JP2011229508A - ゲル状細胞組成物およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血漿を含むゲルに細胞が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材から単離可能な、前記ゲル状細胞組成物の製造方法に関する。細胞が、カルシウムイオンを保持および/または放出する細胞に分化する細胞である骨格筋芽細胞。
【選択図】なし
Description
本発明はまた、ゲル化剤が添加されていない、上記のゲル状細胞組成物に関する。
本発明はさらに、細胞が、カルシウムイオンを保持および/または放出する細胞に分化する細胞である、上記のゲル状細胞組成物に関する。
本発明はさらに、細胞が、骨格筋芽細胞である、上記のゲル状細胞組成物に関する。
(2)(1)で得られた溶液をインキュベートしてゲル化する工程、
を含む、ゲル状細胞組成物の製造方法に関する。
さらにまた、本発明は、インキュベートにより実質的に細胞数が増加しない、上記の方法に関する。
本発明のゲル状細胞組成物は、ゲルの中に細胞が包埋された三次元構造を有し、細胞間隙がゲルで充填されることにより、細胞同士が三次元的に分散包埋された構造体を形成する。そして、培養基材から剥離すると培養基材表面にほぼ細胞を残さずに、ゲル状になった細胞を培養基材表面から剥離することが可能である。そのため従来のシート状細胞培養物と同様の性質を有しながら、従来のシート状細胞培養物と比較して強度、操作、輸送、保存の容易性などを兼ね備えるものである。
本発明のゲル状細胞組成物には血漿がゲル化した状態で含まれている。血漿の含有量は、10〜30%(v/v)、より好ましくは15〜25%(v/v)である。本発明のゲル状細胞組成物に含まれる血漿は凝固因子の活性を維持するため、好ましくは非働化されていない。
液体窒素で凍結保存した骨格筋芽細胞を、37℃のウォーターバス中で2分間融解した。細胞3.0×107個あたり30mlの洗浄液(ハンクス平衡塩液(HBSS(−))に0.5%ヒト血清アルブミンを混合したもの)を加え、240×g、4℃で7分間遠心した。上清を廃棄し、再び細胞3.0×107個あたり30mlの洗浄液を加えて、240×g、4℃で7分間遠心した。再び上清を廃棄し、細胞3.0×107個あたり10mlの洗浄液を加えて細胞を懸濁し、血球計算盤を用いて生細胞濃度を算出した。再び240×g、4℃で7分間遠心し、上清を廃棄して細胞ペレットを得た。
ACD−A液で抗凝固されたヒト血漿を、成分採血装置(テルシス(登録商標)S;テルモ社製)により調製した。自動血球測定装置(XE-2100;シスメックス社製)を用いて血小板濃度を測定し、血小板が検出されないことを確認した。DMEM/F12(Invitrogen社製)にヒト血漿を20%混合し、孔径0.2μmのフィルターで濾過し、ヒト血漿混合培地を得た。
細胞濃度が4.6×106個/mlになるように細胞ペレットにヒト血漿混合培地を加え、懸濁した。この懸濁液2mlを、3.5cmの細胞培養皿(Becton Dickinson社製)に入れ、37℃、5%CO2の条件で18時間インキュベートした。インキュベート後、ゲル状シートの周辺部を、注射針を使用して剥がし、シート状に形成されたゲル状細胞組成物を観察した。
細胞濃度を 4.6×106個/mlとし、インキュベート時間を2時間とした以外は実験例3と同様にゲル状細胞培養物を作製した。ポジティブコントロールとしてヒト血漿混合培地2mlに0.47mMのCaイオンを添加したもの、ネガティブコントロールとしてヒト血漿混合培地2mlのみを同様に準備した。
下記A、B、CおよびDの細胞を準備した。
A:温度応答性培養皿のUPCELL(登録商標)(セルシード社製)に、0.775mlの培地(20%ヒト血清DMEM/F12)を入れ、37℃、5%CO2下で16時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度4.6×106個/mlでヒト血清混合培地(実施例2において、ヒト血漿の代わりにヒト血清を用いて同様に調製)に懸濁したものを1.6ml入れ、24時間インキュベートした。
B: UPCELL(登録商標)(セルシード社製)に、0.775mlの培地(20%ヒト血清DMEM/F12)を入れ、37℃、5%CO2下で16時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度4.6×106個/mlでヒト血漿混合培地に懸濁したものを1.6ml入れ、24時間インキュベートした。
C:通常の培養皿(Becton Dickinson社製)に、0.775mlの培地(20%ヒト血清DMEM/F12)を入れ、37℃、5%CO2下で16時間プレインキュベートした。プレインキュベートに用いた培地の廃棄後、骨格筋芽細胞を細胞濃度4.6×106個/mlでヒト血漿混合培地に懸濁したものを1.6ml入れ、24時間インキュベートした。
D:通常の培養皿(Becton Dickinson社製)に、プレインキュベートなしで、骨格筋芽細胞を細胞濃度4.6×106個/mlでヒト血漿混合培地に懸濁したものを1.6ml入れ、24時間インキュベートした。
細胞濃度をそれぞれ5×105、1.55×106、3.1×106、4.65×106、6×106とし、インキュベート時間を30分とした以外は実施例3と同様にゲル状細胞組成物を形成し、ゲル化の度合いを比較した。
Claims (6)
- 血漿を含むゲルに細胞(線維芽細胞を除く)が包埋されたゲル状細胞組成物であって、培養基材から単離可能な、前記ゲル状細胞組成物。
- ゲル化剤が添加されていない、請求項1に記載のゲル状細胞組成物。
- 細胞が、カルシウムイオンを保持および/または放出する細胞に分化する細胞である、請求項1または2に記載のゲル状細胞組成物。
- 細胞が、骨格筋芽細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のゲル状細胞組成物。
- (1)血漿を含む溶液と、細胞(線維芽細胞を除く)とを混合する工程、
(2)(1)で得られた溶液をインキュベートしてゲル化する工程、
を含む、ゲル状細胞組成物の製造方法。 - インキュベートにより実質的に細胞数が増加しない、請求項5に記載の方法。
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