JP2011125302A - 油脂分解菌及び油脂分解剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、Acinetobacter属に属し、以下の菌学的性質を示す、油脂分解菌を提供する。
細胞形態 球菌
細胞の直径 0.8〜0.9μm
胞子の有無 −
グラム染色性 −
運動性 −
41℃での生育 +
カタラーゼ +
オキシダーゼ −
グルコースからの酸/ガス産生 −/−
グルコースの酸化/発酵 +/−
なお、「+」は陽性であること、「−」は陰性であることを示す。
【選択図】 なし
Description
細胞形態 球菌
細胞の直径 0.8〜0.9μm
胞子の有無 −
グラム染色性 −
運動性 −
41℃での生育 +
カタラーゼ +
オキシダーゼ −
グルコースからの酸/ガス産生 −/−
グルコースの酸化/発酵 +/−
なお、「+」は陽性であること、「−」は陰性であることを示す。
硝酸塩還元活性 −
インドール産生活性 −
ブドウ糖酸性化活性 −
アルギニンジヒドロラーゼ活性 −
ウレアーゼ活性 −
エスクリン加水分解活性 −
ゼラチン加水分解活性 +
β−ガラクトシダーゼ活性 −
チトクロームオキシダーゼ活性 −
クエン酸の利用性 +
ブドウ糖資化性 −
L−アラビノース資化性 −
D−マンノース資化性 −
D−マンニトール資化性 −
N−アセチル−D−グルコサミン資化性 −
マルトース資化性 −
グルコン酸カリウム資化性 −
n−カプリン酸資化性 +
アジピン酸資化性 +
dl−リンゴ酸資化性 +
クエン酸ナトリウム資化性 +
酢酸フェニル資化性 +
DL−乳酸ナトリウム資化性 +
L−アスパラギン酸ナトリウム資化性 −
エタノール資化性 −
なお、「+」は陽性であること、「−」は陰性であることを示す。
これにより、本発明の油脂分解菌が高い油脂分解能を示す条件となるばかりでなく、BOD分解菌の増殖を抑えることができるため、汚泥発生量を少なくでき、かつ油脂分解効率を更に上昇させることができる。
神奈川県、福島県、愛媛県で採取した土壌を試料とし、滅菌した生理食塩水に懸濁した後、超音波洗浄器にて5分間超音波処理を行った。処理後5分間ほど静置し、上澄み液を3000ppmとなるよう混合油脂(サラダ油/ラード/牛脂、質量比1:1:1)を添加したアルカリ人工下水培地1(表1)又はアルカリ人工下水培地2(表2)各5mlが入った18φ×180mm試験管に1%(v/v)となるように接種した。
サンプルNo.192及びNo.219から純粋分離した菌株の油脂分解性について、再現性の確認を行った。n−ヘキサン抽出では抽出時に中間層及びエマルション形成により、残存している油脂の抽出精度が低いと考えられたため、クロロホルム/メタノール(3:1)40mlで抽出し、遠心分離(5,000rpm、30min)した後、静かに分液ロートに移し、クロロホルム(下)層を新しい遠心管に入れ、再び遠心分離(10,000rpm、10min)した。遠心分離後、静かに分液ロートに移し、クロロホルム(下)層をフラスコに取り、無水硫酸マグネシウムにて脱水後、ろ過、エバポレートすることにより残存油分の測定を行った。その結果、両菌株は再現性良く、高い油脂分解性を示すことがわかった(表3)。
油脂分解過程を把握するために、上記抽出した残存油分のTLC分析を行った。その結果を図1に示す。No.192株(左パネル)は、左レーンから順に、オレイン酸(OA)、オリーブ油(トリオレイン;O)、混合油脂(サラダ油/ラード/牛脂、質量比1:1:1;S)、抽出後の水層(W)、抽出した残存油分が含まれるクロロホルム層(C)をロードした。同様に、No.219株(右パネル)は、左レーンから順に、オレイン酸(OA)、オリーブ油(トリオレイン;O)、混合油脂(サラダ油/ラード/牛脂、質量比1:1:1;S)、抽出した残存油分が含まれるクロロホルム層(C)、抽出後の水層(W)をロードした。No.192株及びNo.219株のいずれも水層(W)からは油脂が検出されず、残存油脂は完全にクロロホルム層(C)へ抽出されたことがわかった。No.219株に比べ、No.192株の方がジグリセリド(DG)、モノグリセリド(MG)、脂肪酸(FA)存在量が多いことがわかった。これは、No.192株の油脂分解過程ではリパーゼによるトリグリセリド(TG)の分解と脂肪酸の代謝(β酸化)が律速となっていることを示唆するものである。一方、No.219株では抽出油分中にDG、MGがほとんど観察されず、FA存在量も少ないことから、グリセリドの分解が迅速であると推察される。
16S rDNAの塩基配列解析により、No.192株の同定を行った。No.192株からのDNA抽出を、InstaGene Matrix(BioRad社製、CA、USA)を用いて行った。全長16S rDNAをPCR反応により増幅した。PCR反応には、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用いた。得られたPCR産物を鋳型とし、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステム社製、CA、USA)を用いてサイクルシークエンスを実施した。ABI PRISM 3130x1 Genetic Analyzer System(アプライドバイオシステム社製、CA、USA)によりシークエンスを解析し、ChromasPro1.4(Technelysium Pty Ltd.,Tewantin,AUS)ソフトウェアを用いて塩基配列を決定した。決定したNo.192株の16S rDNA塩基配列を、アポロン2.0(テクノスルガ・ラボ社製)ソフトウェア及びアポロンDB−BA ver4.0(テクノスルガ・ラボ社製)データベースによる相同性検索及び簡易分子系統解析に供した。その結果、No.192株の16S rDNA塩基配列はアポロンDB−BA ver4.0データベース中のグラム陰性細菌Acinetobactor baumannii DSM30007株、Acinetobactor junii DSM6964株の16S rDNA塩基配列とそれぞれ97.7%の相同率を示した(表4)。また、国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)に対しても相同性検索を実施した結果、No.192株の16S rDNA塩基配列は、グラム陰性細菌Acinetobactor calcoaceticusの16S rDNA塩基配列と98.1%の相同率を示した。
No.192株について、光学顕微鏡(BX50F4、オリンパス社製)による形態観察、Barrowらの方法(Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. 1993年,Cambridge University Press.)に基づいて、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、グラム染色性、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵(O/F)等の試験を実施した。グラム染色性解析にはフェイバーG「ニッスイ」(日水製薬社製)を用いた。結果を表6に示す。また、図2にNo.192株のコロニー形態の写真を示した。
Acinetobactor sp.SS−192株の油脂分解率に対する培養液pHの影響を解析した。培地は、pH調整剤(1M Tris−HCl、pH9)以外はアルカリ人工下水培地2と同じ組成のものを用いた。この培地をベースとし、pH6〜8の培地はpH調整剤として塩酸又は水酸化ナトリウムを用い、pH9の培地はpH調整剤として1M Tris−HCl(pH9)を用い、pH10の培地はpH調整剤として1Mグリシン/水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)を用いて、それぞれpHを調整した。これらの培地に3000ppmとなるように混合油脂(サラダ油/ラード/牛脂、質量比1:1:1)を添加したものを500mlバッフルフラスコに100ml入れ、24時間予備培養した試験管培養液を1%(v/v)となるように接種し、120rpm、37℃で24時間震盪培養した。培養後、オートクレーブ(121℃、20分)処理し、クロロホルム/メタノール(3:1)40mlで抽出し、遠心分離(5,000rpm、30min)した後、静かに分液ロートに移し、クロロホルム(下)層を新しい遠心管に入れ、再び遠心分離(10,000rpm、10min)した。遠心分離後、静かに分液ロートに移し、クロロホルム(下)層をフラスコに取り、無水硫酸マグネシウムにて脱水後、ろ過、エバポレートすることにより残存油分を定量した。菌を接種しないコントロールとの差から油脂分解率を算出した。
Acinetobactor sp.SS−192株の油脂分解率に対する培養温度の影響を解析した。500mlバッフルフラスコに、3000ppmとなるように混合油脂(サラダ油/ラード/牛脂、質量比1:1:1)を添加したアルカリ人工下水培地2を100ml入れ、24時間予備培養した試験管培養液を1%(v/v)となるように接種した。培養温度を10、15、20、25、30、33.5、35、37、40℃にそれぞれ設定し、120rpmで24時間震盪培養した。その後、上記と同様にして残存油分を定量し、油脂分解率を算出した。
抗生物質含有プレートを用いて、抗生物質感受性試験を行った。その結果、Acinetobactor sp.SS−192株はアンピシリン感受性であることがわかった。
Claims (6)
- Acinetobacter属に属し、以下の菌学的性質を示す、油脂分解菌。
細胞形態 球菌
細胞の直径 0.8〜0.9μm
胞子の有無 −
グラム染色性 −
運動性 −
41℃での生育 +
カタラーゼ +
オキシダーゼ −
グルコースからの酸/ガス産生 −/−
グルコースの酸化/発酵 +/−
なお、「+」は陽性であること、「−」は陰性であることを示す。 - 以下の菌学的性質を更に示す、請求項1に記載の油脂分解菌。
硝酸塩還元活性 −
インドール産生活性 −
ブドウ糖酸性化活性 −
アルギニンジヒドロラーゼ活性 −
ウレアーゼ活性 −
エスクリン加水分解活性 −
ゼラチン加水分解活性 +
β−ガラクトシダーゼ活性 −
チトクロームオキシダーゼ活性 −
クエン酸の利用性 +
ブドウ糖資化性 −
L−アラビノース資化性 −
D−マンノース資化性 −
D−マンニトール資化性 −
N−アセチル−D−グルコサミン資化性 −
マルトース資化性 −
グルコン酸カリウム資化性 −
n−カプリン酸資化性 +
アジピン酸資化性 +
dl−リンゴ酸資化性 +
クエン酸ナトリウム資化性 +
酢酸フェニル資化性 +
DL−乳酸ナトリウム資化性 +
L−アスパラギン酸ナトリウム資化性 −
エタノール資化性 −
なお、「+」は陽性であること、「−」は陰性であることを示す。 - 寒天培地上において、30℃、24時間培養で直径1mmの周縁全縁の円形、表面がスムーズ、レンズ状で、不透明な淡黄色コロニーを形成する、請求項1又は2に記載の油脂分解菌。
- 配列番号1で特定される塩基配列に対して98%以上の相同率を示す16S rDNA塩基配列を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の油脂分解菌。
- 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 受託番号NITE P−846(Acinetobacter sp.SS−192)で特定される油脂分解菌。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の油脂分解菌を含む油脂分解剤。
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JPN6013037455; J.Gen.Appl.Microbiol. Vol.40, 1994, p.103-113 * |
JPN6013037457; Biosci.Biotechnol.Biochem. Vol.66, No.7, 2002, p.1579-1582 * |
JPN6013037458; 生物工学 第80巻, 2002, p.559-562 * |
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