JP2011223925A - ロドコッカス細菌のためのランダムゲノム挿入及び欠失ツール - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ロドコッカス属に属する細菌を、任意配列(好ましくは1つ又は複数の選択マーカー遺伝子)を含む直鎖状DNA断片を用いて形質転換することにより、当該直鎖状DNAを前記細菌のゲノムに挿入する方法、当該細菌の細胞内DNAの機能をランダムに喪失させる方法、及び当該方法により作製された形質転換体。
【選択図】 なし
Description
(1)ロドコッカス属に属する細菌を、任意配列を有する直鎖状DNA断片を用いて形質転換し、当該直鎖状DNAを前記細菌のゲノムに挿入する方法。
(2)さらに、前記細菌のゲノムDNAの機能をランダムに喪失させることができる、(1)に記載の方法。
(3)直鎖状DNA断片が、所望のタンパク質をコードする遺伝子、及び/又は1つ若しくは複数の選択マーカー遺伝子を含むものである(1)に記載の方法。
(4)直鎖状DNA断片が、大腸菌におけるプラスミド複製開始点を含むものである、(1)に記載の方法。
(5)プラスミド複製開始点がプラスミドpMB1及びその派生物由来のものである(4)に記載の方法。
(6)選択マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子、又は薬剤耐性遺伝子と条件致死遺伝子との組み合わせである(3)〜(5)のいずれか1項に記載の方法。
(7)薬剤耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子である(6)に記載の方法。
(8)条件致死遺伝子がsacB遺伝子である、(6)に記載の方法。
(9)前記(1)〜(8)のいずれか1項に記載の方法により作製された形質転換体。
(10)前記(6)〜(9)のいずれか1項に記載の方法により作製された形質転換体を、致死条件下で培養することにより、形質転換により挿入された断片の一部又は全部が脱落した株を作製する方法。
(11)前記(10)に記載の方法により作製された株。
本発明において、ロドコッカス属に属する細菌に挿入する任意配列を有する直鎖状DNA断片としては、例えばランダム配列を有する核酸、有用タンパク質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子、遺伝子発現調節遺伝子、プロモーター配列、プラスミドDNA、バクテリオファージDNAなど、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。そして、これらのDNA断片により形質転換された株であるかどうかを確認し、取得するためには、上記DNA断片に1つ又は複数の選択マーカー遺伝子を含むものであること(例えば連結させておくこと)が好ましい。任意配列の長さは特に限定されるものではなく、100〜20,000塩基、好ましくは500〜10,000塩基、さらに好ましくは800〜3,000塩基長のものである。
ベクターとしてはプラスミドベクター、バクテリオファージベクター、レトロトランスポゾンベクターなどを用いることができる。目的に応じて種々の改変を加えること、例えば既存のベクターに、選択マーカー、レポーター遺伝子やプロモーター配列などの各種遺伝子、あるいは複製起点を導入することにより、形質転換用DNA断片調製用のベクターにすることができる。
プラスミド複製開始点としては、例えばプラスミドpMB1由来のもの、広域宿主プラスミドRK2由来のもの、及びその派生物などが挙げられる。
ロドコッカス属菌としては、例えばロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)PR4株(NBRC)、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)ATCC12674、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)ATCC17895、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)ATCC19140等が挙げられる。PR4株は、NBRC(独立行政法人製品評価技術基盤機構、生物遺伝資源部門)から、またATCC株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できる。
上記の通り得られた形質転換体(「本発明の形質転換体」という)において、DNA断片が挿入されたゲノム領域を確認するためには、その確認目的の配列を含む断片をゲノムDNAから調製する必要がある。そこで本発明においては、例えば以下のように行うことができる。
本発明においては、上記の通り作製された形質転換体を、致死条件下で培養することにより、形質転換により挿入された断片の一部又は全部が脱落した株を作製することができる。
致死条件は、例えば条件致死マーカーとしてsacB遺伝子を用いた場合には、スクロースを含んだ培地で生育させる条件である。
(1)鋳型プラスミドの作製
プラスミドpK19mobよりmob領域を除くため、pK19mobを制限酵素NspV(タカラバイオ株式会社)及びPagI(フェルメンタス社)を用いて切断した。以下の組成で制限酵素処理を行った。
pK19mob 20μl
10x M buffer(タカラバイオ) 5μl
BSA 5μl
NspV 2μl
PagI 2μl
D.W. 16μl
Total 50μl
37℃にて2時間反応を行い、反応終了後に5μl の3M 酢酸ナトリウムと125μlのエタノールを加え、4℃ 15000 rpm で15分間遠心して沈殿を得た。200μlの70% エタノールを加え、4℃ 15000 rpmで1分間遠心して上清を除き、沈澱を乾燥し、50μlの滅菌水に溶解した。
まず、約140μlのXL10-Goldコンピテントセル(アジレント・テクノロジー株式会社)を氷上解凍し、4μlの2-メルカプトエタノールを加え、氷上にて10分間静置した。次に、滅菌した試験管にXL10-Goldを30μlずつ分注し、ライゲーション後の溶液を4μl加え、氷上にて30分間静置したのち、42℃ 30秒間加温し、再び氷上にて2分間静置した。その後、各試験管にSOC培地を0.5ml加え、37℃にて1時間培養を行った後、カナマイシン硫酸塩(Km)(50μg/ml)を含むLB寒天培地(以下、LB Km50寒天培地)に全量を塗布した。37℃にて一晩培養した後、コロニーを確認し、同寒天培地にストリークした。
得られたプラスミドをpK19Bと命名した。
pK19Bを鋳型として、カナマイシン耐性遺伝子とプラスミド複製開始領域を含むDNA断片を増幅した。
PCR条件
反応液組成
Prime star max pre-mix(タカラバイオ) 25μl
Primer 1 1μl
Primer 2 1μl
鋳型DNA(pK19B) 1μl
D.W. 22μl
Total 50μl
反応温度
98℃ 10sec
98℃ 5sec
以下30サイクル
55℃ 10sec
72℃ 1min
72℃ 4min
30cycles
プライマー配列は、以下の通りである。
<MK07断片用プライマー>
Primer 1:TN-1
GGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGC(配列番号1)
Primer 2:TN-2
GGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATG(配列番号2)
※ 下線部はトランスポゼース認識配列(文献:Nature Biotechnology 18:97 (2000))
<MK09断片用プライマー>
Primer 1:TN-3 CTGCCGCAAGCACTCAGGGCGC(配列番号3)
Primer 2:TN-4 CCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATG(配列番号4)
反応終了後、予想されるサイズのDNAの増幅を0.7%アガロースゲル電気泳動により確認した。
(1)コンピテントセルの作製
ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)NBRC100887(Rhodococcus erythropolis PR4)株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。
(2)形質転換体の作製
実施例1で調製したDNA断片をTE緩衝液(10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)を用いて6倍に希釈後、1μlを取り、(1)で作製したコンピテントセルの菌体懸濁液各10μlを混合し、氷冷した。遺伝子導入装置 Gene Pulser(BIO RAD)用のキュベットに各混合液を入れ、Gene Pulserを用いて20 KV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショックを行った。その後、キュベットにLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、1%NaCl)500μlを加え、30 ℃、5時間静置した後、LB Km50寒天培地に塗布し、30 ℃、3日間培養した。
その結果、形質転換体を得ることができ、形質転換効率は2.2×104コロニー/μgDNAであった(表1)。
(1)ゲノムDNAの調製
DNA断片MK07を用いて得られた形質転換体6株を、10ml のLB Km10液体培地にて、30℃ 2日間振とう培養を行った。培養液を4℃ 8000rpmで10分間の遠心分離により集菌し、50mM EDTA 4.8mlに懸濁後、20mg/mlのリゾチームを含むTENS溶液(50mM-Tris, 10mM-EDTA, 50mM NaCl, 20% sucrose)を1.2ml加え37℃で一晩振とうした。リゾチーム処理後の菌体懸濁液より、1mlをマイクロチューブに分注し、4℃ 15000rpmで5分間遠心し、沈殿を得た。沈殿より、Wizard Genomic DNA Purification Kit(プロメガ株式会社)を用いてゲノムDNAを得た。
(2)ゲノムDNAの制限酵素処理
こうして得られたゲノムDNA10μlに、2μlの10x K Buffer(タカラバイオ株式会社)、7.5μ lの滅菌水、0.5μ lの制限酵素BamHI(タカラバイオ株式会社)を加え、37℃ にて4時間反応させた。0.7%アガロースゲル電気泳動により、ゲノムDNAが切断されていることを確認した後、フェノール/クロロホルム処理を行った。エタノール沈殿後、風乾し、10μlの滅菌水に溶解させた。
(3)DNA断片のセルフライゲーション(環状化)及び大腸菌の形質転換
ゲノムDNA断片 2μlにDNA Ligation Kit <Mighty Mix>(タカラバイオ株式会社)のLigation Mixを2μl加え、4℃にて一晩反応させることにより、DNA断片のセルフライゲーションを行った。ライゲーション後の溶液を用いて大腸菌XL10-Goldの形質転換を以下のようにして行った。
上記形質転換された大腸菌を37℃にて一晩培養後、現れたコロニーを複数同寒天培地にストリークした。2個のコロニーをそれぞれ2mlの LB Km50液体培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。培養液をマイクロチューブに移し、4℃ 15000rpmで5分間遠心し、QIAprep miniprep Kit(株式会社キアゲン)を用いプラスミドを調製した。
オリゴヌクレオチドTN-6: GTTTCGCCACCTCTGACTTG(配列番号8)
実施例2と同様にして、MK09によるNBRC100887の形質転換を行った。
その結果、形質転換体を得ることができ、形質転換効率は1.5×104コロニー/μgDNAであった(表1)。
実施例3と同様にして、形質転換体におけるMK09のゲノム挿入領域及び挿入形態を調べた。その結果、図4及び図5に示されるように、MK09の端が部分的に欠ける場合があるが、MK09ほぼ全体がゲノムへのランダムな挿入を起こしており、またゲノムの欠失(数bp〜数十kb、図4ではbp〜数百bp)を伴っていることが明らかとなった。
鋳型プラスミドの作製
<pK19mobsacB1の作製>
sabB遺伝子を含むプラスミドpDNR-1r(Clontech Laboratories Inc.)を鋳型にして、実施例1と同様にPCR法によりsacB遺伝子を増幅し、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。増幅用のプライマーとして、NspV切断サイトを付加したプライマーSAC-01(配列番号9)及びSAC-02(配列番号10)を用いた。
プライマー:
SAC-01:5’- GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG -3’(配列番号9)
SAC-02:5’- GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG -3’(配列番号10)
増幅されたDNA断片を制限酵素NspVにより消化し、実施例1と同様にしてWizard SV Gel and PCR Clean-up system(プロメガ株式会社)を用いて精製し、sacB遺伝子を含むDNA断片を得た。
プラスミドpK19mobsacB1よりmob領域を除くため、まずpK19mobsacB1を制限酵素NspV(タカラバイオ株式会社)により部分切断し、その後PagI(フェルメンタス社)を用いて切断した。反応条件は、実施例1と同様であるが、部分切断には反応時間を調整して適当な時間を選択した。
得られたプラスミドをpK19sacB1と命名した。
Primer 1:TN-1
GGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGC(配列番号1)
Primer 2:TN-7
GGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATG(配列番号11)
実施例2と同様にして、MK10によるNBRC100887の形質転換を行った。
その結果、形質転換体を得ることができ、形質転換効率は1.8×103コロニー/μgであった。
実施例3と同様にして、形質転換体のうちの1つについてMK10のゲノム挿入領域及び挿入形態を調べた。その結果、図2及び図3に示されるように、MK10の端が部分的に欠けていたが、MK10ほぼ全体がゲノムへのランダムな挿入を起こしており、またゲノムの欠失(6,042bp)を伴っていることが明らかとなった。
ショ糖添加培地を用いたゲノムからのMK10の脱落
6個の形質転換体をそれぞれ、LB液体培地 200μlに懸濁し、100μlを10%Sucroseを含むLB寒天培地に蒔き、30℃ 3日間培養した。現れたコロニーをランダムに3〜6株取得し、同寒天培地及びLB Km50寒天培地にストリークし、生育の確認を行った。その結果を表2に示した。
[比較例1]
DNA断片MK07とTransposaseとの複合体によるNBRC100887(Rhodococcus erythropolis PR4)の形質転換
実施例1で調製した3.3μlのDNA断片MK07に75% グリセロール 6.7μlを加え、全量10μlとした。この溶液 2μlに、2μl のTransposase(EPICENTRE Biotechnologies社)を加え充分な撹拌後、室温で30分間放置することにより複合体を形成させた。1μlの複合体溶液を用い、実施例2と同様にしてRhodococcus erythropolis PR4株の形質転換を行った。その結果、表1に示すように形質転換効率は8.4×103コロニー/μgDNAであった。
MK07複合体が挿入されたゲノム領域の確認
実施例3と同様にして、6株についてゲノムDNAへの挿入領域、挿入様式を調べた。その結果、DNA断片MK07を用いたときとは異なり、大半は典型的なTransposon型の挿入様式を示した(図7及び図8)。
[比較例2]
DNA断片MK07による大腸菌XL10-Goldの形質転換
PCR法により増幅した後に鋳型プラスミドpK19Bを制限酵素DnpI処理により分解する工程を加えた他は実施例1と同様にして、DNA断片MK07及びMK09を調製した。DpnIはメチル化されたGを含むGATC配列を認識して切断するため、大腸菌XL10-GoldやJM109株を宿主とする形質転換体から調製されたプラスミドは分解するが、PCR等のin vitroで増幅されたDNA断片はメチル化されたGを含まないため分解しない。
Claims (9)
- ロドコッカス属に属する細菌を、任意配列を有する直鎖状DNA断片を用いて形質転換し、当該直鎖状DNAを前記細菌のゲノムに挿入する方法。
- さらに、前記細菌のゲノムDNAの機能をランダムに喪失させることができる、請求項1に記載の方法。
- 直鎖状DNA断片が、所望のタンパク質をコードする遺伝子、及び/又は1つ若しくは複数の選択マーカー遺伝子を含むものである請求項1に記載の方法。
- 直鎖状DNA断片が、大腸菌におけるプラスミド複製開始点を含むものである、請求項1に記載の方法。
- プラスミド複製開始点がプラスミドpMB1及びその派生物由来のものである請求項4に記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子、又は薬剤耐性遺伝子と条件致死遺伝子との組み合わせである請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により作製された形質転換体。
- 請求項7に記載の形質転換体を、致死条件下で培養することにより、形質転換により挿入された断片の一部又は全部が脱落した株を作製する方法。
- 請求項8に記載の方法により作製された株。
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