CN117384269A - 短肽mfrlp及其在制备动脉重塑相关疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种短肽MFRLP及其在制备动脉重塑相关疾病药物中的应用；具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的短肽，所述短肽MFRLP定位于线粒体，与MT‑CYTB结合，可抑制VSMC表型由收缩表型向合成表型转换，同时，可通过调节线粒体氧化磷酸化能力来影响VSMC表型转换。所述短肽可用于制备与动脉重塑相关疾病治疗的药物或促进线粒体氧化磷酸化能力的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种短肽MFRLP及其在制备动脉重塑相关疾病药物中的应用。
背景技术
心血管疾病高居全球非感染性致死疾病的首位，而其中92％的致死性心血管疾病与动脉重塑相关。动脉重塑是指动脉血管应对各种因素的刺激，通过改变自身的结构和功能来适应局部环境，表现为管壁增厚、管壁管腔比值增加，血管弹性降低及血管硬化等。动脉重塑是心脑血管疾病的病理基础之一，并且是心血管病死亡率的独立危险因素，如冠状动脉发生动脉重塑导致冠心病、支架再狭窄；脑血管发生动脉重塑导致缺血性卒中；主动脉发生动脉重塑导致动脉瘤、夹层；阻力血管出现动脉重塑则参与高血压的发生发展。
动脉血管作为高血压的直接靶器官，在压力、炎症等刺激作用下发生结构和功能的改变，最终出现病理性动脉重塑。目前临床上主要通过降压、降脂等来控制动脉重塑，ACEI类、ARB类及β受体阻滞剂类药物虽然能够起到一定的抑制作用，但是，临床血压、血脂控制达标率低，顽固性高血压患者即使使用三种或三种以上降压药物也无法达到正常血压，重塑的动脉也无法得到有效缓解，缺乏针对动脉重塑治疗的有效手段，因此明确动脉重塑的发病机制，寻找有效的治疗靶点和药物具有迫切的临床需求。
发明内容
基于此，为解决现有技术中存在的至少一种技术问题，本发明提出一种短肽MFRLP及其在制备动脉重塑相关疾病药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种短肽MFRLP，所述短肽MFRLP为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的短肽；
A2)将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且具有与抑制线粒体自噬制VSMC表型转换和/或调节线粒体氧化磷酸化能力的短肽；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接蛋白标签得到的融合短肽；
A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的短肽衍生物。
上述短肽中，序列1(SEQ ID No.1)和序列2(SEQ ID No.2)均由64个氨基酸残基组成。
SEQ ID NO：1氨基酸序列为：
N端
-MAYPFQLGLQDATSPIIEELINFHDHTLIIVFLISSLVLYIISLILTTKLTHTSTIDAQEVETI-C端，所述序列为鼠源短肽MFRLP。
SEQ ID NO：2氨基酸序列为：
N端
-MAHAAQVGLQDATSPIIEELITFHDHALIIIFLICFLVLYALFLTLTTKLTNTNISDAQEIETV-C端，所述序列为人源短肽MFRLP。
上述短肽中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述短肽中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述短肽MFRLP可以是人工合成的短肽，也可以是利用基因工程手段在体外表达获得的短肽。
本发明所述短肽的一个或多个氨基酸可以用构象为D-型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性。其中D-型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸、高丝氨酸等。
A4)所述修饰可为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰。
上述短肽衍生物为下述任一项：
C1)上述的多肽的氨基端连接氨基端保护基和/或上述的多肽的羧基端连接羧基端保护基得到的连接物；
C2)上述的多肽的羧基端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；
C3)上述的多肽的氨基端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；
C4)上述的多肽的氨基端和羧基端均连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物。
本发明的第二方面，提供一种lncRNA MFRL核酸分子，其编码上述的短肽MFRLP。
本发明的第三方面，提供一种载体，包括上述的lncRNA MFRL核酸分子。所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明的第四方面，提供一种细胞，包含所述的载体、或其基因组中整合有上述的lncRNA MFRL核酸分子或表达如上述的短肽。
本发明的第五方面，提供一种药物组合物，包括上述的短肽MFRLP，以及药学上可接受的载体或赋形剂。所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
本发明的第六方面是提供上述的短肽MFRLP、核酸分子、载体、细胞、药物组合物在制备动脉重塑相关疾病药物中的应用。
本发明的第七方面是提供上述的短肽MFRLP、核酸分子、载体、细胞、药物组合物在制备促进线粒体氧化磷酸化能力的药物中的应用。
进一步地，所述药物通过口服、皮下、静脉、鼻内、经皮给药。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的短肽MFRLP定位于线粒体，与线粒体细胞色素b(MT-CYTB)结合。过表达短肽MFRLP增强血管平滑肌细胞(VSMC)中电子传递链复合体III(COX III)酶活性，减少活性氧(ROS)蓄积，抑制线粒体自噬制VSMC表型转换。因此，可通过利用短肽MFRLP抑制VSMC表型由收缩表型向合成表型转换，从而制备与动脉重塑相关疾病治疗的药物；同时，短肽MFRLP可能通过调节线粒体氧化磷酸化能力来影响VSMC表型转换，从而可用于制备促进线粒体氧化磷酸化能力的药物。
附图说明
图1为lncRNAMFRL编码短肽MFRLP示图；
图2为qRT-PCR检测lncRNAMFRL在各个组织的表达情况示图；
图3为RNA-FISH检测lncRNAMFRL及α-SMA在动脉组织中的表达情况示图；
图4为RNA-FISH检测lncRNAMFRL在VSMC中的亚细胞定位及qRT-PCR检测VSMC核质分离RNA的lncRNA的表达情况示图；
图5为沉默lncRNA MFRL促进VSMC向合成表型转换示图；
图6为免疫荧光检测MFRLP-eGFP的亚细胞定位示意图；
图7为qRT-PCR及WB检测VSMC收缩型基因或收缩态蛋白的影响示意图；
图8为MFRLP-His重组蛋白提取、纯化示图；
图9为小鼠TAC造膜短肽MFRLP腹腔注射实验示意图；
图10为短肽MFRLP与MT-CYTB结合测试示图；
图11为过表达短肽MFRLP抑制ROS生成，促进ATP生成测试示图；
图12为过表达短肽MFRLP对COX III酶活性的影响示图；
图13为过表达短肽MFRLP对线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3 II的影响示图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
生物材料如下：
1.载体
质粒pcDNA3.1、pEGFP、PET28a均购自北京擎科有限公司。
2、分子生物学试剂和培养基
PCR相关试剂购自广州瑞真公司；WB实验所用一抗购自proteintech公司，SDS-PAGE配制试剂购自杭州弗德公司，RNA-FISH检测试剂盒购自广州锐博公司，His纯化蛋白提纯试剂购自翌圣公司，ROS检测试剂盒、MitoSOX检测试剂盒、线粒体荧光探针购自碧云天公司，COXIII活性检测试剂盒、HE染色试剂盒、天狼星红染色试剂盒购自索莱宝公司，DMEM高糖培养基及胎牛血清购自Gibco公司。
3、细胞
293T细胞、小鼠平滑肌细胞系(MOVAS)均由南方医科大学南方医院心内科实验室保种。
4、实验动物
小鼠购于优达(广州)生物技术有限公司，健康雄性C57BL/6J小鼠，平均体重20-25g。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-wayANOVA检验，*P<0.05表示具有显著性差异，**P<0.01表示具有极显著性差异，***P<0.001表示具有极显著性差异，****P<0.0001表示具有极显著性差异。
实施例1、短肽MFRLP的发现
通过长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)测序，比较了主动脉弓横向缩窄模型小鼠(TAC)与假手术组小鼠(Sham)升主动脉组织中差异表达的lncRNA。关注到了一条全新的lncRNAMSTRG109.1，如序列SEQ ID NO.3所示。根据后续实验结果，将其命名为lncRNAMFRL。在实验过程中，使用NCBIORFfinder工具，发现其可能编码短肽。
通过使用ORF在线预测工具ORFfinder(网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)进行ORF预测。
质粒构建：构建ORF-Flag、ORFmut-Flag、ORF-eGFP、ORFmut-eGFP质粒，载体为pcDNA3.1或者peGFP，如图1A、E所示，交由北京擎科生物有限公司合成，质粒经过测序验证其序列正确。
LncRNAMFRL编码短肽MFRLP：
将目的质粒转染进293T细胞中，通过WB以及免疫荧光可以检测到lncRNAMFRL的第二个开放阅读框ORF2-Flag，及相应的ORF-eGFP能检测到相应Flag标签或GFP标签的表达,而起始密码子突变的ORFmut-Flag及ORFmut-eGFP则检测不到，验证了lncRNA MFRL其二号开放阅读框编码64个氨基酸的短肽，将短肽命名为MFRLP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
质粒细胞转染：
将细胞接种至六孔板，待细胞融合度为60％～80％，取两支无菌1.5mL EP管，各加入125μL减血清培养基Opti-MEM，第一支EP管中加5μL Lipofectamine 3000Reagent，第二支EP管中先加入质粒2500ng，再加入5μL P3000 Reagent。
将两支EP管的液体轻柔混匀形成转染复合物，室温静置15分钟。
将转染复合物均匀滴加到细胞培养液中，轻轻混匀，置于细胞培养箱中。
转染8小时后，换液。培养48～72小时后通过Western Blot(WB)或者免疫荧光行后续检测。
图1给出了lncRNA MFRL编码短肽MFRLP示图，其中(A)质粒构建模式图；(B)ORFfinder预测的lncRNA MFRL中的ORF，仅关注正义链；(C)细胞免疫荧光检测ORF-Flag融合蛋白的表达；(D)WB检测ORF-Flag融合蛋白的表达；(E)质粒构建模式图；(F-G)免疫荧光检测融合蛋白的表达；(H-I)WB检测融合蛋白的表达。
实施例2、lncRNA MFRL的组织特异性
通过qRT-PCR检测lncRNA MFRL在各个组织的表达情况，如图2所示，其中(A)qRT-PCR检测小鼠各组织的lncRNA MFRL的表达量；(B)qRT-PCR检测Sham组、TAC组中lncRNAMFRL的表达情况。结果表明MFRL在心脏及血管组织中高表达，并且同样通过qRT-PCR可以发现，在TAC诱导的重塑动脉组织中，lncRNA MFRL的表达量显著下降。
通过RNA荧光原位杂交技术(RNA-FISH)检测其在小鼠主动脉中的表达，如图3所示，并对比RNA-FISH检测lncRNA MFRL在VSMC中的亚细胞定位及qRT-PCR检测VSMC核质分离RNA的lncRNA的表达情况，如图4所示，其中图4(A)RNA-FISH检测lncRNA MFRL在VSMC中的亚细胞定位；图4(B)qRT-PCR检测VSMC核质分离RNA的lncRNA的表达情况，以Snora41作为细胞核RNA阳性对照，GAPDH作为细胞质RNA阳性对照。
结果显示，lncRNA MFRL与VSMC标志物α-SMA存在共定位，即lncRNAMFRL主要位于动脉中膜VSMC中(图3)，并且主要位于细胞质(图4A)。
RNA荧光原位杂交技术(RNA-FISH)：
采用锐博生物设计合成的lncRNA MFRL探针及FISH试剂盒。1mL PBS清洗细胞5分钟。4％多聚甲醛，室温静置10分钟。1mL PBS清洗细胞。加入200μL预冷的0.5％ Triton X-100，4℃静置5分钟。弃去后，加入1mL PBS清洗细胞5分钟，60rpm，共3次。加入200μL 37℃预热的预杂交液，37℃封闭30分钟。避光，将2.5uL lncRNA探针加入到100μL 37℃预热的杂交液中。弃去预杂交液，加入100μL含有探针的杂交液，避光，37℃杂交过夜。42℃，1mL4×SSC(含0.1％ Tween-20)，2×SSC，1×SSC溶液，分别清洗5分钟，3次。1mL PBS清洗细胞，室温5分钟，共3次。滴加适量含DAPI抗荧光淬灭封片剂。
实施例3、短肽MFRLP抑制VSMC由合成表型向收缩表型转换
使用小干扰RNA沉默lncRNA MFRL的表达，qRT-PCR检测收缩型基因Sm22α、Smmhc、α-Sma以及合成型基因Ki67、Opn的表达水平(图5A)，并且通过WB检测VSMC的收缩表型蛋白α-SMA、SM22α的表达水平(图5B-C)，与对照组相比，沉默lncRNAMFRL后，VSMC收缩态基因表达减少，合成型基因表达增多，细胞向合成表型转换。
通过免疫荧光检测MFRLP-eGFP的亚细胞定位，结果如图6所示，表明在VSMC中通过质粒过表达短肽MFRLP。通过qRT-PCR及WB检测VSMC收缩态基因的表达变化，结果如图7所示，其中(A)qRT-PCR检测VSMC中过表达短肽MFRLP对收缩型基因α-Sma、Sm22α的影响；(B-C)WB检测VSMC中过表达短肽MFRLP对收缩态蛋白α-SMA、SM22α的影响。表明，过表达短肽MFRLP后促进VSMC收缩态基因α-SMA、SM22α的RNA及蛋白表达水平。
实施例4、短肽MFRLP腹腔注射改善TAC诱导的动脉重塑
由北京擎科生物技术有限公司构建MFRLP-His重组蛋白大肠杆菌表达质粒，将MFRLP-His质粒转化至大肠杆菌中，扩增大肠杆菌，使用IPTG诱导其表达MFRLP-His重组蛋白，并将MFRLP-His重组蛋白提取并纯化、去除内毒素后，通过WB(图8A)及考马斯亮蓝(图8B)确认成功提取了MFRLP-His重组蛋白。
图8为提取、纯化MFRLP-His重组蛋白示意图，其中(A)MFRLP-His质粒示意图；(B)WB检测MFRLP-His重组蛋白纯化效果，M：Marker，E.coil:大肠杆菌，CL：细菌裂解液，FT：Flow Through上样流出液，W：Wash洗涤液，E：Elution洗脱液；(C)考马斯亮蓝检测MFRLP-His重组蛋白纯化效果。
为进一步探究短肽MFRLP能否在体内发挥作用，对小鼠行TAC造模并每日予短肽腹腔注射，手术后两周处死小鼠，分离升主动脉组织，并通过HE染色及MASSON染色对其进行形态学分析(图9A-B)，并对肽腹腔注射后升主动脉中膜面积、外膜面积、中膜厚度进行统计(图9C)，结果表明，与TAC组相比，短肽腹腔注射后升主动脉中膜面积、外膜面积、中膜厚度显著下降，以上结果提示，短肽腹腔注射改善压力超负荷诱导的动脉重塑。
His重组蛋白提取纯化：
由北京擎科公司构建MFRL-His重组蛋白大肠杆菌表达质粒。转化后，挑取单菌落，接种5mL LB培养基，37℃，200rpm，摇床震荡过夜。将过夜培养的5mL菌液加入至500mL含相应抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm，摇床震荡2小时左右(菌体OD 600为0.6-0.8)。加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5nM，诱导重组蛋白的表达，继续37℃，200rpm，摇床震荡4小时。
菌液7000rpm，离心15分钟，将菌体收集至50mL离心管中，加入40mL Lysis Buffer(含1％PMSF)。加入1mg/mL的溶菌酶，10μg/mL的RNase A和5μg/mL的DNase I，震荡悬浮菌体，超声破碎至菌液基本保持澄清。4℃，10000rpm，离心30分钟，取上清使用0.22μm过滤器过滤至新离心管，-20℃冰箱保存或进行下一步。
使用翌圣生物有限公司的His蛋白纯化凝胶进行样本纯化：将His标签蛋白琼脂糖纯化树脂装入6mL亲和层析柱。30mL去离子水冲洗层析柱。30mL Lysis Buffer平衡层析柱。将样本加入层析柱中，尽量控制流速，低于0.5mL/分钟，留取上样流出液以进行后续检测。平衡/洗杂：80mL Wash Buffer洗杂层析柱，留取洗杂液以进行后续检测。使用30mLElution Buffer洗脱，并收集洗脱液(目的蛋白溶液)，流速0.5mL/分钟。使用翌圣生物有限公司的内毒素去除凝胶去除内毒素：充分混匀内毒素高效去除纯化树脂，装入6mL亲和层析柱，并使用3mL再生液清洗，重复2次。3mL平衡液平衡层析柱。流速0.5mL/min。将样本加入到层析柱内，流速小于0.25mL/min，收集流出液，即为内毒素去除样本。透析：将透析袋剪成15mL的小段。在500mL的2％碳酸氢钠和1mmol/L EDTA的溶液中(pH＝8.0)将透析袋煮沸10分钟。
使用去离子水彻底清洗透析袋。在500mL的1mmol/L EDTA溶液(pH＝8.0)中将透析袋煮沸10分钟。冷却后去离子水清洗干净使用，或保存在4℃冰箱。透析袋中装入待透析蛋白液体，并夹好两端，在4℃无菌PBS溶液中进行透析。透析后袋透析袋中溶液即为所需His重组蛋白溶液。
实施例5、短肽MFRLP与MT-CYTB结合，减少ROS蓄积，抑制线粒体自噬
参考图10，为验证短肽MFRLP与MT-CYTB结合短肽，使用STRING数据库对其相互作用蛋白进行预测(10A)，结果表明MFRLP可能结合部分线粒体相关蛋白发挥作用。线粒体荧光探针Mito-Tracker与MFRLP-GFP荧光结果表明短肽MFRLP与线粒体存在共定位(图10B)。蛋白质分子对接模拟实验表明，短肽MFRLP与MT-CYTB存在可结合的分子位点(图10C，蓝色为MT-CYTB，黄色为MFRLP)，进一步通过免疫共沉淀及免疫荧光共定位表明MFRLP与MT-CYTB结合(图10D免疫共沉淀检测MFRLP-Flag与MT-CYTB相互结合；图10E免疫荧光检测MFRLP-Flag与MT-CYTB共定位)。
并通过检测(图11-13)表明了过表达短肽MFRLP显著抑制了VSMC中ROS的蓄积(图11A)以及线粒体ROS的蓄积(图11B)，并增加了细胞内ATP的含量(图11D)，同时COX III活性增强(图12)，线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3 II表达减少(图13A-B)。
图11A为DHE检测过表达短肽MFRLP后对细胞内ROS蓄积的影响；图11B为MitoSOX检测过表达短肽MFRLP后对细胞内线粒体ROS蓄积的影响；图11C ROS及MitoSOX统计图；图11D为过表达短肽MFRLP对细胞内ATP含量的影响。图12为过表达短肽MFRLP对COX III酶活性的影响。图13为过表达短肽MFRLP对线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3 II的影响。
综上说明了本发明的lncRNA MSTRG109(lncRNA MFRL)在主动脉弓缩窄(TAC)诱导的动脉重塑中表达显著下降，并且表达64个氨基酸的短肽MFRLP；短肽MFRLP可以减轻TAC模型及颈动脉损伤模型诱导的动脉重塑。短肽MFRLP与线粒体细胞色素B(MT-CYTB)结合，增强COX III酶活性，减少ROS蓄积，抑制线粒体自噬，进而抑制血管平滑肌细胞(VSMC)表型转换，改善动脉重塑。上述研究表明短肽MFRLP与VSMC表型转换有关，可通过促进短肽MFRLP的表达抑制VSMC向合成表型转换，从而制备与动脉重塑相关疾病治疗药物，具有较大应用前景。进一步猜想短肽MFRLP可能通过调节线粒体氧化磷酸化能力来影响VSMC表型转换。因此，本发明的短肽MFRLP也可以应用在制备促进线粒体氧化磷酸化能力的药物中。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.短肽MFRLP，其特征在于，所述短肽MFRLP为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的短肽；
A2)将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且具有与抑制线粒体自噬制VSMC表型转换和/或调节线粒体氧化磷酸化能力的短肽；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合短肽；
A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的短肽衍生物。
2.lncRNAMFRL核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1所述的短肽MFRLP。
3.一种载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的lncRNA MFRL核酸分子。
4.一种细胞，其特征在于，包含如权利要求3所述的载体、或其基因组中整合有如权利要求2所述的核酸分子或表达如权利要求1所述的短肽。
5.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的短肽MFRLP，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
6.如权利要求1所述的短肽MFRLP、如权利要求2所述的lncRNA MFRL核酸分子、如权利要求3所述的载体、如权利要求4所述的细胞、如权利要求5所述的药物组合物在制备动脉重塑相关疾病药物中的应用。
7.如权利要求1所述的短肽MFRLP、如权利要求2所述的lncRNA MFRL核酸分子、如权利要求3所述的载体、如权利要求4所述的细胞、如权利要求5所述的药物组合物在制备促进线粒体氧化磷酸化能力的药物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述药物通过口服、皮下、静脉、鼻内、经皮给药。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1150433A (zh) * | 1994-03-30 | 1997-05-21 | 米托科公司 | 线粒体缺陷相关疾病的诊断，治疗以及细胞和动物模型 |
| US20040214272A1 (en) * | 1999-05-06 | 2004-10-28 | La Rosa Thomas J | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants |
| US20120277286A1 (en) * | 2009-10-30 | 2012-11-01 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Compositions and methods for the treatment or prevention of mitochondrial diseases |
| CN104364259A (zh) * | 2012-03-26 | 2015-02-18 | 普罗努塔利亚公司 | 营养性片段、蛋白质和方法 |
| CN106399320A (zh) * | 2016-10-18 | 2017-02-15 | 南方医科大学 | 一种花狭口蛙的基因及其编码的多肽和该多肽的用途 |
| CN107011428A (zh) * | 2008-03-28 | 2017-08-04 | Mdna生命科学有限公司 | 异常线粒体dna、相关的融合转录物及其杂交探针 |
| CN110404053A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-11-05 | 中山大学 | 短肽mpm在制备用于治疗肌肉细胞分化相关疾病的药物中的应用 |
| CN110433277A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-12 | 上海市农业科学院 | 蚕豆蛋白肽在制备治疗炎症的药物中的应用及药物 |
| CN111978408A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-11-24 | 山东大学 | 靶向IKKβ的短肽及其在炎症性疾病中的应用 |
-
2023
- 2023-09-21 CN CN202311229491.2A patent/CN117384269B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1150433A (zh) * | 1994-03-30 | 1997-05-21 | 米托科公司 | 线粒体缺陷相关疾病的诊断，治疗以及细胞和动物模型 |
| US20040214272A1 (en) * | 1999-05-06 | 2004-10-28 | La Rosa Thomas J | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants |
| CN107011428A (zh) * | 2008-03-28 | 2017-08-04 | Mdna生命科学有限公司 | 异常线粒体dna、相关的融合转录物及其杂交探针 |
| US20120277286A1 (en) * | 2009-10-30 | 2012-11-01 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Compositions and methods for the treatment or prevention of mitochondrial diseases |
| CN104364259A (zh) * | 2012-03-26 | 2015-02-18 | 普罗努塔利亚公司 | 营养性片段、蛋白质和方法 |
| CN106399320A (zh) * | 2016-10-18 | 2017-02-15 | 南方医科大学 | 一种花狭口蛙的基因及其编码的多肽和该多肽的用途 |
| CN110404053A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-11-05 | 中山大学 | 短肽mpm在制备用于治疗肌肉细胞分化相关疾病的药物中的应用 |
| CN110433277A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-12 | 上海市农业科学院 | 蚕豆蛋白肽在制备治疗炎症的药物中的应用及药物 |
| CN111978408A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-11-24 | 山东大学 | 靶向IKKβ的短肽及其在炎症性疾病中的应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| INFORMATICS, PATHOGEN.: "Cytochrome C oxidase subunit II%2C transmembrane domain [Chlamydia trachomatis], GenBank:CRH42919.1", 《GENPEPT》, 13 June 2015 (2015-06-13), pages 1 * |
| R. DANIEL RUDIC ET AL.: "COX-2–Derived Prostacyclin Modulates Vascular Remodeling", 《CIRCULATION RESEARCH》, vol. 96, 24 June 2005 (2005-06-24), pages 1240 - 1247 * |
| REMY CHENEVARD ET AL.: "Selective COX-2 Inhibition Improves Endothelial Function in Coronary Artery Disease", 《CIRCULATION》, vol. 107, 28 January 2003 (2003-01-28), pages 405 - 409 * |
| SATISH, R. ET AL.: "hypothetical protein [Mycolicibacterium phage J1], GenBank:QXN67751.1", 《GENPEPT》, 17 March 2022 (2022-03-17), pages 1 * |
| 冯婷 等: "主动脉弓缩窄模型所致小鼠主动脉重塑的lncRNA表达谱分析", 《 解放军医学杂志》, vol. 45, no. 9, 28 September 2020 (2020-09-28), pages 913 - 921 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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