JP2011137047A - 凍結乾燥の際に生物学的分子を安定化するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】凍結乾燥の際、生物学的分子を安定化させる組成物および方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、生物学的分子、特に、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７の調製のための組成物および方法に関する。少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する溶解緩衝液に溶解された生物学的分子は、減少した凝集およびタンパク質分解による分解を示す。１つの局面によれば、本発明は、少なくとも１つの非晶質賦形剤、少なくとも１つの非晶質緩衝剤、および少なくとも１つのＭｅｎＣ免疫原を含む溶解緩衝液を提供する。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、凍結乾燥の際、生物学的分子を安定化するための組成物および方法、ならびに生物学的分子を凍結乾燥するための方法に関する。

（発明の背景）
ワクチンは、多くの異なる疾患の予防および／または治療に広範に用いられる。髄膜炎菌性髄膜炎（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）は、ワクチンを通して予防および／または治療が提供され得る、このような疾患の１つである。

髄膜炎菌性髄膜炎ワクチンは、免疫原性が比較的低い、髄膜炎菌ポリサッカライド（ＰＳ）を利用する。髄膜炎菌ポリサッカライドの免疫原性が比較的低いことを克服するため、ＰＳワクチンは、タンパク質キャリアと結合体化されて免疫原性を増大し、そして若年の小児で長期の防御を提供する。Ｃ髄膜炎菌（ＭｅｎＣ）に対するこのようなワクチンの１つであるＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７は、タンパク質キャリアとしてＣＲＭ１９７を用いて調製されている（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９２、第１０巻、１０号：６９１〜８）。

しかし、結合体化髄膜炎菌ポリサッカライドワクチンＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７の使用には、いくつかの問題が付随しており、そして実際には一般にタンパク質含有ワクチンに関連する問題である。ワクチンの保管期限を延長するため、処方物は頻繁に凍結乾燥される。しかし、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７の凍結乾燥は、凍結および保存の間、タンパク質凝集をもたらし得る。ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７の場合、凝集物は非共有結合のＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７の多量体（マルチマー）を示す。この多量体は、疎水性の相互作用によって会合するようである。現在の溶解緩衝液の処方物（すなわち、緩衝液として１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）および賦形剤として１．５％マンニトールを含有する）の使用は、９．５％〜１０％程度の高さの凝集を生じ得る。凝集の増大につれて、利用可能な免疫原の濃度が低下する。従って、凍結乾燥の間の凝集に対して生物学的分子を安定化することにより、凝集の問題を克服する組成物および方法についての必要性が存在する。１９７ワクチンは、互いに共有結合したＡおよびＢの２つのフラグメントからなる。フラグメントＡは、安定であり、変性に対して非常に耐性であることが見出されている。しかし、フラグメントＢは、変性に非常に感受性であり、凍結乾燥の間、タンパク質分解性の分解に供される。タンパク質分解性の分解が増大するにつれ、利用可能な機能的免疫原の濃度は低下する。従って、凍結乾燥および保管の間、分解を最小限にする組成物、および生物学的分子の調製方法についての必要性がさらに存在する。

今日まで、凍結乾燥の際の生物学的分子の凝集および／または分解を説明しそして最小限にすることを追求する種々の理論が存在するが、満足な技術は存在しない。Ｏｒｉｉらは、グリセロールおよび糖が、おそらく、ｐＨの変化を最小限にすることにより、凍結および融解によって生じる損傷から生物学的物質を保護すると報告している（Ｏｒｉｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７７，８１：１６３〜１６８）。

Ａｒａｋａｗａらは、種々の糖を用いて、水溶液中のタンパク質の安定化を評価した（Ａｒａｋａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８２，２１：６５３６〜６５４４）。Ａｒａｋａｗａらは、水溶液中の成分タンパク質の保護を、糖の凝集力（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｆｏｒｃｅ）と関連付けている（この力は、水の表面張力の増大の原因である）。しかし、この因子は、凍結乾燥された溶液中では無関係である。Ａｒａｋａｗａらは、凍結乾燥した溶液の安定性には取り組んでいない。さらに、Ａｒａｋａｗａらは、水溶液中に存在するスクロースがいくつかの酵素の活性を実際に低下することを報告している。

Ｐｉｋａｌらは、賦形剤が、タンパク質を安定化するのに有効であるように少なくとも部分的に非晶質のままでなければならないことを報告しているが、ただし、非晶質賦形剤は、安定性増強には十分な条件ではないことに注意しており、実際、タンパク質溶液に対するアモルファス賦形剤の添加は、賦形剤とタンパク質との間の分子相互作用を通じてタンパク質を現実には安定化し得ないことを観察している（Ｐｉｋａｌら、Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１９９０，３，２６〜２９）。Ｐｉｋａｌらは、高レベルの緩衝剤は、凍結の間、緩衝剤成分の１つの結晶化および引き続くｐＨ値の増大偏向を導くようであるので、回避されるべきであること、ならびに非晶質を保持する緩衝剤でさえ、これが乾燥物質の分解温度およびガラス転移温度を通常下げるので、高レベルでは安定でないことを述べている。この著者らは、その実験において、低レベルの緩衝剤は、非晶質を保持する傾向であり、なお分解温度またはガラス転移温度に劇的に影響することはないことを報告している。しかし、Ｐｉｋａｌらは、高いレベルの緩衝剤または低いレベルの緩衝剤を規定していない。しかし、後の報告では、Ｐｉｋａｌらは、逆相ＨＰＬＣに基づき、凝集が１．６９ｍＭリン酸緩衝液中で最大であり、一方分解は最小であったことを報告している（Ｐｉｋａｌら．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９１，８：４２７〜４３６）。従って、この著者らは、リン酸緩衝剤のレベルは、関連要因ではないようであると結論している。

Ｉｚｕｔｓｕらは、非晶質状態でマンニトールを維持することが、βガラクトシダーゼを安定化すると報告している（Ｉｚｕｔｓｕら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９３，第１０巻８号１２３２〜１２３７）。Ｉｚｕｔｓｕらは、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液において、マンニトールは、２００〜５００ｍＭで非晶質であり、そしてβガラクトシダーゼを安定化するように働いたことを報告している。１０ｍＭおよび５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液において、マンニトールは、５０〜１００ｍＭで非晶質であり、そして安定化効果を示す。Ｉｚｕｔｓｕらはまた、リン酸ナトリウム緩衝液中のグルコースが、酵素活性を保護することを報告しているが、このような効果を得るために適切なグルコースの濃度についてのいずれのデータも提供していない。

凍結乾燥された酵素溶液に対する選択したアミノ酸の保護効果がまた試験されている（Ｓｅｇｕｒｏら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，２７：７０〜７９）。溶液中で乳酸脱水素酵素を用い、凍結乾燥の間の、グルタミン酸１ナトリウム（ＭＳＧ）および塩酸リジン（Ｌｙｓ−ＨＣｌ）の保護効果を評価した。Ｓｅｇｕｒｏらは、酵素溶液へのＭＳＧまたはＬｙｓ−ＨＣｌのいずれかの添加が、酵素活性の損失を、約４０％（脱イオン水を用いるコントロール）から２０〜２５％（ＭＳＧまたはＬｙｓ−ＨＣｌを用いる場合）に低下させることに気づいた。この著者らは、塩濃度もイオン強度も、溶解した酵素の安定化には重要でないことを示唆している。Ｓｅｇｕｒｏらは、凍結変性における最も関連する要因は、添加物によって生成された過冷却現象の終わりか、または水から氷への相変化のいずれかであることを報告している。

種々の組成物の凍結乾燥のための手順が、いくつかの参考文献において記載されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これらの参考文献に記載されている凍結乾燥のための方法は、一連のサイクルを含む。

ＤｅＬｕｃａら（１９６５）は、生成物の共融温度が、凍結乾燥サイクルの設計に重要な因子であること、ならびに種々の有機塩および無機塩の共融温度が類似であること（表１）を報告している。この著者らは、凍結乾燥サイクルの設計における重要な他の因子としては、凍結塊の過冷却効果および熱伝導性特性が挙げられると述べている。ＤｅＬｕｃａら（１９６５）は、マンニトールもスクロースも有機塩の安定性またはこの系の共融温度に有意な影響を及ぼさないと報告している。ＤｅＬｕｃａら（１９７７）は、添加物の共融温度は、サイクル時間に影響するので、薬物の共融温度よりも低くなければならないと報告しており、そして、１塩基性および２塩基性のリン酸ならびに塩化ナトリウムを添加することが出来上がりの固体の特性を改善することを示唆している。この著者らは、この生成物の共融温度および過冷却特性を決定することによりサイクル時間を最適化することが可能であり得ると結論している。
凍結乾燥の際、生物学的分子を安定化させる組成物および方法の必要性が存在する。

ＤｅＬｕｃａ，Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９７７，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１，６２０〜６２９ ＤｅＬｕｃａら．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９６５，第５４巻４号，６１７〜６２４ Ｐｉｋａｌら．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１９９０，３，２６〜２９

（発明の要旨）
本発明は、非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液を用いて、これが、凍結乾燥の間および後、すなわち、凍結乾燥の「際（ｕｐｏｎ）」の凝集および分解に対して生物学的分子を安定化させ得るという驚くべき発見に起因する。

１つの局面によれば、本発明は、少なくとも１つの非晶質賦形剤、少なくとも１つの非晶質緩衝剤、および少なくとも１つのＭｅｎＣ免疫原を含む溶解緩衝液を提供する。

別の局面によれば、本発明は、凍結乾燥の際、１つ以上のＭｅｎＣ免疫原を安定化させる方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中にＭｅｎＣ免疫原を溶解して混合物を形成する工程、次いでこの混合物を凍結乾燥する工程を包含する。

なお別の局面において、本発明は、１つ以上のＭｅｎＣ免疫原を保管（貯蔵）する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中にＭｅｎＣ免疫原を溶解して混合物を形成する工程、次いでこの混合物を凍結乾燥する工程を包含する。

なお別の局面において、本発明は、ＭｅｎＣ免疫原を凍結乾燥する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中にＭｅｎＣ免疫原を溶解して混合物を形成する工程、
この混合物を、約１０００Ｐａ〜約２０００Ｐａの圧力下で約１０℃〜約２０℃で負荷する工程、この混合物を約１０００Ｐａ〜約２０００Ｐａの圧力下で約−７０℃〜約−５０℃の温度で約１時間〜約４時間凍結させる工程、この混合物を約５Ｐａ〜約１０Ｐａの圧力下で約−５０℃〜約−３５℃の温度で約１８時間〜約３０時間乾燥させる工程、およびこの混合物を約５Ｐａ〜約１０Ｐａの圧力下で約１０℃〜約２０℃の温度で約２時間〜約１２時間乾燥させる工程、を包含する。

別の局面において、本発明は、ＭｅｎＣ免疫原の凍結乾燥のための方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中でＭｅｎＣ免疫原を溶解して混合物を形成する工程、この混合物を、約１０００Ｐａの圧力下で約１０℃で負荷する工程、この混合物を約１０００Ｐａの圧力下で約−５０℃の温度で約２時間凍結させる工程、この混合物を約５Ｐａの圧力下で約−３５℃の温度で約２４時間乾燥させる工程、およびこの混合物を約５Ｐａの圧力下で約２０℃の温度で約８時間乾燥させる工程、を包含する。
別の局面において、本発明は、凍結乾燥の際、ＭｅｎＣワクチンを安定化させる方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中でＭｅｎＣワクチンを溶解して混合物を形成する工程、およびこの混合物を凍結乾燥する工程、を包含する。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１） 少なくとも１つの非晶質賦形剤、少なくとも１つの非晶質緩衝剤、および少なくとも１つのＭｅｎＣ免疫原を含有する、溶解緩衝液。
（項目２） 前記非晶質緩衝剤が有機緩衝剤である、項目１に記載の溶解緩衝液。
（項目３） 前記有機緩衝剤が、イミダゾール緩衝剤およびヒスチジン緩衝剤からなる群より選択される、項目２に記載の溶解緩衝液。
（項目４） 前記非晶質賦形剤が糖である、項目１に記載の溶解緩衝液。
（項目５） 前記糖がスクロースである、項目４に記載の溶解緩衝液。
（項目６） 前記ＭｅｎＣ免疫原がＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７である、項目１に記載の溶解緩衝液。
（項目７） 凍結乾燥の際に１つ以上のＭｅｎＣ免疫原を安定化するための方法であって、以下：
（ａ）該ＭｅｎＣ免疫原を、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する溶解緩衝液に溶解して、混合物を形成する工程、ならびに
（ｂ）該混合物を凍結乾燥する工程、
を包含する、方法。
（項目８） 前記ＭｅｎＣ免疫原がＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７である、項目７に記載の方法。
（項目９） 項目７に記載の方法に従って安定化された、凍結乾燥組成物であって、少なくとも１つの非晶質賦形剤、少なくとも１つの非晶質緩衝剤、および少なくとも１つのＭｅｎＣ免疫原を含有する、組成物。
（項目１０） １つ以上のＭｅｎＣ免疫原を貯蔵するための方法であって、以下：
（ａ）ＭｅｎＣ免疫原を溶解緩衝液に溶解して混合物を形成する工程であって、該溶解緩衝液が、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する、工程、ならびに
（ｂ）該混合物を凍結乾燥する工程、
を包含する、方法。
（項目１１） 前記ＭｅｎＣ免疫原がＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７である、項目１０に記載の方法。
（項目１２） ＭｅｎＣ免疫原の凍結乾燥のための方法であって、以下：
ＭｅｎＣ免疫原を溶解緩衝液に溶解して混合物を形成する工程であって、該溶解緩衝液が、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する、工程；
該混合物を、約１０℃〜約２０℃で、約１０００Ｐａ〜約２０００Ｐａの圧力下で負荷する工程；
該混合物を、約１時間〜約４時間、約−７０℃〜約−５０℃の温度で、約１０００Ｐａ〜約２０００Ｐａの圧力下で凍結させる工程；
該混合物を、約１８時間〜約３０時間、約−５０℃〜約−３５℃の温度で、約５Ｐａ〜約１０Ｐａの圧力下で乾燥する工程；および
該混合物を、２時間〜約１２時間、約１０℃〜約２０℃の温度で、約５Ｐａ〜約１０Ｐａの圧力下で乾燥する工程、
を包含する、方法。
（項目１３） 前記ＭｅｎＣ免疫原がＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７である、項目１２に記載の方法。
（項目１４） ＭｅｎＣ免疫原の凍結乾燥のための方法であって、以下：
ＭｅｎＣ免疫原を溶解緩衝液に溶解して混合物を形成する工程であって、該溶解緩衝液が、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する、工程；
該混合物を、約１０℃で、１０００Ｐａの圧力下で負荷する工程；
該混合物を、約２時間、約−５０℃の温度で、１０００Ｐａの圧力下で凍結させる工程；
該混合物を、約２４時間、約−３５℃の温度で、約５Ｐａの圧力下で乾燥する工程；および
該混合物を、約８時間、約２０℃の温度で、約５Ｐａの圧力下で乾燥する工程、
を包含する、方法。
（項目１５） 前記免疫原がＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７である、項目１４に記載の方法。
（項目１６） 凍結乾燥の際にＭｅｎＣワクチンを安定化するための方法であって、以下：
（ａ）該ＭｅｎＣワクチンを溶解緩衝液に溶解して混合物を形成する工程であって、該溶解緩衝液が、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する、工程、ならびに
（ｂ）該混合物を凍結乾燥する工程、
を包含する、方法。
（項目１７） 前記ＭｅｎＣワクチンがＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７である、項目１６に記載の方法。
（項目１８） 項目１６に記載の方法に従って安定化された、ＭｅｎＣワクチンであって、少なくとも１つの非晶質賦形剤および少なくとも１つの非晶質緩衝剤を含有する、ＭｅｎＣワクチン。

図１は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により得られたＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７のクロマトグラムを表す。メインピークは、１９分と２４分の間で見られた。凝集生成物を表すピークは、約１５〜１７分で見られ、そして断片化生成物を表すピークは２４分以上経過時に見られた。 図２Ａ〜Ｃは、マンニトール緩衝液（図２Ａ）、マンニトール−スクロース緩衝液（図２Ｂ）、およびスクロース緩衝液（図２Ｃ）の示差走査熱量分析（ＤＳＣ）図を表す。緩衝液中の２５％のマンニトールをスクロースで置換することにより、再結晶化ピークの減少およびガラス遷移温度の変化が生じた。 図３は、ＭｅｎＣの回収率（％）により決定された凍結乾燥時の凍結温度の効果およびＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７処方物の安定性に対するスクロースの存在の効果を現す。ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７は、スクロースを含まない処方物と比較した場合、５．０％のスクロースの存在下でより大きな安定性を示した。 図４Ａ〜Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定されたＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７の凝集に対する賦形剤−緩衝剤組成の効果を示す。図４Ａは、マンニトールおよび／またはスクロースの量を変化させて含有させた１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液の使用を表す。図４Ｂは、マンニトールおよび／またはスクロースの量を変化させて含有させた５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液の使用を表す。処方物中の非晶質賦形剤（今回の場合ではスクロース）の量を増加させた場合、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７の凝集が減少した。 図５は、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定されたＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７の凝集に対するストレス（３７℃）の効果を表す。非晶質緩衝剤（ヒスチジンまたはイミダゾールのいずれか）中の処方物は、３７℃での長時間のインキュベーション後、非晶質性のない緩衝剤（リン酸ナトリウム緩衝液）中の処方物よりも少ない凝集を実証した。

（発明の詳細な説明）
本発明は、緩衝液組成物、生物学的分子組成物、ならびに凍結乾燥時の生物学的分子の凝集および分解を減少させることによる生物学的分子の調製および安定化のための方法を提供する。この組成物および方法は、結晶化し得る（非晶質性のない）緩衝剤および賦形剤と完全に非晶質かまたは部分的に非晶質な緩衝剤および賦形剤との交換に関する。

本明細書中で用いられる場合、用語「溶解緩衝液」は、あるタンパク質または複数のタンパク質を凍結乾燥のために溶解するための溶液をいう。この「溶解緩衝液」は、少なくとも１つの非晶質賦形剤および少なくとも１つの非晶質緩衝剤を含む。好ましい実施形態において、溶解緩衝液は、ＭｅｎＣ免疫原をさらに含む。さらに好ましい実施形態において、溶解緩衝液は、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７をさらに含む。

本明細書中で用いられる場合、用語「生物学的分子」は、タンパク質、核酸、および糖を含むがこれらに限定されない。生物学的分子は、個々にまたは他の生物学的分子と組み合わせて使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、生物学的分子は免疫原である。さらに好ましい実施形態において、生物学的分子はＭｅｎＣ免疫原である。なおさらに好ましい実施形態において、生物学的分子はＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７である。

本明細書中で用いられる場合、用語「タンパク質」は、ポリペプチド、ペプチド、およびこれらのアナログをいう。「タンパク質」はまた、複数のポリペプチドおよび他の生物学的分子と複合体化しているペプチドも含む。本発明の好ましい実施形態において、タンパク質は免疫原である。

本明細書中で用いられる場合、用語「免疫原」は、細胞に接触した場合に細胞および／または体液の免疫応答を誘発し得る任意の化合物をいい、ワクチンおよび免疫原を含む組成物が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、抗体の応答およびＴ細胞の応答が誘発される。このような免疫原は、予防目的の適用および治療目的の適用、ならびに抗体の生成に関する研究目的の適用において有用であると考えられる。

本明細書中で用いられる場合、用語「核酸」は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。

本明細書中で用いられる場合、用語「糖」は、オリゴ糖および多糖を含む。

本発明中で用いられる場合、用語「非晶質賦形剤」は、凍結乾燥時に非晶質性を維持する賦形剤をいう。特定の条件下では非晶質性を維持するが、他の条件下では結晶化し得る賦形剤が含まれる。賦形剤の非晶質の性質を維持する条件は、本発明に含まれる。非晶質賦形剤は当業者に周知であり、スクロース、ラクトース、および（本明細書中に記載される条件下では）マンニトールを含む糖類が挙げられるがこれらに限定されない。非晶質賦形剤としてはまた、当業者に周知の条件下ではセルロース、特にソルビトールが挙げられ得るが、これらに限定されない。非晶質賦形剤は、個々にかまたは２つ以上の異なる非晶質賦形剤を含む混合物としてかのいずれかで使用され得る。好ましい実施形態において、この非晶質賦形剤はスクロースである。より好ましい実施形態において、溶解緩衝液中のスクロースの終濃度は約１．５％〜約５％である。

本明細書中で用いられる場合、用語「ＭｅｎＣワクチン」は、少なくとも１つのＭｅｎＣ免疫原を含むワクチンをいう。好ましい実施形態において、ＭｅｎＣワクチンはＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７を含む。

本明細書中で用いられる場合、用語「非晶質緩衝剤」は、凍結乾燥時に非晶質性を維持する緩衝剤（例えば、有機緩衝剤）をいう。特定の条件下では非晶質性を維持するが、他の条件下では結晶化し得る緩衝剤が含まれる。緩衝剤の非晶質の性質を維持する条件もまた含まれる。非晶質緩衝剤は、当業者に周知であり、イミダゾール緩衝剤およびヒスチジン緩衝剤、ピペリジン、ならびにジイソプロピルエチルアミンが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、この非晶質緩衝剤は、イミダゾール緩衝剤である。さらに好ましい実施形態において、この非晶質緩衝剤はイミダゾール緩衝剤であり、かつ約１０ｍＭの濃度を有する。

本明細書中で用いられる場合、用語「安定化」は、凝集ならびに分解の阻害、減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、抑制、減少（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）、減少（ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｎｇ）、および低下と同義で用いられる。本発明は、生物学的分子の凝集および／または分解を実質的に阻害する方法を含む。実質的な凝集の阻害または分解は、結晶化し得る緩衝剤および／または賦形剤を用いたコントロールと比較して、約２５％から約１００％の凝集および分解の減少をいう。好ましくは、凝集または分解は、約５０％、より好ましくは約７５％、そしてなおより好ましくは約１００％阻害される。

本明細書中で用いられる場合、用語「凍結乾燥時」とは、生物学的分子の凍結乾燥の期間および凍結乾燥された生物学的分子のその後の保存の期間をいう。

本明細書および添付の特許請求の範囲中で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容がそうではないことをはっきりと示さない限り複数の参照を含む。従って、例えば、「免疫原（ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）」に対する参照は、２つ以上のこのような免疫原の混合物を含む。

本発明に基いて、生物学的分子を凍結乾燥する方法もまた提供される。この方法は、少なくとも１つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液に生物学的分子を溶解し、混合物を形成する工程、次いでこの混合物を凍結乾燥する工程を包含する。本発明の１つの実施形態において、凍結乾燥は、２０℃でサンプルを負荷する工程、約２５ミクロンの真空圧および約２５℃／時間の傾斜率の下でサンプルを約２時間、凍結させて約−５０℃にする工程、および約２４時間、約−３５℃で乾燥する工程を包含する。好ましい実施形態において、この生物学的分子はＭｅｎＣ免疫原である。より好ましい実施形態においてこの生物学的分子は、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７である。本発明の実施を通じて、生物学的分子は、凝集および分解に対して安定化される。

本発明は、凍結乾燥時に凝集が減少されそして分解が最小化された生物学的分子を調製するための組成物および方法に対する長年の必要性を満足させる。溶解緩衝液中の非晶質のない賦形剤および非晶質性のない緩衝剤を、非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤と交換することにより、凍結乾燥時およびその後の保存時の凝集および分解の減少が達成される。

（材料および方法）
別に注意書きがない限り、以下の材料および方法が用いられる。

ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ Ｃ群多糖（ＭｅｎＣ）は、２〜９個が連結したシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）のホモポリマーであり、Ｃ７および／またはＣ８位で部分的にＯ−アセチル化している。ＣＲＭ １９７は、野生型ジフテリア毒素の変異体である（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９２、Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．１０、６９１−８）。アミノ酸５２位に存在するグリシンをグルタミン酸で置換することにより、酵素活性を完全に喪失させられる。複合体を調製するために、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃ群の内包性多糖を加水分解し、そして得られたオリゴ糖（ＯＳ）をＣＲＭ １９７にカップリングした。内包性多糖へのＣＲＭ １９７のカップリングは、オリゴ糖の選択的な末端還元基の活性およびその後の特別なスペーサーを通じたタンパク質のカップリングに基づいた（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９２、１０、６９１−６９８）。この複合体中のＣＲＭ １９７に対するシアル酸の割合は約０．６である。オリゴ糖の長さの平均を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ−Ｑ分析、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ^TMでの溶出）により１４．２と概算した。オリゴ糖のＫ_dは０．３３と０．４１の間であり、そして遊離の糖濃度は約２．５％であった。

ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７バルクロット１（「ＭｅｎＣ Ｂｕｌｋ」）は、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）中の約１．０４５ｍｇ／ｍＬ
ＣＲＭ １９７、および約０．６３６ｍｇ／ｍＬ ＭｅｎＣ抗原（シアル酸含有量で測定した）からなり、４℃で保存される。本明細書で開示されるすべてのＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７溶液を、試験前に０．２２μｍ滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ^TMフィルターを通して濾過した。このバルク溶液は凍結乾燥の前に希釈される。

Ｓｉｅｎａから得た抗原（ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７）を凍結乾燥したＭｅｎＣ複合ワクチンは、以下の組成物を有する：１９．７μｇのＣＲＭ １９７と複合体化した１２μｇ（シアル酸含有量で測定した）のｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ Ｃオリゴ糖抗原（Ｓｉｅｎａ、イタリア）、９ｍｇのマンニトール、および１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）。投与前に、凍結乾燥された抗原を、０．６ｍＬの水酸化アンモニウムアジュバンドに溶解する。この溶液の０．５ｍＬを注入する。

ＤＳＣ（示差走査熱量分析：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）：Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄのオペレーティングシステムを備えたＳＩＩ Ｓｅｉｋｏ機器を用いて、付加的な結晶性を分析することによりＤＳＣを算出した。賦形剤溶液のサンプル溶液を、１０℃／分の傾斜率で凍結し、約−５０℃の温度にした。媒介ガスとして乾燥窒素を用い、種々の傾斜率（０．６２５℃／分〜１０℃／分）でサンプルを暖める間の温度変化をモニターした。温度変化に対する賦形剤組成物の効果を評価した。

ＭｅｎＣ Ｂｕｌｋの透析法を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（登録商標）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌａｇｕｎａ Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）を使用して、リン酸ナトリウム緩衝液を本明細書中で試験した種々の緩衝液で置換するために１０，０００ＭＷのカットオフで実施した。透析後に、ＭｅｎＣ Ｂｕｌｋ溶液を、種々の容積の緩衝液および適切な量の賦形剤で希釈することによって、１．０４５ｍｇ／ｍＬの所望のタンパク質濃度を得た。リン酸ナトリウム、ヒスチジンヒドロクロリド、およびイミダゾールヒドロクロリド緩衝液（全てのｐＨは、７．２）を、処方において使用した。緩衝液の濃度を、５〜１０ｍＭへと変えた。使用した賦形剤は、マンニトール、マンニトール−スクロース混合物、またはスクロースであった。賦形剤の濃度は、１．５％、３％、または５％であった。いくつかの処方物（Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標））もまた、添加した。調製後、全ての処方されたＭｅｎＣ Ｂｕｌｋ溶液を、０．２２μｍの滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過し、そして４℃で保存した。

凍結乾燥：最終生成物を、ＭｅｎＣ Ｂｕｌｋの凍結乾燥によって調製した。フリーズドライサイクルは、異なる段階を誘導し、そしてマンニトール（Ａ^*）、マンニトール−スクロース（Ｂ）、およびスクロース（Ｃ）処方物とで異なった（表１を参照のこと）。

ＨＰＳＥＣ（高速サイズ排除クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））分析：ＴＳＫ ＧＥＬ^R Ｇ４０００ＳＷ_XLカラム（３０ｃｍ×７．８ｍｍ内径）（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）、液体移動相中でのＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））分離のための小粒子親水性ゲルのカラムを、凍結乾燥および可溶化の後に、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７ワクチンの分析のために使用した。製造業者によって提供された指針書に従って、理論段数は、１６，０００より大きく、そして非対称性因子は、０．７〜１．６であった。

ＨＰＳＥＣ分析は、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７（Ｓｉｅｎａ）およびＭｅｎＣ Ｂｕｌｋそれぞれに対して、１８．３分および２２．８分の反応時間を示した。蛍光検出器で測定されるように、ＭｅｎＣの回収率は、約９５％（１０μＬの注射容積に対して５回の測定から計算された値）であった。注射容積の増加は、主なピークの領域での比例的な増加に導いた。注射の再現性は、１％未満の標準誤差（標準偏差×１００／平均ピーク領域）で高かった。異なるバイアルからの１０回の注射（各２０μＬ）の精度もまた、高かった（平均値＝１９．８３μＬ、標準偏差＝０．０８５μＬ）。最小注入容積（標準偏差＝０．１μＬ〜２０μＬ）は、０．３５μＬであると見出された。

ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７の代表的なクロマトグラム（凍結乾燥）は、図１に示され、そして１９〜２４分（メインピーク）に、幅広い非対称的なピークを示す。サンプルに圧力を加えた後に、２つのさらなるピークが出現した：一方は、１５〜１７分の保持時間を有する高分子量の生成物（凝集生成物）に関し、そして他方は、保持時間が２４分を越える低分子量の生成物（断片生成物）であった。

カラムクロマトグラフィーに関して、流速が、０．５ｍＬ／分であり、圧力が３５０〜４００ｐｓｉ．であり、移動相が、室温で、２００ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（ＨＰＬＣ等級、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）であった。サンプルの放出は、ＵＶ検出器（２１４ｎｍ）および蛍光検出器（２８０ｎｍ Ｅｘ．および３４０ｎｍ Ｅｍ．）で検出された。γ−グロブリン、オボアルブミン、ミオグロビン、およびビタミンＢ−１２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むゲル濾過標準が、標準として使用された。分析は、２個のポンプＷａｔｅｒｓ ５１０ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒおよびＭｏｄｌ５１０ポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ４８６ Ｔｕｎｅａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ ７１２ ＷＩＳＰ注入システム、およびＸｅポンプを備えたＨｉｔａｃｈｉ Ｆ１ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌ−７４８０からなるシステム）を使用して実施された。

以下の実施例は、本発明を例示することを意味し、そして任意の方法で、本発明を限定するように構築されない。当業者は、本発明の意図および範囲内である改変を認識する。

（実施例）
（実施例１：ｐＨ指示薬を用いた凍結実験）
１８個の異なる処方物を、凍結の間に、ｐＨの変化における、溶液組成の影響を研究するために調製した。表２は、リン酸緩衝液の濃度、賦形剤の濃度、およびこれらの処方物中でのマンニトール−スクロースの割合の変動を示す。全処方物の開始のｐＨ値は、ｐＨ７．２であった。凍結実験を、凍結乾燥チャンバ中で実施し、そして数回の工程を含んだ。サンプルを、凍結乾燥チャンバ中に充填し、そして０．２時間２０℃で保持した。次いで、サンプルを、６０℃／分のランプ速度（ｒａｍｐ ｒａｔｅ）で−５０℃まで冷却し、次いで、−５０℃で０．５時間保持した。次に、サンプルを６０℃／分のランプ速度で−２０℃まで昇温させ、そして−２０℃で０．５時間保持した。サンプルを、６０℃／分のランプ速度で−５０℃まで冷却し、次いで６０℃／分のランプ速度で−２０℃まで昇温させた。

凍結乾燥後に、種々の時間点および温度でｐＨ測定した。この賦形剤を、汎用ｐＨ指示薬（この指示薬は、ｐＨの変化で色が変わる）を用いて実施した。各色は、適切なｐＨと関連した。２０℃で０時間（点１）、−２０℃で３時間後（点２）、−５０℃で４時間後（点３）、および−２０℃で５時間後（点４）に、ｐＨ測定を行った。サンプルを、−２０℃で一晩保持し、そして−２０℃で３４．５時間後（点５）に次の測定を行った。種々の処方物を含む１４４個のバイアル（各処方物に対して８個のバイアル；１８種の処方物）の統計的な研究を、−２０℃で３４．５時間後に実施した。

２０℃（２）〜−２０℃（４）の温度での乾燥の間に、リン酸緩衝液が、ｐＨを変化させることは、既知である。マンニトールまたはマンニトール−スクロース混合物のいずれかを含む処方物は、ｐＨの変化をほとんど示さなかった（表２を参照のこと）。−５０℃で、ｐＨは、約５と５．５との間であり、そして−２０℃で、ｐＨは、約６と６．５との間であった。種々の処方物のｐＨの有意な変化は、開始５時間の間に観測されなかった。しかし、特定の色の変化（いわゆる、黄色および橙色固体の界面での橙色および赤色スポットの出現）は、３４．５時間後に生じた。この観測は、リン酸塩の結晶化が緩慢なプロセスおよびランダムなプロセスであることを実証した。さらに、２種の塩（リン酸一ナトリウムおよびリン酸二ナトリウム）は、異なる結晶点（それぞれ、−９．７℃および−０．５℃）を有した。

凍結乾燥の間のｐＨ変化の統計学的研究によると、この観測が３つの群に分けられ得ることを示した。

群１ ｐＨ６．０
黄色 ｐＨ６．０およびｐＨ５．５のスポット
群２ ｐＨ５．５
橙色 ｐＨ５．５およびｐＨ５．０の５個以上のスポット
群３ ｐＨ５．５
赤色 ｐＨ５．０〜５．５およびｐＨ５．０の５個以上のスポット。各群に属する、サンプルの割合は、以下の式：％＝ｎ×１００／Ｎを使用して計算される（ｎは、各群のサンプルの数であり、そしてＮは、分析したサンプルの総数であった（この場合Ｎ＝８）（表２を参照のこと））。

表２に示される統計学的分析は、広い範囲で、マンニトールを含む処方物は、群２および３に属する一方で、高いスクロース含有量を有する処方物は、群１に属することを示す。従って、マンニトールの一部をスクロースに置換することで、わずかにｐＨが変化する。処方物中により多くスクロースが存在すると、より小さなｐＨ変化が得られる。ほとんどの顕著な結果が、１０ｍＭのリン酸緩衝液中の１．５％の賦形剤（８０％、９０％または１００％のマンニトールのいずれかを含む）、および５ｍＭのリン酸緩衝液中のスクロースを含む５％の賦形剤（８０％または９０％のマンニトールのいずれかを含む）のいずれかから得られる（これらの各々は、黄色の群に入るサンプルの１００％に導く）。

マンニトールおよびスクロースのような不活性な有機化合物の添加は、リン酸緩衝液のｐＨの変化を減少させる。これらの添加物の効果は、結晶の成長およびリン酸塩の沈殿を阻害する処方物の増加した粘度に関連する。この溶液の粘弾特性は、結晶化の温度（５）に影響を与えるので、この特性は、冷却の際に、塩の結晶化を妨げ、氷晶網目構造内に分散された過冷却された液体を提供する。

（実施例２：再結晶における、緩衝液選択の効果）
水中のマンニトールは、マンニトールの結晶化に起因して、約−２５℃で発熱ピークを示すことが示されている（Ｇａｔｈｌｉｎら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｄｒｕｇ．Ａｓｓｏｃ．，１９８０，３４４：３９８−４０８）。リン酸ナトリウム緩衝液の存在下で、この発熱ピーク温度は、水溶液中においてのものと異なる（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，１９９１，４５：９４−１００；Ｓｅｇｕｒｏら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，２７：７０−７９）。観測された熱挙動差（ｔｈｅｒｍａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）は、結晶化度の変化に関連し得る（Ｉｚｕｔｓｕら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９３，１０，Ｎｏ．８，１２３２−１２３７）。

図２Ａ−Ｃ中のＤＳＣ図は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の３％マンニトール溶液（ｐＨ７．２）が−２３．５℃（ΔＨ＝−７７３５．２ｍＪ／ｍｇ）で発熱性再結晶、ならびに−３２℃（ΔＣｐ＝３５１ｍＪ／ｄｅｓ。ｍｇ）および−３０．１℃（ΔＣｐ＝４４２ｍＪ／ｄｅｇ．ｍｇ）で発熱性ガラス転移を生じる。２５％のマンニトールをスクロースで置換することによって、再結晶化ピーク（ΔＨ＝−２５７２ｍＪ／ｍｇ）の減少、ならびに−４１．４℃（ΔＣｐ＝６．７ｍＪ／ｄｅｇ．ｍｇ）および−３１．０℃（ΔＣｐ＝９３ｍＪ／ｄｅｃ．ｍｇ）へのガラス転移温度のシフトを生じる。リン酸ナトリウム緩衝液中でのスクロース溶液の熱分析（図２Ｃ）により、−２９．２℃（ΔＣｐ＝２８９．８ｍＪ／ｄｅｇ．ｍｇ）でガラス転移のみを示した。従って、スクロースを結晶化マンニトール溶液に添加することで、冷却の間に非結晶マンニトールの形成を生じ、そして結晶化を予防する。

（実施例３：スクロースでのＭｅｎＣ Ｂｕｌｋの安定化）
ＭｅｎＣ Ｂｕｌｋのスクロースでの安定化を、凍結実験において示した（図３）。ＭｅｎＣ Ｂｕｌｋの１４の処方物を、種々の組成の非晶質賦形剤および種々の濃度のリン酸緩衝液で、上記のように調製した（図３）。これらの処方物を、方法Ｂに従って凍結乾燥した（表１を参照のこと）。この凍結乾燥は、Ｓｉｅｎａ，Ｉｔａｌｙ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、１９８８、２５：２４４−２５５）によって以前に開発されたように、アニーリングを伴う凍結を包含した。サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される、凍結乾燥の間の凝集の抑制を使用して、安定化を測定した。図４に示すように、凝集の抑制は、スクロースの含有量に直接関係することが見出された。

（実施例４：非晶質緩衝剤でのリン酸ナトリウム緩衝剤の置換が、ＭｅｎＣ Ｂｕｌｋ処方物の安定性を増加させる）
ヒスチジン−ヒスチジン塩酸塩およびイミダゾール−イミダゾール塩酸塩の溶液（両方ｐＨ７．２）を、緩衝液として使用した。マンニトールを含まない純粋なスクロースを使用して、タンパク質を安定化した。種々の処方物を、ＭｅｎＣ
Ｂｕｌｋを安定化する試みにおいて試験した。これらの処方物を、方法Ｃに従って凍結乾燥した（表１を参照のこと）。

この凍結乾燥サイクルは、アニーリングなしでの１回の凍結、および−３５℃（スクロースのガラス転移温度より低温）での一次乾燥を包含した。凍結乾燥の間の賦形剤の非晶質の状態に起因して、凍結サイクルの時間の合計は、減圧が増加するにつれて増加した。表３に示す結果は、凍結乾燥の間の凝集が完全に防止されたことを実証する。コントロール実験（すなわち、非晶質ではない緩衝剤および／または賦形剤）において、凝集は、試験溶液に対して観察された凝集より高かった。例えば、凝集は、スクロースを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で３．３％であり、そしてマンニトールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で９．５％であった。凝集は、１．５％スクロースを含む１０ｍＭイミダゾール緩衝液中で０％であり、そして１．５％スクロースを含む１０ｍＭヒスチジン緩衝液中で０．７８％であった。

（実施例５：安定性研究）
ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７固体サンプルを、インキュベーターで３ヶ月間にわたって、４℃、２５℃、または３７℃での凍結乾燥後に、ストレスを加えた。選択した時点において、サンプルをインキュベーターから取り出し、０．６ｍＬの蒸留水で再構成し、そしてＨＰＳＥＣによって分析した。全ての処方物は、４℃において安定であった。すなわち、貯蔵の際に凝集の増加を示さなかった。

ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７のサンプル（Ｓｉｅｎｎａ）は、イミダゾールまたはヒスチジンの緩衝剤のいずれかを含有する処方物が示したより高い凝集を、ストレス試験の間に示した（図５）。ＭｅｎＣ−ＣＲＭ １９７処方物におけるヒスチジンまたはイミダゾールの緩衝剤の使用は、ワクチンの安定性を増加させた。本発明は、この機構に束縛されることを望まないが、安定化は、ＣＲＭ １９７のトリプトファンの、構造的に類似のイミダゾール環との相互作用に起因し得ると考えられる。

本明細書中において引用した全ての参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。

Ａ^* Ｂｉｏｃｉｎｅによって以前に開発された
凍結ランプ −６０℃／ｈ、乾燥ランプ −２５℃／ｈ
特別の工程は、予備通気（Ｎ₂／空気、圧力０．８５ｂａｒ）、封止、通気（Ｎ₂／空気）、および４℃での貯蔵である。

Ａ＝マンニトールに対する凍結乾燥サイクル
Ｂ＝マンニトール−スクロースに対する凍結乾燥サイクル
Ｃ＝スクロースに対する凍結乾燥サイクル。

^* 固体サンプルの表面上のスポットに対するｐＨ値

Claims (1)

1. 明細書中に記載の発明。

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