JP2011050259A - コロニーピッキング方法、コロニーピッキング装置、及び融合細胞クローン作製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明に係るコロニーピッキング方法は、細胞融合され、選択培地で選択培養された後に行う1次スクリーニングの結果が陽性であったウェル内に含まれる融合細胞のコロニーから融合細胞のクローンを得るために行われるコロニーピッキング方法であって、前記ウェル内に含まれる融合細胞のコロニーの中から1つのコロニーを選択して当該コロニーに含まれる融合細胞をピッキングするピッキング工程S10と、前記ピッキングした融合細胞を個別の培地にまき込むまき込み工程S20とを含むことを特徴とする。
【選択図】図1
Description
例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ(雑種細胞;hybridoma)のクローンを作製する場合を例にとって説明すると、
(A)目的とする抗原を接種して免疫された動物の脾臓細胞に含まれるB細胞と、ミエローマ細胞株などの腫瘍細胞とを、ポリエチレングリコールなどの細胞融合誘起物質を用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを複数作製する工程、
(B)複数作製した前記ハイブリドーマを96ウェル(穴)プレート(例えば、100〜200μL/ウェル)の各ウェルに入れられたHAT(ヒポキサンチン、アミノプリテン及びチミジン)を含む培地などの選択培地で選択培養して、各ハイブリドーマに由来するコロニーを複数有するコロニー群を1つ以上得る工程、
(C)1つ以上得られたコロニー群の中から、目的とする抗原と結合する抗体を産生するハイブリドーマのコロニーを有するコロニー群を、FACS法(fluorescence activated cell sorting)などのフローサイトメトリー法やELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay)などによってスクリーニング(一般的に1次スクリーニング(1st screening)と呼ばれている)する工程、
(D)1次スクリーニングで得られた陽性ウェルに含まれるハイブリドーマのコロニー群を24ウェルプレートにスケールアップ(例えば、1mL/ウェル)して培養する工程、
(E)24ウェルプレートで培養したハイブリドーマのコロニー群をFACS法などのフローサイトメトリー法やELISA法などによる再度のスクリーニング(一般的に2次スクリーニング(2nd screening)と呼ばれている)を行う工程、
(F)2次スクリーニングで得られた陽性ウェルからハイブリドーマのコロニーを採取し、限界希釈法などによってクローニングを行う工程、
(G)クローニングしたコロニーが単一細胞由来のものであるか否かのスクリーニングを行なう工程、
を順次行うことでモノクローナル抗体を産生するモノクローナルなハイブリドーマなどの融合細胞を作製している(例えば、非特許文献1参照)。
なお、本発明は、目的とする分化形質を保持するモノクローナルな融合細胞を作製するためのコロニーピッキング方法、コロニーピッキング装置、及び融合細胞クローン作製方法に係るものであるが、融合細胞を得るまでに必要な操作や融合細胞の取り扱い方法、融合細胞のクローニング方法などについて、発明を実施するための最良の形態及び実施例に特に説明がない場合には、例えば、非特許文献1や常用される標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれらを修飾したり、改変したりした方法を用いることができる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いることができる。また、当業者であれば本明細書の記載及び例えば、非特許文献1や標準的なプロトコール集などの記載から容易に本発明を再現することができる。
図1(a)に示すように、本発明に係るコロニーピッキング方法は、細胞融合され、選択培地で選択培養された後に行う1次スクリーニングの結果が陽性であったウェル内に含まれる融合細胞のコロニーから融合細胞のクローンを得るために行われるコロニーピッキング方法であって、ピッキング工程S10と、まき込み工程S20とを含んでなる。
なお、ピッキング工程S10を行う前の免疫、細胞融合、選択培地による選択培養、及び1次スクリーニングの各工程は、通常行われる手法により行うことができる。
かかる選択培地による選択培養は、融合細胞作製時と同様の条件、例えば、5%CO2濃度下、37℃でウェル内のコロニーの区別がつくくらいまで培養することにより行うことができる。なお、培養期間中、必要に応じて選択培地の半量や全量を交換してもよく、適度なスピードでウェルプレートを揺動してもよい。このようにすると、作製した融合細胞に由来するコロニーを複数有するコロニー群が、96ウェルプレートの各ウェル内に形成される。
この1次スクリーニングは、従来から行われているハイブリドーマの作製方法において1次スクリーニング(1st screening)と呼ばれるものに相当し、例えば、流体を利用した細胞測定方法であるフローサイトメトリー法、特に、蛍光抗体で染色した対象となる融合細胞を液流にのせて流し、レーザー光の焦点を通過させて各細胞が発する蛍光を測定し、特定の細胞のみを生きたまま無菌的に分取することが可能なFACS法(fluorescence activated cell sorting)によって行うことができる。FACS法による場合、液滴荷電方式やセルキャプチャー方式などにより行うことができる。また、1次スクリーニングは、前記した手法に限定されず、例えば、ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay)などによっても行うこともできる。
前記したように、1次スクリーニング直後の96ウェルプレートのウェル内に形成されるコロニーの大きさは非常に小さいので、作製された融合細胞のコロニーを個別にピッキングするのは極めて困難であるが、本願では後記するコロニーピッキング装置を用いることによって容易に行うことができる。当該コロニーピッキング装置については後に詳述することとする。
本発明に係る融合細胞クローン作製方法は、前記した本発明に係るコロニーピッキング方法を工程の一部に含むものであり、細胞融合され、選択培地で選択培養された後に行う1次スクリーニングの結果が陽性であったウェル内に含まれる融合細胞のコロニーから融合細胞のクローンを作製するための方法である。
本発明に係る融合細胞クローン作製方法は、ピッキング工程S10と、まき込み工程S20と、培養工程S30とを含む。なお、ピッキング工程S10とまき込み工程S20は、コロニーピッキング方法のピッキング工程S10及びまき込み工程S20と全く同様であるので詳細な説明を省略する。
本発明に係るコロニーピッキング装置1は、細胞融合され、選択培地で選択培養された後に行う1次スクリーニングの結果が陽性であったウェル内に含まれる融合細胞のコロニーから融合細胞のクローンを得るために行われるコロニーピッキング装置であって、前記した本発明に係るコロニーピッキング方法のピッキング工程S10と、まき込み工程S20とを実施するための装置であり、ピッキング手段と、まき込み手段とを有している。
また、まき込み手段は、ピッキングした融合細胞を個別に培養できるように個別の培地にまき込むものであり、実質的に前記したまき込み工程S20と同様の作用を奏する。
また、先端部41の肉厚が小さいほどウェルの壁部近傍にできたコロニーから融合細胞をピッキングし易くなるので好ましい。従って、先端部41の肉厚は、例えば、50〜400μm程度とするとよい。
このような細管体4は、ガラス管やプラスチック管を熱して引き伸ばすことで作製することができる。
さらに、細管体4は、載置台3に対して少なくとも上下方向に可動する可動部42を備えた保持具43に保持されているので、手動又は電動によって可動部42を動かして細管体4を下方向に移動させれば融合細胞のコロニーを正確にピッキングすることが可能となり、また、可動部42を動かして細管体4を上方向に移動させればピッキングした融合細胞を他の培地に移すことができるようになる。
かかる圧力制御装置5は、接続手段51を介して接続された細管体4内の圧力を制御することができるものであればどのようなものを用いてもよい。例えば、ペリスタポンプなどを好適に用いることができる。接続手段51は、シリコン製などの中空のチューブ等であって、当該接続手段51内の圧力を精密に制御可能とするためなるべく内径が小さいものを用いるとよい。
これらの容器位置入換手段6を備えていれば、コロニー群を有する培養用容器の位置P1と、前記個別の培地が添加された培養用容器の位置P2とを入れ換えるだけで、細管体4でピッキングした融合細胞を個別の培地に確実且つ容易にまき込むことができる。
まず、常法により細胞融合され、選択培地で選択培養され、1次スクリーニングが行われて、その結果が陽性であったウェルを有する96ウェルプレートなどの培養用容器を載置台3上に載置し、固定する。
その後は、培地にまき込んだ融合細胞を所定の条件で培養し、常法により2次スクリーニングやクローニング等を行うことで、シングルセルクローンからなる細胞株を得ることができる(図1(b)参照)。
(比較例)
比較例では、非特許文献2に記載の手法に従って、生体内で発現量が少なく、融合細胞の増殖速度が遅いタンパク質αのモノクローナル抗体を産生する融合細胞(ハイブリドーマ)のクローニングを試みた。
実施例1では、融合細胞の作製と1次スクリーニングの操作までを比較例と同じ条件で行った。なお、96ウェルプレート内の培地は、比較例と同じものを用い、比較例と同じ条件で培養した。1次スクリーニングの結果、比較例とほぼ同じ数(480個)の陽性ウェルを得ることができた。
従って、実施例1によれば、目的とする分化形質を保持する融合細胞を従来よりも確実に得ることができ、且つ従来法に比べてかかる融合細胞を作製するための労力や時間的及び金銭的な負担を軽減することができた。
実施例2では、免疫を実施例1と異なる条件で行った以外は、全く同じ条件で実験を行った。実施例1における免疫は、抗原として、タンパク質αの全長DNAを導入し、タンパク質αを表面に提示させたBVを常法により精製し、腹腔内投与する(投与量は、1匹あたりブラッドフォード値で0.1mg)とともに、精製したタンパク質α(投与量は、1匹あたりブラッドフォード値で0.005mg)を完全フロイントアジュバントとともに腫瘍近傍皮下投与することによって免疫した。
S20 まき込み工程
S3 ピッキング前スクリーニング工程
S25 クローニング工程
S30 培養工程
S33 培養後スクリーニング工程
S35 クローニング工程
1 コロニーピッキング装置
2 顕微鏡
3 載置台
4 細管体
41 先端部
42,42a 可動部
43 保持具
44 基端部
5 圧力制御装置
51 接続手段
6 容器位置入換手段
61 回転盤
62 水平移動盤
Claims (7)
- 細胞融合され、選択培地で選択培養された後に行う1次スクリーニングの結果が陽性であったウェル内に含まれる融合細胞のコロニーから融合細胞のクローンを得るために行われるコロニーピッキング方法であって、
前記ウェル内に含まれる融合細胞のコロニーの中から1つのコロニーを選択して当該コロニーに含まれる融合細胞をピッキングするピッキング工程と、
前記ピッキングした融合細胞を個別の培地にまき込むまき込み工程と、
を含むことを特徴とするコロニーピッキング方法。 - 細胞融合され、選択培地で選択培養された後に行う1次スクリーニングの結果が陽性であったウェル内に含まれる融合細胞のコロニーから融合細胞のクローンを得るために行われるコロニーピッキング装置であって、
前記ウェル内に含まれる融合細胞のコロニーの中から1つのコロニーを選択して当該コロニーに含まれる融合細胞を、前記融合細胞の大きさの1〜40倍の大きさの内径を有する先端部を備えた細管体によってピッキングするピッキング手段と、
前記細管体でピッキングした融合細胞を個別の培地にまき込むまき込み手段と、
を含むことを特徴とするコロニーピッキング装置。 - 細胞融合され、選択培地で選択培養された後に行う1次スクリーニングの結果が陽性であったウェル内に含まれる融合細胞のコロニーから融合細胞のクローンを作製するための融合細胞クローン作製方法であって、
前記ウェル内に含まれる融合細胞のコロニーの中から1つのコロニーを選択して当該コロニーに含まれる融合細胞をピッキングするピッキング工程と、
前記ピッキングした融合細胞を個別の培地にまき込むまき込み工程と、
個別の培地にまき込んだ融合細胞を培養する培養工程と、
を含むことを特徴とする融合細胞クローン作製方法。 - 前記ピッキング工程の前に、前記陽性であったウェル内に含まれる融合細胞のコロニーの中から陽性を示す融合細胞のコロニーを検出するピッキング前スクリーニング工程を行うことを特徴とする請求項3に記載の融合細胞クローン作製方法。
- 前記まき込み工程の後に、前記融合細胞をクローニングするクローニング工程を行うことを特徴とする請求項3又は請求項4に記載の融合細胞クローン作製方法。
- 前記培養工程の後に、培養した融合細胞の陽性反応を確認する培養後スクリーニング工程を行うことを特徴とする請求項3又は請求項4に記載の融合細胞クローン作製方法。
- 前記培養後スクリーニング工程の後に、当該培養後スクリーニングの結果が陽性であった融合細胞をクローニングするクローニング工程を行うことを特徴とする請求項6に記載の融合細胞クローン作製方法。
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