JP2011516089A - 動物の腸管中のグラム陰性細菌コロニー形成に抗する酵素プレミックス - Google Patents

Abstract

本発明は、（ａ）１０％から１００％の範囲からなるマンノース含有量のポリマー又はポリマー混合物と；（ｂ）β−マンナナーゼ酵素と；（ｃ）抗結合剤とを含有し、抗結合剤が、２０％より高い吸収能と、０．１０から２．７０ｇ／ｃｍ^３の範囲からなる嵩密度を有する、家畜飼養のためのプレミックスを提供する。本発明のプレミックスは、腸管を通って良好に拡散し、動物の成長に影響を及ぼすことなく、グラム陰性細菌のコロニー形成を効果的に阻害する。

Description

本発明は、動物の腸管中の病原性グラム陰性細菌の低減又は予防に効果的な家畜飼養のためのプレミックスに関する。

家禽及び肉は食物媒介病原体のよくある原因である。家禽製品に付随する病原菌は、サルモネラ属菌（Salmonella spp.）、リステリア菌、大腸菌及びカンピロバクター・ジェジュニを含む。これらの微生物は飼育中に家禽及び動物群中に、また加工中に死体に入る。これらの細菌は消化管表面を被覆する粘液にコロニー形成し、腸陰窩の粘液深くにまた見出すことができる。
家禽における腸炎菌（ＳＥ）の感染は、関連した食中毒の発生のため、家禽類工業における最も深刻な問題の一つである。家禽類におけるサルモネラ属菌感染を阻害するために多くの努力がなされている。抗生物質でのサルモネラ属菌の阻害は、耐性細菌株の発生と家禽製品中の抗生物質の残留毒性のため、実用的であるとは思えない。

最近、ワクチン接種が一般的なアプローチ法となっているが、幾つかの制約がある。ワクチン療法は、サルモネラ血清検査がなされる場合、抗体の由来がワクチンからか又は最近病原体から由来するものかを区別することができない。よって、ワクチン接種の期間を厳密に計画し、特定の時間間隔に限定されなければならない。ある種の炭水化物、酵母、特にマンノース残基がサルモネラ属菌コロニー形成の防止に効果的であることが報告されている。
他の最近のアプローチ法は、その腸にコロニー形成するサルモネラ生物の量を減少させるために、ある種の単量体及び二量体の糖類を家禽の食餌中に使用することに基づく。以前に示されているように、腸上皮細胞の表面の糖レセプターは、どうやらある種の細菌性病原体が結合するためのレセプターになっていると思われる。グラム陰性細菌線毛とこれらのレセプター間の相互作用は、動物給餌中のある種の単糖によってブロックすることができる。

ＰＣＴ出願番号ＷＯ０３１０１２１９には、家畜飼養に使用されるプレミックスが記載されている。この出願では、ローカストビーンガム、液状加水分解酵素調製物及びセピオライト（家畜飼養のための許容されている添加剤である）を含有するプレミックスが記載されている。この混合物はヒヨコにおけるサルモネラのコロニー形成に抗するために使用されている。
先行技術においてなされた努力にもかかわらず、（サルモネラ属菌のような）グラム陰性細菌のコロニー形成の予防又は阻害に更に効果的な新しい組成物の研究は尚も活発な分野である。

発明者は、１０％から１００％の範囲からなるマンノース含有量のポリマーと；β−マンナナーゼ酵素と；特定の吸収能と嵩密度（容積密度、バルク密度）を有する抗結合剤（anti-binding agent）とのプレミックスが、動物腸管におけるグラム陰性細菌コロニー形成に対して効果的であることを見出した。特に、このプレミックスは、高流動性を有しており、腸管を通る良好な拡散を意味している。この高流動性及び拡散の主要な利点は、プレミックスの効能が増加し、よって所望の効果（つまり、細菌コロニー形成を避けること）を達成するのに低い含有用量（つまり、動物給餌中への混合物の量）だけが必要となることである。以下に示されるように、本発明の少量の混合物が所望の効果を達成するのに十分であり、これは、投与されなければならない飼料の全量を少し高めることを意味する。これは、家畜を養わなければならない場合には決まった量の飼料が投与されるので、これは重要である。本発明の混合物が多い量で供給されなければならないならば、飼料の量を減少させなければならず、よって、動物の食餌はその成長には適切ではないであろう。この場合、動物の適切な成長を助けるためには更なる栄養分が飼料に添加されなければならない。

ＷＯ０３１０１２１９の教示から、液状加水分解酵素調製物と共に、技術的に許容可能な添加剤としてのセピオライト、及び天然ガムを含有する混合物が、サルモネラのコロニー形成阻害能を有していることが知られている。該出願の実施例では、使用される混合物の量は、全飼料重量に対して２．５重量％から５重量％であり、つまり、細菌コロニー形成の阻害のために以下の実施例で使用されているものより５から１０倍多い。
有利には、本発明の混合物は低い量（例えば、表２及び３では、量は０．５重量％／全飼料である）で効果的であるので、飼料の量が現実的に維持され、動物の適切な成長に必要とされる栄養分の量が維持され、よって他の成分の添加が必要とされない。

他方、本発明のプレミックスが投与される場合、コントロールと比較して転換指数（conversion index ）が維持されることが関連している。コントロール群と有意に等しい転換指数の値は、良好な転換（動物に投与された食物が肉／卵に転換される）の指標である。有意に高い異なった値は、不適切な転換（所望量の肉／卵を達成するために多量の食物が動物に投与されなければならない）の指標である。以下に例証されるように（表１、行Ｔ−３）、ＷＯ０３１０１２１９に記載されたプレミックスは、コントロール群の転換指数とは有意に異なる転換指数を有している。有利には、本発明のプレミックスを投与した場合（表２、行Ｔ−２及びＴ−３）、コントロール群と有意な差はない。

よって、第一の態様では、本発明は、（ａ）１０％から１００％の範囲からなるマンノース含有量のポリマー又はポリマー混合物と；（ｂ）β−マンナナーゼ酵素と；（ｃ）抗結合剤とを含有し、抗結合剤が、２０％より高い吸収能と、０．１０から２．７０ｇ／ｃｍ^３の範囲からなる嵩密度を有する、家畜飼養のためのプレミックスに関する。
驚いたことに、セピオライトの代わりに、そのような性質（つまり、吸収能と嵩密度）を有する抗結合剤を使用すると、コロニー形成阻害における効果を改善する。この改善は、（上で説明したような）同じ効果を達成するためにＷＯ０３１０１２１９において必要とされる量より少なくとも約５倍低い量での本発明のプレミックスの使用を可能にする。

理論に拘束されるものではないが、本発明の第一態様に係る抗結合剤を使用すると、酵素がプレミックス中で良好に拡散し、それがその基質（つまり、ポリマー）を加水分解しなければならないときに、より効果的であると思われる。
拡散の改善はまた得られる生成物（β−マンナナーゼによって加水分解されるポリマー）に影響を及ぼす。よって、得られる製品は、抗結合剤が存在するため、腸管中に良好に拡散し、細菌コロニー形成阻害におけるその効果を改善する。

第二態様では、本発明は、本発明の第一態様に係るプレミックスを含有する家畜飼養組成物に関する。
第三態様では、本発明は、動物腸管におけるグラム陰性細菌コロニー形成の阻害のための家畜飼養組成物の調製における、本発明の第一態様に係るプレミックスの使用に関する。この態様は、上述の本発明のプレミックスを投与することにより、グラム陰性細菌コロニー形成を被っているか又は被っていることが疑われる動物の治療方法として構成されうる。
動物腸管におけるグラム陰性細菌コロニー形成の阻害剤として使用される上述のプレミックスもまた本発明の一部である。

発明の詳細な記載
本発明では、「１０％から１００％の範囲からなるマンノース含有量のポリマー」なる表現は、専らマンノース単位からなるホモ多糖（つまり、マンノース１００％の含有量の多糖）及びマンノースと他の多糖、例えばグルコース、ガラクトース、α−ガラクトース誘導体、ガラクトマンナン、ガラクトサミン、フコース、及びアラビノースを含むヘテロ多糖を包含する。本発明に係るポリマーは、限定されないが、グアガム、キサンタンガム、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、カッシアガム、パーム核ミール、アルギン、カラギーナン、ローカストビーンガム、ローカストビーン種子、及びそれらの混合物を含む。
本発明の第一態様の一実施態様では、ポリマーは１０％から６０％の範囲からなるマンノース含有量を有する。
本発明において、「抗結合剤」なる用語は、β−マンナナーゼ活性から生じる化合物粒子間の接着を減少させ又は避ける任意の物質を包含する。

本発明の第一の態様の好ましい実施態様では、抗結合剤は、６０から７０％の範囲からなる吸収能と、０．１０から０．３０ｇ／ｃｍ^３の範囲からなる嵩密度を有する。
抗結合剤の吸収能は次のプロトコルを使用して決定される：
１．− スケールで５０ｍＬの容量フラスコの風袋重さを量る。
２．− 定量される５０ｇの抗結合剤を加える。
３．− メスシリンダーを用いて、脱イオン水を徐々に加え、抗結合剤によりその全体が吸収されるまで、ガラス棒を用いて撹拌する。
４．− 抗結合剤がそれ以上の液体を吸収できなくなるまでこの操作（ポイント３）を繰り返す。
５．− 該分析は２回実施されなければならない。
６．− 次の式を適用する：
吸収能＝[ｇ脱イオン水／ｇ脱イオン水＋ｇ抗結合剤]＊１００

抗結合剤の嵩密度は次のプロトコルを使用して決定される：
１．− 半化学天秤（０．０１ｇ精度）で５０ｍｌのメスシリンダーの風袋重さを量る。
２．− 抗結合剤と一致するまでメスシリンダーに充填する。不正確な結果を避けるためにメスシリンダーをたたかない。
３．− 充填したシリンダーの重さを量る。
４．− ２回定量する。
５．− 嵩密度＝重さ（ｇ）／５０ｍｌ＝ｇ／ｍｌ。（最終結果は両測定値の平均である）。

本発明のプレミックスが調製される場合、それは好ましくは均一な固形混合物として得られる。均一な固形混合物を得るためには、酵素は固形形態、例えば粉末でありうる。
酵素が固形形態であるという点は、その取り扱いを容易にし、腸管を通したその拡散を改善する。ＷＯ０３１０１２１９では、セピオライト添加剤が、最初は液体調製物の形態であった酵素を「固化」するためにビヒクルとして使用された。本発明では、上で指摘された性質を有する抗結合剤の使用が、腸管中への混合物の拡散を困難にし、よって細菌コロニー形成の阻害におけるその効果を悪化させる塊がプレミックス中に出現するのを防止する。

本発明の第一の態様の更に他の好ましい実施態様では、酵素の比は、ポリマー１グラム当たり５から４０の酵素活性単位からなる。酵素活性単位は、４０℃及びｐＨ＝４でイナゴマメガラクトマンナンから１分当たり１マイクロモルのマンノース（mannosa）を放出する酵素の量としてβ−マンナナーゼ酵素に対して決定される。
本発明の第一の態様の他の実施態様では、ポリマーは、グアガム、キサンタンガム、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、アルギン、カラギーナン、ローカストビーンガム、ローカストビーン種子、カッシアガム、パーム核ミール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。

本発明では、本発明のプレミックスに含有される「β−マンナナーゼ酵素」は天然又は合成由来でありうる。「合成由来」には、工学技術（例えば組換え）によって得られる酵素の任意の形態が包含される。
本発明の第一の態様の好ましい実施態様では、β−マンナナーゼ酵素は、国際生化学連合の命名法によれば、Ｅ．Ｃ．３．２．１．７８である。
本発明の第一の態様の他の好ましい実施態様では、抗結合剤の量は、プレミックスの全重量に対して０．５から４重量％の範囲からなる。

抗結合剤の例証的な非限定的例は、沈降及び乾燥ケイ酸（Ｅ５５１ａ）、コロイド状シリカ（Ｅ５５１ｂ）、バーミキュライト（Ｅ５６１）、Ｋｉｅｓｅｌｇｕｒ（Ｅ５５１ｃ）、合成ケイ酸カルシウム（Ｅ５５２）、合成ケイ酸ナトリウムアルミニウム（Ｅ５５４）、合成アルミン酸カルシウム（Ｅ５９８）、火山由来のクリノプチロライト（Ｅ５６７）である。「Ｅ」数、例えば「Ｅ５５１ａ」は、欧州連合で認可された付加数に対応する。本発明の第一態様の好ましい実施態様では、抗結合剤は、沈降及び乾燥ケイ酸（Ｅ５５１ａ）、コロイド状シリカ（Ｅ５５１ｂ）、及びバーミキュライト（Ｅ５６１）からなる群から選択される。

本発明の第二の態様の好ましい実施態様では、プレミックスは全組成物の０．０５から１．５重量％からなる。
明細書を通して説明したように、本発明のプレミックスは、グラム陰性細菌のコロニー形成の効果的な阻害に有用である。「グラム陰性細菌」なる用語には、限定されないが、線毛（fimbria）を呈する細菌、例えばとりわけ腸内細菌科が含まれる。本発明の第三態様の好ましい実施態様では、グラム陰性細菌はサルモネラである。

明細書と特許請求の範囲を通して、「含有する」なる語句及び語句の変形例、例えば「含有している」は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は工程を排除することを意図していない。
次の実施例は、例示のために提供されるもので、本発明を限定するものではない。

実施例１：動物用食餌に関する０．５重量％の割合での本発明に係るプレミックスの調製
餌１トン当たり、プレミックスを次のようにして調製する：
（ｉ）ローカストビーンガム： ４４８２．５ｇ
（ｉｉ）β−マンナナーゼ： ２１．５ｇ
（ｉｉｉ）ローカストビーン種子： ４４６ｇ
（ｉｖ）ケイ酸： ５０ｇ
この実験のプレミックスを得るには、（１）成分（ｉｖ）及び（ｉｉｉ）を最初の段階で混合しなければならない。第二段階で、（２）（ｉ）の１／３を（ｉｉ）の全部と混合しなければならない。均一なミックス後、（ｉ）の残りをこの最後のプレミックスに加える。最後に、（１）と（２）を均一に混合する。

実施例２：従来の様々な製品を補充した餌を２８日間消費するレグホーンニワトリでの試験
ＩＲＴＡの動物栄養学部の実験飼育場において、５動物／ケージの割合でニワトリをケージに配した。餌はすりつぶした形態のトウモロコシ−大豆ベースとした。プレミックスの配合は常にトウモロコシとの置換によった。
ニワトリに、ナリジクス酸で標識した腸内菌（サルモネラ・エンテリティディス）を投与した。製品の各一の配合の効果を、ニワトリの盲腸中のサルモネラの存在を決定することによって評価した。ニワトリには、一日齢で、それらが飼育場に到着したときに、２０μｇ／ｍｌのナリジクス酸と１２μｇ／ｍｌのＣｌＨｇに耐性のある株である腸内菌（Ｓ−２１４６／ｃ／０３ Ｔｎ ５^１２）を接種することによって投与した。株はバルセロナのＬ．Ｓ．Ａ．コレクションから得た。
２８日間の試験中、餌消費及び初期及び最終体重からの実験データを集めた。そのデータを用いて次のパラメータを計算した：毎日の体重増加（ＤＢＷＧ）（ｇ／ｄ）、毎日の餌摂取量（ＤＦＩ）（ｇ／ｄ）及び餌転換指数（ＦＣＩ）（毎日の餌摂取量／毎日の体重増加）。ａ，ｂ，ｃ：同じ欄の異なった文字は有意差を意味する。

ＷＯ０３０１０１２１９に記載されたプレミックスを使用して、感染の減少が達成される。しかし、転換指数はコントロールと比較して有意に高く、体重増加に減少が観察される。

実施例３：本発明のプレミックスを使用する実験結果
ＩＲＴＡの動物栄養学部の実験飼育場において５動物／ケージの割合で雌鶏をケージに配した。餌はすりつぶした形態のトウモロコシ−大豆ベースとした。実施例１において説明したように、プレミックスの配合は常にトウモロコシとの置換によった。
餌消費及び体重変化の各４週のデータを記録した。そのデータを用いて、餌転換指数（毎日の餌摂取量／毎日の体重増加）を計算した。結果を表２に示す。

治療の２７日目に、全ての雌鶏に腸内菌を経口投与した。使用した株は、過去の試験で最も侵襲的なものから選択したＧＮ８２５及びＧＮ１０６３の混合物であった。４週毎（各４週の期間の終わりに）の０．５％のコントロール及び新規物質での二通りの治療では、治療当たり８匹の動物を安楽死させ、卵巣及び盲腸をサルモネラの存在／不存在について検査した。腸内菌実験を修正ＩＳＯ規格に従って実施した。簡潔に述べると、組織試料を、２２５ｍｌの緩衝ペプトン水を含む滅菌プラスチック容器に集め、インキュベートし、半固形培地Rappaport-Vassiliadis中の３滴の濃縮前ブロスを加え、この培地をインキュベートした。推定のサルモネラ白色コロニーをＸＬＴ４寒天板に移し、サルモネラの存在／不存在を確認した。結果は表３に示す。

本発明に係るプレミックスを用いて得られた結果から、コントロール群と比較して転換指数が実質的に維持され、プレミックスが感染動物に投与された場合の体重変化は、コントロール群と比較したとき実際に維持される。

Claims (13)

1. （ａ）１０％から１００％の範囲からなるマンノース含有量のポリマー又はポリマー混合物と；
   （ｂ）β−マンナナーゼ酵素と；
   （ｃ）抗結合剤と
   を含有し、抗結合剤が、２０％より高い吸収能と、０．１０から２．７０ｇ／ｃｍ^３の範囲からなる嵩密度を有する、家畜飼養のためのプレミックス。
2. ポリマーが１０％から６０％の範囲からなるマンノース含有量を有する請求項１に記載のプレミックス。
3. 抗結合剤が、６０から７０％の範囲からなる吸収能と、０．１０から０．３０ｇ／ｃｍ^３からなる嵩密度を有する、請求項１から２の何れか一項に記載のプレミックス。
4. 均一な固形形態である請求項１から３の何れか一に記載のプレミックス。
5. 酵素の比が、ポリマー１グラム当たり５から４０の酵素活性単位からなる請求項１から４の何れか一に記載のプレミックス。
6. 抗結合剤の量がプレミックスの全重量に対して０．５から４重量％からなる請求項１から５の何れか一に記載のプレミックス。
7. ポリマーが、グアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、アラビアゴム、アルギン、カラギーナン、ローカストビーンガム、ローカストビーン種子、カッシアガム、パーム核ミール、及びそれらの混合物からなる群から選択される請求項１から６の何れか一項に記載のプレミックス。
8. β−マンナナーゼ酵素 が、国際生化学連合の命名法によるＥ．Ｃ．３．２．１．７８である請求項１から７の何れか一項に記載のプレミックス。
9. 抗結合剤が、ケイ酸、コロイド状シリカ、及びバーミキュライトからなる群から選択される請求項１から８の何れか一項に記載のプレミックス。
10. 請求項１から９の何れか一項に記載のプレミックスを含有する家畜飼養組成物。
11. 動物腸管におけるグラム陰性細菌コロニー形成の阻害剤として使用される請求項１から９の何れか一項に記載のプレミックス。
12. 動物腸管におけるグラム陰性細菌コロニー形成の阻害のための家畜飼養組成物の調製における請求項１から９の何れか一項に記載のプレミックスの使用。
13. グラム陰性細菌がサルモネラ属菌である請求項１２に記載のプレミックス。