JP2011515091A - 異常型ミトコンドリアdna、関連融合転写物およびそのハイブリダイゼーションプローブ - Google Patents
異常型ミトコンドリアdna、関連融合転写物およびそのハイブリダイゼーションプローブ Download PDFInfo
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Abstract
Description
ミトコンドリアゲノムは、核酸の小規模ではあるが重要な配列である。ミトコンドリアDNAまたは「mtDNA」は、33億bpという莫大な核ゲノム(ハプロイド)と対比して、16,569核酸塩基対(bp)(Anderson et al., 1981;Andrews et al., 1999)の小ゲノムを含む。その遺伝子補体は、その核細胞メイトより実質的に小さい(0.0005%)。しかしながら、個々の細胞は、特定の細胞機能によって、およそ103〜104個のミトコンドリアを保有する(Singh and Modica-Napolitano 2002)。情報伝達または化学的シグナル伝達は、一般的に、核およびミトコンドリアゲノム間で起こる(Sherratt et al., 1997)。さらに、特定の核構成成分がミトコンドリア配列の維持および安定性に関与する(Croteau et al., 1999)。一旦受精が起きると、卵細胞内のミトコンドリアのクローン拡大のため、所定の個体におけるmtDNAゲノムは全て同一である。しかしながら、突然変異誘発性事象は、体細胞突然変異として反映される配列多様性を誘導し得る。これらの突然変異は、異形成として知られている状態で身体全体の異なる組織中に蓄積し得る。
約3,000個の核遺伝子がミトコンドリアを構築し、操作し、維持するために必要とされるが、ミトコンドリアゲノムによりコードされるのはこれらのうちの37個のみであって、このことは、ミトコンドリアが核遺伝子座に重度に依存していることを示す。ミトコンドリアゲノムは、正しい翻訳を保証する、2つのrRNAと22のtRNAを含めた24の遺伝子の補体、ならびに電子伝達に不可欠である残り13の遺伝子をコードする(図1参照)。ミトコンドリアゲノムは、ミトコンドリアゲノムにより供給される13のポリペプチドのほかに、この生命機能に必要な酸化および還元反応を成し遂げるために70の核コード化タンパク質に依存する。核およびミトコンドリアタンパク質はともに、ミトコンドリア内膜を及ぶ複合体を形成し、細胞代謝に必要とされる化学燃料であるアデノシン三リン酸またはATPの80〜90%を集合的に生成する。エネルギー産生のほかに、ミトコンドリアは、同様に他の代謝経路においても中心的役割を果たす。ミトコンドリアの重要な機能は、細胞死またはアポトーシスの媒介である(Green and Kroemer, 2005参照)。本質的に、ミトコンドリア外膜を、あるいはさらに、同様にミトコンドリア内膜を透過するシグナル経路が存在する。特定のミトコンドリアタンパク質が細胞基質に放出される場合、不可逆的細胞死が始動される。この工程は、いくつかのミトコンドリアタンパク質が有する多機能的役割を強調する。これらのマルチタスク型タンパク質は、同様に、代替的機能を有し得る他のミトコンドリアタンパク質が存在する、ということを示唆する。
ミトコンドリアゲノムは、それが環状の無イントロンDNA分子であるという点で異常型である。ゲノムは、特定長の配列と側面を接する反復モチーフが点在する。これらの反復間の配列は、十分に理解されていない状況下で欠失しがちである。ミトコンドリアゲノム中の反復の数を考えると、多数の考え得る欠失が存在する。最も良く知られた例は、4977の「共通欠失」である。この欠失は、いくつかの名を挙げられた症状および疾患と関連付けられてきており、老化に伴い頻度を増大すると考えられる(Dai et al., 2004;Ro et al., 2003;Barron et al., 2001;Lewis et al., 2000;Muller-Hocker, 1998;Porteous et al., 1998)(図4)。ミトコンドリアゲノムの分野における最新の見解は、ミトコンドリア欠失が、活性酸素種およびUVRのような作用物質によるミトコンドリアゲノムに対する損傷の単なる有害副産物である、というものである(Krishnan et al 2008, Nature Genetics)。さらに、高レベルのmtDNA欠失は、細胞呼吸に必要な遺伝子配列を失う結果として、ATPの形態でエネルギーを産生する細胞の能力に重篤な結果を及ぼし得ると認識されているが、しかし、これらの欠失ミトコンドリア分子が下流経路の一構成成分であり、意図された機能的役割を有し、そしておそらくは出願人により予測されてきたようにミトコンドリアの認識遺伝子の代替的天然形態としてより適切である、とは予測されない。
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
上記で考察したように、ミトコンドリア融合転写物は、大豆(Morgens et al 1984)、および稀な神経筋障害に罹患しているヒト(Nakase et al 1990)で、報告されている。しかしながら、ヒト癌と関連した融合転写物は記載されていない。
ミトコンドリアDNA(mtDNA)動力学は、重要な診断ツールである。mtDNAにおける突然変異は、しばしば、疾患発症の予備的指標であり、疾患開始に関連した危険因子を示すバイオマーカーとして振舞う。本発明によれば、ミトコンドリアゲノムにおける大規模再配列突然変異は、癌に関連した融合転写物の生成を生じる。したがって、このような転写物をコードするmtDNAならびに癌の検出、診断およびモニタリングのためにそれに向けられるプローブの使用が提供される。
本発明による突然変異体mtDNA配列は、融合転写物の生成を引き起こす任意の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、挿入、転座、欠失、重複、組換え、再配列またはその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。修飾または変化はわずか2〜3塩基から数キロ塩基までサイズを大きく変え得るし、好ましくは修飾は、かなり多くの欠失またはその他の大規模ゲノム異常を生じる。
FUS10744:14124(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L(ND4L)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号3)
FUS7974:15496(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号4)
FUS7992:15730(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号5)
FUS8210:15339(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号6)
FUS8828:14896(ATPシンターゼF0サブユニット6(ATPアーゼ6)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号7)
FUS10665:14856(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L(ND4L)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号8)
FUS6075:13799(シトクロムcオキシダーゼサブユニットI(COI)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号9)
FUS6325:13989(シトクロムcオキシダーゼサブユニットI(COI)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号10)
FUS7438:13476(シトクロムcオキシダーゼサブユニットI(COI)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号11)
FUS7775:13532(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号12)
FUS8213:13991(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号13)
FUS9191:12909(ATPシンターゼF0サブユニット6(ATPアーゼ6)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号14)
FUS9574:12972(シトクロムcオキシダーゼサブユニットIII(COIII)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号15)
FUS10367:12829(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット3(ND3)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号16)
FUS8469:13447(ATPシンターゼF0サブユニット8〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット)(配列番号17)
FUS9144:13816(ATPシンターゼF0サブユニット6(ATPアーゼ6)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号51)。
配列番号2(FUS8469:13447;AltMet)
配列番号3(FUS10744:14124)
配列番号4(FUS7974:15496)
配列番号5(FUS7992:15730)
配列番号6(FUS8210:15339)
配列番号7(FUS8828:14896)
配列番号8(FUS10665:14856)
配列番号9(FUS6075:13799)
配列番号10(FUS6325:13989)
配列番号11(FUS7438:13476)
配列番号12(FUS7775:13532)
配列番号13(FUS8213:13991)
配列番号14(FUS9191:12909)
配列番号15(FUS9574:12972)
配列番号16(FUS10367:12829)
配列番号17(FUS8469:13447;OrigMet)
配列番号51(FUS9144:13816)、ならびに
その断片または変異体。
本発明の別の態様は、本発明の異常型mtDNA配列を認識し得るハイブリダイゼーションプローブを提供することである。本明細書中で用いる場合、「プローブ」という用語は、標的領域中の配列とプローブ中の少なくとも1つの配列の相補性のため、標的核酸中の配列と二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、当該技術分野で既知の方法に従って標識され得る。
生物学的試料中の異常型mtDNAのレベルの測定は、被験者における1つ以上の癌の存在を確定し得る。したがって、本発明は、癌を予測し、診断し、またはモニタリングするための方法であって、1つ以上の生物学的試料を得ること、試料からmtDNAを抽出すること、ならびに以下の:試料中の1つ以上の異常型mtDNAの量を定量し、そして検出された量を参照値と比較することにより異常型mtDNAに関して試料を検定することからなる方法を包含する。当業者に理解されるように、参照値は、癌を予測し、診断し、またはモニタリングしようとするかに基づいている。したがって、参照値は、1つ以上の既知の非癌性生物学的試料から、1つ以上の既知の癌性生物学的試料から、および/または長期間に亘って採取された1つ以上の生物学的試料から収集されたmtDNAデータと関連し得る。
a)少なくとも1つのプローブを相補的異常型ミトコンドリアDNA配列とハイブリダイズさせるためにプローブのうちの少なくとも1つを用いてハイブリダイゼーション反応を実行するステップ;
b)少なくとも1つのプローブとハイブリダイズされるミトコンドリアDNAの量を定量することにより、試料中の少なくとも1つの異常型ミトコンドリアDNA配列の量を定量するステップ;そして
c)試料中のミトコンドリアDNAの量を少なくとも1つの既知の参照値と比較するステップ
を包含する方法を提供する。
本発明はさらに、癌を予測し、診断し、および/またはモニタリングするための方法に有用な融合転写物および関連ハイブリダイゼーションプローブの同定を提供する。このような分子は、天然転写物の単離により、あるいは、本発明の方法に従って単離されるmtDNAの組換え発現により得られる、と当業者は理解する。上記のように、このようなmtDNAは、典型的には、第一遺伝子からの開始コドンおよび第二遺伝子の終止コドンを有するスプライス化遺伝子を含む。したがって、それらから得られる融合転写物は、スプライス化遺伝子に関連した接合点を含む。
天然融合転写物は、生物学的試料から抽出され、当該技術分野で既知の任意の適切な方法に従って同定され得るし、あるいは実施例に記載される方法に従って実行され得る。本発明の一実施形態では、ポリ−A尾部を有する転写物を標的にするオリゴ(dT)プライマーを用いて、その後、標的転写物に対して意図されたプライマー対を用いたRT−PCRにより、安定ポリアデニル化融合転写物が同定される。
配列番号19(転写物2;10744:14124)
配列番号20(転写物3;7974:15496)
配列番号21(転写物4;7992:15730)
配列番号22(転写物5;8210:15339)
配列番号23(転写物6;8828:14896)
配列番号24(転写物7;10665:14856)
配列番号25(転写物8;6075:13799)
配列番号26(転写物9;6325:13989)
配列番号27(転写物10;7438:13476)
配列番号28(転写物11;7775:13532)
配列番号29(転写物12;8213:13991)
配列番号30(転写物14;9191:12909)
配列番号31(転写物15;9574:12972)
配列番号32(転写物16;10367:12829)
配列番号33(転写物20;8469:13447;OrigMet)
配列番号50(転写物13;9144:13816)。
配列番号35(転写物2)
配列番号36(転写物3)
配列番号37(転写物4)
配列番号38(転写物5)
配列番号39(転写物6)
配列番号40(転写物7)
配列番号41(転写物8)
配列番号42(転写物9)
配列番号43(転写物10)
配列番号44(転写物11)
配列番号45(転写物12)
配列番号46(転写物14)
配列番号47(転写物15)
配列番号48(転写物16)
配列番号49(転写物20)
配列番号52(転写物13)
融合転写物が一旦特性化されれば、生物学的試料中の転写物を標的にするよう、プライマーまたはプローブが開発され得る。このようなプライマーおよびプローブは、(じょうきのような)任意の既知の方法を用いて、または以下で提供される実施例に記述されるように、調製され得る。プローブは、例えば、融合転写物のために、そして試料中の転写物の存在を検出するために用いられる検出技法、例えばPanomics(商標)によるQuantiGene2.0(商標)のために生成され得る。プライマーおよびプローブは、本発明の例示的融合転写物に対して直接的に、あるいはその断片または変異体に対して生成され得る。例えば、配列番号18〜33および50で記述される配列、ならびに表1に開示される配列は、当該融合配列を含む核酸配列を検出するプローブを設計するために用いられ得る。
生物学的試料中のミトコンドリア融合転写物のレベルの測定は、被験者における1つ以上の癌の存在を確定し得る。したがって、本発明は、癌を予測し、診断し、またはモニタリングするための方法であって、1つ以上の生物学的試料を得ること、試料からミトコンドリアDNAを抽出すること、ならびに以下の:試料中の1つ以上の融合転写物の量を定量し、そして検出された量を参照値と比較することにより融合転写物に関して試料を検定することからなる方法を提供する。当業者に理解されるように、参照値は、癌を予測し、診断し、またはモニタリングしようとするかに基づいている。したがって、参照値は、1つ以上の既知の非癌性生物学的試料から、1つ以上の既知の癌性生物学的試料から、および/または長期間に亘って採取された1つ以上の生物学的試料から収集された転写物データと関連し得る。
a)少なくとも1つのプローブを相補的異常型ミトコンドリア融合転写物とハイブリダイズさせるために上記プローブのうちの少なくとも1つを用いてハイブリダイゼーション反応を実行するステップ;
b)少なくとも1つのプローブとハイブリダイズされる転写物の量を定量することにより、試料中の少なくとも1つのミトコンドリア融合転写物の量を定量するステップ;そして
c)試料中のミトコンドリア融合転写物の量を少なくとも1つの既知の参照値と比較するステップ
を包含する方法を提供する。
特定の疾患を診断士、または特定のミトコンドリア突然変異を同定するための方法およびスクリーニングツールも、本明細書中で意図される。ハイブリダイゼーションの任意の既知の方法は、プローブ/プライマーベースの技法、例えばシングルプレックスおよびマルチプレックスの両方の分枝DNAおよびqPCR(これらに限定されない)を含めたこのような方法を実行するために用いられ得る。野生型または突然変異化領域をマッチングするオリゴヌクレオチドプローブ、および対照プローブを有するアレイ技法も、用いられ得る。市販のアレイ、例えばマイクロアレイまたは遺伝子チップが適している。これらのアレイは、スライドまたはマイクロチップ上のプローブの数千のマッチドおよび対照ペアを胃含有し、非常に迅速に全ゲノムをシーケンシングし得る。ゲノムおよびDNA配列解析におけるマイクロアレイの使用を記載する再検討論文は、オンラインで入手可能である。
本発明の方法はさらに、1つ以上の検定の結果に基づいたモニタリングレジメまたは療法コースを推奨する工程を包含し得る。これにより、個別化医療、例えば、患者の癌の進行をモニタリングすることによる(例えば初期またはその後の突然変異がいつ起きたかを認識することによる)癌療法、あるいは治療(例えば、突然変異が安定化された時を認識することによる)を臨床医が実施できるようになる。
本発明は、1つ以上の生物学的試料を獲得するかまたは収集することを含む診断的試験を提供する。本発明の状況において、「生物学的試料」は、mtDNAおよびmtRNAが獲得され得る細胞を含有する組織または体液を指す。例えば、生物学的試料は、皮膚、肺、乳房、前立腺、神経、筋肉、心臓、胃、結腸、直腸組織等(これらに限定されない)を含めた組織から、あるいは血液、唾液、脳脊髄液、痰、尿、粘液、滑液、腹水、羊水等から得られる。生物学的試料は、癌性または非癌性組織から得られ、外科検体または生検検体(これらに限定されない)であり得る。
本発明は、臨床環境において癌を検出するための診断/スクリーニングキットを提供する。このようなキットは、1つ以上の試料採取手段を、本発明による1つ以上のプローブと組合せて包含し得る。
ミトコンドリア4977「共通欠失」、ならびにPCT出願番号PCT/CA2007/001711(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)で本出願人により以前に同定された3.4kb欠失は、前立腺組織においてオリゴ−dT選択により同定されるような活性転写物を有する独特のオープンリーディングフレームを生じる(図2および3)。乳房組織試料の検査も、3.4kb欠失に起因する安定なポリアデニル化融合転写物の存在を明示する(図4)。
(RNA単離cDNA合成)
メーカーの使用説明書に従って、Aurum(商標)総RNA脂肪および繊維組織キット(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて、急速凍結前立腺および乳房組織試料(腫瘍に隣接する悪性および正常組織の両方)から総RNAを単離した。この実験では、ゲノムDNA夾雑は回避されるべきものであったため、当該技術分野で一般に知られているような方法を用いて、DNアーゼ処理段階を包含した。ND−1000分光光度計(NanoDrop(登録商標) technologies)で、RNAの量および質を確定した。約100gの出発物質から、総RNA濃度は、1.89〜2.10の260/280比で100から1000ng/μLまで変化した。RNA濃度を100ng/μLに調整し、メーカーの使用説明書に従って、RT−PCR用のSuperScript(商標)一次鎖合成系(Invitrogen)での一次鎖DNA合成のために、各鋳型2μLを用いた。安定ポリアデニル化融合転写物を同定するために、ポリ−A尾部を有する転写物を標的にするオリゴ(dT)プライマーを用いた。
DNAエンジンOpticon(登録商標)2連続蛍光検出系(Bio-Rad, Hercules, CA)上でのiQ(商標)SYBR(登録商標)Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA)で5μLの各cDNA鋳型を用いて、実時間PCRを実施した。4977bp欠失をターゲッティングするプライマー対は:8416F 5'−CCTTACACTATTCCTCATCAC−3'、13637R 5'−TGACCTGTTAGGGTGAGAAG−3'であり、ならびに3.4kb欠失に関するものは:ND4LF 5’−TCGCTCACACCTCATATCCTC−3’、ND5R 5’−TGTGATTAGGAGTAGGGTTAGG−3’である。反応カクテルは、以下のものを含む:2×SYBR(登録商標)Green Supermix(100mMのKCl、40mMのトリス−HCl、pH8.4、0.4mMの各dNTP[dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP])、iTaq(商標)DNAポリメラーゼ、50単位/ml、6mMのMgCl2、SYBR(登録商標)Green1、20nMのフルオロセインおよび安定剤)、250nMの各プライマー、およびddH2O。PCRサイクルパラメーターを以下に示す:(1)95℃、2分間、(2)95℃、30秒間、(3)55℃(4977bp欠失に関して)および63℃(3.4kb欠失に関して)、30秒間(4)72℃、45秒間、(5)プレート読取、その後、工程3〜5を39サイクル、そして4℃で最終インキュベーション。サイクル閾値および融解曲線分析のほかに、増幅産物の具体的可視化のためにアガロースゲル上で試料を移動させた(図2〜4参照)。
3.4kb欠失のような突然変異化ミトコンドリアゲノムに起因する新規の転写物の存在を検出し、さらに実証するために、種々のハイブリダイゼーションプローブを設計した。この目的のために、定量的遺伝子発現解析用のシングルプレックス分枝DNAプラットホーム(QuantiGene 2.0(商標)、Panomics(商標))を利用した。この実施例で列挙した特定の欠失および配列は、配列番号1で列挙される全mtDNAゲノムに関するそれらの相対的位置に基づいている。本実施例においてプローブが設計された4つの転写物の核酸配列は、本明細書中で以下のように同定される:転写物1(配列番号18)、転写物2(配列番号19)、転写物3(配列番号20)および転写物4(配列番号21)。
上記の4つの融合転写物、すなわち転写物1〜4を用いて、一患者からの2つの前立腺組織試料を分析して、新規の予測融合転写物の定量的差を査定した。実験結果を、以下の表2に示すが、この場合、「Homog 1」は、一患者からの凍結前立腺腫瘍組織のホモジネートを指し、「Homog 2」は、その患者の当該腫瘍に隣接する凍結正常前立腺組織のホモジネートを指す。これらの試料を、25.8mgのHomog 1および28.9mgのHomog 2で出発して、メーカーのプロトコール(QuantiGene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantiGene(登録商標)2.0 Reagent System User Manual)に従って処理した(表5aおよび5bに検定設定を示す)。
実施例3と同一プロトコールを用いて、しかし3.4kb mtゲノム欠失に関連した新規の融合転写物である転写物2のみに集中して、乳房腫瘍の2つの試料およびその腫瘍に隣接する無腫瘍組織の2つの試料、ならびに前立腺腫瘍組織の3つの試料(1試料は隣接無腫瘍組織を含む)に関して、分析を実行した。本実施例に関する結果を、表4に示す。対応する正常組織切片を有する前立腺腫瘍組織は、腫瘍組織が、正常隣接組織の約2倍の量の融合転写物を有するという点で、実施例3で分析した前立腺試料と同様のパターンを実証した。乳房腫瘍試料は、隣接非腫瘍組織と比較した場合、融合転写物レベルの顕著な増大を実証した。実施例3で言及した実験において最も再現可能的に実施されるので、ホモジネートの1:100希釈液をこの分析のために用いた。
この試験は、結腸直腸癌を検出するに際しての本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。9例の対照(良性)組織試料(試料1〜9)および10例の腫瘍(悪性)組織試料(試料10〜19)を含む合計19の試料を調製した。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(QuantiGene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantiGene(登録商標)2.0 Reagent System User Manual)。7つの標的転写物および1つのハウスキーピング転写物を、前記実施例に上記したような方法で調製した。転写物の特質を、以下のように要約する:
a)三重反復検定に関するCV(変動係数)を確定する;≦15%である場合は、許容可能である。
上記分析の結果を図6a〜6g(試料番号に対するlog2aRLU−log2hRLUのプロットを含む)に示す。各転写物に関する結果から確定されるそれぞれのROC(受信者動作特性)曲線も示す。
上記の結果は、結腸直腸癌の検出、ならびに正常結腸直腸組織から悪性組織を区別するに際しての、転写物2、3、8、9、10、11および12の有用性を例証する。上記のように、転写物2および3は、前立腺癌の検出において有用性があることも見出された。転写物2は、乳癌の検出において有用性があることも判明した。転写物11は、黒色腫皮膚癌の検出において有用性があることも判明した。転写物8は、肺癌の検出において有用性があることも見出された。列挙したいくつかの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における結腸直腸癌の特性化の検出のためのツールとして用いられ得る。
この試験は、肺癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。実施例5の場合と同様に、9例の対照(良性)組織試料(試料1〜9)および10例の腫瘍(悪性)組織試料(試料10〜19)を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(QuantiGene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantiGene(登録商標)2.0 Reagent System User Manual)。ホモジネートを1:8に希釈し、4つの標的転写物および1つのハウスキーピング転写物の量を、Glomax(商標)多重検出系(Promega)で、相対的発光強度単位(RLU)で測定した。全試料を、各転写物に関して三重反復試験で検定した。バックグラウンド測定(無鋳型)を、同様に三重反復試験で実行した。
転写物6:正常(良性)および悪性群(p=0.06)の平均(p<0.1)間に統計学的有意差が存在する。ROC曲線により実証されるような−6.5691のカットオフ値の使用は、80%の感受性および71%の特異性を生じ、曲線下面積は0.77であるが、これは、適正な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。
実施例6からの結果は、肺癌腫瘍の検出における本発明の転写物6、8、10および20の有用性、ならびに悪性および正常肺組織間の区別を例証する。これら3つの転写物のいずれかを、臨床設定における肺癌の検出または特性化のために用い得る。
この試験は、黒色腫の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。この試験では、5例の対照(良性)組織試料および9例の悪性組織試料を含む合計14の試料を用いた。全試料をホルマリン固定し、パラフィン包埋した(FFPE)。FFPE組織試料を切片にして試験管に入れ、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(Quantigene(登録商標)2.0 Sample Processing Kit for FFPE Samples;およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual)。ホモジネートを1:4に希釈し、7つの標的転写物および1つのハウスキーピング転写物の量を、Glomax(商標)多重検出系(Promega)で、相対的発光強度単位(RLU)で測定した。全試料を、各転写物に関して三重反復試験で検定した。バックグラウンド測定(無鋳型)を、同様に三重反復試験で実行した。
転写物6:正常および悪性群(p=0.01)の平均(p≦0.01)間に統計学的有意差が存在する。さらに、ROC曲線により実証されるような−5.9531のカットオフ値の使用は、89%の感受性および80%の特異性を生じ、曲線下面積は0.96であるが、これは、非常に良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。
実施例7からの結果は、悪性黒色腫の検出における本発明の転写物6、10、11、14、15、16および20の有用性を例証する。上記のように、転写物10および11は、結腸直腸癌を検出するのに有用性を有することも判明したが、一方、転写物6は肺癌の検出において有用性がある。疾患による転写物概要を、表6に示す。
この試験は、卵巣癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。10例の対照(良性)組織試料(試料1〜10)および10例の腫瘍(悪性)組織試料(試料11〜20)を含む合計20の試料を調製した。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(Quantigene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual)。8つの標的転写物および1つのハウスキーピング転写物を、前記の実施例で略記したように調製した。
a)三重反復検定に関するCV(変動係数)を確定する;≦15%である場合は、許容可能である。
上記分析の結果を図9a〜9h(試料番号に対するlog2aRLU−log2hRLUのプロットを含む)に示す。各転写物に関する結果から確定されるそれぞれのROC(受信者動作特性)曲線も示す。
上記の結果は、卵巣癌の検出における、ならびに正常卵巣組織から悪性組織を区別するに際しての、転写物1、2、3、6、11、12、15および20の有用性を例証する。転写物1、2および3は、前立腺癌の検出において有用性があることも見出された。転写物6は、黒色腫および肺癌の検出において有用性があることも判明した。転写物11は、黒色腫皮膚癌、結腸直腸癌および精巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物12は、結腸直腸癌および精巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物15は、黒色腫および精巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物20は、結腸直腸癌、黒色腫および精巣癌の検出において有用性があることも見出された。列挙した8つの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における卵巣癌の検出または特性化のためのツールとして用いられ得る。
この試験は、精巣癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。8例の対照(良性)組織試料(試料1〜8)および9例の腫瘍(悪性)組織試料(試料9〜17)を含む合計17の試料を調製した。悪性試料のうちの5例は非精上皮腫(試料9〜13)であり、4例は精上皮腫(試料14〜17)であった。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(Quantigene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual)。10の標的転写物および1つのハウスキーピング転写物を、前記の実施例で略記したように調製した。
a)三重反復検定に関するCV(変動係数)を確定する;≦15%である場合は、許容可能である。
上記分析の結果を図10〜18(試料番号に対するlog2aRLU−log2hRLUのプロットを含む)に示す。各転写物に関する結果から確定されるそれぞれのROC(受信者動作特性)曲線も示す。
上記の結果は、精巣癌および亜型精巣癌の検出における、ならびに正常精巣組織から悪性組織を区別するに際しての、転写物2、3、4、11、12、13、15、16および20の有用性を例証する。転写物2は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物3は、前立腺癌、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物4は、前立腺癌および結腸直腸癌における有用性を有することも見出された。転写物11は、結腸直腸癌、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物12は、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物15は、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物16は、黒色腫皮膚癌の検出において有用性があることも判明した。転写物20は、結腸直腸癌、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。列挙した9つの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における精巣癌の検出または特性化のためのツールとして用いられ得る。
特に以下の参考文献を、前記の説明中で引用した。これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される。
−バックグラウンドG1、H1
−空のウエルG2〜G8、H2〜H8
Claims (23)
- 癌に関連した単離ミトコンドリア融合転写物。
- 挿入、転座、欠失、重複、組換え、再配列またはその組合せを含む請求項1記載のミトコンドリア融合転写物。
- 欠失を含む請求項2記載のミトコンドリア融合転写物。
- 配列番号18〜33または50のいずれか1つに記載の記配列を有する請求項3記載のミトコンドリア融合転写物。
- 配列番号18〜21、23、25〜33または50のいずれか1つに記載の配列を有する請求項3記載のミトコンドリア融合転写物。
- 表1に示される欠失配列の発現RNA転写物を含む請求項3記載のミトコンドリア融合転写物。
- 配列番号34〜49および52のいずれか1つに記載の配列を有する請求項4記載のミトコンドリア融合転写物。
- 請求項1記載のミトコンドリア融合転写物をコードする単離ミトコンドリアDNA(mtDNA)。
- 配列番号2〜17または51のいずれか1つに記載の配列を有する請求項8記載の単離mtDNA。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のミトコンドリア融合転写物または請求項8もしくは9記載のmtDNAの少なくとも一部と相補的な核酸配列を有するハイブリダイゼーションプローブ。
- 哺乳類における癌の検出方法であって、
請求項1〜6のいずれか一項に記載のミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補的である核酸配列を有する少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブによって、哺乳類からの組織試料をハイブリダイズすることにより、癌に関連した少なくとも1つのミトコンドリア融合転写物の存在に関して前記試料を検定するステップを包含する方法。 - 哺乳類における癌の検出方法であって、請求項7または8記載のmtDNAの少なくとも一部と相補的である核酸配列を有する少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブによって、哺乳類からの組織試料をハイブリダイズすることにより、癌に関連した少なくとも1つの異常型mtDNAの存在に関して前記試料を検定する工程を包含する方法。
- 前記癌が、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫皮膚癌およびその組合せからなる群から選択される請求項11または12記載の方法。
- 前記検定が、以下の:
a)前記少なくとも1つのプローブを相補的ミトコンドリア融合転写物またはmtDNAとハイブリダイズさせるために前記プローブのうちの少なくとも1つを用いてハイブリダイゼーション反応を実行するステップ;
b)前記少なくとも1つのプローブとハイブリダイズされる前記転写物またはmtDNAの量を定量することにより、前記試料中の少なくとも1つのミトコンドリア融合転写物またはmtDNAの量を定量するステップ;および
c)前記試料中のミトコンドリア融合転写物またはmtDNAの量を少なくとも1つの既知の参照値と比較するステップ
を包含する請求項13記載の方法。 - 前記検定が診断的画像技法を用いて実行される請求項14記載の方法。
- 前記診断的画像技法が高処理量マイクロアレイ分析を含む請求項15記載の方法。
- 前記検定が分枝DNA技法を用いて実行される請求項14記載の方法。
- 前記検定がPCRを用いて実行される請求項14記載の方法。
- 哺乳類における癌の存在を検出するための検定の実行用キットであって、
請求項1〜6のいずれか一項に記載のミトコンドリア融合転写物または請求項8もしくは9記載のmtDNAの少なくとも一部と相補的である少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブを含むキット。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の10’s、100’sまたは1000’sのミトコンドリア融合転写物を有するマイクロアレイからなる、癌に関連したものを同定するためのスクリーニングツール。
- 請求項8または9記載の10’s、100’sまたは1000’sのミトコンドリアDNAを有するマイクロアレイからなる、癌に関連したものを同定するためのスクリーニングツール。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の10’s、100’sまたは1000’sのミトコンドリア融合転写物を有する多重分枝DNA検定からなる癌に関連したものを同定するためのスクリーニングツール。
- 請求項8または9記載の10’s、100’sまたは1000’sのミトコンドリアDNAを有する多重分枝DNA検定からなる癌に関連したものを同定するためのスクリーニングツール。
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