KR20170004033A - 비정상적인 미토콘드리아 ｄｎａ, 그것에 연관된 융합 트랜스크립트 및 혼성화 프로브 - Google Patents

비정상적인 미토콘드리아 ｄｎａ, 그것에 연관된 융합 트랜스크립트 및 혼성화 프로브 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암을 예측하거나, 진단하거나 및/또는 모니터링하는데 유용한 신규 미토콘드리아 융합 트랜스크립트 및 모 돌연변이 mtDNA 분자를 제공한다. 또한, 본 발명의 방법에 사용하기 위해 그에 상보적인 혼성화 프로브가 제공된다.

Description

비정상적인 미토콘드리아 ＤＮＡ, 그것에 연관된 융합 트랜스크립트 및 혼성화 프로브{ABERRANT MITOCHONDRIAL DNA, ASSOCIATED FUSION TRANSCRIPTS AND HYBRIDIZATION PROBES THEREFOR}
본 발명은 미토콘드리아 유전체학 분야에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은 미토콘드리아 게놈 융합 트랜스크립트 및 그에 혼성화된 프로브의 식별 및 용도에 관한 것이다.
미토콘드리아 게놈
미토콘드리아 게놈은 핵산의 작지만 중요한 서열이다. 미토콘드리아 DNA, 또는 "mtDNA"는 33억 bp (haploid)의 광대한 핵 게놈과 대조적으로 16,569 핵산 염기쌍 (bp) (Anderson et al., 1981 ; Andrews et al., 1999)의 작은 게놈을 포함한다. 그의 유전적 보체는 그의 핵 세포 메이트의 그것보다 실질적으로 더 작다 (0.0005%). 그러나, 개개의 세포는 특이적 세포 기능에 따라 103 내지 104개의 미토콘드리아를 어느 곳에나 전달한다 (Singh and Modica-Napolitano 2002). 통신 또는 화학적 시그널링은 핵과 미토콘드리아 게놈 사이에서 관례적으로 발생한다 (Sherratt et al., 1997). 더욱이, 특이적 핵 성분은 미토콘드리아 서열의 유지 및 통합에 책임이 있다 (Croteau et al., 1999). 주어진 개체 내의 모든 mtDNA 게놈들은 일단 수정이 발생하면 난자 내의 미토콘드리아의 클론 확장으로 인해 동일하다. 그러나 돌연변이 유발 사건은 체세포 돌연변이로서 반영된 서열 다양성을 유도할 수 있다. 이들 돌연변이는 헤테로플라즈미로서 공지된 조건에서 신체 전반의 상이한 조직 내에 축적될 수 있다.
미토콘드리아 프로테옴
핵 자리에 대한 심한 미토콘드리아 의존도를 지시하는, 미토콘드리아 게놈에 의해 코드화된 이들 중 단지 37개에 의해 미토콘드리아를 구성하고, 작동시키고 유지하기 위해 약 3,000개의 핵 유전자가 요구된다. 미토콘드리아 게놈은 전자 수송에 필수적인 나머지 13개의 유전자의 정확한 해석을 보장하는 2 rRNAs 및 22 tRNAs를 포함하여 24개 유전자의 보체에 대해 코드화한다 (도 1 참조). 미토콘드리아 게놈은 미토콘드리아 게놈에 의해 공급되는 13개의 폴리펩티드 외에, 이러한 중요한 기능에 필수적인 산화 및 환원 반응을 수행하기 위한 70개의 핵 인코딩된 단백질에 의존한다. 핵 및 미토콘드리아 단백질 모두는 안쪽 미토콘드리아 멤브레인을 스패닝하는 착물을 형성하고 세포 대사에 필요한 화학 연로 아데노신 트리포스페이트 또는 ATP의 80-90%를 총괄적으로 발생시킨다. 에너지 생산 외에, 미토콘드리아는 다른 대사 경로에서 마찬가지로 중심 역할을 한다. 미토콘드리아의 중요한 기능은 세포 사멸 또는 아폽토시스의 조정이다 (Green and Kroemer, 2005 참조). 필수적으로, 바깥쪽 미토콘드리아 멤브레인, 또는 마찬가지로 안쪽 미토콘드리아 멤브레인을 침투할 수 있는 신호 경로가 있다. 특정 미토콘드리아 단백질 시토졸 내로 방출되는 경우, 비-가역적 세포 사멸은 진행중으로 설정된다. 이러한 과정은 몇몇 미토콘드리아 단백질이 갖는 다중-기능적 역할을 강조한다. 이들 멀티-태스킹 단백질은 대안의 기능을 가질 수 있는 다른 미토콘드리아 단백질이 마찬가지로 존재할 수 있음을 시사한다.
미토콘드리아 융합 트랜스크립톰
미토콘드리아 게놈은 그것이 환상의 인트론이 적은 DNA 분자라는 점에서 흔치 않다. 게놈은 특정 길이의 서열 측면에 있는 반복 모티브들과 사이에 배치된다 이들 반복물 사이의 서열은 잘 알려지지 않은 상황 하에 결실되기 쉽다. 미토콘드리아 게놈에서 반복물의 수가 가정되면, 많은 가능한 결실이 존재한다. 최고의 공지된 예는 4977개의 "공통 결실"이다. 이러한 결실은 여러 가지 알려진 상태 및 질병들과 연관되어 있고, 노화됨에 따라 빈도가 증가하는 것으로 생각된다 (Dai et al., 2004; Ro et al., 2003; Barron et al., 2001 ; Lewis et al., 2000; Muller-Hocker, 1998; Porteous et al., 1998) (도 4). 미토콘드리아 유전체학 분야의 현재 생각은 미토콘드리아 결실은 단지 반응성 산소 종들 및 UVR과 같은 작용제들에 의한 미토콘드리아 게놈에 대한 손상의 해로운 부산물 (Krishnan et al 2008, Nature Genetics)이라는 것이다. 더욱이, 높은 레벨의 mtDNA 결실이 세포 호흡에 필요한 유전자 서열을 누락한 결과로서 ATP의 형태로 에너지를 생산하기 위해 세포의 능력에 대해 심각한 결과를 가질 수 있는 것으로 인식되더라도, 이들 결실된 미토콘드리아 분자들은 하류 경로의 일 성분일 수 있고, 의도된 기능적 역할을 하고, 가능하게는 출원인이 예상한 바와 같이 미토콘드리아의 인식된 유전자의 대안의 자연적 형태로서 더욱 적절히 검토될 수 있는 것으로 예상되지 않는다.
mtDNA의 서열 역학은 중요한 진단 도구이다. mtDNA에서 돌연변이는 종종 질병 발현의 예비 지시자이다. 예를 들면, 미토콘드리아 게놈에서 점 돌연변이는 전립선에서 종양 초점의 특징인 것으로 드러나고 있다. 이러한 경향은 또한 종양 조직에 인접하거나 또는 멀리 떨어진 정상적으로 보이는 조직들로 확장한다 (Parr et al. 2006). 이는 미토콘드리아 돌연변이가 악성 형질전환 경로에서 조기 발생함을 시사한다.
예를 들면, 3.4kb 미토콘드리아 결실 빈도는 양성 및 악성 전립선 조직들 사이를 차별화하는데 우수한 유틸리티를 갖는다 (Maki et al. 2008).
미토콘드리아 융합 트랜스크립트는 먼저 대두에서 (Morgens et al. 1984) 및 이후에 희귀한 신경근육 질환인 컨스-세이어 증후군인 2명의 환자들에서와 같이 문헌에 이미 보고되어 있다 (Nakase et al 1990). 중요하게는 이들 트랜스크립트는 임의의 인간 암들과의 연관성을 갖는 것으로 밝혀지지 않았거나 또는 (그에 관하여 조사되지) 않았다.
본 발명의 목적은 비정상적인 미토콘드리아 DNA, 연관된 융합 트랜스크립트 및 그를 위한 혼성화 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따라, 암과 연관된 단리된 미토콘드리아 융합 트랜스크립트가 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따라, 서열번호 34 내지 49 및 52 중의 임의의 하나에 나타낸 바의 서열을 갖는, 상기 융합 트랜스크립트에 대응하는 미토콘드리아 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 융합 트랜스크립트를 인코딩한 단리된 mtDNA가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트 또는 mtDNA의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 갖는 혼성화 프로브가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명에 따른 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 갖는 적어도 하나의 혼성화 프로브로 샘플을 혼성화시킴으로써 암과 연관된 적어도 하나의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 존재에 대해 포유동물로부터 조직 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 포유동물에서 암의 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명에 따른 mtDNA의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 갖는 적어도 하나의 혼성화 프로브로 샘플을 혼성화함으로써 암과 연관된 적어도 하나의 비정상적인 mtDNA의 존재에 대해 포유동물로부터 조직 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 포유동물에서 암의 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 융합 트랜스크립트 또는 mtDNA의 적어도 일부에 상보적인 적어도 하나의 혼성화 프로브를 포함하는, 포유동물에서 암의 존재를 검출하기 위해 분석을 수행하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 암과 연관된 것들을 식별하기 위해 10's, 100's, 또는 1000's의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트를 갖는 마이크로어레이로 구성된 선별 도구가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 암과 연관된 것들을 식별하기 위해 미토콘드리아 융합 트랜스크립트에 대응하는 10's, 100's, 또는 1000's의 미토콘드리아 DNA를 갖는 마이크로어레이로 구성된 선별 도구가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 암과 연관된 것들을 식별하기 위해 미토콘드리아 융합 트랜스크립트에 대응하는 10's, 100's, 또는 1000's의 멀티플렉스 분지된 DNA 분석으로 구성된 선별 도구가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 암과 연관된 것들을 식별하기 위해 미토콘드리아 융합 트랜스크립트에 대응하는 10's, 100's, 또는 1000's의 미토콘드리아 DNA를 갖는 멀티플렉스 분지된 DNA 분석으로 구성된 선별 도구가 제공된다.
본 발명의 구체예들은 이하 첨부된 도면을 참조하여 실시예로써만 기재될 것이다:
도 1은 미토콘드리아 코딩 유전자를 보여주는 예시도이다.
도 2는 3.4kb 결실의 손실에 의해 유발된 전립선 샘플에서 폴리아데날화된 융합 트랜스크립트를 보여주는 도면이다.
도 3은 4977kb 공통 결실의 손실에 의해 유발된 전립선 샘플에서 폴리아데날화된 융합 트랜스크립트를 보여주는 도면이다.
도 4는 게놈으로부터 3.4 kb의 손실에 의해 유발된 유방 샘플에서 폴리아데날화된 융합 트랜스크립트를 보여주는 도면이다.
도 5a 및 5b는 유전자의 스플라이싱 전후 미토콘드리아 DNA 영역의 예를 보여주는 도면이다.
도 6a 내지 6g는 대장암 종양의 식별에 있어서 본 발명의 트랜스크립트 2, 3, 8, 9, 10, 11 및 12에 대한 결과를 예시하는 도면이다.
도 7a 내지 7d는 폐암 종양의 식별에 있어서 본 발명의 트랜스크립트 6, 8, 10 및 20에 대한 결과를 예시하는 도면이다.
도 8a 내지 8g는 흑색종의 식별에 있어서 본 발명의 트랜스크립트 6, 10, 11, 14, 15, 16 및 20에 대한 결과를 예시하는 도면이다.
도 9a 내지 9h는 난소암의 식별에 있어서 본 발명의 트랜스크립트 1, 2, 3, 6, 11, 12, 15 및 20에 대한 결과를 예시하는 도면이다.
도 10 내지 18은 고환암의 식별에 있어서 본 발명의 트랜스크립트 2, 3, 4, 11, 12, 13, 15, 16 및 20에 대한 결과를 예시하는 도면이다.
본 발명은 암을 예측하거나, 진단하거나 및/또는 모니터링하는데 유용한 신규 미토콘드리아 융합 트랜스크립트 및 모 돌연변이 mtDNA 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 융합 트랜스크립트 및 연관된 mtDNA 분자를 검출하기 위한 혼성 프로브를 제공하고 그러한 프로브의 용도를 제공한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "수차" 또는 "돌연변이"는 융합 트랜스크립트를 초래하고 삽입, 전좌, 결실, 복제, 재조합, 재배열 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 야생형 미토콘드리아 DNA 서열에서 임의의 변형을 포함한다.
본원에 정의된 바, "생물학적 샘플"은 관심을 끄는 분자로부터 획득할 수 있는 세포를 함유하는 조직액 또는 체액을 의미한다. 예를 들면, 생물학적 샘플은 전립선, 유방, 대장, 폐 및 피부와 같은 조직으로부터, 또는 혈액, 타액, 뇌 척수액, 가래, 소변, 점액, 관절낭액, 복막액, 양수 등으로부터 유도될 수 있다. 생물학적 샘플은 수술 표본 또는 생검 표본일 수 있다. 생물학적 샘플은 샘플의 특성을 변형시키기 위해 소스로부터 획득되는 것으로서 직접적으로 또는 전처리 후에 사용될 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플은 예를 들면, 혈액으로부터 플라즈마 또는 혈청을 제조하고, 세포들을 분쇄하고, 고체 f세포들을 분쇄하고, 물질로부터 액체를 제조하고, 점성 유체를 희석하고, 액체를 여과하고, 액체를 증류하고, 액체를 농축하고, 간섭 성분을 불활성화하고, 시약을 첨가하는 등에 의해 사용 전에 전처리될 수 있다.
"연속" 트랜스크립트는 두 스플라이스된 유전자의 시작에서 끝까지 리딩 프레임을 유지하는 융합 트랜스크립트이다. "말단" 트랜스크립트는 제2 스플라이스된 유전자의 원시 종결 코돈 전에 미숙한 종결 코돈을 초래하는 융합 트랜스크립트이다.
본원에 사용된 바와 같이, "미토콘드리아 DNA" 또는 "mtDNA"는 미토콘드리아에 존재하는 DNA이다.
본원에 사용된 바와 같이, "미토콘드리아 융합 트랜스크립트" 또는 "융합 트랜스크립트"라는 표현은 돌연변이된 미토콘드리아 DNA 서열의 트랜스크립션의 결과로서 생산되고 여기서 그러한 돌연변이는 미토콘드리아 결실 및 기타 대규모 미토콘드리아 DNA 재배열을 포함할 수 있는 RNA 트랜스크립션 제품을 의미한다.
컴퓨터 분석 및 서열 표적화
상기 고찰한 바와 같이, 미토콘드리아 융합 트랜스크립트는 대두에서 (Morgens et al. 1984) 및 희귀한 신경근육 질환을 앓고 있는 인간에서 (Nakase et al 1990) 보고되고 있다. 그러나 인간 암과 연관된 융합 트랜스크립트는 기재되어 있지 않다.
암과 연관된 인간 미토콘드리아 게놈의 대규모 결실을 매핑한 것으로부터 획득한 지식, 높은 빈도의 이들 결실의 관찰, 및 전사적으로 활성인 돌연변이된 mtDNA 분자의 또 다른 유기체 및 또 다른 질병 유형에서의 증거를 사용함으로써, 출원인은 암과 관련되는 경우 그러한 결실이 DNA 분자 및 손상 및 회복 공정보다 중요할 수 있다고 가설하였다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 미토콘드리아 게놈의 컴퓨터 분석이 많은 잠재적 결실 부위를 시사하는 반복 요소들에 특이적으로 수행되었다. 이러한 초기 단계 후, 비-인접 위치 또는 비-탠덤 위치를 갖는 미토콘드리아 서열에서 독특한 반복물을 식별함으로써, 초기화됨에 따라 결실 DNA 분자중의 결실 사건은 개방된 리딩 프레임 (ORF)을 갖는 융합된 DNA 서열을 생산하기 위해 재폐쇄되거나 재결찰될 수 있는 그들 반목물을 확인하기 위해 필터가 적용되었다. 이어서, 18 분자의 서브세트는 1) 그것들이 인간의 자연스러운 생물학적 상태에서 존재하는지 및 2) 그것들이 악성 종양에 대한 관련성을 갖는지 여부를 조사하기 위한 타겟화를 위해 선택되었다. 이들 조사로부터 결과는 이하에 기재된다.
게놈의 돌연변이
미토콘드리아 DNA (mtDNA) 역학은 중요한 진단 도구이다. mtDNA에서 돌연변이는 종종 발전하는 질병의 예비 지시자이고, 질병의 시작과 연관된 위험 인자들을 지시하는 바이오마커로서 작용한다. 본 발명에 따라, 미토콘드리아 게놈에서 대규모 재배열 돌연변이는 암과 연관된 융합 트랜스크립트의 발생을 초래한다. 따라서, 암의 검출, 진단 및 모니커링을 위해 그에 지향된 그러한 트랜스크립트 및 프로브를 인코딩한 mtDNA의 용도가 제공된다.
당업계의 숙련자는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 mtDNA 분자가 자연적으로-발생하는 돌연변이체를 통해 유도될 수 있거나, 본원에 기재된 융합 트랜스크립트의 임의의 것의 상보적 서열에 기초할 수 있음을 인정한다. 예시적인 mtDNA 서열 및 융합 트랜스크립트는 출원인들의 미국 우선권 출원 제61/040,616호에 기재되어 있으며, 여기서 참고 문헌으로서 그의 전문을 인용한다.
돌연변이체 게놈의 서열의 검출
본 발명에 따른 돌연변이체 mtDNA 서열은 융합 트랜스크립트의 발생을 초래하는 임의의 변형을 포함할 수 있다. 그러한 변형의 비제한적인 예는 삽입, 전좌, 결실, 복제, 재조합, 재배열 또는 이들의 조합을 포함한다. 그 변형 또는 변화는 단지 몇몇 염기로부터 여러 킬로베이스로 크기가 크게 다양할 수 있고, 바람직하게는 그 변형은 실질적인 결실 또는 다른 대규모 게놈의 수차를 초래한다.
그러한 돌연변이의 존재를 검출하기 위한 DNA의 검출은 업계-인식된 방법을 사용하고, 이어서 미토콘드리아 게놈의 모든 영역 또는 하나의 영역을 증폭시킴으로써 발생할 수 있고, 분자 생물학의 현행 프로토콜에 기재된 바와 같이 미토콘드리아 게놈의 서열화를 포함할 수 있다. 대안으로, 관심있는 특이적 단편의 증폭을 요구하지 않는 기술뿐만 아니라 조잡한 조직 균질물이 사용될 수 있다.
돌연변이를 검출하는 단계는 당업계의 기술자들에게 공지된 바의 임의의 기술로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, mtDNA를 분석하는 것은 DNA를 분지화하고, mtDNA를 서열화하고, mtDNA를 PCR, 써던, 노던, 웨스턴 사우쓰-웨스턴 블롯 혼성화에 의해 증폭하고, HPLC를 변성하고, 마이크로어레이, 비이오칩 또는 유전자 칩, 분자 마커 분석, 바이오센서에 대해 혼성화하고, 용융 온도 프로파일링 또는 상기한 것들 중의 임의의 조합에 의한 표적의 선택을 포함할 수 있다.
서열 미토콘드리아 DNA에 대한 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있다. 바람직하게는, mtDNA는 서열화에 앞서 PCR에 의해 증폭된다. PCR 방법은 당업계에 공지되어 있고 문헌[MuINs and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. PCR 제품은 벡터 내로 직접적으로 서열화되거나 또는 클론화될 수 있고 이는 다시 세균 호스트 내에 놓인다. DNA 서열화 방법의 예는 문헌[Brumley, R. L. Jr. and Smith, L. M., 1991, 수평형 초박 겔 전기영동에 의한 고속 DNA 서열화, Nucleic Acids Res. 19:4121-4126 and Luckey, J.A., et al, 1993, 모세관 겔 전기영동에 의한 고속 DNA 서열화, Methods Enzymol. 218: 154-172]에서 발견되었다. PCR 및 mtDNA의 서열화의 조합된 사용은 문헌[Hopgood, R., et al, 1992, PCR 제품으로부터 직접적으로 인간 mtDNA를 자동 서열화하기 위한 전략, Biotechniques 13:82-92 and Tanaka, M. et al, 1996, mtDNA의 자동 서열화, Methods Enzymol. 264: 407-421]에 기재되어 있다.
다양한 프라이머를 제조하기 위한 적합한 서열을 선택하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 프라이머는 Applied Biosystems USA Inc. (Foster City, California), DuPont, (Wilmington, Del.), 또는 Milligen (Bedford, Mass.)로부터 입수할 수 있는 것들과 같이 상업적으로 입수할 수 있는 장비를 사용하여 통상의 고체-상 합성을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따라, 후보 게놈의 서열을 결정하기 위해, 서열 결실의 접함점이 먼저 확인된다. 서열 결실은 주로 5' 및 3' 말단에서 삭제되어야 할 서열의 측면에 위치하는 직접 및 간접 반복 요소들에 의해 확인된다. 게놈으로부터 뉴클레오티드 섹션의 제거에 이어 게놈의 결찰은 신규한 접합점의 생성을 초래한다.
접합점의 식별에 따라, 접합점의 측면에 위치하는 유전자의 뉴클레오티드는 스플라이스된 유전자를 식별하기 위해 결정된다. 통상적으로 스플라이스된 유전자는 제1 유전자로부터 개시 코돈 및 제2 유전자로부터 종결 코돈을 포함하고, 연속 트랜스크립트 즉, 리딩 프레임을 시작점으로부터 두 스플라이스된 유전자의 말단으로 유지하는 것으로부터 발현될 수 있다. 유전자 서열 내에 함유된 대안의 개시 또는 종결 코돈은 본원에 기재된 서열번호 2 및 서열번호 17에 의해 명백한 것으로 사용될 수 있다. 개방된 리딩 프레임 (ORF)을 갖는 것으로 발견된 일부 공지된 미토콘드리아 결실은 재배열된 서열이 스플라이스 부위에서 재결합되는 경우 표 1에 제공된다.
실험실에서 존재하는 것으로 검증된 본 발명의 방법에 사용하기 위한 예시적인 mtDNA 분자가 이래 제공된다. 이들 mtDNA는 공지된 미토콘드리아 게놈 (서열번호 1)의 변형에 기초하며 융합 또는 "FUS" 지정을 할당하여 왔으며, 여기서 A:B는 제1의 스플라이스된 유전자의 최종 미토콘드리아 뉴클레오티드와 제2의 스플라이스된 유전자의 제1의 미토콘드리아 뉴클레오티드 사이의 접합점을 나타낸다. 스플라이스된 유전자의 식별은 대응하는 서열 식별자에 의해 괄호로 제공된다. 아래 제공되는 경우, (AltMet) 및 (OrigMet)은 대안 및 원시 해독 시작 부위 각각을 의미한다.
FUS 8469:13447 (AltMet) (ATP 신타제 FO 서브유니트 8 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트) (서열번호 2)
FUS 10744:14124 (NADH 데히드로게나제 서브유니트 4L (ND4L) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 3)
FUS 7974:15496 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 II (COM) 내지 사이토크롬 b (Cytb)) (서열번호 4)
FUS 7992:15730 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 II (COM) 내지 사이토크롬 b (Cytb)) (서열번호 5)
FUS 8210:15339 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 II (COM) 내지 사이토크롬 b (Cytb)) (서열번호 6)
FUS 8828:14896 (ATP 신타제 FO 서브유니트 6 (ATPase6) 내지 사이토크롬 b (Cytb)) (서열번호 7)
FUS 10665:14856 (NADH 데히드로게나제 서브유니트 4L (ND4L) 내지 사이토크롬 b (Cytb)) (서열번호 8)
FUS 6075:13799 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 I (COI) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 9)
FUS 6325:13989 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 I (COI) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 10)
FUS 7438:13476 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 I (COI) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 11)
FUS 7775:13532 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 II (COM) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 12)
FUS 8213:13991 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 II (COM) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 13)
FUS 9191 :12909 (ATP 신타제 FO 서브유니트 6 (ATPase6) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 14)
FUS 9574:12972 (사이토크롬 c 옥시다제 서브유니트 III (COIN) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 15)
FUS 10367:12829 (NADH 데히드로게나제 서브유니트 3 (ND3) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 16)
FUS 8469: 13447 (OrigMet) (ATP 신타제 FO 서브유니트 8 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트) (서열번호 17)
FUS 9144:13816 ((ATP 신타제 FO 서브유니트 6 (ATPase6) 내지 NADH 데히드로게나제 서브유니트 5 (ND5)) (서열번호 51)
본 발명은 또한 암을 예측, 진단 및/또는 모니터링하기 위한 이들 서열의 변이체 또는 단편의 용도를 제공한다
"변이체"는 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 mtDNA 서열과 상이하지만, 그의 필수적인 특성을 보유하는 핵산을 의미한다. 일반적으로, 변이체들은 전체적으로 매우 유사하고, 많은 영역에서 선택된 mtDNA 서열과 동일하다. 구체적으로, 본 발명의 변이체는 스플라이스된 유전자의 접합점의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하고, 그에 인접한 1개 이상의 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 변이체 서열은 본 발명의 mtDNA 서열 또는 그에 대해 상보적인 스트랜드 중의 임의의 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
본 발명에서, "단편"은 기재된 게놈의 서열, 또는 그에 상보적인 스트랜드에 함유된 것의 일부인 짧은 핵산 서열을 의미한다. 이러한 부분은 스플라이스된 유전자의 접합점을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하고, 그에 인접한 1개 이상의 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 단편은 바람직하게는 적어도 약 15 nt, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 nt, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 30 nt, 한층 더 바람직하게는 적어도 약 40 nt, 적어도 약 50 nt, 적어도 약 75 nt, 또는 적어도 약 150 nt의 길이다. "적어도 20 nt 길이"의 단편은 예를 들면, 상기 mtDNA 서열 중의 임의의 것의 20개 이상의 접촉하는 베이스를 포함하도록 의도된다. 이러한 맥락에서 "약"은 한쪽 말단이나 또는 양쪽 말단에서 여러 (5, 4, 3, 2, 또는 1) 뉴클레오티드에 의해 특정하게 인용된 값, 더 큰 값 또는 더 작은 값을 포함한다. 이들 단편은 본원에 고찰된 바의 진단 프로브 및 프라이머로서 이들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 용도를 갖는다. 물론, 더 큰 단편 (예, 50, 150, 500, 600, 2000 뉴클레오티드)이 역시 예상된다.
따라서, 본 발명의 특정 구체예에서, mtDNA 서열은 다음:
서열번호 2 (FUS 8469:13447; AltMet)
서열번호 3 (FUS 10744:14124)
서열번호 4 (FUS 7974:15496)
서열번호 5 (FUS 7992:15730)
서열번호 6 (FUS 8210:15339)
서열번호 7 (FUS 8828:14896)
서열번호 8 (FUS 10665:14856)
서열번호 9 (FUS 6075:13799)
서열번호 10 (FUS 6325:13989)
서열번호 11 (FUS 7438:13476)
서열번호 12 (FUS 7775:13532)
서열번호 13 (FUS 8213:13991)
서열번호 14 (FUS 9191 :12909)
서열번호 15 (FUS 9574:12972)
서열번호 16 (FUS 10367:12829)
서열번호 17(FUS 8469:13447; OrigMet)
서열번호 51 (FUS 9144:13816), 및 이들의 단편 또는 변종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
프로브
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 비정상적인 mtDNA 서열을 인식할 수 있는 혼성화 프로브를 제공하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "프로브"라는 용어는 프로브 내의 적어도 하나의 서열과 표적 영역 내의 서열의 상보성으로 인해 표적 핵산 내의 서열과 듀플렉스 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 당업계에 공지된 방법에 따라 라벨링될 수 있다.
특정 질병과 연관된 비정상적인 mtDNA가 일단 식별되면, 예를 들면 mtDNA의 올리고뉴클레오티드의 어레이에 대한 혼성화는 특정 돌연변이를 식별하기 위해 사용될 수 있지만, 임의의 공지된 혼성화 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 프라이머들에 의해서와 같이, 프로브는 본 발명의 예시적인 mtDNA 융합 분자에 반하여, 또는 그의 단편 또는 변이체에 직접적으로 발생될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2-17 및 51에 나타낸 서열 및 표 1에 기재된 것들은 관심있는 융합 서열을 포함하는 핵산 서열을 검출할 프라이머 또는 프로브를 고안하도록 사용될 수 있다. 당업계의 숙련자들에 의해 이해되는 바와 같이, 이들 핵산 분자를 혼성화시키는 프라이머 또는 프로브는 고도로 엄격한 혼성화 조건 또는 더 낮은 엄격화 조건 하에 그렇게 혼성화될 수 있고, 그러한 조건은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 분자 생물학의 현행 프로토콜 [(John Wiley & Sons, New York (1989)), 6.3.1-6.3.6]에서 발견된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 프로브는 스플라이스된 유전자의 접합점을 포함하는 비정상적인 mtDNA의 적어도 일부에 상보적인 서열을 함유한다. 이러한 부분은 접합점 A:B에 연루된 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하고, 그에 인접한 1개 이상의 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명은 접합점 A:B에 연루된 및/또는 인접한 뉴클레오티드를 사용하여 mtDNA 분자를 선택할 임의의 적합한 표적화 메카니즘을 포함한다.
당업계에 공지된 여러 가지 유형의 프로브는 본 발명에 의해 예상된다. 예를 들면, 프로브는 혼성화 프로브일 수 있고, 그의 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 결합은 브롬화 에티듐, SYBR® Green, SYBR® Gold 등의 일반적인 DNA 결합 염료를 사용하여 검출될 수 있다. 대안으로, 프로브는 1개 이상의 검출가능한 라벨을 혼입할 수 있다. 검출 가능한 라벨은 그의 성질 또는 특성이 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 분자 또는 모이어티이고, 프로브가 그의 표적 서열에 의해 혼성화되는 능력이 영향을 받지 않도록 선택된다. 핵산 서열을 라벨링하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들면, Ausubel et at., (1997 & updates) 분자 생물학에서 현행 프로토콜, Wiley & Sons, New York 참조).
본 발명의 프로브에 의해 사용하기 적합한 라벨은 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광단, 효소, 콜로이드성 입자, 형광 마이크로입자, 등과 같이 직접적으로 검출될 수 있는 것들을 포함한다. 당업계의 숙련자는 직접적으로 검출할 수 있는 라벨이 이 라벨의 검출이 가능하도록 기질, 트리거링 시약, 빛 등과 같은 추가의 성분을 요구할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 또한 간접적으로 검출된 라벨의 사용을 예상한다.
본 발명의 프로브는 바람직하게는 적어도 약 15 nt, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 nt, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 30 nt, 한층 더 바람직하게는 적어도 약 40 nt, 적어도 약 50 nt, 적어도 약 75 nt, 또는 적어도 약 150 nt의 길이이다. "적어도 20 nt 길이"의 프로브는 예를 들면, 본 발명의 mtDNA 서열에 상보적인 2개 이상의 접촉 염기를 포함하도록 의도된다. 물론, 더 큰 프로브 (예, 50, 150, 500, 600, 2000 뉴클레오티드)가 바람직할 수 있다.
본 발명의 프로브는 또한 생물학적 샘플 내의 핵산 분자에 혼성화될 것이고, 그로 인해 본 발명의 방법을 가능케 한다. 따라서, 본 발명의 일 측면에서, 암을 검출하는데 사용하기 위한 혼성화 프로브가 제공되고, 여기서 프로브는 비정상적인 mtDNA 분자의 적어도 일부에 상보적이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 고환암, 전립선암 및/또는 흑색종 피부암의 검출을 위해 프로브 및 그러한 프로브의 사용(또는 그를 사용한 방법)을 제공한다.
분석
생물학적 샘플에서 비정상적인 mtDNA의 레벨을 측정함으로써 피검자에서 1개 이상의 암의 존재를 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 1개 이상의 생물학적 샘플을 수득하고, 샘플로부터 mtDNA를 추출하고, 샘플 내의 1개 이상의 비정상적인 mtDNA 서열의 양을 정량화하고 검출된 정량을 기준 값과 비교함으로써 비정상적인 mtDNA에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는, 암을 예측하거나, 진단하거나 또는 모니터링하는 방법을 포함한다. 당업계의 숙련자들이 이해하는 바와 같이, 기준 값은 그 방법이 암을 예측하거나, 진단하거나 또는 모니터링하고자 하는지 여부에 기초한다. 따라서, 기준 값은 1개 이상의 공지된 비-암성 생물학적 샘플로부터, 1개 이상의 공지된 암성 생물학적 샘플로부터, 및/또는 시간이 경과함에 따라 취한 1개 이상의 생물학적 샘플로부터 수집된 mtDNA 데이터에 관련할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 비정상적인 미토콘드리아 DNA의 존재에 대해 포유동물로부터 조직 샘플을 분석하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 혼성화 프로브로 샘플을 혼성화함으로써 포유동물로부터 조직 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 프로브는 본원에 기재된 바의 본 발명의 돌연변이체 미토콘드리아 DNA 서열에 반하여 발생될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 분석이 다음:
a) 적어도 하나의 프로브가 상보적인 비정상적인 미토콘드리아 DNA 서열에 혼성화되도록 적어도 하나의 프로브를 사용하여 혼성화 반응을 수행하는 단계;
b) 적어도 하나의 프로브에 혼성화된 미토콘드리아 DNA의 양을 정량화함으로써 샘플 내의 적어도 하나의 비정상적인 미토콘드리아 DNA 서열의 양을 정량화하는 단계; 및,
c) 샘플 내의 미토콘드리아 DNA의 양을 적어도 하나의 공지된 기준 값에 비교하는 단계를 포함하는 상기한 바의 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 포함된 것은 아래 기재된 진단 이미징 분석을 포함하여 암을 예측, 진단 또는 모니터링하기 위한 방법들이다. 본 발명의 진단 분석 은 고-처리량으로 용이하게 채택될 수 있다. 고-처리량 분석은 다수의 샘플을 동시에 처리하는 장점을 제공하고 다수의 샘플을 선별하는데 요구되는 시간을 현저히 감소시킨다. 따라서, 본 발명은 복수개의 시험 샘플 내의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출 및/또는 정량화하기 위해 고-처리량 선별 또는 분석에서 본 발명의 뉴클레오티드의 사용을 예상한다.
융합 트랜스크립트
본 발명은 암을 예측, 진단 및/또는 모니터링하기 위한 방법들에서 유용한 융합 트랜스크립트 및 연관된 혼성화 프로브의 식별을 추가로 제공한다. 당업계의 숙련자라면 그러한 분자가 천연적으로-발생하는 트랜스크립트의 단리를 통해 또는, 대안으로 본 발명의 방법에 따라 단리된 mtDNAs의 재조합 발현에 의해 유도될 수 있음을 인정할 것이다. 고찰된 바와 같이, 그러한 mtDNAs는 통상적으로 제1 유전자로부터 개시 코돈 및 제2 유전자로부터 종결 코돈을 갖는 스플라이스된 유전자를 포함한다. 따라서, 이들로부터 유도된 융합 트랜스크립트는 스플라이스된 유전자와 연관된 접합점을 포함한다.
융합 트랜스크립트의 검출
천연적으로 발생하는 융합 트랜스크립트는 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있고 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 따라 식별되거나, 또는 실시예에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 안정한 폴리아데닐화된 융합 트랜스크립트는 폴리-A 테일을 갖는 트랜스크립트를 표적화한 올리고(dT) 프라이머를 사용하고, 이어서 표적 트랜스크립트에 반하여 고안된 프라이머 쌍들을 사용하여 RT-PCR에 의해 식별된다.
다음 예시적인 융합 트랜스크립트는 그러한 방법들을 사용하여 검출되었고 실시예에 지시된 바와 같이 암을 예측, 진단 및/또는 모니터링하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 마찬가지로, 표 1에서 식별된 ORF 서열로부터 유도된 융합 트랜스크립트는 본 발명의 분석 및 방법에 따라 암을 예측, 진단 및/또는 모니터링하는데 유용할 수 있다.
서열번호 18 (트랜스크립트 1;8469: 13447; AltMet)
서열번호 19 (트랜스크립트 2;10744:14124)
서열번호 20 (트랜스크립트 3;7974: 15496)
서열번호 21 (트랜스크립트 4;7992: 15730)
서열번호 22 (트랜스크립트 5;8210: 15339)
서열번호 23 (트랜스크립트 6;8828: 14896)
서열번호 24 (트랜스크립트 7;10665:14856)
서열번호 25 (트랜스크립트 8;6075: 13799)
서열번호 26 (트랜스크립트 9;6325: 13989)
서열번호 27 (트랜스크립트 10;7438: 13476)
서열번호 28 (트랜스크립트 11;7775: 13532)
서열번호 29 (트랜스크립트 12;8213:13991)
서열번호 30 (트랜스크립트 14;9191 : 12909)
서열번호 31 (트랜스크립트 15;9574: 12972)
서열번호 32 (트랜스크립트 16; 10367: 12829)
서열번호 33 (트랜스크립트 20;8469: 13447; OrigMet)
서열번호 50 (트랜스크립트 13; 9144:13816)
더욱이, 본원에 기재된 것들과 동일한 특성의 융합 트랜스크립트는 임상 종양학 분야에서 사용하기 위한 것으로 예상된다.
융합 트랜스크립트는 또한 당업계에 공지된 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 통상적으로 이것은 관심있는 mtDNA 서열을 포함하는 발현 벡터에 의한 적합한 숙주 세포의 형질전환 (형질감염, 형질 유도 또는 감염을 포함함)과 연루된다.
본원에서 식별된 융합 트랜스크립트의 변이체 또는 단편이 또한 제공된다. 그러한 서열은 게놈의 변이체 및 단편에 관하여 상기 크기 제한 및 상동성 %를 고수할 수 있거나 또는 기술자에 의해 적합한 것으로 결정될 수 있다.
또한, 트랜스크립트 1-16 및 20에 대응하는 추정되는 단백질 서열은 아래 열거된다. 가설적 융합 단백질을 인코딩하는 이들 서열은 본 발명의 추가의 구체예로서 제공된다.
서열번호 34 (트랜스크립트 1)
서열번호 35 (트랜스크립트 2)
서열번호 36 (트랜스크립트 3)
서열번호 37 (트랜스크립트 4)
서열번호 38 (트랜스크립트 5)
서열번호 39 (트랜스크립트 6)
서열번호 40 (트랜스크립트 7)
서열번호 41 (트랜스크립트 8)
서열번호 42 (트랜스크립트 9)
서열번호 43 (트랜스크립트 10)
서열번호 44 (트랜스크립트 11)
서열번호 45 (트랜스크립트 12)
서열번호 46 (트랜스크립트 14)
서열번호 47 (트랜스크립트 15)
서열번호 48 (트랜스크립트 16)
서열번호 49 (트랜스크립트 20)
서열번호 52 (트랜스크립트 13)
프로브
일단 융합 트랜스크립트가 특성화되면, 프라이머 또는 프로브는 생물학적 샘플에서 트랜스크립트를 표적화하도록 개발될 수 있다. 그러한 프라이머 및 프로브는 (상기한 바와 같이) 또는 아래 제공된 실시예들에 나타낸 바와 같이 임의의 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 프로브는 예를 들면 융합 트랜스크립트에 대해 발생될 수 있고, PanomicsTM에 의한 QuantiGene 2.0TM과 같은 검출 기술이 샘플 내의 트랜스크립트의 존재를 검출하기 위해 사용되었다. 프라이머 및 프로브는 본 발명의 예시적인 융합 트랜스크립트에 반하여 직접적으로, 또는 그의 단편 또는 변이체에 대해 발생될 수 있다. 예를 들면, 표 1에 나타낸 서열들 뿐만 아니라 서열번호 18-33 및 50에 나타낸 서열이 관심있는 융합 서열을 포함하는 핵산 서열을 검출할 프로브를 고안하기 위해 사용될 수 있다.
당업계의 숙련자들이 이해할 수 있듯이, 본 발명의 융합 트랜스크립트에 혼성화하도록 고안된 프로브는 스플라이스된 유전자의 접합점을 발현하는 트랜스크립트의 적어도 일부에 상보적인 서열을 함유한다. 이 부분은 발현된 접합점에 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하고, 그에 인접한 1개 이상의 상보적 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명은 스플라이스된 유전자의 접합점에 인접하고 포함된 뉴클레오티드를 사용하는 융합 트랜스크립트를 선택할 임의의 적합한 표적화 메카니즘을 포함한다.
당업계에 공지된 다양한 타입의 프로브 및 라벨링 방법이 트랜스크립트 프로브의 제조를 위해 예상된다. 그러한 타입 및 방법은 게놈의 서열 검출에 관련하여 상기 기재되어 있다. 본 발명의 트랜스크립트 프로브는 바람직하게는 적어도 약 15 nt, 더 바람직하게는 적어도 약 20 nt, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30 nt, 한층 더 바람직하게는, 적어도 약 40 nt, 적어도 약 50 nt, 적어도 약 75 nt, 또는 적어도 약 150 nt의 길이이다. "적어도 20 nt 길이"의 프로브는 예를 들면, 본 발명의 mtDNA 서열에 상보적인 20개 이상의 접촉 염기를 포함하도록 의도된다. 물론, 더 큰 프로브 (예, 50, 150, 500, 600, 2000 뉴클레오티드)가 바람직할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 암을 검출하는데 사용하기 위한 혼성화 프로브를 제공하고, 여기서 프로브는 상기 제공된 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 적어도 일부에 상보적이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 고환암, 전립선암 또는 흑색종 피부암의 검출을 위해 프로브 및 그러한 프로브의 사용(또는 그를 사용한 방법)을 제공한다.
분석
생물학적 샘플에서 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 레벨을 측정함으로써 피검자에서 1개 이상의 암의 존재를 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 1개 이상의 생물학적 샘플을 수득하고, 샘플로부터 미토콘드리아 RNA를 추출하고, 샘플 내의 1개 이상의 융합 트랜스크립트의 양을 정량화하고 검출된 정량을 기준 값과 비교함으로써 융합 트랜스크립트에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는, 암을 예측하거나, 진단하거나 또는 모니터링하는 방법을 포함한다. 당업계의 숙련자들이 이해하는 바와 같이, 기준 값은 그 방법이 암을 예측하거나, 진단하거나 또는 또는 모니터링하고자 하는지 여부에 기초한다. 따라서, 기준 값은 1개 이상의 공지된 비-암성 생물학적 샘플로부터, 1개 이상의 공지된 암성 생물학적 샘플로부터, 및/또는 시간이 경과함에 따라 취한 1개 이상의 생물학적 샘플로부터 수집된 트랜스크립트에 관련할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 암의 검출 방법을 제공하고, 이 방법은 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 갖는 적어도 하나의 혼성화 프로브로 샘플을 혼성화함으로써 본 발명의 적어도 하나의 융합 트랜스크립트의 존재에 대해 상기 포유동물로부터 조직 샘플을 분석하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 분석이 다음:
a) 적어도 하나의 프로브가 상보적인 비정상적인 미토콘드리아 융합 트랜스크립트에 혼성화되도록 적어도 하나의 프로브를 사용하여 혼성화 반응을 수행하는 단계;
b) 적어도 하나의 프로브에 혼성화된 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 양을 정량화함으로써 샘플 내의 적어도 하나의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 양을 정량화하는 단계; 및,
c) 샘플 내의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 양을 적어도 하나의 공지된 기준 값에 비교하는 단계를 포함하는 상기한 바의 방법을 제공한다.
상기 고찰한 바와 같이, 본 발명의 진단 분석은 본원에 기재된 바의 진단 방법 및 선별 도구를 포함하고 고-처리량에 대해 용이하게 채택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 복수개의 시험 샘플 내의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출 및/또는 정량화하기 위해 고-처리량 선별 또는 분석에서 본 발명의 융합 트랜스크립트 및 연관된 프로브의 사용을 예상한다.
진단 방법 및 선별 도구
특이적 질병을 진단하거나 또는 특이적 미토콘드리아 돌연변이를 식별하기 위한 방법 및 선별 도구가 또한 여기서 예상된다. 임의의 공지된 혼성화 방법은 분지된 DNA 및 qPCR, 두 단일-플렉스 및 멀티-플렉스와 같이 프로브/프라이머 기재 기술을 포함하지만 이것으로만 제한되지 않는 그러한 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 기술, 야생형 또는 돌연변이된 영역을 매치시키는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 제어 프로브를 갖는 어레이 기술이 사용될 수도 있다. 마이크로어레이 또는 유전자 칩과 같이 상업적으로 입수할 수 있는 어레이가 적합하다. 이들 어레이는 슬라이드 또는 마이크로칩 상에 프로브의 수천 개의 매치된 쌍 및 제어 쌍을 함유하고, 전체 게놈을 매우 신속하게 서열화할 수 있다. 게놈 및 DNA 서열에서 마이크로어레이의 사용을 기재하는 다시보기 기사는 온라인으로 입수할 수 있다.
주어진 생물학적 조건에 관련된 표적을 식별하도록 고안된 선별 도구는 특정 질병 또는 질환과 연관된 핵산의 특이적 배열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에 따라, 1개 이상의 암과 연관된 것들을 식별하기 위해 10's, 100's, 또는 1000's의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트를 갖는 마이크로어레이로 구성된 선별 도구가 제공된다. 또 다른 구체예에 따라, 1개 이상의 암과 연관된 것들을 식별하기 위해 미토콘드리아 융합 트랜스크립트에 대응하는 10's, 100's, 또는 1000's의 미토콘드리아 DNA를 갖는 마이크로어레이로 구성된 선별 도구가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 1개 이상의 암과 연관된 것들을 식별하기 위해 10's, 100's, 또는 1000's의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트를 갖는 멀티플렉스 브랜치된 DNA 분석으로 구성된 선별 도구가 제공된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 1개 이상의 암과 연관된 것들을 식별하기 위해 미토콘드리아 융합 트랜스크립트에 대응하는 10's, 100's, 또는 1000's의 미토콘드리아 DNA를 갖는 멀티플렉스 브랜치된 DNA 분석으로 구성된 선별 도구가 제공된다.
임상 종양학 분야에서 유용한 접근법이 또한 여기서 예상되고 양전자 방사 단층촬영 (PET), 콘트라스트 자기 공명 영상화 (MRI) 등과 같은 진단 영상화 기술을 포함할 수 있다. 이들 진단 방법은 당업계의 숙련자들에게 잘 알려져 있고, 암의 진단 및 예후에 유용하다.
진단 모니터링
본 발명의 방법은 1개 이상의 분석의 결과에 기초한 치료 과정 또는 모니터링 레짐을 추천하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 환자의 암의 진행 (초기 또는 후속 돌연변이가 발생한 때를 인지함으로써 등) 또는 치료 (돌연변이가 안정화된 때를 인지함으로써 등)를 모니터링함으로써 예를 들면 암 치료법과 같이 내과의사들이 맞춤형 의료를 시행할 수 있게 한다.
현재 다루고 있는 서열 변화의 경계를 알게 됨에 따라, 그 정보는 전-암성 상태 또는 존재하는 암 상태를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 시간이 경과함에 따라 연속적인 샘플 내의 비정상적인 mtDNA의 양을 정량화함으로써, 암 증상의 진행이 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 야생형으로부터 돌연변이의 제1 세트를 검출하기 위해 제시간 내의 일 시점에 환자의 조직을 분석함으로써 제공된 데이터는 분석, 수차의 변화가 발생된 경우를 결정하기 위해 후속 분석으로부터 제공된 데이터에 반하여 비교될 수 있다.
암의 증상을 아직 발전시키지 않은 개체에서 돌연변이가 발견되는 경우, 그 돌연변이는 암 상태를 발전시킬 유전적 민감성을 지시할 수 있다. 질병에 대한 민감성의 측정 또는 그의 존재의 진단은 존재하는 경우 환자의 가족 병력에서 암 증상 및 다른 위험 인자의 존재, 예를 들면 환경 인자에 대한 노출의 만연 및 환자의 세포가 또 다른 종류의 돌연변이를 수반하는지 여부에 관한 정보에 기초한 정성적 기반으로 추가로 평가될 수 있다.
생물학적 샘플
본 발명은 1개 이상의 생물학적 샘플을 획득 또는 수집하는 것을 포함하는 진단 시험을 제공한다. 본 발명의 맥락에서, "생물학적 샘플"은 그로부터 mtDNA 및 mtRNA가 획득될 수 있는 세포를 함유하는 조직 또는 체액에 관한 것이다. 예를 들면, 생물학적 샘플은 피부, 폐, 유방, 전립선, 신경, 근육, 심장, 위, 결장, 직장 조직 등을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 조직으로부터; 또는 혈액, 타액, 뇌 척수액, 가래, 소변, 점액, 관절낭액, 복막액, 양수 등으로부터 유도될 수 있다. 생물학적 샘플은 암성 또는 비-암성 조직으로부터 획득될 수 있으며, 수술 표본 또는 생검 표본일 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
생물학적 샘플은 이 샘플의 특성을 변조시키기 위해, 소스로부터 획득된 바와 같이 직접적으로 또는 전처리 후에 사용될 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플은 예를 들면, 플라즈마 또는 혈청을 혈액으로부터 제조하고, 세포들을 분쇄하고, 고체 물질로부터 액체를 제조하고, 점성 유체를 희석시키고, 액체를 여과하고, 액체를 증류시키고, 액체를 농축시키고, 간섭하는 성분을 불활성화시키고, 시약을 첨가하는 등에 의해 사용 전에 전처리될 수 있다.
당업계의 숙련자는 1개 이상의 샘플 타입이 단일회로 분석될 수 있음을 (즉, 1개 이상의 암을 검출하기 위해) 이해할 것이다. 더욱이, 수집 과정이 예를 들면, 시간이 경과함에 따라 암을 모니터링하기 위해 요구되는 경우, 주어진 샘플은 단독으로 또는 시험 기간 전반에 취해진 다른 샘플과 함께 진단될 수 있다. 이러한 관점에서, 생물학적 샘플은 1회만, 또는 2주로, 매달, 반년에 또는 매년 등과 같이 규칙적인 간격으로 취해질 수 있다.
키트
본 발명은 임상적 환경에서 암을 검출하기 위한 진단/선별 키트를 제공한다. 그러한 키트는 본 발명에 따른 1개 이상의 프로브와 조합하여 1개 이상의 샘플링 수단을 포함할 수 있다.
키트는 임의로 완충액, 염, 검출 시약 등과 같이 진단 분석을 수행하기 위해 요구되는 시약을 포함할 수 있다. 완충액 및 생물학적 샘플의 단리 및/또는 처리를 위해 필요한 용액 등과 같은 다른 성분들이 또한 키트에 포함될 수 있다. 키트의 1개 이상의 성분들은 동결 건조될 수 있고, 키트는 동결 건조된 성분들의 재구성을 위해 적합한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
적합한 경우, 키트는 반응 용기, 혼합 용기 및 시험 샘플의 제조를 촉진시키는 다른 성분들을 함유할 수도 있다. 이 키트는 또한 종이 형태로 또는 컴퓨터-판독 가능한 형태로, 예를 들면 디스크, CD, DVD 등으로 제공될 수 있는 설명서를 임의로 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서 샘플링 수단 및 본 발명의 혼성화 프로브를 포함하는 암을 진단하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 여러 가지 측면은 다음 실시예들을 사용하여 예시적으로 기재될 것이다. 본원에 제공된 실시예들은 단지 본 발명의 특정 특정 구체예들을 예시하도록 작용하며 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하고자 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 검출
PCT 출원 제PCT/CA2007/001711호 (그의 전체 내용은 참고로 혼입됨)에서 본 출원인에 의해 이미 확인된 미토콘드리아 4977 "공통 결실" 및 3.4kb 결실은 전립선 조직에서 올리고--dT 선택에 의해 식별된 바 활성 트랜스크립트를 갖는 독특한 개방된 리딩 프레임을 초래한다(도 2 및 3). 유방 조직 샘플의 조사는 또한 3.4kb 결실로부터 기인하는 안정한 폴리아데닐화된 융합 트랜스크립트의 존재를 드러낸다 (도 4).
결실 트랜스크립트 검출을 위한 역 트랜스크립타제-PCR 프로토콜
RNA 단리 cDNA 합성
전체 RNA는 제조자의 설명서에 따라 AurumTM 전체 RNA 지방 및 섬유상 조직 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 스냅 냉동된 전립선 및 유방 조직 샘플 (종양에 인접한 악성 및 정상 샘플 모두)로부터 단리되었다. 이 실험에서, 게놈의 DNA 오염이 피해져야 했기 때문에, DNase I 치료 단계가 당업계에 공통적으로 공지된 바의 방법을 사용하여 포함되었다. RNA 정량 및 품질은 ND-1000 분광 광도계 (NanoDrop® 테크놀로지스)에 의해 결정되었다. 약 10Og의 출발 물질로부터, 전체 RNA 농도는 1.89 - 2.10 사이에서 260/280 비율로 100 - 1000ng/ul로부터 변화하였다. RNA 농도는 100ng/ul로 조절되었고 각각의 템플릿 2ul가 제조업자 의 설명서에 따라 RT-PCR (Invitrogen)을 위해 SuperscriptTM 제1-스트랜드 합성 시스템에 의해 제1 표준 DNA 합성을 위해 사용되었다. 안정한 폴리아데닐화된 융합 트랜스크립트를 확인하기 위해, 폴리-A 꼬리를 갖는 트랜스크립트를 표적화하는 올리고(dT) 프라이머가 사용되었다.
PCR
실시간 PCR은 DNA 엔진 Opticon® 2 연속 형광 검출 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 iQTM SYBR® 그린 수퍼믹스 (Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 각각의 cDNA 템플릿 5ul를 사용하여 수행되었다. 4977bp 결실을 표적화한 프라이머 쌍은 다음; 8416F 5'-CCTTACACTATTCCTCATCAC-3', 13637R 5'- TGACCTGTTAGGGTGAGAAG-3'이고, 3.4 kb 결실에 대한 것들은 다음; ND4LF 5'- TCGCTCACACCTCATATCCTC-3', ND5R 5'-TGTGATTAGGAGTAGGGTTAGG-3'이다. 반응 칵테일은 다음을 포함하였다: 2X SYBR® 그린 수퍼믹스 (10OmM KCL, 4OmM 트리스-HCI, pH 8.4, 0.4mM의 각각의 dNTP [dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP], iTaqTM DNA 폴리머라제, 50 유니트/ml, 6mM MgCI2, SYBR® 그린 1, 2OnM 플루오레세인, 및 안정제), 25OnM의 각각의 프라이머, 및 ddH2O. PCR 사이클링 파라메터들은 다음과 같았다; (1) 95℃에서 2분 동안, (2) 95℃에서 30초 동안, (3) 55℃ (4977bp 결실에 대해) 및 63℃ (3.4 kb 결실에 대해)에서 30초 동안, (4) 72℃에서 45초 동안, (5) 단계 3 내지 5의 39 주기, 및 4℃에서 최종 인큐베이션 후 판독된 플레이트. 사이클링 임계값 및 용융 곡선 분석과 별도로, 샘플은 증폭 제품의 특이적 가시화를 위해 아가로스 겔 상에서 수행되었다 (도 2 내지 4 참조).
도 2는 미토콘드리아 게놈으로부터 3.4kb의 손실에 의해 환기된 전립선 샘플 내의 폴리아데날화된 융합 트랜스크립트를 보여주는 아가로스 겔이다. 도 2에 대한 범례: B-블랭크, 레인 1-6, cDNA에서 검출된 트랜스크립트; 레인 7-12, 레인 1-6에서 샘플에 대한 어떠한 역 트랜스크립타제 (RT) 대조군도 없음.
도 3은 4977kb 공통 결실의 손실에 의해 환기된 전립선 샘플에서 폴리아데날화된 융합 트랜스크립트를 보여준다. 도 3에 대한 범례: B-블랭크, 레인 1 -6, cDNA에서 검출된 트랜스크립트; 레인 7-12, 레인 1-6에서 샘플에 대한 어떠한 RT 대조군도 없음.
도 4는 mt게놈으로부터 3.4kb의 손실에 의해 환기된 유방 샘플 내의 폴리아데날화된 융합 트랜스크립트를 보여준다. 도 4에 대한 범례: 레인 2-8, 유방 cDNAs로부터 트랜스크립트; 레인 9, 음의 (물) 대조군; 레인 10 및 11, 레인 2 및 3에서 샘플에 대한 음의 어떠한 RT도 없는 대조군.
이들 결과는 안정한 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 존재를 나타낸다.
실시예 2: 융합 제품의 식별 및 타겟화
다양한 혼성화 프로브는 3.4kb 결실 등과 같이 돌연변이된 미토콘드리아 게놈으로부터 기인하는 신규 트랜스크립트의 존재를 검출하고, 추가로 나타내도록 고안되었다. 이러한 목적을 위해, 정량적 유전자 발현 분석을 위한 단일-플렉스 분지된 DNA 플랫폼 (QuantiGene 2.0TM, PanomicsTM)이 이용되었다. 본 실시예에서 특이적 결실 및 열거된 서열은 서열번호 1에 인용된 전체 mtDNA 게놈과 이들의 상대적 위치에 기초한다. 프로브가 이 실시예에서 고안된 4개의 트랜스크립트의 핵산 서열은 여기서 다음과 같이 식별되었다: 트랜스크립트 1 (서열번호 18), 트랜스크립트 2 (서열번호 19), 트랜스크립트 3 (서열번호 20) 및 트랜스크립트 4 (서열번호 21).
3.4kb 미토콘드리아 게놈 결실로부터 연속 트랜스크립트의 예는 유전자 ND4L (NADH 데히드로게나제 서브유니트 4L) 및 ND5 (NADH 데히드로게나제 서브유니트 5)에 의해 발생한다. 서열번호 19에 대한 상보적 서열을 갖는 프로브가 트랜스크립트 2를 검출하기 위해 사용되었다. 반복적인 소자들이 ND4L에서 위치 10745-10754 및 ND5에서 14124-14133에서 발생한다.
3.4kb 결실은 ND4L의 3' 말단의 제거, 완전한 ND4 유전자, tRNA 히스티딘, tRNA 세린2, tRNA 류신2, 및 ND5의 5' 말단의 대다수 (도 5a 참조)의 제거를 초래하고, 10744(ND4L):14124(ND5)의 접합점에 의한 ND4L 및 ND5의 유전자 스플라이스를 초래한다 (도 5b). 서열번호 3은 상기 방식으로 검출된 RNA 트랜스크립트 (서열번호 19)에 대한 상보적 DNA 서열이다.
마찬가지로, 트랜스크립트 1은 ATP아제 8과 위치 8469:13447 (서열번호 18)와 연관된 ND5 사이의 융합 트랜스크립트이다. 트랜스크립트 3 및 4 (서열번호 20 및 서열번호 21, 각각)는 뉴클레오티드 위치 7974:15496 및 7992:15730 각각과 연관된 COII과 Cytb 사이의 융합 트랜스크립트이다. 표 3은 본 실시예에 사용된 여러 가지 서열 사이의 관계의 요약을 제공한다. 표 3은 검출된 융합 트랜스크립트 및 검출된 융합 트랜스크립트에 상보적인 DNA 서열이다.
실시예 3: 전립선암에 대한 적용
상기 고찰된 4개의 융합 트랜스크립트, 즉, 트랜스크립트 1 내지 4를 사용함으로써, 1인의 환자로부터 2개의 전립선 조직 샘플은 신규한 예측된 융합 트랜스크립트의 정량적 차이를 평가하기 위해 분석되었다. 실험 결과는 아래 표 2에 제공되고, 여기서 "Homog 1"은 환자로부터 냉동된 전립선 종양 조직의 호모제네이트를 의미하고, "Homog 2"는 환자의 종양에 인접한 냉동된 정상적 전립선 조직의 호모제네이트를 의미한다. 이들 샘플은 25.8 mg의 Homog 1 및 28.9 mg의 Homog 2으로 시작하여 제조자의 프로토콜 (신선한 동물 조직 및 냉동된 동물 조직에 대한 QuantiGene® 샘플 프로세싱 키트; 및 QuantiGene® 2.0 시약 시스템 사용자 매뉴얼) 에 따라 처리되었다 (분석 셋업은 표 5a 및 5b에 나타낸다).
분명히 나타낸 것은 정상적인 인접 전립선 조직에 비교하여 전립선암 조직 내의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 증가된 존재이다. 융합 트랜스크립트는 훨씬 더 낮은 레벨이더라도 정상적인 조직 내에 존재한다. 프로브를 표적 트랜스크립트에 혼성화시킴으로써 발생된 상대적인 발광 유니트 (RLU)는 풍부한 각각의 트랜스크립트에 직접적으로 비례한다. 표 2는 또한 샘플에 대해 취해진 판독치의 백분율로서 표현된 변화 계수, CV를 지시한다. CV는 값들의 평균으로 나뉜 표준 편차를 포함한다. 암 조직 내의 그러한 안정하게 전사된 미토콘드리아 유전자 제품의 현저성은 질병 진화 및 진행에서 의미를 갖는다.
실시예 4: 유방암에 대한 적용
실시예 3으로부터와 동일하지만 단지 3.4kb mt게놈 결실과 연관된 신규 융합 트랜스크립트인 트랜스크립트 2에만 초점을 맞춘 프로토콜을 사용함으로써, 분석은 유방 종양 조직의 2개의 샘플 및 그들 종양에 인접한 종양이 없는 조직의 2개의 샘플, 뿐만 아니라 인접한 종양이 없는 조직을 포함하는 하나의 샘플인 전립선 종양 조직의 3개의 샘플 상에서 수행되었다. 이러한 실시예에 대한 결과는 표 4에 제공된다. 대응하는 정상 조직 섹션을 갖는 전립선 종양 조직 샘플은 종양 조직이 정상의 인접 조직이 가진 양보다 대략적으로 2배의 양의 융합 트랜스크립트를 갖는다는 점에서 실시예 3에서 분석된 전립선 샘플에 대한 유사한 패턴을 보였다. 유방 종양 샘플은 인접한 비-종양 조직에 비교하는 경우 융합 트랜스크립트 레벨의 현저한 증가를 나타냈다. 호모제네이트의 1:100 희석은 그것이 실시예 3에 인용된 실험에서 가장 재생 가능하게 수행됨에 따라 이러한 분석을 위해 사용되었다.
따라서, 상기 고찰된 결과는 전립선 및 유방 조직 모두의 종양을 검출함에 있어서 본 발명의 트랜스크립트의 적용을 예시한다.
실시예 5: 대장암에 대한 적용
본 연구는 대장암을 검출하는데 있어서 본 발명의 여러 가지 트랜스크립트의 효과를 측정하고자 하였다. 9개의 대조군 (양성) 조직 샘플 (샘플 1 내지 9) 및 10개의 종양 (악성) 조직 샘플 (샘플 10 내지 19)을 포함하는 전체 19개의 샘플이 제조되었다. 이 샘플은 제조업자의 추천 (신선한 동물 조직 및 냉동된 동물 조직에 대한 QuantiGene® 샘플 프로세싱 키트; 및 QuantiGene® 2.0 시약 시스템 사용자 매뉴얼)에 따라 균질화되었다. 7개의 표적 트랜스크립트 및 1개의 하우스키퍼 트랜스크립트가 선행된 실시예에서 상기 개략된 방식으로 제조되었다. 트랜스크립트의 특성은 다음과 같이 요약된다:
Figure pat00001
트랜스크립트 2 및 3은 실시예 3 및 4에 관하여 상기 고찰된 것들과 동일한 것이 주지된다.
균질물은 OCT 블록으로부터 대략적으로 25mg의 조직을 사용하여 제조되고, 트랜스크립트 2 및 4에 대해 1:1로, 트랜스크립트 10 및 11에 대해 1:8로 희석된다. 트랜스크립트의 정량은 GlomaxTM 멀티 검출 시스템 (Promega) 상에서 상대적 발광 유니트 RLU에서 측정되었다. 모든 샘플은 각각의 트랜스크립트에 대해 삼중으로 분석되었다. 배경 측정 (어떠한 템플릿도 없음)은 마찬가지로 삼중으로 행해졌다. 분석은 샘플에 대해 RLU 값으로부터 하한치를 감산함으로써 배경을 고려하였다. 입력 RNA는 식 log2 a RLU - log2 h RLU을 사용함으로써 설명되고, 여기서 a는 표적 융합 트랜스크립트이고 h는 하우스키퍼 트랜스크립트이다.
다음 단계로 구성된 데이터의 분석:
a) 삼중 분석을 위해 CV (변화 계수)를 확립하고; < 15%인 경우 수락될 수 있음
b) 표적 융합 트랜스크립트(a) 및 하우스키퍼 트랜스크립트 (h)의 삼중 분석을 위한 평균 RLU 값을 확립한다.
c) 배경 RLU (I)의 삼중 값으로부터 하한치를 확립한다
d) (a)로부터 하한치 (I)를 감산한다.
e) log2 a RLU - log2 h RLU를 산출한다.
결과의 요약:
상기 분석의 결과는 도 6a 내지 6g에 예시되고, 이는 샘플수에 반하여 log2 a RLU - log2 h RLU의 플롯을 포함한다. 또한 각각의 트랜스크립트를 위한 결과로부터 결정된 각각의 ROC (수신기 작동 특성) 곡선이 예시되어 있다.
트랜스크립트 2: 정상 및 악성 그룹 (p>0.09)의 평균 (p<0.10) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재하고, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 3.6129의 컷오프 값을 사용하는 것은 60%의 민감성 및 89%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 공정한 시험 정확도를 나타내는 0.73이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 3: 정상 및 악성 그룹 (p>0.03)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재하고, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 4.0813의 컷오프 값을 사용하는 것은 60%의 민감성 및 78%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 공정한 시험 정확도를 나타내는 0.79이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 8: 정상 및 악성 그룹 (p>0.06)의 평균 (p<0.1) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재하고, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -6.0975의 컷오프 값을 사용하는 것은 60%의 민감성 및 89%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 공정한 시험 정확도를 나타내는 0.76이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 9: 정상 및 악성 그룹 (p>0.06)의 평균 (p<0.1) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재하고, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 7.5555의 컷오프 값을 사용하는 것은 60%의 민감성 및 89%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 공정한 시험 정확도를 나타내는 0.76이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 10: 정상 및 악성 그룹 (p>0.01)의 평균 (p<0.10) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재하고, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 3.8272의 컷오프 값을 사용하는 것은 90%의 민감성 및 67%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.84이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 11: 정상 및 악성 그룹 (p>0.06)의 평균 (p<0.10) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재하고, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 3.1753의 컷오프 값을 사용하는 것은 70%의 민감성 및 78%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.76이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 12: 정상 및 악성 그룹 (p>0.06)의 평균 (p<0.1) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재하고, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 3.2626의 컷오프 값을 사용하는 것은 70%의 민감성 및 78%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.76이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
결론:
상기 결과는 대장암을 검출하는데 있어서 및 정상 대장 조직으로부터 악성을 구별하는데 있어서 트랜스크립트 2, 3, 8, 9, 10, 11, 및 12의 유틸리티를 예시한다. 상기 지시된 바와 같이, 트랜스크립트 2 및 3은 또한 전립선암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 2는 또한 유방암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 11은 또한 흑색종 피부암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 10은 또한 폐암 및 흑색종의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 8 은 또한 폐암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 열거된 7개의 트랜스크립트 중 임의의 것이 임상적 세팅으로 대장암의 특성을 검출하기 위한 도구로서 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
실시예 6: 폐암에 대한 적용
본 연구는 폐암을 검출하는데 있어서 본 발명의 여러 가지 트랜스크립트의 효과를 측정하고자 하였다. 실시예 5에서와 같이, 9개의 대조군 (양성) 조직 샘플 (샘플 1 내지 9) 및 10개의 종양 (악성) 조직 샘플 (샘플 10 내지 19)이 제조업자의 추천 (신선한 동물 조직 및 냉동된 동물 조직에 대한 QuantiGene® 샘플 프로세싱 키트; 및 QuantiGene® 2.0 시약 시스템 사용자 매뉴얼)에 따라 균질화되었다. 균질물은 1:8로 희석되었고, 4개의 표적 트랜스크립트 및 1개의 하우스키퍼 트랜스크립트가 GlomaxTM 멀티 검출 시스템 (Promega) 상에서 상대적 발광 유니트 RLU에서 측정되었다. 모든 샘플은 각각의 트랜스크립트에 대해 삼중으로 분석되었다. 배경 측정 (어떠한 템플릿도 없음)은 마찬가지로 삼중으로 행해졌다.
다음 트랜스크립트는 본 실시예를 위해 제조되었다:
Figure pat00002
본 실시예에 사용된 조직 샘플은 다음 특성을 갖는다:
Figure pat00003
데이터의 분석은 실시예 5에 기재된 방법에 따라 수행되었다. 결과는 도 7a, 7b, 7c 및 7d에 예시되어 있다.
결과의 요약:
트랜스크립트 6: 정상 (양성) 및 악성 그룹 (p=0.06)의 평균 (p<0.1) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재하고, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -6.5691의 컷오프 값을 사용하는 것은 80%의 민감성 및 71%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 공정한 시험 정확도를 나타내는 0.77이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 8: 정상과 및 악성 그룹의 의미 사이의 차이는 통계학적으로 현저하다 p<0.05 (p=0.02). ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -9.6166의 컷오프 값을 사용하는 것은 90%의 민감성 및 86%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.86이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 10: 정상과 및 악성 그룹의 의미 사이의 차이는 통계학적으로 현저하다 p≤0.01 (p=0.01). ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -10.6717의 컷오프 값을 사용하는 것은 90%의 민감성 및 86%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.89이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 20: 정상과 및 악성 그룹의 의미 사이의 차이는 통계학적으로 현저하다 p≤0.1 (p=0.1). ROC 곡선에 의해 나타낸 바 2.5071의 컷오프 값을 사용하는 것은 70%의 민감성 및 71%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 공정한 시험 정확도를 나타내는 0.74이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
결론:
실시예 6으로부터의 결과는 폐암 종양을 검출하는데 있어서 및 악성 및 정상 폐 조직 사이를 구별하는데 있어서 트랜스크립트 6, 8, 10, 및 20의 유틸리티를 예시한다. 이들 3개의 트랜스크립트 중 임의의 것이 임상적 세팅으로 폐암의 결실 또는 특성화를 위해 사용될 수 있다.
실시예 7: 흑색종에 대한 적용
본 연구는 흑색종을 검출하는데 있어서 본 발명의 여러 가지 트랜스크립트의 효과를 측정하고자 하였다. 이 연구에서, 5개의 대조군 (양성) 조직 샘플 및 9개의 악성 조직 샘플을 포함하는 전체 14개의 샘플이 사용되었다. 모든 샘플은 포르말린 고정되고, 파라핀 내장되었다 (FFPE). (FFPE) 조직 샘플은 각각의 샘플이 균질화 전에 20미크론으로 대략화되도록 제조업자의 추천 (FFPE 샘플에 대한 QuantiGene® 2.0 샘플 프로세싱 키트; 및 QuantiGene® 2.0 시약 시스템 사용자 매뉴얼)에 따라 튜브 내로 섹션화되고 균질화되었다. 균질물은 1:4로 희석되었고, 7개의 표적 트랜스크립트 및 1개의 하우스키퍼 트랜스크립트의 정량이 GlomaxTM 멀티 검출 시스템 (Promega) 상에서 상대적 발광 유니트 RLU에서 측정되었다. 모든 샘플은 각각의 트랜스크립트에 대해 삼중으로 분석되었다. 배경 측정 (어떠한 템플릿도 없음)은 마찬가지로 삼중으로 행해졌다.
본 실시예에 사용된 14개의 조직 샘플은 다음 특성을 갖는다:
Figure pat00004
다음 트랜스크립트가 본 실시예를 위해 제조되었다:
Figure pat00005
지시된 바와 같이, 트랜스크립트 10 및 11은 또한 실시예 5에 사용되었다. 데이터의 분석은 실시예 5에 기재된 방법에 따라 수행되었다. 그 결과는 도 8a -8g에 예시되어 있다.
결과의 요약:
트랜스크립트 6: 정상 및 악성 그룹 (p=0.01)의 평균 (p≤0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. 추가로, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -5.9531의 컷오프 값을 사용하는 것은 89%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.96이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 10: 정상 및 악성 그룹 (p=0.05)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. 추가로, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 4.7572의 컷오프 값을 사용하는 것은 89%의 민감성 및 40%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.82이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 11: 정상 및 악성 그룹 (p=0.02)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. 추가로, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 1.6762의 컷오프 값을 사용하는 것은 78%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.89이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 14: 정상 및 악성 그룹 (p=0.05)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. 추가로, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -4.9118의 컷오프 값을 사용하는 것은 89%의 민감성 및 60%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.82이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 15: 정상 및 악성 그룹 (p=0.07)의 평균 (p<0.1) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. 추가로, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 7.3107의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 67%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.80이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 16: 정상 및 악성 그룹 (p=0.03)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. 추가로, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -10.5963의 컷오프 값을 사용하는 것은 89%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.878이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 20: 정상 및 악성 그룹 (p=0.04)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. 추가로, ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -8.3543의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.89이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
결론:
실시예 7로부터의 결과는 악성 흑색종을 검출하는데 있어서 본 발명의 트랜스크립트 6, 10, 11, 14, 15, 16 및 20의 유틸리티를 예시한다. 상기 지시된 바와 같이, 트랜스크립트 10 및 11은 또한 대장암을 검출하는데 있어서 유틸리티를 갖는 한편, 트랜스크립트 6은 폐암을 검출하는데 있어서 유틸리티를 갖는다. 질병에 의한 트랜스크립트 요약은 표 6에 제공된다.
실시예 8: 난소암에 대한 적용
본 연구는 난소암을 검출하는데 있어서 본 발명의 여러 가지 트랜스크립트의 효과를 측정하고자 하였다. 10개의 대조군 (양성) 조직 샘플 (샘플 1 내지 10) 및 10개의 종양 (악성) 조직 샘플 (샘플 11 내지 20)을 포함하는 전체 20개의 샘플이 제조되었다. 이 샘플은 제조업자의 추천 (신선한 동물 조직 및 냉동된 동물 조직에 대한 QuantiGene® 샘플 프로세싱 키트; 및 QuantiGene® 2.0 시약 시스템 사용자 매뉴얼)에 따라 균질화되었다. 8개의 표적 트랜스크립트 및 1개의 하우스키퍼 트랜스크립트가 선행된 실시예에서 상기 개략된 방식으로 제조되었다.
이 샘플에 사용된 20개의 조직 샘플은 다음 특성을 가졌다:
Figure pat00006
트랜스크립트의 특성은 다음과 같이 요약된다:
Figure pat00007
트랜스크립트 1, 2, 3, 6, 11, 12, 15 및 20은 실시예 3-7에 관하여 트랜스크립트 2 및 3은 실시예 3 및 4에 관하여 상기 고찰된 것들과 동일한 것이 주지된다.
균질물은 대략적으로 25mg의 냉동된 조직을 사용하여 제조되고, 1:4로 희석된다. 트랜스크립트의 정량은 GlomaxTM 멀티 검출 시스템 (Promega) 상에서 상대적 발광 유니트 RLU에서 측정되었다. 모든 샘플은 각각의 트랜스크립트에 대해 삼중으로 분석되었다. 배경 측정 (어떠한 템플릿도 없음)은 마찬가지로 삼중으로 행해졌다. 분석은 샘플에 대해 RLU 값으로부터 하한치를 감산함으로써 배경을 고려하였다. 입력 RNA는 식 log2 a RLU - log2 h RLU을 사용함으로써 설명되고, 여기서 a는 표적 융합 트랜스크립트이고 h는 하우스키퍼 트랜스크립트이다.
다음 단계로 구성된 데이터의 분석:
a) 삼중 분석을 위해 CV (변화 계수)를 확립하고; ≤ 15%인 경우 허용될 수 있다.
b) 표적 융합 트랜스크립트(a) 및 하우스키퍼 트랜스크립트 (h)의 삼중 분석을 위한 평균 RLU 값을 확립한다.
c) 배경 RLU (I)의 삼중 값으로부터 하한치를 확립한다
d) (a)로부터 하한치 (I)를 감산한다.
e) log2 a RLU - log2 h RLU를 산출한다.
결과의 요약:
상기 분석의 결과는 도 9a 내지 9h에 예시되고, 이는 샘플수에 반하여 log2 a RLU - log2 h RLU의 플롯을 포함한다. 또한 각각의 트랜스크립트를 위한 결과로부터 결정된 각각의 ROC (수신기 작동 특성) 곡선이 예시되어 있다.
트랜스크립트 1: 정상 및 악성 그룹 (p=0.002)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 11.1503의 컷오프 값을 사용하는 것은 90%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.91이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 2: 정상 및 악성 그룹 (p=0.001)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 0.6962의 컷오프 값을 사용하는 것은 90%의 민감성 및 1000%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.96이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 3: 정상 및 악성 그룹 (p=0.000)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 0.6754의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 1.00이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 6: 정상 및 악성 그룹 (p=0.007)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 9.6479의 컷오프 값을 사용하는 것은 90%의 민감성 및 70%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.86이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 11: 정상 및 악성 그룹 (p=0.000)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 1.3794의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 90%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.99이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 12: 정상 및 악성 그룹 (p=0.001)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 1.2379의 컷오프 값을 사용하는 것은 90%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.96이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 15: 정상 및 악성 그룹 (p=0.023)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 8.6926의 컷오프 값을 사용하는 것은 70%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.80이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 20: 정상 및 악성 그룹 (p=0.000)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 0.6521의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.76이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
결론:
상기 결과는 난소암을 검출하는데 있어서 및 정상 난소 조직으로부터 악성을 구별하는데 이어서 트랜스크립트 1, 2, 3, 6, 11, 12, 15, 및 20의 유틸 리티를 예시한다. 트랜스크립트 1, 2 및 3은 또한 전립선암을 검출하는데 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 6은 또한 흑색종 및 폐암을 검출하는데 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 11은 또한 흑색종 피부암, 대장암 및 고환암을 검출하는데 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 12는 또한 대장암 및 고환암을 검출하는데 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 15는 또한 흑색종 및 고환암을 검출하는데 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. . 트랜스크립트 20은 또한 대장암, 흑색종, 및 고환암을 검출하는데 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 열거된 8개의 트랜스크립트중 어느 것이나 임상적 세팅에서 난소암의 검출 또는 특성화를 위한 도구로서 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
실시예 9: 고환암에 대한 적용
본 연구는 고환암을 검출하는데 있어서 본 발명의 여러 가지 트랜스크립트의 효과를 측정하고자 하였다. 8개의 대조군 (양성) 조직 샘플 (샘플 1 내지 8) 및 9개의 종양 (악성) 조직 샘플 (샘플 9 내지 17)을 포함하는 전체 17개의 샘플이 제조되었고, 악성 샘플중 5개는 비-정상피종 (샘플 9-13)이었고, 4개는 정상피종 (샘플 14-17)이었다. 이 샘플은 제조업자의 추천 (신선한 동물 조직 및 냉동된 동물 조직에 대한 QuantiGene® 샘플 프로세싱 키트; 및 QuantiGene® 2.0 시약 시스템 사용자 매뉴얼)에 따라 균질화되었다. 10개의 표적 트랜스크립트 및 1개의 하우스키퍼 트랜스크립트가 선행된 실시예에서 상기 개략된 방식으로 제조되었다.
이 실시예에 사용된 17개의 조직 샘플은 다음 특성을 가졌다:
Figure pat00008
트랜스크립트의 특성은 다음과 같이 요약된다:
Figure pat00009
트랜스크립트 2, 3, 4, 7, 11, 12, 15, 16 및 20은 실시예 3-8에 관하여 상기 고찰된 것들과 동일한 것이 주지된다.
균질물은 대략적으로 25mg의 냉동된 조직을 사용하여 제조되고, 1:4로 희석되었다. 트랜스크립트의 정량은 GlomaxTM 멀티 검출 시스템 (Promega) 상에서 상대적 발광 유니트 RLU에서 측정되었다. 모든 샘플은 각각의 트랜스크립트에 대해 삼중으로 분석되었다. 배경 측정 (어떠한 템플릿도 없음)은 마찬가지로 삼중으로 행해졌다. 분석은 샘플에 대해 RLU 값으로부터 하한치를 감산함으로써 배경을 고려하였다. 입력 RNA는 식 log2 a RLU - log2 h RLU을 사용함으로써 설명되고, 여기서 a는 표적 융합 트랜스크립트이고 h는 하우스키퍼 트랜스크립트이다.
다음 단계로 구성된 데이터의 분석:
a) 삼중 분석을 위해 CV (변화 계수)를 확립하고; ≤ 15%인 경우 허용될 수 있다.
b) 표적 융합 트랜스크립트(a) 및 하우스키퍼 트랜스크립트 (h)의 삼중 분석을 위한 평균 RLU 값을 확립한다.
c) 배경 RLU (I)의 삼중 값으로부터 하한치를 확립한다
d) (a)로부터 하한치 (I)를 감산한다.
e) log2 a RLU - log2 h RLU를 산출한다.
결과의 요약:
상기 분석의 결과는 도 10 내지 18에 예시되고, 이는 샘플수에 반하여 log2 a RLU - log2 h RLU의 플롯을 포함한다. 또한 각각의 트랜스크립트를 위한 결과로부터 결정된 각각의 ROC (수신기 작동 특성) 곡선이 예시되어 있다.
일부 트랜스크립트는 양성과 악성 고환 조직을 구별하지만, 다른 것들은 정상피종 및 비-정상피종의 종양 서브타입 및/또는 양성 고환 조직 사이의 구별을 제공한다. 따라서, 각각의 클래스로부터 트랜스크립트를 조합하는 것은 고환암의 검출뿐만 아니라 정상피종 또는 비-정상피종의 서브타입으로 분류를 촉진시킬 것이다.
트랜스크립트 2: 정상 그룹과 및 악성 정상피종 (p=0.02)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 1.5621의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 1.00이다. 또한, 악성 정상피종과 및 악성 비-정상피종 (p=0.024)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 2.1006의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.90이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 3: 정상 그룹과 및 악성 정상피종 (p=0.018)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 0.969의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 87.5%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.969이다. 또한, 악성 정상피종과 및 악성 비-정상피종 (p=0.017)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 1.8181의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.9이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 4: 정상 그룹과 및 악성 그룹 (0.034)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 9.7628의 컷오프 값을 사용하는 것은 67%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.833이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 11: 정상 그룹과 및 악성 정상피종 (p=0.016)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 0.732의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 1.00이다. 또한, 악성 정상피종과 및 악성 비-정상피종 (p=0.016)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 0.9884의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.90이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 12: 정상 그룹과 및 악성 정상피종 (p=0.056)의 평균 (p<0.1) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 1.5361의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 87.5%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.969이다. 또한, 악성 정상피종과 및 악성 비-정상피종 (p=0.044)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 1.6039의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 80%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.9이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 13: 정상 그룹과 및 악성 그룹 (p=0.019)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -9.8751의 컷오프 값을 사용하는 것은 87.5%의 민감성 및 78%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 매우 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.875이다. 또한, 악성 비-정상피종과 및 양성 그룹 (p=0.000)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -13.9519의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 87.5%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.975이다. 또한, 악성 정상피종과 및 악성 비-정상피종 (p=0.001)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -15.8501의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 1.00이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 15: 정상 그룹과 및 악성 그룹 (p=0.065)의 평균 (p<0.1) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 - 5.4916의 컷오프 값을 사용하는 것은 75%의 민감성 및 89%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.833이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 16: 정상 그룹과 및 정상피종 및 비-정상피종 모두를 포함하는 악성 그룹 (p=0.037)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -6.448의 컷오프 값을 사용하는 것은 89%의 민감성 및 75%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 양호한 시험 정확도를 나타내는 0.806이다. 또한, 정상 및 악성 정상피종 (p=0.037)의 평균 (p<0.05) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 -7.4575의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 87.5%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 0.938이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
트랜스크립트 20: 정상 그룹과 및 악성 정상피종 (p=0.006)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 1.8364의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 1.00이다. 또한, 악성 정상피종과 및 악성 비-정상피종 (p=0.004)의 평균 (p<0.01) 사이에 통계학적으로 현저한 차이가 존재한다. ROC 곡선에 의해 나타낸 바 1.6065의 컷오프 값을 사용하는 것은 100%의 민감성 및 100%의 특이성을 초래하고, 곡선 아래 영역은 우수한 시험 정확도를 나타내는 1.00이다. 선택된 임계 값은 특정 적용을 위한 시험의 특이성이나 또는 민감성을 증가시키도록 조절될 수 있다.
결론:
상기 결과는 고환암, 및 고환암 서브타입의 검출에 있어서, 및 정상 고환 조직으로부터 악성 조직을 구별함에 있어서 트랜스크립트 2, 3, 4, 11, 12, 13, 15, 16, 및 20의 유틸리티를 예시한다. 트랜스크립트 2는 또한 전립선, 유방, 대장 및 난소암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 3은 또한 전립선, 유방, 흑색종, 대장, 및 난소암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 4는 또한 전립선 및 대장암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 11은 또한 대장, 흑색종, 및 난소암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 12는 또한 대장 및 난소암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 15는 또한 흑색종 및 난소암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 16은 흑색종 피부암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 트랜스크립트 20은 또한 대장암, 흑색종 및 난소암의 검출에 있어서 유틸리티를 갖는 것으로 밝혀졌다. 열거된 9개의 트랜스크립트 중의 임의의 것은 임상적 세팅에서 고환암의 검출 또는 특성화를 위한 도구로서 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 조직 샘플 내의 암의 존재를 결정하기 위한 분석을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 상기한 바의 분석을 수행하기 위해 필요한 시약을 포함한다. 특히, 키트는 상기한 바와 같이 트랜스크립트 1 내지 17, 및 20에 대응하는 1개 이상의 혼성화 프로브를 함유하는 1개 이상의 용기를 포함한다. 이해할 수 있듯이, 분석을 수행하기 위한 시약은 임의의 필수적인 완충액, 염, 검출 시약 등을 포함할 수 있다. 더욱이, 키트는 예를 들면 균질화 또는 핵산 추출에 의해 필요한 조직 샘플, 이 조직 샘플을 제조하기 위한 시약 또는 물질을 획득하기 위해서, 및 주제의 분석 또는 분석들을 수행하기 위해 임의의 필요한 샘플 수집 장치, 용기 등을 포함할 수 있다. 키트는 또한 병에 걸린 또는 병에 걸리지 않은 조직에 대해 허용되는 값을 확립 또는 인증하기 위해 대조용 조직 또는 샘플을 포함할 수 있다.
본 발명은 특정한 특정 구체예에 기재되었지만, 그의 여러 가지 변형은 이에 첨부된 특허 청구의 범위에 개략된 바의 존 발명의 정신 및 범위에서 벗어남이 없이 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다. 본 출원에 언급된 모든 문서 (기사, 매뉴얼, 특허 출원 등)는 참고 문헌으로서 그의 전문으로 본원에 인용된다.
문헌 목록
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aucauccuag uccucaucgc ccucccaucc 240 cuacgcaucc uuuacauaac agacgagguc aacgaucccu cccuuaccau caaaucaauu 300 ggccaccaau gguacugaac cuacgaguac accgacuacg gcggacuaau cuucaacucc 360 uacauacuuc ccccauuauu ccuagaacca ggcgaccugc gacuccuagc cgcagaccuc 420 cucauucuaa ccugaaucgg aggacaacca guaagcuacc cuuuuaccau cauuggacaa 480 guagcauccg uacuauacuu cacaacaauc cuaauccuaa uaccaacuau cucccuaauu 540 gaaaacaaaa uacucaaaug ggccu 565 <210> 22 <211> 1174 <212> RNA <213> Human <400> 22 auggcacaug cagcgcaagu aggucuacaa gacgcuacuu ccccuaucau agaagagcuu 60 aucaccuuuc augaucacgc ccucauaauc auuuuccuua ucugcuuccu aguccuguau 120 gcccuuuucc uaacacucac aacaaaacua acuaauacua acaucucaga cgcucaggaa 180 auagaaaccg ucugaacuau ccugcccgcc aucauccuag uccucaucgc ccucccaucc 240 cuacgcaucc uuuacauaac agacgagguc aacgaucccu cccuuaccau caaaucaauu 300 ggccaccaau gguacugaac cuacgaguac accgacuacg gcggacuaau cuucaacucc 360 uacauacuuc ccccauuauu ccuagaacca ggcgaccugc gacuccuuga cguugacaau 420 cgaguaguac ucccgauuga agcccccauu 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cucauccgcu uccacccccu agcagaaaau 900 agcccacuaa uccaaacucu aacacuaugc uuaggcgcua ucaccacucu guucgcagca 960 gucugcgccc uuacacaaaa ugacaucaaa aaaaucguag ccuucuccac uucaagucaa 1020 cuaggacuca uaauaguuac aaucggcauc aaccaaccac accuagcauu ccugcacauc 1080 uguacccacg ccuucuucaa agccauacua uuuaugugcu ccggguccau cauccacaac 1140 cuuaacaaug aacaagauau ucgaaaaaua ggaggacuac ucaaaaccau accucucacu 1200 ucaaccuccc ucaccauugg cagccuagca uuagcaggaa uaccuuuccu cacagguuuc 1260 uacuccaaag accacaucau cgaaaccgca aacauaucau acacaaacgc cugagcccua 1320 ucuauuacuc ucaucgcuac cucccugaca agcgccuaua gcacucgaau aauucuucuc 1380 acccuaacag gucaaccucg cuuccccacc cuuacuaaca uuaacgaaaa uaaccccacc 1440 cuacuaaacc ccauuaaacg ccuggcagcc ggaagccuau ucgcaggauu ucucauuacu 1500 aacaacauuu cccccgcauc ccccuuccaa acaacaaucc cccucuaccu aaaacucaca 1560 gcccucgcug ucacuuuccu aggacuucua acagcccuag accucaacua ccuaaccaac 1620 aaacuuaaaa uaaaaucccc acuaugcaca uuuuauuucu ccaacauacu cggauucuac 1680 ccuagcauca cacaccgcac aauccccuau cuaggccuuc uuacgagcca aaaccugccc 1740 cuacuccucc uagaccuaac cugacuagaa aagcuauuac cuaaaacaau uucacagcac 1800 caaaucucca ccuccaucau caccucaacc caaaaaggca uaauuaaacu uuacuuccuc 1860 ucuuucuucu ucccacucau ccuaacccua cuccuaauca cauaa 1905 <210> 31 <211> 1545 <212> RNA <213> Human <400> 31 augacccacc aaucacaugc cuaucauaua guaaaaccca gcccaugacc ccuaacaggg 60 gcccucucag cccuccuaau gaccuccggc cuagccaugu gauuucacuu ccacuccaua 120 acgcuccuca uacuaggccu acuaaccaac acacuaacca uauaccaaug auggcgcgau 180 guaacacgag aaagcacaua ccaaggccac cacacaccac cuguccaaaa aggccuucga 240 uacgggauaa uccuauuuau uaccucagaa guuuuuuucu ucgcaggauu uuucugagcc 300 uuuuaccacu ccagccuagc cccuaccccc caauuaggag ggcacuggcc cccaacaggc 360 aucaccccac uacuaggccu ccuccuagca gcagcaggca aaucagccca auuaggucuc 420 caccccugac uccccucagc cauagaaggc cccaccccag ucucagcccu acuccacuca 480 agcacuauag uuguagcagg aaucuucuua cucauccgcu uccacccccu agcagaaaau 540 agcccacuaa uccaaacucu aacacuaugc uuaggcgcua ucaccacucu guucgcagca 600 gucugcgccc 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naturally occurring amino acid <400> 48 Met Asn Phe Ala Leu Ile Leu Met Ile Asn Thr Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Met Ile Ile Thr Phe Trp Leu Pro Gln Leu Asn Gly Tyr Met Glu 20 25 30 Lys Ser Thr Pro Tyr Glu Cys Gly Phe Asp Pro Met Ser Pro Ala Arg 35 40 45 Val Pro Phe Ser Met Lys Phe Phe Leu Val Ala Ile Thr Phe Leu Leu 50 55 60 Phe Asp Leu Glu Ile Ala Leu Leu Leu Pro Leu Pro Trp Ala Leu Gln 65 70 75 80 Thr Thr Asn Leu Pro Leu Met Val Met Ser Ser Leu Leu Leu Ile Ile 85 90 95 Ile Leu Ala Leu Ser Leu Ala Asn Thr Ala Ala Ile Gln Ala Ile Leu 100 105 110 Tyr Asn Arg Ile Gly Asp Ile Gly Phe Ile Leu Ala Leu Ala Trp Phe 115 120 125 Ile Leu His Ser Asn Ser Trp Asp Pro Gln Gln Met Ala Leu Leu Asn 130 135 140 Ala Asn Pro Ser Leu Thr Pro Leu Leu Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala 145 150 155 160 Gly Lys Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Pro Trp Leu Pro Ser Ala Met 165 170 175 Glu Gly Pro Thr Pro Val Ser Ala Leu Leu His Ser Ser Thr Met Val 180 185 190 Val Ala Gly Ile Phe Leu Leu Ile Arg Phe His Pro Leu Ala 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ccuaaccuga cuagaaaagc uauuaccuaa aacaauuuca 840 cagcaccaaa ucuccaccuc caucaucacc ucaacccaaa aaggcauaau uaaacuuuac 900 uuccucucuu ucuucuuccc acucauccua acccuacucc uaaucacaua a 951 <210> 51 <211> 951 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA <400> 51 atgaacgaaa atctgttcgc ttcattcatt gcccccacaa tcctaggcct acccgccgca 60 gtactgatca ttctatttcc ccctctattg atccccacct ccaaatatct catcaacaac 120 cgactaatca ccacccaaca atgactaatc aaactaacct caaaacaaat gataaccata 180 cacaacacta aaggacgaac ctgatctctt atactagtat ccttaatcat ttttattgcc 240 acaactaacc tcctcggact cctgcctcac tcatttacac caaccaccca actatctata 300 aacctagcca tggccatccc cttatgagcg ggcacagtga ttataggctt tcgctctaag 360 attaaaaatg ccctagccca cttcttacca caaggcacac ctacacccct tatccccata 420 ctagttatta tcgaaaccat cagcctactc attcaaccaa tagccctggc cgtacgccta 480 accgctaaca ttactgcagg ccacctactc atgcacctaa ttggaagcgc caccctagca 540 atatcaacca ttaaccttcc ctctacactt atcatcttca caattctaat tctactgact 600 atcctagaaa tcgctgtcac tttcctagga cttctaacag ccctagacct caactaccta 660 accaacaaac ttaaaataaa atccccacta tgcacatttt atttctccaa catactcgga 720 ttctacccta gcatcacaca ccgcacaatc ccctatctag gccttcttac gagccaaaac 780 ctgcccctac tcctcctaga cctaacctga ctagaaaagc tattacctaa aacaatttca 840 cagcaccaaa tctccacctc catcatcacc tcaacccaaa aaggcataat taaactttac 900 ttcctctctt tcttcttccc actcatccta accctactcc taatcacata a 951 <210> 52 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> putative protein sequence <220> <221> misc_feature <222> (317)..(317) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 52 Met Asn Glu Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Ala Pro Thr Ile Leu Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ala Ala Val Leu Ile Ile Leu Phe Pro Pro Leu Leu Ile Pro 20 25 30 Thr Ser Lys Tyr Leu Ile Asn Asn Arg Leu Ile Thr Thr Gln Gln Trp 35 40 45 Leu Ile Lys Leu Thr Ser Lys Gln Met Met Thr Met His Asn Thr Lys 50 55 60 Gly Arg Thr Trp Ser Leu Met Leu Val Ser Leu Ile Ile Phe Ile Ala 65 70 75 80 Thr Thr Asn Leu Leu Gly Leu Leu Pro His Ser Phe Thr Pro Thr Thr 85 90 95 Gln Leu Ser Met Asn Leu Ala Met Ala Ile Pro Leu Trp Ala Gly Thr 100 105 110 Val Ile Met Gly Phe Arg Ser Lys Ile Lys Asn Ala Leu Ala His Phe 115 120 125 Leu Pro Gln Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ile Pro Met Leu Val Ile Ile 130 135 140 Glu Thr Ile Ser Leu Leu Ile Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Arg Leu 145 150 155 160 Thr Ala Asn Ile Thr Ala Gly His Leu Leu Met His Leu Ile Gly Ser 165 170 175 Ala Thr Leu Ala Met Ser Thr Ile Asn Leu Pro Ser Thr Leu Ile Ile 180 185 190 Phe Thr Ile Leu Ile Leu Leu Thr Ile Leu Glu Ile Ala Val Thr Phe 195 200 205 Leu Gly Leu Leu Thr Ala Leu Asp Leu Asn Tyr Leu Thr Asn Lys Leu 210 215 220 Lys Met Lys Ser Pro Leu Cys Thr Phe Tyr Phe Ser Asn Met Leu Gly 225 230 235 240 Phe Tyr Pro Ser Ile Thr His Arg Thr Ile Pro Tyr Leu Gly Leu Leu 245 250 255 Thr Ser Gln Asn Leu Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Thr Trp Leu Glu 260 265 270 Lys Leu Leu Pro Lys Thr Ile Ser Gln His Gln Ile Ser Thr Ser Ile 275 280 285 Ile Thr Ser Thr Gln Lys Gly Met Ile Lys Leu Tyr Phe Leu Ser Phe 290 295 300 Phe Phe Pro Leu Ile Leu Thr Leu Leu Leu Ile Thr Xaa 305 310 315

Claims (16)

  1. 서열번호 19로 나타낸 핵산 서열을 포함하는, 암과 연관된 단리된 미토콘드리아 융합 트랜스크립트.
  2. 제1항의 융합 트랜스크립트에 대응하거나 서열번호 35 나타낸 아미노산 서열을 갖는, 미토콘드리아 융합 단백질.
  3. 제1항의 융합 트랜스크립트를 인코딩하는, 단리된 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 분자.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 3으로 나타낸 핵산 서열을 포함하는, 단리된 mtDNA 분자.
  5. 제1항에 따른 미토콘드리아 융합 트랜스크립트 또는 제3항 또는 제4항에 따른 mtDNA 분자의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함하고, 상기 일부가 스플라이스된 유전자의 접합점을 포함하는, 혼성화 프로브.
  6. 제1항에 따른 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 갖고 상기 일부가 스플라이스된 유전자의 접합점을 포함하는 혼성화 프로브를 포함하는, 암과 연관된 적어도 하나의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트의 존재를 검출하기 위한 조성물.
  7. 제3항에 따른 mtDNA 분자의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 갖고 상기 일부가 스플라이스된 유전자의 접합점을 포함하는 혼성화 프로브를 포함하는, 암과 연관된 적어도 하나의 비정상적인 mtDNA 분자의 존재를 검출하기 위한 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 암이 전립선암, 고환암, 난소암, 유방암, 또는 대장암 중 하나 이상인, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 암이 전립선암, 고환암, 난소암, 유방암, 또는 대장암 중 하나 이상인, 조성물.
  10. 제8항 또는 제9에 있어서,
    상기 검출이,
    a) 적어도 하나의 프로브가 상보적 미토콘드리아 융합 트랜스크립트 또는 mtDNA에 혼성화도록 적어도 하나의 프로브를 사용하여 혼성화 반응을 수행하는 단계;
    b) 적어도 하나의 프로브에 혼성화된 트랜스크립트 또는 mtDNA의 양을 정량화시킴으로써 샘플 내의 적어도 하나의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트 또는 mtDNA의 양을 정량화하는 단계; 및
    c) 샘플 내의 미토콘드리아 융합 트랜스크립트 또는 mtDNA의 양을 적어도 하나의 공지된 기준 값과 비교하는 단계를 수행하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 검출은 진단 영상화 기술을 사용하여 수행되는, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 진단 영상화 기술은 고처리량의 마이크로어레이 분석을 포함하는, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 검출은 분지된(branched) DNA 기술을 사용하여 수행되는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 검출은 PCR을 사용하여 수행되는, 조성물.
  15. 제1항의 융합 트랜스크립트 또는 제3항 또는 제4항의 mtDNA 분자의 적어도 일부에 상보적이고 상기 일부가 스플라이스된 유전자의 접합점을 포함하는 적어도 하나의 혼성화 프로브를 포함하는, 포유동물에서 암의 존재를 검출하기 위한 분석을 수행하기 위한 키트.
  16. 제1항에 있어서, 암이 전립선암, 고환암, 난소암, 유방암, 대장암, 폐암, 흑색종 피부암 또는 이들의 조합인, 단리된 미토콘드리아 융합 트랜스크립트.
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