JP2011092121A - 増殖可能な動物細胞の調製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1) 少なくとも一部が電極である基板上で動物細胞を培養する工程、及び(2)電極に高周波変動電位を印加して、培養により前記基板表面に付着した細胞を剥離する工程、を含む増殖可能な動物細胞の調製方法。前記高周波変動電位は、周波数が1KHz〜10MHzの範囲であり、かつ±1.0V(vs Ag/AgCl) またはそれより小さい電位の幅とする。剥離時の培養液はカルシウム及びマグネシウムを含まない培養液とする。
【選択図】図1
Description
[1]
(1)少なくとも一部が電極である基板表面上で動物細胞を培養する工程、及び
(2)前記電極に高周波変動電位を印加して、培養により前記基板表面に付着した細胞を剥離する工程、を含む増殖可能な動物細胞の調製方法であって、
前記高周波変動電位は、周波数が1KHz〜10MHzの範囲であり、かつ±1.0V(vs Ag/AgCl)またはそれより小さい電位の幅とすること、及び
剥離時の培養液はカルシウム及びマグネシウムを含まない培養液とすることを特徴とする、前記調製方法。
[2]
前記剥離時の培養液はリン酸緩衝液(Ca2+、Mg2+不含)とする、[1]に記載の調製方法。
[3]
前記高周波変動電位は、矩形波、正弦波、または三角波である、[1]または[2]に記載の調製方法。
[4]
前記基板表面は、全面が電極である[1]〜[3]のいずれかに記載の調製方法。
[5]
前記基板表面は、一部が電極であり、工程(2)において電極表面上及び電極近傍の非電極表面上の細胞を剥離する[1]〜[3]のいずれかに記載の調製方法。
[6]
剥離した増殖可能な動物細胞を、さらに継代して増殖可能な動物細胞を維持する工程を含む、[1]〜[5]のいずれかに記載の調製方法。
[7]
培養して細胞をシート状にし、シート状の細胞を増殖可能な状態で剥離して、増殖可能な動物細胞シートを得る、[1]〜[6]のいずれかに記載の調製方法。
[8]
動物細胞が皮膚細胞である、[1]〜[7]のいずれかに記載の調製方法。
本発明の方法は、以下の工程(1)及び(2)を含む。
工程(1)は、少なくとも一部が電極である基板表面上で動物細胞を培養する工程である。動物細胞を培養する少なくとも一部が電極である基板としては特に制限はない。前記基板表面は、全面が電極であっても、一部が電極であり、一部は、非電極(基板)であってもよい。さらに、少なくとも一部が電極である基板は、例えば、電極以外の基板に電極層を設けたものであっても、カーボン電極等のように全体が電極であるものであってもよい。電極以外の基板に電極層を設けたものの場合、基板は、絶縁性の基板の表面の一部または全部に電極を有するものであることができる。そのような電極を有する基板は、例えば、スライドガラスに酸化インジウム(ITO)をコーティングしたものであることができる。但し、絶縁性の基板は、スライドガラスに限定される意図ではなく、非導電性の固体であれば特に制限はなく、非導電性の有機材料や無機材料からなるものであることができる。非導電性の有機材料や無機材料としては、ガラス以外に、例えば、プラスチックやセラミックス等を挙げることもできる。電極は、酸化インジウム(ITO) に限定される意図ではなく、公知の電極材料からなるものを適宜利用できる。
工程(2)は、培養して細胞が付着した少なくとも一部が電極である基板の電極に高周波変動電位を印加して細胞を剥離する工程である。電極に付着した細胞及び電極近傍の非電極表面上の細胞は、高周波変動電位を印加することで剥離する。高周波変動電位は、具体的には、周波数は1KHz〜10MHz の範囲、好ましくは1〜5MHzの範囲とすることができ、 電位は、例えば、±1.0V(vs Ag/AgCl)またはそれより小さい電位の幅とすることができ、例えば、±0.9V(vs Ag/AgCl)、±0.8V(vs Ag/AgCl)などにすることもできる。高周波変動電位の波形は、例えば、矩形波、正弦波、三角波等であることができる。
(1)電極作製
以下の手順に従って、電極及び3電極培養系を作製した。図2に電極作製の手順の説明図を示す。
2)このスライドグラスの端の部分をダイヤモンドドリルで穴をあけ、導電性樹脂(Dotite, D-550, 藤倉化成(株))で導線とITO電極をつなげた。
3)ラブテックチェンバースライド(Lab-tek chamber slike, 177410, NalgeNunc)のチェンバー部分を取り外し、水槽修復用のシリコンボンド(東芝シリコーン, TSE382-C クリア)でITOパターン電極上に接着した。
4)ラブテックチェンバースライドのフタ部分を2か所、ダイヤモンドドリルで穴をあけ、白金電極と銀/塩化銀電極を接続した。
5)フタとチェンバーを組み合わせて、3電極培養系(右上写真)を完成させた。
参考例1で作製した3電極培養系を用いて、以下の手順で動物細胞の電気的継代法を実施した。
2)細胞が電極基板上に付着したことを確認し、ITOパターン電極チェンバー内をPBS(-)に置き換えた。
3)ファンクションジェネレーター(AD8624A, A&D company, Tokyo, Japan)を接続したポテンシオスタット(PS-14, Toho technical research)で、3MHz, ±1.0V(vs. Ag/AgCl)の矩形波変動電位を、3電極培養系にしたITOパターン電極に印加した。
4)電極から剥離した細胞を回収し、新しいカルチャーボトルに移した後、細胞付着率および細胞増殖の有無を、位相差顕微鏡(CKX-41, Olympus)で観察した。
電圧印加条件を3MHz, -0.4 〜 +0.4V(vs. Ag/ AgCl)に替えた以外は、実施例1と同様の条件で、電極からの細胞剥離を試みた。結果を図5に、電圧印加時間0分、60分の画像を示す。この電圧印加条件では、60分の印加でも細胞はほとんど剥離しなかった。
培地中のヒト皮膚繊維芽細胞に±1.0V、3MHzの電位印加を48hr加えても、図6に示すように、培地中のカルシウムやマグネシウムによる影響で細胞は、剥がれない。
参考例1で作製した3電極培養系を用いて、以下の手順で動物細胞への定電位印加による剥離を実施した。
2)細胞が電極基板上に付着したことを確認し、ITOパターン電極チェンバー内をPBS(-)に置き換えた。
3)ポテンシオスタット(PS-14, Toho technical research)で、-1.0V(vs. Ag/AgCl)の定電位を、3電極培養系にしたITOパターン電極に印加した。
4)位相差顕微鏡(CKX-41, Olympus)で観察した。
5)0.4%トリパンブルー in PBS(-)溶液で(ICN Biomedicals, Aurora, Ohio, USA)、電位印加60分後における動物細胞の生死を判別した。
図1の(C)に相当する電極基板を用いた以外は、実施例1と同様にして細胞の培養及び剥離を行った。図9に電圧印加時間0分、30分、60分の画像を示す。3MHz, -1.0 〜 +1.0V(vs. Ag/ AgCl)の電圧印加条件では、30分以上の印加で細胞を剥離することに成功した。その際、電流は検出されなかった(電気化学反応なし)。電気剥離後、細胞をカルチャ―ボトルに継代すると、24時間後まで細胞が正常に付着し、増殖することを確認した。
ITO電極に定電位または高周波変動電位を印加したときのITO電極の表面の水に対する接触角を測定した。測定は、シクロオクタンを満たした電解槽中のITO電極の表面に水滴を載せ、定電位(-0.4Vまたは+0.4V(vs. Ag/AgCl))印加(24時間)前後の接触角または高周波変動電位(±1.0V、3MHz、矩形波変動電位)を30分若しくは60分印加前後の接触角を測定することで行った。結果を図10に示す。-0.4V及び+0.4Vの定電位(vs. Ag/AgCl)は24時間の印加により、水に対する接触角が約20〜30%低下したのに対して、高周波変動電位の印加は30分または60分の印加で約20〜40%低下し、電極の親水性がより短時間に増加することが分かる。この結果から、本発明における動物細胞の高周波変動電位印加による剥離は、電極表面の親水性の増加が一因であると推察される。
Claims (8)
- (1)少なくとも一部が電極である基板表面上で動物細胞を培養する工程、及び
(2)前記電極に高周波変動電位を印加して、培養により前記基板表面に付着した細胞を剥離する工程、を含む増殖可能な動物細胞の調製方法であって、
前記高周波変動電位は、周波数が1KHz〜10MHzの範囲であり、かつ±1.0V(vs Ag/AgCl)またはそれより小さい電位の幅とすること、及び
剥離時の培養液はカルシウム及びマグネシウムを含まない培養液とすることを特徴とする、前記調製方法。 - 前記剥離時の培養液はリン酸緩衝液(Ca2+、Mg2+不含)とする、請求項1に記載の調製方法。
- 前記高周波変動電位は、矩形波、正弦波、または三角波である、請求項1または2に記載の調製方法。
- 前記基板表面は、全面が電極である請求項1〜3のいずれかに記載の調製方法。
- 前記基板表面は、一部が電極であり、工程(2)において電極表面上及び電極近傍の非電極表面上の細胞を剥離する請求項1〜3のいずれかに記載の調製方法。
- 剥離した増殖可能な動物細胞を、さらに継代して増殖可能な動物細胞を維持する工程を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の調製方法。
- 培養して細胞をシート状にし、シート状の細胞を増殖可能な状態で剥離して、増殖可能な動物細胞シートを得る、請求項1〜6のいずれかに記載の調製方法。
- 動物細胞が皮膚細胞である、請求項1〜7のいずれかに記載の調製方法。
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