzycy jak cukrzyca trzustkopochodna (wywołana zapaleniem trzustki połączonym ze zniszczeniem wysp trzustki lub uszkadzającym komórki działaniem toksyn), cukrzyca steroidowa (skutek zwiększonego uwalniania hormonów działających antagonistycznie w stosunku do insuliny, np. w przebiegu choroby Cushinga), cukrzyca ciężarnych (skutek zwiększonego wydzielania antagonistów insuliny: laktogenu łożyskowego, somatomammotropiny kosmówkowej, estrogenów, progesteronu i prolaktyny).

Zaburzenia metaboliczne występujące w przebiegu cukrzycy mogą doprowadzić do wystąpienia poważnych i nieodwracalnych zmian w organizmie. Przy czym główną rolę w tym procesie odgrywa hiperglikemia.

Długotrwała hiperglikemia prowadzi do zwiększonej aktywacji szlaku poliolowego. Glukoza redukowana jest do sorbitolu w komórkach, które zawierają enzym reduktazę aldozy. Prowadzi to do nagromadzenia sorbitolu, który jest poliolem, pośrednim produktem przemiany glukozy w fruktozę. Glukoza jest redukowana do sorbitolu, a następnie sorbitol jest utleniany do fruktozy. W warunkach długotrwałej hiperglikemii proces ten nasila się powodując np. odkładanie się sorbitolu w aksonach, obrzęk i us zkodzenie komórek Schwanna (demielinizację), zaburza przewodnictwo nerwowe (polineuropatie). Nagromadzenie sorbitolu w soczewce oka powoduje następowe zatrzymanie w niej wody prowadząc do rozwoju zaćmy. Hiperglikemia nasila powstawanie białek osoczowych zawierających cukry, takich jak fibrynogen, haptoglobina, czy czynniki krzepnięcia V i VIII, prowadząc do wzrostu lepkości krwi oraz zwiększając ryzyko wystąpienia zakrzepicy. Długotrwała hiperglikemia powoduje wiązanie glukozy do wolnych grup aminowych białek w wyniku czego powstają związki - końcowe produkty glikacji (ang. advanced glycation end products, AGE), których stężenie rośnie wraz z wiekiem i może doprowadzić do powstania nefropatii czy mikroangiopatii cukrzycowej. Gdy poziom glukozy we krwi jest za wysoki, także komórki układu immunologicznego nie pracują prawidłowo. Zaburzona jest produkcja przez nie enzymów i cytokin.

Przewlekła hiperglikemia może prowadzić do powstawania różnego rodzaju trudno gojących się ran, z owrzodzeniami i stopą cukrzycową włącznie. Stopy i kostki są szczególnie narażone na powstawanie powikłań związanych z gojeniem się powstałej rany. Związane jest to z tym, że dynamika procesu gojenia poniżej kolan jest nieco inna niż w pozostałej części ciała. Jest to wynikiem m.in. podatności

PL 237 474 B1 tego obszaru ciała na powstawanie obrzęków, które utrudniają gojenie. Ponadto, czynnikami sprzyjającymi rozwojowi ran stóp u diabetyków są wspomniane wyżej uszkodzenia nerwów i zaburzone przewodnictwo nerwowe (neuropatie) oraz zaburzenia krążenia (mikroangiopatie). Osłabione czucie powoduje, że rany stóp są przez pacjentów później zauważane. Co więcej, rany mogą ulec zakażeniu i ich wygojenie staje się jeszcze trudniejsze.

W dotychczasowej praktyce klinicznej na opracowaną podiatrycznie ranę stosuje się specjalne żele lub opatrunki hydrożelowe, które jedynie zapewniają w niej optymalne środowisko, przyspieszając tym samym proces gojenia. Opatrunek przylega szczelnie do rany zapobiegając dodatkowemu zakażeniu. Dodatkowo na zakażone rany stosuje się miejscowo antybiotyk lub środek bakteriobójczy. Rany mogą być zabezpieczone aktywnymi opatrunkami, które np. pochłaniają nadmiar wysięku czy zapachu np. opatrunki węglowo-srebrowe lub mają tylko działanie przeciwbakteryjne jak opatrunki srebrowe.

Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) są jedną z najchętniej stosowanych przez pacjentów i najczęściej przepisywanych przez lekarzy grup leków. Znane są powszechnie ich właściwości przeciwbólowe, przeciwzapalne oraz przeciwgorączkowe. Mechanizm działania całej szerokiej grupy NLPZ, w tym kwasu 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowego (sulindaku), oparty jest o powinowactwo tej grupy leków do cyklooksygenazy (COX) prowadzące do zahamowania aktywności katalitycznej tego enzymu, a co za tym idzie zahamowania produkcji prekursorów mediatorów prozapalnych - prostaglandyn i tromboksanów.

Znane są dwie cyklooksygenazy. COX-1, występuje konstytutywnie w większości komórek, natomiast COX-2 występuje w sposób indukowany, a jej ekspresja zależy od typu działającego bodźca. Bezpośrednim produktem genów wczesnej odpowiedzi jest COX-2, której ilość wzrasta pod wpływem stresu, czynników wzrostowych, karcynogenów i cytokin. COX-1 tworzy prostanoidy uczestniczące w utrzymaniu homeostazy. COX-2 jest głównym źródłem prostanoidów w stanach zapalnych i nowotworach. NLPZ wywierają swoje działanie poprzez hamowanie cyklooksygenaz. Indometacyna i kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) są bardziej selektywne w stosunku do COX-1.

Kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) jest sulfoksydowym prolekiem, który ulega odwracalnej przemianie w aktywny metabolit siarczkowy. Jest on wydzielany do żółci, a następnie wchłaniany z jelita.

Kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) jest wskazany w schorzeniach reumatoidalnych. Hamuje także rozwój rodzinnej polipowatości jelit (Friederich P. i wsp.: Effects of intervention with sulindac and inulin/VSL#3 on mucosal and luminal factors in the pouch of patients with familial adenomatous polyposis. Int. J. Colorectal Dis., 2011; 26: 575-582) oraz prawdopodobnie rozrost raka okrężnicy (Lee Y.S. i wsp.: CXCR2 inhibition enhances sulindac-mediated suppression of colon cancer development. Int. J. Cancer., 2014; 135: 232-237; Li X. i wsp.: Sulindac sulfide inhibits colon cancer cell growth and downregulates specificity protein transcription factors. BMC Cancer, 2015; 15: 974), piersi (Tinsley H.N. i wsp.: Sulindac sulfide selectively inhibits growth and induces apoptosis of human brest tumor cells by phosphodiesterase 5 inhibition, elevation of cyclic GMP, and activation of protein kinase G. Mol. Cancer Ther., 2009; 8: 33313340) oraz prostaty (Du J. i wsp.: Anticancer activities of sulindac in prostate cancer cells associated with c-Jun NH2-terminal kinase νβ-catenin signaling. Oncol. Lett., 2014; 8: 313-316). W postaci sulfonu (rzadziej siarczku) zdaje się zmniejszać częstość występowania nowotworów układu pokarmowego u szczurów (Femia A.P. i wsp.: Sulindac, 3,3'-diindolylmethane and curcumin reduce carcinogenesis in the Pirc rat, an Apc-driven model of colon carcinogenesis. BMC Cancer, 2015; 15: 611).

Z amerykańskiego opisu patentowego US 20120295979 A1 znane jest zastosowanie sulindaku tj. kwasu 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowego do ochrony komórek nabłonkowych siatkówki przed stresem oksydacyjnym, który jest głównym sprawcą zwyrodnienia plamki żółtej oka prowadzącego w konsekwencji do utraty wzroku.

Z opisu patentowego WO 2011088474 A2 znane jest zastosowanie sulindaku a mianowicie kwasu 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowego i jego pochodnych sulfonowych do leczenia zakażeń wirusowych układu oddechowego rhinowirusami, polegającego na zahamowaniu lub zmniejszeniu ilości cykli replikacyjnych wirusa, zapobiegając tym samym rozprzestrzenianiu się zakażenia.

Najnowsze badania wskazują, że wymienione korzystne działania NLPZ nie wyczerpują w pełni ich potencjału terapeutycznego.

PL 237 474 B1

Istotą wynalazku jest kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) o wzorze 1, pokazanym na rysunku, do zastosowania w leczeniu trudno gojących się ran u pacjentów z cukrzycą.

Kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy w połączeniu z co najmniej jednym nośnikiem farmaceutycznym, może być stosowany w postaci dawek jednostkowych zawierających od 1 mg do 200 mg substancji o wzorze 1.

Niespodziewanie stwierdzono, że kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) wywiera korzystny wpływ na proces gojenia się zranionej skóry u osobników z cukrzycą, kiedy zostanie naniesiony bezpośrednio na powstałą ranę.

Do leczenia uszkodzonej skóry u osobników z cukrzycą można stosować kwas 2-[(3Z)-6-fluoro2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) w postaci zwykłych preparatów farmaceutycznych podawanych na skórę. Tak więc, kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) może być zawarty w stałych, półstałych lub ciekłych preparatach farmaceutycznych w ilości czynnej, prowadzącej do wyzdrowienia (całkowitego zagojenia uszkodzonej powłoki skórnej) wraz ze zwykłymi farmaceutycznymi środkami pomocniczymi i nośnikami. Jako przykłady preparatów w postaci płynnej należy wymienić roztwory o różnej lepkości podawane bezpośrednio na uszkodzoną skórę. Te preparaty farmaceutyczne mogą zawierać substancje zwiększające lepkość, takie jak np. metyloceluloza, karboksymetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, guma arabska, tragakanta, alginian sodu, żelatyna, karbomer, bentonit. Ponadto mogą zawierać rozpuszczalniki takie jak np. woda, alkohole czy glikole oraz substancje stabilizujące (polisorbat, Cremophor®) czy przeciwutleniające (pirosiarczan sodu, kwas askorbowy).

Preparaty substancji czynnych z farmaceutycznymi substancjami pomocniczymi i/lub nośnikami można mieszać i sporządzać w znany sposób. W celu wytworzenia preparatu w postaci płynnej należy zmieszać odpowiednią ilość jednej lub więcej z substancji zagęszczających z wodą, pozostawić do odpowietrzenia, a następnie dodawać substancję czynną. Można uzupełnić skład o dodanie związków stabilizujących oraz przeciwutleniających.

Opis badań i wyników

Do badań użyto 63 dorosłe samce szczurów Wistar. Wszystkie zwierzęta poddano dwutygodniowej obserwacji celem wykluczenia infekcji. Szczury umieszczano w standardowych klatkach, po 5 osobników w każdej. Zwierzęta przebywały w pomieszczeniu o temperaturze 22±2°C, wilgotności powietrza 60-70% oraz w naturalnym oświetleniu (12/12 w cyklu dzień/noc). Zwierzęta miały zapewniony swobodny dostęp do wody i standardowej paszy laboratoryjnej ad libitum.

Indukcja eksperymentalnej cukrzycy

Cukrzyca indukowana była alloksanem, związkiem silnie toksycznym, niszczącym wyspy β Langerhansa trzustki. Alloksan podawany był w pojedynczej dawce 170 mg/kg masy ciała w 0.1 M buforze cytrynianowo-fosforanowym o pH 4.0, dootrzewnowo, po 24-godzinnym głodzeniu. Po podaniu alloksanu wodę do picia zastąpiono 2% roztworem cukru/glukozy na 10 dni. Po 10 dniach od podania alloksanu, po 12-godzinnym głodzeniu sprawdzano stężenie glukozy we krwi. Do dalszej części eksperymentu kwalifikowano te zwierzęta, u których stężenie glukozy było większe niż 16 mmol/l 31 zwierząt rozwinęło pełnoobjawową cukrzycę.

Określenie nocyceptywnego progu cieplnego

Próg odczuwania bólu termicznego dla każdego szczura z cukrzycą badano trzy miesiące po indukcji cukrzycy, jak opisano w Alshahrani i wsp., 2012 do identyfikacji zmienioną obróbkę sensoryczne u szczurów (Alshahrani S. i wsp.: Rapid determination of the thermal nociceptive threshold in diabetic rats. J Vis Exp., 2012; (63): e3785).

Oznaczanie stężenia glukozy i hemoglobiny glikowanej we krwi

Stężenie glukozy oceniano przy pomocy gleukometru Roche Accu Check Active. Stężenie hemoglobiny glikowanej oznaczano przy pomocy aparatu Clover A1c analyzer używając odpowiedniego zestawu odczynników (kitu).

PL 237 474 Β1

Indukcja ran ciętych

Każda grupa eksperymentalna została wyrównana (dobrana w odpowiedni sposób) pod kątem średniego stężenia glukozy, hemoglobiny glikowanej i cieplnego progu bólowego.

Zwierzęta znieczulano wodzianem chloralu (300 mg/kg m.c.), a następnie ręcznie usuwano sierść na stronie grzbietowej. Pole operacyjne przemywano 70% alkoholem etylowym. W górnej części grzbietu w okolicy łopatkowej, wycinano kwadratowy kawałek skóry o powierzchni 1 cm². Następnie w linii środkowej grzbietowej umieszczano okrągły „ogranicznik” (sterylny pierścień o średnicy 20 mm i wysokości 8 mm) i mocowano do skóry szwem jedwabnym. Natychmiast po zabiegu podawano domięśniowo metamizol (40 mg/kg m.c.). leczenie przeciwbólowe kontynuowano przez kolejne 3 dni podając metamizol 200 mg/kg m.c. per os.

Leczenie ran i pobieranie próbek

Zwierzęta z grup badanych otrzymywały kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) (Sul) lub kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) + DMSO (Sul + DMSO), a z grupy kontrolnej sól fizjologiczną. Wszystkie roztwory (200 μΙ/dzień, aż do całkowitego wygojenia się rany) nakładano bezpośrednio na powierzchnię rany. Rany z nałożonym lekiem lub solą fizjologiczną zabezpieczano sterylnym gazikiem.

Każdego dnia rany przemywano 0,05% roztworem chlorheksydyny (w równych objętościach) w celu zminimalizowania zanieczyszczenia i nadkażenia ran.

Podczas przemywania ran zwierzęta utrzymywano w lekkiej narkozie eterowej. 3, 5 i 7 dnia od indukcji ran, wnękę komory przemywano 1 ml sterylnej soi fizjologicznej. Popłuczyn użyto do badań immunologicznych.

Dynamika epitelializacji i gojenia się rany

Każdego dnia, przy zmianie opatrunku, rany były fotografowane przy użyciu aparatu cyfrowego Samsung S5K3L2 (13 Mpix). Wielkość ran makroskopowo oceniano przy użyciu oprogramowania ImageJ (NIH, USA).

Stopień epitelializacji (Sj) obliczano na podstawie wzoru:

X 100% (I), gdzie S_ep - oznacza powierzchnię nabłonka, S_wound - powierzchnię rany poddaną leczeniu.

Względny rozmiar rany (¾) wyrażono jako procent pierwotnej powierzchni rany:

S,=£txioo« gdzie S_o - oznacza początkową powierzchnię rany, a S_t - powierzchnia rany poddaną leczeniu.

Histologia

Próbki tkanek do badań histologicznych pobierano następnego dnia po pełnej epitelializacji wycinając fragmenty skóry z tkanką łączną powyżej zewnętrznej powięzi mięśni grzbietowych. Wyciętą skórę utrwalano w paraformaldehydzie (4% w PBS, 0.01 M, pH 7.4), odwadniano w roztworach alkoholowych, zatapiano w bloczki parafinowe a następnie cięto na skrawki o grubości 5 μm przy użyciu mikrotomu.

Pomiar aktywności reduktazy aldozy w mięśniach podskórnych szczura

Próbki tkanek homogenizowano w 135 mM Na, K buforze fosforanowym (pH 7,0) zawierającym 5 mM 2-merkaptoetanolu. Homogenat odwirowano przy 12000 g przez 30 minut, a supernatant używano w następnych etapach. Aktywność reduktazy aldozowej została określona zgodnie z klasyczną metodą, w której jako substrat służy aldehyd glicerynowy. Mieszanina inkubacyjna zawierała 135 mM Na, K buforu fosforanowego (pH 7,0), 100 mM siarczanu litu, 0.03 mM NADPH, 0.04 mM D, L-aldehydu glicerolowego (monomeryzowany w temperaturze 80°C przez 10 minut i ochłodzono do temperatury pokojowej) jako substratu i roztworu próbki (50 μΙ). Reakcję zainicjowano przez dodanie NADPH w temperaturze 37°C i zatrzymano dodając 0.5 M HCI, a następnie przez dodanie 6 M NaOH zawierającego

PL 237 474 Β1 mM imidazolu. Roztwór ogrzewano w temperaturze 60°C przez 10 minut w celu przekształcenia NADP do fluorescencyjnego produktu. Fluorescencję mierzono przy użyciu spektrofluorometru przy długości fali wzbudzeńie/emisja 360/460 nm. Próbę przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. Zawartość białka określono za pomocą testu BCA.

Ekstrakcja sorbitolu z tkanki mięśniowej

Każdą próbkę mięśni pocięto na małe kawałki i zmielono (zhomogenizowano) w obecności ciekłego azotu aż do uzyskania proszku. Sproszkowane mięśnie ważono, po czym dodawano 1 ml 0.5 M kwasu nadchlorowego lodowatego i sonikowano próbki. Sonikat tkanki wirowano przez 5 minut w celu usunięcia osadu. Otrzymany supernatant zobojętniono przez dodanie 0.5 M roztworu węglanu potasu. Następnie roztwór mieszano ruchem wirowym przez 45 sekund, a następnie wirowano przez 5 minut przy 5000 g i osad odrzucono. Próbki przechowywano w zamrażarce w -86°C do czasu oznaczania sorbitolu.

Oznaczanie stężenia sorbitolu w tkance mięśniowej

Zobojętnione ekstrakty mięśni wirowano i 10 μί próbki wraz ze standardami sorbitolu naniesiono do 96-dołkowej płytki. Reakcję rozpoczęto przez dodanie do każdej studzienki 10 μΙ mieszaniny reakcyjnej zawierającej 20 μg/μL dehydrogenazy sorbitolu, 2 mM NAD w 50 mM buforze glicyna-NaOH, pH 9,7. Po inkubacji z dehydrogenazą sorbitolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej do każdego dołka płytki dodawano 100 μΙ roztworu zawierającego 65 μg/ml diaforazy, 10 μΜ FMN, 20 μΜ resazuryny w 50 mM buforze glicyna-NaOH, pH 9,7. Fluorescencję (EX / em w 544/590 nm) mierzono przy użyciu fluorescencyjnego czytnika płytek przez 1 godzinę. Stężenie sorbitolu wyrażono w nmol/mg wilgotnej masy mięśni.

Normy etyczne wykorzystania zwierząt w badaniach

Wszystkie eksperymenty były prowadzone zgodnie z protokołem komisji Narodowego Instytutu Zdrowia, Opieki i Wykorzystania Zwierząt (USA).

Statystyka

Uzyskane wyniki zostały opracowane przy użyciu programu Graph Pad Prism v. 6.0. Dane w tabelach przedstawiono w postaci średniej + błąd standardowy średniej lub jako mediana (25 percentyl, 75 percentyl). Istotność statystyczną oceniano przy analizy wariancji ANOVA i testu post hoc Tukey’a. Za istotne statystycznie przyjmowano wartości p < 0.05.

Wizualizację gojenia się ran przedstawiono na fig. 2.

Wyniki

Tabela - Parametry cukrzycy u zwierząt.

Grupa	N	Glukoza mmol/1	Hgb glikozylowana %	Temperatura progu bólowego, °C
Kontrola	5	4.67±0.52	6.18±0.54	50.4±0.45
Cukrzyca	9	23.76±1.41	16.51±0.38	43.7±0.34***
Cukrzyca +Sul	8	20.76±1.50	16.72±0.44	43.3±0.43
Cukrzyca +Sul+DMSO	8	21.83±1.73	15.64±0.68	44.0±0.38

***p<0.001 w porównaniu do grupy kontrolnej

PL 237 474 Β1

Tabela - Wpływ leków na gojenie się ran, stężenie sorbitolu i poziom aktywności reduktazy aldozowej w podskórnej warstwie mięśni.

Grupa	N	Całkowite wygojenie, dni	Sorbitol, nmol/mg	AR, nmole NADPH/min/mg białka
Kontrola	5	15.4±0.63 15.3(14.3)16.6)	0.030+0.001 0.030(0.028,0.033)	0.76+0.02 0.776(0.701 ;0.802)
Cukrzyca	7	26.6+0.60 26.0(26.0)27.0) * $ *	0.190+0.025 0.21(0.12)0.22) Ηί Φ #	6.91+0.32 7.0(6.05)7.79) Ψ
Cukrzyca+Sul	7	23.7+0.65 24.0(22.0)25.0) Δ	0.057+0.005 0.053(0.048)0.075) ΔΔΔ	0.64+0.04 0.677(0.63;0.69) ΔΔΔ
Cukrzyca +Sul+DMSO	7	21.9+0.99 21.0(20.0)25.0) ΔΔΔ	0.041+0.006 0.032(0.029)0.061) ΔΔΔ	0.40+0.03 0.375(0.343)0.47) ΔΔΔ

***p<0.001 w porównaniu do grupy kontrolnej ^Δρ<0.05, ^ΔΔΔρ<0.001 analiza wariancji AN0VA z testem post hoc Tukey’a

Histologia

Preparaty z pobranych fragmentów skóry przygotowano w standardowy sposób i zabarwiono klasyczną metodą z użyciem hematoksyliny i eozyny oraz metodą van Gisona z użyciem kwasu pikrynowego i kwaśnej fuksyny. Preparaty analizowano w mikroskopie świetlnym Leica DM 1000 wyposażonym w kamerę cyfrową Leica DFC300 FX.

Cukrzyca

We wszystkich miejscach próbki, z wyjątkiem miejsca uszkodzenia, naskórek był prawidłowy, z widocznymi warstwami, ale w większości obszarów pojawiały się zmiany nekrotyczne naskórka i warstwy siatkowej skóry właściwej, a także włókien mięśni podskórnych, w pobliżu których znajdowała się strefa obrzęku i nacieku zapalnego (Fig. 3).

W obszarze rany, warstwę podstawną skóry właściwej stanowi nieuformowana tkanka łączna/dojrzała tkanka granulacyjna. Wiązki kolagenu skóry właściwej są obrzęknięte, przezroczyste, ostro wybarwione, a pomiędzy nimi zlokalizowane są pyknotyczne rdzenie fibroblastów.

W naczyniach tkanki podskórnej obserwowano objawy erytrostazy i zakrzepicy, często także krwotoki do tkanki podskórnej.

Włókna mięśniowe pozbawione są jądra komórkowego (lub posiadają „cień” jądra), miofibrylle są przykurczone, a w cytoplazmie widoczne są wyraźne pęknięcia. Widoczny jest obrzęk oraz liczne makrofagi, limfocyty i neutrofile naciekające tkankę łączną. Pomiędzy naciekającymi makrofagami widoczne są fragmenty włókien mięśniowych z edematycznymi jądrami i jednorodną cytoplazmą. Włókna mięśni leżące głębiej niż dociera strefa nacieku zapalnego mają zwykłą strukturę (Fig. 4).

Cukrzyca + Kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak)

We wszystkich miejscach nieuszkodzonego obszaru próbki naskórek jest prawidłowy, z widocznymi wszystkimi warstwami, z nierównomiernie zagęszczoną warstwą rogową i ziarnistą. Na krawędzi ranek naskórek nacieczony jest w stopniu nieznacznym pojedynczymi limfocytami. W warstwach głębokich skóry właściwej obserwowano zmienione miażdżycowo naczynia krwionośne (Fig. 5). W okolicy uszkodzenia, skóra została odbudowana w postaci bliznowatej tkanki ze zmodyfikowanej tkanki łącznej, nacieczonej nieznacznie w pobliżu granicy z naskórkiem przez makrofagi i pojedyncze limfocyty. Na powierzchni uszkodzenia, naskórek został utworzony w postaci równomiernej powłoki, w której widoczne są wszystkie charakterystyczne warstwy (Fig. 6).

PL 237 474 Β1

Cukrzyca + Kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak)+DMSO

We wszystkich miejscach, z wyjątkiem skóry, próbki miały typową strukturę, naskórek był prawidłowy, z widocznymi wszystkimi warstwami. W obszarze uszkodzenia, skóra została odbudowana w postaci bliznowatej tkanki ze zmodyfikowanej tkanki łącznej, nacieczonej nieznacznie w pobliżu granicy z naskórkiem przez makrofagi i pojedyncze limfocyty, obserwowano oddzielne naczynia krwionośne proliferujące w skórze (Fig. 7). Na powierzchni uszkodzenia, naskórek został utworzony w postaci równomiernej powłoki, w której widoczne są wszystkie charakterystyczne warstwy. Na krawędzi uszkodzenia, w okolicy podskórnej zaobserwowano liczne skupiska komórek tworzących gruczoły łojowe (Fig. 8).

Claims

1. Kwas 2-[(3Z)-6-fluoro-2-metylo-3-[(4-metylosulfinylofenylo) metylideno]inden-1-ylo] octowy (sulindak) do zastosowania w leczeniu trudno gojących się ran u pacjentów z cukrzycą.