CN110616264A - Dlx1和hoxc6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒 - Google Patents

Dlx1和hoxc6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DLX1和HOXC6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。该试剂盒操作流程简便，耗时短，质控方法简便、结果重复性好。且使用该试剂盒用于前列腺癌早期诊断、尤其是对于高分级的前列腺癌，和临床病理结果具有非常良好的符合率。

Description

DLX1和HOXC6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种DLX1和HOXC6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒，属于生物医药技术领域。
背景技术
前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤，占全球肿瘤发病率第二位、死亡率第六位，我国PCa的发病率平均每年增长4.7％，是增加最快的男性恶性肿瘤。上海市疾病控制中心的资料显示，前列腺癌的发病率自2002年起已跃居男性泌尿生殖系恶性肿瘤的首位。
前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)是全世界应用最广泛的前列腺癌早期诊断指标，PSA升高提示患者可能存在前列腺癌，但PSA升高也往往因其他的前列腺疾病引起。以PSA灰区(4-10ng/ml)为例，这些患者穿刺活检的阳性率只有10-25％。据统计全世界每年接受前列腺穿刺活检，其中75％以上是不必要的，穿刺活检会给患者带来许多并发症，如血尿、败血症、感染等，给患者带来极大的痛苦。虽然PSA应用广泛，但也存在上述等较大问题，亟需新的检测靶标来弥补其缺陷。
DLX基因家族是一组转录因子，在胚胎发育阶段启动调控作用。DLX1是DLX基因家族中的重要原癌基因，HOXC6是同源盒基因家族成员，是一种重要的转录因子，在器官形成中起到调控作用。DLX1和HOXC6都与前列腺的恶性进展密切相关。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明提供一种多个前列腺相关基因表达联合检测试剂盒及应用，其能够联合检测前列腺相关基因表达，可以明显地提高肿瘤的检出率，其设计巧妙，使用方便，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，本发明提供一种DLX1和HOXC6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。其能够联合检测前列腺相关基因表达，可以明显地提高肿瘤的检出率，其设计巧妙，使用方便，适于大规模推广应用。
DLX1和HOXC6在制备诊断前列腺癌标志物中的联合应用，所述DLX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HOXC6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
DLX1和HOXC6联合检测前列腺癌的试剂盒，包括DLX1 mRNA、和HOXC6 mRNA的定量检测试剂；所述DLX1 mRNA定量检测试剂包括SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针；所述HOXC6 mRNA定量检测试剂包括如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针。
优选地，上述试剂盒还包括PSA mRNA定量检测试剂，所述PSA mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的探针。
优选地，上述试剂盒还包括一步法RT-PCR反应液，包括One-step RT/RI EnzymeMix，Probe qPCR Supermix。
优选地，上述试剂盒还包括两步法RT-PCR试剂：包括引物探针混合液，RT反应液和PCR反应液；所述RT反应液包括5×Buffer，dNTP，HiScript III Reverse Transcriptase，随机引物，Oligo(DT)和水；所述PCR反应液包括2×Buffer，dNTP，Mg2+，AceTaq DNAPolymerase和水。
优选地，上述试剂盒还包括标准品，阴性质控品和阳性质控品；所述标准品包括如SEQ ID NO.4所示的DLX1基因重组质粒、如SEQ ID NO.5所示的HOXC6基因重组质粒、如SEQID NO.6所示的PSA基因重组质粒；阳性质控品为前列腺癌细胞株LNcap总RNA逆转录后的cDNA，阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1总RNA逆转录后的cDNA。
本发明所达到的有益效果：
本发明给出了一种基于PCR方法的DLX1/HOXC6尿液检测试剂盒，该试剂盒操作流程简便，耗时短，质控方法简便、结果重复性好。且使用该试剂盒用于前列腺癌早期诊断、尤其是对于高分级的前列腺癌，和临床病理结果具有非常良好的符合率。
附图说明
图1是实施例中标准品扩增曲线图；
图2是实施例中标准曲线图；
图3是DLX1检测ROC曲线图；
图4是HOXC6检测ROC曲线图；
图5是DLX1+HOXC6检测ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
一种DLX1和HOXC6在制备前列腺癌标志物中的试剂盒，包括DLX1 mRNA、和HOXC6mRNA的定量检测试剂；所述DLX1 mRNA定量检测试剂包括SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针；所述HOXC6 mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针。
由于PSA是前列腺特异抗原，尿液中的PSA基因表达均来源于前列腺，因此尿液中PSA基因(SEQ ID NO.3)可以用来作为前列腺来源RNA量的内参基因。试剂盒还包括PSAmRNA定量检测试剂，所述PSA mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的探针。
试剂盒还包括一步法RT-PCR反应液，一步法RT-PCR预混液包含One-step RT/RIEnzyme Mix，Probe qPCR Supermix，反应条件为：逆转录50℃，25分钟为预变性95℃，3分钟，扩增95℃，10秒，60℃，30秒，45个循环。
试剂盒还包括标准品，阴性质控品和阳性质控品。标准品包括如SEQ ID NO.4所示的DLX1基因重组质粒、如SEQ ID NO.5所示的HOXC6基因重组质粒、如SEQ ID NO.6所示的PSA基因重组质粒；阳性质控品为前列腺癌细胞株LNcap总RNA逆转录后的cDNA，阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1总RNA逆转录后的cDNA。
实施例1：用于对DLX1和HOXC6及参考基因PSA定量PCR检测的引物及探针的设计与筛选
根据DLX1，HOXC6和PSA cDNA序列(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3)共设计了10组正向引物、反向引物及荧光探针，采用上述引物和探针，以DLX1，HOXC6和PSA mRNA序列制备的重组质粒(SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6)为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序分析，验证所设计的10组引物及探针的可靠性，淘汰扩增效率低及扩增产物不特异的引物及探针。
经过初筛，保留6组正向引物、反向引物及荧光探针。然后提取尿液样本总RNA反转录为cDNA，分别使用上述初筛后的6组正向引物、反向引物及荧光探针进行PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火/延伸30秒，45个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，根据Ct值最小和荧光信号增幅最大原则进行筛选。经过上述试验过程，筛选优化得到的正向引物、反向引物及探针序列(SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.15)
实施例2：DLX和HOXC6联合检测试剂盒反应体系和反应条件的优化1.反应体系的优化
1.1引物及探针浓度的优化
将正向引物(10μΜ)、反向引物(10μΜ)按体积比1:1混合，依次加入0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.8μL和1.0μL；探针(10μΜ)依次加入0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL和0.7μL；再加入模板cDNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Probe qPCR Supermix 15μL，ddH2O补足至30μL；同时对引物及探针浓度进行优化，根据最大荧光信号强度和最小Ct值综合考虑，确定本发明的最佳引物用量为：正向引物和反向引物均为0.5μL，探针用量为0.5μL；正向引物、反向引物和探针的终浓度均为0.17μΜ。
1.2实时定量PCR反应预混液的选择
为比较不同厂家生产的荧光定量反应预混液性能差异，使用相同的cDNA模板，选取多种实时定量PCR反应预混液进行平行对比。PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火/延伸30秒，45个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
结果显示：使用2*Probe qPCR Supermix作为荧光定量反应的预混液，具有最优的效果，因此，选用2*Probe qPCR Supermix为荧光定量反应的预混液。
2.反应条件的优化
2.1退火温度的优化
根据引物Tm值，将退火温度按58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、依次递增，进行退火温度的优化，选择最佳退火温度进行后续试验。
综合平衡退火温度PCR扩增反应的效率和扩增的特异性，优选的最佳退火温度为60℃。2.2退火时间的优化
在退火温度为60℃的条件下，设定退火时间分别为30s、31s、32s、33s、34s、对退火时间进行优化，经过实验对比，最终确定的最佳退火时间为33秒。
实施例3：检测试剂盒对于标准样品的灵敏度检测
根据(SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6)设计DLX1、HOXC6、PSA cDNA重组质粒分别作梯度稀释，各有6个稀释点，分别浓度为100,000拷贝/微升、10,000拷贝/微升、1,000拷贝/微升、100拷贝/微升、10拷贝/微升、1拷贝/微升。
使用实施实例1获取的引物探针和实施实例2的反应条件进行PCR检测，反应条件为：95℃，3分钟；95℃，10秒，60℃，30秒，45个循环。扩增曲线如图1所示，然后根据检测结果绘制标准曲线，结果如图2所示。结果显示，这个由DXL1，HOXC6和PSA组成的三重RT-PCR具有很高的灵敏度。
实施例4：临床样本的检测
采用本发明实施例3的荧光定量PCR检测试剂盒对62例临床标本(从浙江大学医学院附属第一医院泌尿外科获取的尿液样本，其中29例为前列腺癌(Gleason>7的样本由23例)，，33例为前列腺炎或其他良性病变)进行检测。反应条件为：逆转录50℃15分钟，预变性95℃，3分钟；95℃，10秒，60℃，30秒，45个循环。根据标准样品分别计算每个样本DLX1，HOXC6和PSA的拷贝数。然后使用DLX拷贝数/PSA拷贝数计算DLX分数，HOXC6拷贝数/PSA拷贝数计算HOXC6分数，将DLX分数和PSA分数相加计算总分。分别使用DLX分数，HOXC6分数和总分和病理结果绘制受试者工作曲线(ROC)评估三种分数对前列腺癌的诊断能力(图3-图5)，结果显示，DLX，HOXC6和DLX/HOXC6联合检测的AUC分别是0.62，0.65，0.733，DLX/HOXC6联合检测具有显著优势，当评分阈值选在0.25时灵敏度为91％，特异性43％(对高分级前列腺癌特异性为61％)。
实施例5：本试剂盒还可以使用两步法RT-PCR试剂：由引物探针混合液，RT反应液和PCR反应液组成反应体系中RT反应液包括5×Buffer，dNTP，HiScript III ReverseTranscriptase，随机引物，Ol igo(DT)和水。PCR反应液包括2×Buffer，dNTP，Mg2+，AceTaqDNA Polymerase和水。逆转录条件为：37℃，25分钟；85℃15秒；PCR条件为预变性95℃，10分钟，扩增95℃，10秒，60℃，30秒，45个循环。
综上，本发明的一种DLX1和HOXC6基因表达联合检测试剂盒及应用，其能够联合检测前列腺相关基因表达，可以明显地提高肿瘤的检出率，其设计巧妙，使用方便，适于大规模推广应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州昱鼎生物科技有限公司
<120> DLX1和HOXC6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒
<141> 2019-11-12
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2203
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
aagctttgaa ccgagtttgg ggagctcagc agcatcatgc ttagactttt caaagagaca 60
aactccattt tcttatgaat ggaaagtgaa aacccctgtt ccgcttaaat tgggttcctt 120
cctgtcctga gaaacataga gacccccaaa agggaagcag aggagagaaa gtcccacacc 180
cagaccccgc gagaagagat gaccatgacc accatgccag aaagtctcaa cagccccgtg 240
tcgggcaagg cggtgtttat ggagtttggg ccgcccaacc agcaaatgtc tccttctccc 300
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<212> DNA
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ttcaccctca gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtgctgg acgctggaca gggggcaaaa 660
gcacctgctc gggtgattct gggggcccac ttgtctgtaa tggtgtgctt caaggtatca 720
cgtcatgggg cagtgaacca tgtgccctgc ccgaaaggcc ttccctgtac accaaggtgg 780
tgcattaccg gaagtggatc aaggacacca tcgtggccaa cccctgagca cccctatcaa 840
ccccctattg tagtaaactt ggaaccttgg aaatgaccag gccaagactc aagcctcccc 900
agttctactg acctttgtcc ttaggtgtga ggtccagggt tgctaggaaa agaaatcagc 960
agacacaggt gtagaccaga gtgtttctta aatggtgtaa ttttgtcctc tctgtgtcct 1020
ggggaatact ggccatgcct ggagacatat cactcaattt ctctgaggac acagatagga 1080
tggggtgtct gtgttatttg tggggtacag agatgaaaga ggggtgggat ccacactgag 1140
agagtggaga gtgacatgtg ctggacactg tccatgaagc actgagcaga agctggaggc 1200
acaacgcacc agacactcac agcaaggatg gagctgaaaa cataacccac tctgtcctgg 1260
aggcactggg aagcctagag aaggctgtga gccaaggagg gagggtcttc ctttggcatg 1320
ggatggggat gaagtaagga gagggactgg accccctgga agctgattca ctatgggggg 1380
aggtgtattg aagtcctcca gacaaccctc agatttgatg atttcctagt agaactcaca 1440
gaaataaaga gctgttatac tgtgaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1483
<210> 4
<211> 173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagggaagaa ggaacagtgg aggcgggacg ccctccatct cctcggagcc ccgcgaggtc 60
cggcccagca acttcccggc atccgcgctc tagcctgaac cctggcctgg gccgagcagt 120
ggcagcagag agtggcctcg gagggaagcc actgccacct gagacagccc aag 173
<210> 5
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttccagaac cgccggatga agtggaaaaa agaatctaat ctcacatcca ctctctcggg 60
gggcggcgga ggggccaccg ccgacagcct gggcggaaaa gaggaaaagc gggaagagac 120
agaagaggag aagcagaaag agtgaccagg actgtccctg ccacccctct ctccctttct 180
ccctcgctcc ccaccaactc tcccctaatc acacactctg ta 222
<210> 6
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctgcggcgg tgttctggtg cacccccagt gggtcctcac agctgcccac tgcatcagga 60
acaaaagcgt gatcttgctg ggtcggcaca gcctgtttca tcctgaagac acaggccagg 120
tatttcaggt cagcca 136
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagggaagaa ggaaca 16
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttgggctgt ctcag 15
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggcatccgc gctctagcct 20
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttccagaac cgcc 14
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tacagagtgt gtgattagg 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggccaccgc cgacagcc 18
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctgcggcgg tgttct 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggctgacct gaaata 16
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcccactgca tcaggaaca 19

Claims (6)

1.DLX1和HOXC6在制备诊断前列腺癌标志物中的联合应用，所述DLX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HOXC6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.DLX1和HOXC6联合检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于，包括DLX1 mRNA、和HOXC6mRNA的定量检测试剂；所述DLX1 mRNA定量检测试剂包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针；所述HOXC6 mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针。
3.根据权利要求2所述的DLX1和HOXC6联合检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PSA mRNA定量检测试剂，所述PSA mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的探针。
4.根据权利要求3所述的DLX1和HOXC6联合检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括一步法RT-PCR反应液，包括One-step RT/RI Enzyme Mix，Probe qPCRSupermix。
5.根据权利要求3所述的DLX1和HOXC6联合检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括两步法RT-PCR试剂：包括引物探针混合液，RT反应液和PCR反应液；所述RT反应液包括5×Buffer，dNTP，HiScript III Reverse Transcriptase，随机引物，Oligo(DT)和水；所述PCR反应液包括2×Buffer，dNTP，Mg2+，AceTaq DNA Polymerase和水。
6.根据权利要求4-5任一项权利要求所述的DLX1，HOXC6和PCA3联合检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品，阴性质控品和阳性质控品；所述标准品包括如SEQ ID NO.4所示的DLX1基因重组质粒、如SEQ ID NO.5所示的HOXC6基因重组质粒、如SEQ ID NO.6所示的PSA基因重组质粒；阳性质控品为前列腺癌细胞株LNcap总RNA逆转录后的cDNA，阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1总RNA逆转录后的cDNA。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160194724A1 (en) * 2013-08-13 2016-07-07 Mdxhealth Research B.V. Combinations of molecular markers with improved sensitivity and specificity for predicting and treating prostate cancer

Patent Citations (1)

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Non-Patent Citations (1)

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Title
罗苑方 等: "前列腺癌相关生物标志物的研究进展", 《中国医刊》 *

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