JP2008520197A - 光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
(i) 配列番号2のポリペプチド配列、または
(ii) 配列番号2の配列に対して少なくとも80%同一であるポリペプチド配列、
を有するアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でブタン−2−オンを還元することによる(S)−ブタン−2−オールの製造方法に関する。
ee(%)=S−エナンチオマー−R−エナンチオマー/(S−エナンチオマー+R−エナンチオマー)×100
本発明は更に、調節核酸配列の遺伝子制御のもとに、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物に関し、またこれらの発現構築物を少なくとも1つ含むベクターに関する。
本発明のベクターまたは構築物を利用して、例えば少なくとも1つの本発明のベクターを用いて形質転換され、本発明のポリペプチドの生産に使用し得る組換え微生物を作製することが可能である。有利には、上記の本発明の組換え構築物を好適な宿主系に導入して発現させる。これに関係して、当業者に公知の通常のクローニングおよびトランスフェクション方法、例えば共沈法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルスによるトランスフェクション等が、該核酸を特定の発現系において発現させるために好ましく使用される。好適な系は、例えば「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」 F. Ausubelら編、Wiley Interscience, New York 1997またはSambrookら「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
本発明は更に、本発明に従って用いられるポリペプチドまたはその機能的な生物学的活性断片を組換えによって調製するための方法に関し、この方法では、ポリペプチドを産生する微生物を培養し、適切な場合には該ポリペプチドの発現を誘導し、そして該ポリペプチドを該培養物から単離する。ポリペプチドは、必要な場合には工業的規模でこの方法により生産することもできる。
本発明の方法において、デヒドロゲナーゼは遊離の酵素または固定化酵素として使用することができる。
大腸菌プロパノールデヒドロゲナーゼのクローニング
大腸菌プロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の配列は、データベースに登録されている(GenBank ID 48994873 領域:相補鎖 (1550852から1551892))。公知の方法に従って大腸菌ゲノムDNAから該遺伝子を増幅するために用いられるオリゴヌクレオチドは、プロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列に由来するものとした。得られた配列は公表されている配列に一致する。オリゴヌクレオチドのDNA配列を表1に示す。
組換えプロパノールデヒドロゲナーゼの準備
大腸菌LU12418を100 mlのエルレンマイヤーフラスコ (バッフル付き)内の20 mlのLB-Amp/Spec/Cm (100μg/l アンピシリン; 100μg/l スペクチノマイシン; 20μg/l クロラムフェニコール)、0.1mM IPTG、0.5g/l ラムノース中で37℃にて18時間増殖させ、5000*g/10分の遠心分離を行い、10mM TRIS*HCl、pH 7.0で1回洗浄し、同じ緩衝液2ml中に再懸濁した。
大腸菌LU12418組換えデヒドロゲナーゼ活性の測定
それぞれの場合に、6個の形質転換体を100 ml エルレンマイヤーフラスコ (バッフル付き)内の20 mlのLBAmp/Spec/Cm (100μg/l Amp; 100mg/l Spec; 20μg/l Cm)、0.1mM IPTG、0.5g/l ラムノース中で37℃にて18時間増殖させ、5000*g/10分の遠心分離を行い、10mM TRIS/HCl、pH7.0で1回洗浄し、同じ緩衝液2ml中に再懸濁した。
ブタン−2−オールの分析
ブタン−2−オンおよびブタン−2−オールの濃度はGCによって測定できる。また、固定相および移動相の選択により、濃度のほかにee値を決定することもできる。
以下の系を使用して反応を定量化した。
固定相:Chromoltih SpeedROD RP18, 50*4, 6μm, Merck (Darmstadt, Germany),
45℃まで加熱
移動相:溶離液 A:10 mM KH2PO4, pH 2.5
溶離液 B:アセトニトリル
勾配:0〜0.5分, 35%のB; 0.5〜1.0分 35〜80%のB; 1.0〜1.2分 80%のB;
1.2〜1.3分 80%〜35%B; 1.3〜2.0 分 35%のB;
流速:1.5 ml/分
検出:230 および 260 nmにおけるUV検出
保持時間:ブタン-2-オン :約1.6 分
ブタン-2-オール:約1.3 分
真正物質を用いて一連のキャリブレーションを行い、これに基づいて未知のサンプルの濃度を決定することができる。
固定相:Chiracel OD-H, 250*4, 6μm, Daicel, 40℃まで加熱
移動相:溶離液 A:n-ヘキサン
溶離液 B:イソプロパノール
2.5%のBを用いて均一濃度溶離
流速:1.0 ml/分
検出:230 および 260 nmにおけるUV 検出
保持時間:ブタン-2-オン :約9.5 分
(1S)-ブタン-2-オール:約16.6 分
(1R)-ブタン-2-オール:約18.3 分
真正物質を用いて一連のキャリブレーションを行い、これに基づいて未知のサンプルの濃度を決定することができる。
補因子再生のためのグルコースデヒドロゲナーゼの準備およびグルコースデヒドロゲナーゼを用いた補因子の再生(酵素カップリング)
補因子の再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。この酵素は市販のものが入手できる(例えばJulich Fine Chemicals, 注文番号22.10 または 19.10)。以下では、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)グルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子(GenBank アクセッション番号M12276)を用い、大腸菌 XL10 Gold クローン中のpUC19プラスミドにクローニングした。この構築物を大腸菌LU11293と命名する。
3.5g MgSO4 * 7H2O
14g NH4Cl
14ml アンピシリン溶液 (100mg/ml)
500mlの水に溶解し、ろ過滅菌する。
プロパノールデヒドロゲナーゼによる補因子の再生(基質カップリング)
補因子は、プロパノールデヒドロゲナーゼそのものによって再生することもできる。この場合には、別の再生用酵素を添加する必要はない。プロパノールデヒドロゲナーゼは還元剤として種々の一価アルコールを用いることができる。これらは対応するカルボニル化合物に酸化される。プロパノールデヒドロゲナーゼを用いてNADHまたはNADPHを再生するのに好適な一価アルコールはイソプロパノールである。
ギ酸デヒドロゲナーゼを用いた補因子の再生(酵素カップリング)
補因子の再生にギ酸デヒドロゲナーゼを用いることができる。この酵素は市販のものが入手できる(例えばJulich Fine Chemicals 注文番号09.11、24.11または25.10)。実施例5と同様に、補因子はギ酸デヒドロゲナーゼを用いても再生することができる。この方法では、等モル量のギ酸およびブタン−2−オンを、1〜30 U/mlのギ酸デヒドロゲナーゼ粗抽出物および1〜30 U/mlのプロパノールデヒドロゲナーゼ粗抽出物と共に用いる。0.02〜1 mmol/lのNADもしくは NADPまたは0.02〜1 mmol/lのNADHもしくはNADPHを緩衝液に溶解し、10〜60℃でインキュベートした。pHを酸の自動添加によって一定レベルに維持した。
大腸菌の組換えプロパノールデヒドロゲナーゼを用いた(S)−ブタン−2−オールの製造
大腸菌LU12418を実施例2に従って培養し、回収して、破砕した。
D-グルコース270 g (1.5 mol)、ブタン−2−オン135 ml (1.5 mol)、GDH粗抽出物 63 ml (ほぼ30.5 kUに相当)、PDH粗抽出物95 ml (ほぼ20 kUに相当)、およびNADもしくはNADPまたはNADHもしくはNADPH 400 mg (0.6 mmol)をKPi緩衝液 (50 mM KPi, 1 mM MgCl2, pH 6.5)に溶解し、30℃でインキュベートした。反応混合液の出発容量は3リットルであった。pHを2M NaOHの自動添加によって一定レベルに維持した。図は典型的な反応プロファイルを示す。
Claims (8)
- (i) 配列番号2のポリペプチド配列、または
(ii) 配列番号2の配列に対して少なくとも80%同一であるポリペプチド配列、
を有するアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でブタン−2−オンを還元することによる、(S)−ブタン−2−オールの製造方法。 - 補因子としてNADHを使用して還元を行う、請求項1記載の方法。
- 使用する補因子を酵素的に再生する、請求項1記載の方法。
- 補因子をグルコースデヒドロゲナーゼによって再生する、請求項1記載の方法。
- 還元を水性系において行う、請求項1記載の方法。
- アルコールデヒドロゲナーゼが固定化された形態で存在する、請求項1記載の方法。
- 使用するアルコールデヒドロゲナーゼが大腸菌において発現される、請求項1記載の方法。
- ブタン−2−オンを還元することによる(S)−ブタン−2−オールの製造方法における、
(iii) 配列番号2のポリペプチド配列、または
(iv) 配列番号2の配列に対して少なくとも80%同一であるポリペプチド配列、
を有するアルコールデヒドロゲナーゼの使用。
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