JP2011177125A

JP2011177125A - Ｓ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母の取得方法

Info

Publication number: JP2011177125A
Application number: JP2010045789A
Authority: JP
Inventors: Haruyuki Iefuji; 治幸家藤; Nobuto Yasuda; 伸斗安田; Muneyoshi Kanai; 宗良金井; Tsutomu Fujii; 力藤井
Original assignee: National Research Institute of Brewing
Current assignee: National Research Institute of Brewing
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2011-09-15
Anticipated expiration: 2030-03-02
Also published as: JP5641192B2

Abstract

【課題】Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の大量生産のため、従来のＳＡＭ高生産酵母のスクリーニング系と比べてより実験操作が簡易で、且つ、生産性のより高いＳＡＭ高蓄積酵母の取得方法を提供し、それによって得られた酵母を用いたＳＡＭの大量製造方法を提供する。
【解決手段】コルディセピンを含有した選択培地を用いて酵母を培養し、生育してくる酵母（コルディセピン耐性株）を選択することにより、ＳＡＭ高蓄積酵母を効率的に取得する。そして、得られた酵母を用いて所定の培地で培養することで、ＳＡＭの大量生産を工業的に行う。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：以下、ＳＡＭｅ、ＳＡＭということもある）高蓄積酵母の取得方法等に関する。詳細には、ＳＡＭ高蓄積酵母の選択培地によるスクリーニング方法、及び、ＳＡＭ高蓄積酵母を用いたＳＡＭの大量製造方法に関する。

ＳＡＭは生体内に存在する含硫アミノ酸代謝のｋｅｙ物質であり、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼの作用によりメチオニンとＡＴＰから合成される。その構造中に活性型のメチルチオエーテル基を持ち、タンパク質や核酸など種々のメチル基受容体にメチル基を供与することで、生体内の主要なメチル基供与体として働く。医学的臨床試験により、アルコール性肝機能障害、動脈硬化、老人性痴呆症や鬱病、関節炎といった種々の疾患に対し、予防及び改善効果を発揮する生理機能があるという報告がある。更に近年では、癌やＡＩＤＳにも作用することが新たに報告されており、ＥＵ諸国においては医療用医薬品として、アメリカ合衆国においてはサプリメントとしての地位を確立している。日本においても、２００９年２月厚生労働省において、ＳＡＭｅ（ＳＡＭ）が天然に含有する酵母等の食品につき、栄養成分表示等でＳＡＭｅを記載すること自体に問題がないという見解が示されたことより、近い将来、市場活発化の期待が高まっている物質である。

現在までの知見より、このＳＡＭはあらゆる微生物の中でも特に酵母においてその生産能力が高いことが知られており、現在、ＳＡＭの工業的生産はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから抽出することにより行われているが、ＳＡＭの生産機構については不明な点が多く、また酵母培養培地に高価なアミノ酸の大量添加などが必要であり生産コストが高いため、ＳＡＭの作用機序の解明や、従来のＳＡＭ生産系よりも迅速かつ安価で大量生産の可能な系の構築等が現状の課題となっている。

従来のＳＡＭの生産は、既存の株を用い、その菌での生産培地組成を検討することにより生産性の向上が図られてきた。ようやく最近になって、ＳＡＭ生産性酵母の中から、さらに生産性が向上した変異株の取得が試みられているが、大幅なＳＡＭ生産性の向上に達していなかったり（特許文献１）、またセルフクローニング法という煩雑な操作が必要であったり（特許文献２）、特に食品として用いにくい、特定の遺伝子を遺伝子操作によって欠損等させた遺伝子組換え体であるなど（特許文献３）、更に改善の余地がある。

特開２００４−２８３１０３号公報特開２００９−０３４０４３号公報特開２００９−２１３４６９号公報

本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の大量生産のため、従来のＳＡＭ高生産酵母のスクリーニング系と比べてより実験操作が簡易で、且つ、生産性のより高いＳＡＭ高蓄積酵母の取得方法、及び、それによって得られた酵母を用いたＳＡＭの大量製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行い、コルディセピンを含有した選択培地を用いて酵母を培養し、生育してくる変異酵母であるコルディセピン耐性株を選択することにより（ポジティブスクリーニングにより）、ＳＡＭ高蓄積酵母を簡便かつ効率的に取得できることを見出し、本発明に至った。
また、得られた酵母を用いて所定の培地で培養することで、ＳＡＭの大量生産を工業的に行うことができることも見出した。

すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）コルディセピンを含有する選択培地で生育してくるコルディセピン耐性株を取得すること、を特徴とするＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母の取得方法（親株の２〜２０倍量以上（例えば２〜３０倍量）ＳＡＭを高蓄積するＳＡＭ高蓄積酵母の取得方法）。
（２）（１）に記載の方法で取得してなる、遺伝子組換え体でないコルディセピン耐性変異株であるＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母。
（３）該酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はＣａｎｄｉｄａ属に属する酵母であること、を特徴とする（２）に記載のＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母。
（４）該酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであること、を特徴とする（３）に記載のＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母。
（５）コルディセピン耐性を有するＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母である、ＳａｋｅｙｅａｓｔＮＹ９−１０（ＮＩＴＥＰ−８３１）。
（６）コルディセピン耐性を有するＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母である、ＳａｋｅｙｅａｓｔＮＹ７−３（ＮＩＴＥＰ−８３０）。
（７）（２）〜（６）のいずれか１つに記載の酵母を培養し、培養物（培地及び／又は菌体）からＳ−アデノシルメチオニンを取得すること、を特徴とするＳ−アデノシルメチオニンの大量製造方法。
（８）コルディセピンを含有してなること、を特徴とするＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母選択培地。

本発明によれば、コルディセピン含有選択培地によりコルディセピン耐性株をポジティブスクリーニングすることで、簡易かつ効率的にＳＡＭ高蓄積（又はＳＡＭ高含有）酵母を取得することができる。また、ＳＡＭを高濃度に菌体内に蓄積及び／又は菌体外に分泌する酵母も取得することができる。そして、得られた酵母を用いることで、ＳＡＭの大量生産を工業的かつ効率的に行うことができる

Ｋ−９株より取得した２５株（ＮＹ９−１〜２５）のコルディセピン耐性株をＹＰＤ培地で３０℃、２４時間振とう培養した際のＳＡＭ蓄積量を示す（丸印は寄託菌株（ＮＩＴＥＰ−８３１）を示す）。なお、ｄｒｙｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔ（ＤＣＷ）は、乾燥菌体重量を示す。以下同じ。Ｋ−７株より取得した９株（ＮＹ７−１〜９）のコルディセピン耐性株をＹＰＤ培地で３０℃、２４時間振とう培養した際のＳＡＭ蓄積量を示す（丸印は寄託菌株（ＮＩＴＥＰ−８３０）を示す）。Ｋ−９株より取得した５株（ＮＹ９−１、４、９、１０、２４）のコルディセピン耐性株をＯ−培地で３０℃、２４時間振とう培養した際のＳＡＭ蓄積量を示す（丸印は寄託菌株（ＮＩＴＥＰ−８３１）を示す）。Ｋ−７株より取得した３株（ＮＹ７−３、５、６）のコルディセピン耐性株をＯ−培地で３０℃、２４時間振とう培養した際のＳＡＭ蓄積量を示す（丸印は寄託菌株（ＮＩＴＥＰ−８３０）を示す）。

本発明においては、コルディセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ：３−デオキシアデノシン）含有選択培地を用いる。コルディセピンは、リボヌクレオシドであるアデノシンの誘導体で、アデノシンのリボース部位の３位である酸素が欠落している構造であり、酵母のメチオニン代謝経路の中間代謝産物であるアデノシンの正常な機能を阻害する。これによって、メチオニンが正常に代謝されずＳＡＭとして細胞内に高蓄積するものと考えられる。

正常な酵母は、コルディセピン含有培地では生育できない。本発明では、正常な酵母（野生株）をそのまま使用して耐性株を偶発的に出現させる方法を用いても良いが、野性株に突然変異処理を行って使用することによって、コルディセピン耐性株を効率的に取得できる。突然変異処理は定法が適宜利用され、物理的方法及び化学的方法のいずれもが使用可能である。物理的方法としては、紫外線照射、放射線（例えばγ線）照射などがあり、化学的方法としては、例えば、亜硝酸、ナイトロジェンマスタード、アクリジン系色素、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の溶液に菌体を懸濁させる方法などがある。これらの方法は、適宜組み合わせて行うこともできる。

なお、本発明においては、特定の遺伝子を欠損等させた遺伝子組換え体酵母は使用しない。よって、本発明では、遺伝子組換え体でない、つまり野生株が偶発的に変異した変異株又は上記突然変異処理により出現した変異株（本発明においてはこれらを「変異株」と総称している）を得ることができ、食品に用いても問題はない。

つづいて、上述の野生株酵母又は突然変異処理酵母をコルディセピン含有培地で培養して生育してくるコルディセピン耐性株を取得する。本発明におけるスクリーニングは、ポジティブスクリーニングであるので、操作がシンプルでしかも結果判定が正確に行われるため、きわめて効率的である。コルディセピンの添加は、液体培養で清酒酵母の場合、１ｍｌあたり５００〜１０００μｇ（より好ましくは６００〜８００μｇ）含有したＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）が例示される。他の酵母については、上記数値範囲に基づき適宜定めればよい。

酵母としては、Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ等のＣａｎｄｉｄａ属やＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母等が例示される。後者においては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓ．ｂａｉｌｌｉ等が例示される。

また、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する各種の市販酵母、実用酵母、実験室酵母等も本発明の対象であって、清酒酵母（協会６号酵母、協会７号酵母、協会９号酵母、協会１０号酵母等）、焼酎酵母（日本醸造協会焼酎用２号酵母等）、ワイン酵母（ブドウ酒１号酵母（日本醸造協会ブドウ酒１号酵母）、ブドウ酒３号酵母、ブドウ酒４号酵母等）、ビール酵母、パン酵母等も非限定例として挙げられる。

本発明では、上述のような手法で目的とするＳＡＭ高蓄積酵母を取得することができる。一例として挙げると、清酒酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫ−９（協会９号酵母）、Ｋ−７（協会７号酵母）を親株として、それぞれ、目的株を取得するのに成功し、それらの内、Ｋ−９から取得した株をＮＹ９−１０、Ｋ−７から取得した株をＮＹ７−３と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにそれぞれＮＩＴＥＰ−８３１、ＮＩＴＥＰ−８３０として寄託した。

そして、このようにして分離育種したＳＡＭ高蓄積株を培養することによって培養物からＳＡＭを大量に取得することができる。ＹＰＤ培地においては、同じ培地で親株より２０倍を超えるＳＡＭの高蓄積を行うことができ、さらに大量に生産蓄積したいのであれば、例えばＯ−培地（グルコース５％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．４％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．２％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０５％、Ｌ−メチオニン０．１５％）で培養した場合、Ｋ−９菌から選別された変異株は、酵母細胞乾物重量１ｇあたり、１〜８０ｍｇ（例えば３〜８０ｍｇ）、場合によっては８０ｍｇ以上のＳＡＭを高蓄積し、１００ｍｇ以上も蓄積する可能性も充分に認められる。なお、本実施例によれば、親株の２〜２０倍程度のＳＡＭの蓄積が確認されたが、それ以上（例えば１０〜３０倍）の蓄積も充分可能である。

上述のように、ＳＡＭ高蓄積酵母（コルディセピン耐性株）を培養して該酵母を増殖せしめ、増殖した酵母の培養物からＳＡＭを抽出、取得することによってＳＡＭを大量に取得することが可能となる。培養は常法にしたがって行えばよく、その際、親株と変異株との間の増殖特性には格別の相違は認められない（むしろ変異株の方が親株と比べて良好な増殖を示す場合も見られる）。

なお、培養にあたり、ＹＰＤ培地を使用しても問題ないが、メチオニン添加培地（Ｏ−培地等）を使用するとより好ましく、更なるＳＡＭの大量取得が可能となる。メチオニンの添加量は、適宜でよいが、好ましくは０．１５％〜０．７５％の範囲内が好適である。
さらには、リン酸塩、硫酸塩、エタノールから選ばれる少なくとも１以上の添加培地を使用することがより好ましい。これらの添加量も適宜でよいが、好ましくはそれぞれ０．２〜０．４％、０．０５％、４．０％程度が好適である。

以下に本発明の実施例について述べる。

ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫ−９（協会９号酵母）及びＫ−７（協会７号酵母）を親株とし、常法に基づき紫外線照射で変異処理を行った。生存率はおよそ１０％であった。処理菌株を、コルディセピン６００μｇ／ｍｌ含有ＹＰＤ液体培地に植菌し、Ｋ−９株に関しては、３０℃で３日間培養を３回、１日間培養を３回繰り返す継代培養を行い、濁ってきた菌体を１０の５乗倍希釈し、ＹＰＤプレートに１００ｍｌ塗布し３０℃で培養を行い、生育してきたコロニーをピックアップして、コルディセピン耐性株を２６０株選択、取得した。Ｋ−７株に関しては、３０℃で３日間培養を５回、１日間培養を３回繰り返す継代培養を行い、濁ってきた菌体を１０の５乗倍希釈し、ＹＰＤプレートに１００ｍｌ塗布し３０℃で培養を行い、生育してきたコロニーをピックアップして、コルディセピン耐性株を９３株選択、取得した。

このようにしてコルディセピン耐性株として選択した株の中から無作為に、Ｋ−９菌由来の株から２５株（ＮＹ９−１〜２５）、Ｋ−７菌由来の株から９株（ＮＹ７−１〜９）を選び、ＹＰＤ培地で３０℃、２４時間前培養し、ＹＰＤ培地で３０℃、２４時間振とう培養した。培養した菌体を、１０％過塩素酸を用いてＳＡＭを抽出し（３０℃、１時間）、上清を希釈し、キャピラリー電気泳動にてＳＡＭ蓄積量の分析を行った。

ＳＡＭの分析は以下の要領でキャピラリー電気泳動法により測定した。分析条件は以下のとおり。
分析装置
キャピラリー電気泳動システム（Ａｇｉｌｅｎｔ、１１００シリーズ）
分析条件
キャピラリー：ＨＰＣＥｓｔｎｄｒｄｃａｐ７５μｍ×７２ｃｍ
バッファー：４０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ２．５）
電圧：ｐｏｓｉｔｉｖｅ、２０ｋＶ
サンプリング：４秒、ハイドロスタティック法
温度：２５℃
検出：ＵＶ２５４ｎｍ

図１に、Ｋ−９株より取得した２５株（ＮＹ９−１〜２５）、図２にＫ−７株より取得した９株（ＮＹ７−１〜９）の菌体内ＳＡＭ量をそれぞれ親株とともに示した。その結果、Ｋ−９株においてはコルディセピン耐性株２５株中２５株で約２０倍（８〜１２ｍｇＳＡＭ／ｇＤＣＷ）、またＫ−７株においてはコルディセピン耐性株９株中９株で約１０倍（約３ｍｇＳＡＭ／ｇＤＣＷ）、親株より有意にＳＡＭが蓄積していた。

さらにコルディセピン耐性株として選択した株の中から無作為に、Ｋ−９菌由来の株から５株（ＮＹ９−１、４、９、１０、２４）、Ｋ−７菌由来の株から３株（ＮＹ７−３、５、６）を選び、ＹＰＤ培地で３０℃、２４時間前培養し、Ｏ−培地で３０℃、２４時間振とう培養した。培養した菌体を、１０％過塩素酸を用いてＳＡＭを抽出し（３０℃、１時間）、上清を希釈し、キャピラリー電気泳動にてＳＡＭ蓄積量の分析を行った。

図３に、Ｋ−９株より取得した５株（ＮＹ９−１、４、９、１０、２４）、図４にＫ−７株より取得した３株（ＮＹ７−３、５、６）の菌体内ＳＡＭ量をそれぞれ親株とともに示した。その結果、Ｋ−９株においてはコルディセピン耐性株５株中５株で約４倍（約８０ｍｇＳＡＭ／ｇＤＣＷ）、またＫ−７株においてはコルディセピン耐性株３株中３株で約２倍（６０〜７０ｍｇＳＡＭ／ｇＤＣＷ）、親株より有意にＳＡＭが蓄積していた。

本発明を要約すれば、以下の通りである。

本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の大量生産のため、従来のＳＡＭ高生産酵母のスクリーニング系と比べてより実験操作が簡易で、且つ、生産性のより高いＳＡＭ高蓄積酵母の取得方法を提供し、それによって得られた酵母を用いたＳＡＭの大量製造方法を提供することを目的とする。

そして、コルディセピンを含有した選択培地を用いて酵母を培養し、生育してくる酵母（コルディセピン耐性株）を選択することにより、ＳＡＭ高蓄積酵母を効率的に取得することができる。そして、得られた酵母を用いて所定の培地で培養することで、ＳＡＭの大量生産を工業的に行うことができる。

本発明において寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）ＳａｋｅｙｅａｓｔＮＹ９−１０（ＮＩＴＥＰ−８３１）。
（２）ＳａｋｅｙｅａｓｔＮＹ７−３（ＮＩＴＥＰ−８３０）。

Claims

コルディセピンを含有する選択培地で生育してくるコルディセピン耐性株を取得すること、を特徴とするＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母の取得方法。
請求項１に記載の方法で取得してなる、コルディセピン耐性変異株であるＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母。
該酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はＣａｎｄｉｄａ属に属する酵母であること、を特徴とする請求項２に記載のＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母。
該酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであること、を特徴とする請求項３に記載のＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母。
ＳａｋｅｙｅａｓｔＮＹ９−１０（ＮＩＴＥＰ−８３１）。
ＳａｋｅｙｅａｓｔＮＹ７−３（ＮＩＴＥＰ−８３０）。
請求項２〜６のいずれか１項に記載の酵母を培養し、培養物からＳ−アデノシルメチオニンを取得すること、を特徴とするＳ−アデノシルメチオニンの大量製造方法。
コルディセピンを含有してなること、を特徴とするＳ−アデノシルメチオニン高蓄積酵母選択培地。