JP2011033545A - 等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】検体のゲル全体への染み込みが迅速かつ良好に完了し、かつ検体成分の脱落を生じにくい等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法を提供する。
【解決手段】等電点電気泳動用ゲルに対して、検体を膨潤用緩衝液で溶解してなる膨潤用検体溶液を適用した後、前記等電点電気泳動用ゲルの長手方向の側端部から油性成分を流し込む等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法に関する。更に詳しくは本発明は、等電点電気泳動に供する検体を膨潤用の緩衝液（Buffer）で溶解して膨潤用検体溶液を調製し、この膨潤用検体溶液で乾燥固化した等電点電気泳動用ゲルを膨潤させる際の等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法に関する。本発明は、単独で行う等電点電気泳動の他、２次元電気泳動における１次元目電気泳動として行う等電点電気泳動にも好ましく適用される。

従来、細胞抽出物などから蛋白質や核酸を分離・精製する方法が種々に検討されてきている。塩濃度を利用した析出、遠心分離などはその一例であるといえる。

また、蛋白質や核酸の残基が有する電荷や、分子量の違いを利用した精製方法も多数検討されている。電荷を利用した精製方法としては、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーや等電点電気泳動を例示できる。分子量の違いを利用した精製方法としては遠心分離、分子量篩によるカラムクロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥを例示できる。

近年、細胞抽出物等の少量の検体から多様な蛋白質を分離精製する方法として、１次元目に等電点電気泳動を行い、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う２次元電気泳動法が用いられている。

特表２００２−５０３８１３号公報。 この特許文献１は、肝細胞性のガンの診断のために被験者の血清又は血漿について行う２次元電気泳動を開示している。特許文献１の段落「0098」には、１次元目の等電点電気泳動において、検体溶液でローディングしたストリップ（電気泳動用ゲル）をミネラルオイル（流動パラフィン）でカバーする旨の簡単な記載がある。

DavidR.M.Graham et al. 「Improvements in two-dimensional gelelectrophoresis by utilizing a low cost "in-house" neutral pH sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis system」 Proteomics2005,5,2309-2314。 この非特許文献１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む２次元電気泳動における「イン−ハウス・システム」と称する一定の改良について開示している。

等電点電気泳動において、検体を溶解した膨潤用検体溶液で等電点電気泳動用ゲルを膨潤させて等電点電気泳動用膨潤ゲルを作成する際、従来は、例えばゲルを膨潤用検体溶液で膨潤させただけで放置したり、又は膨潤したゲルの表面に単に流動パラフィン等を流し込む場合が一般的であった。

しかし、本願発明者の研究によれば、このようにして等電点電気泳動用の膨潤ゲルを作成すると、ゲルに対する膨潤用検体溶液の染み込みがうまくできず、検体中から検出できる蛋白質等が減少するという検体成分の脱落につながったり、膨潤用検体溶液の染み込みに多くの時間を取られるという不具合があった。

上記の特許文献１及び非特許文献１においても、等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法に関し、上記の不具合を解消するための特段の新規情報を開示しない。

そこで本発明は、検体のゲル全体への染み込みが迅速かつ良好に完了し、かつ検体成分の脱落を生じない等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法を提供することを、解決すべき課題とする。

（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、等電点電気泳動用ゲルに対して、検体を膨潤用緩衝液で溶解してなる膨潤用検体溶液を適用した後、前記等電点電気泳動用ゲルの長手方向の側端部から油性成分を流し込む、等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法である。

（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明において、等電点電気泳動用ゲルの長手方向の両側の側端部から同時に油性成分を流し込む、等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法である。

（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明において、油性成分がシリコンオイルである、等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法である。

（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明において、等電点電気泳動用ゲルが２次元電気泳動に用いるものである、等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法である。

（第５発明）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第１発明〜第４発明において、検体が生物細胞の抽出物であって、該抽出物は酸沈殿、エタノール沈殿、アセトン沈殿又はそれらの組み合わせによる沈殿処理を受けたものである、等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法である。

（第１発明）
少量の検体を効率的にゲルに取り込むために、検体を膨潤用緩衝液で溶解して膨潤用検体溶液を作成し、この膨潤用検体溶液を等電点電気泳動用ゲルに適用する。そして、ゲルの長手方向の側端部から油性成分を流し込むと、油性成分はゲルの側端部から中央部に向かって広がりゲルを覆う。油性成分がゲルを覆った状態でしばらく放置すると、検体は効率的にゲルに取り込まれる。

その場合、ゲルの側端部から中央部に向かって広がる油性成分によって膨潤用検体溶液がはじかれるため、膨潤用検体溶液のゲルへの染み込みが促進され、検体のゲル全体への染み込みが迅速かつ良好に完了する。即ち、検体のゲルへの染み込みに多くの時間を取られるという不具合が防止される。

又、従来のようにゲル表面に油性成分を流し込んだ場合、油性成分がゲルから広がるので、その流れに押されてはじかれた、染み込みきれていない膨潤用検体溶液の一部がゲルから拡散してしまい、検出できる蛋白質等の減少及びゲルの膨潤不足につながっていたと考えられる。しかし、第１発明においては油性成分がゲルの側端部から中央部に向かって広がるので、このような検体成分の脱落を生じない。

更に、検体のゲルへの染み込みの際に上記のようにゲルに対して油性成分を流し込むと、検体中の分離・精製の対象とならない荷電性の物質である粗雑物が排除されるという効果も期待することができる。例えば、分離・精製の対象が蛋白質である場合は、リン脂質、ゲノムＤＮＡやＲＮＡを含む核酸、脂肪酸、金属イオン、抽出用の界面活性剤等が粗雑物に含まれる。

（第２発明）
第２発明においては、油性成分がゲルの両側の側端部から中央部に向かって同時に広がって行くので、検体のゲルへの染み込みに要する時間が一層短縮され、かつ、検出できる蛋白質等のゲルからの脱落という不具合も一層有効に防止される。

（第３発明）
油性成分としては、上記第１発明又は第２発明の効果をより良好に確保できるという点で、特にシリコンオイルが好ましい。

（第４発明）
第１発明〜第３発明に係る等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法は、２次元電気泳動における１次元目の電気泳動に用いる等電点電気泳動用ゲルに対しても、好ましく適用することができる。

（第５発明）
第１発明〜第４発明において、電気泳動に供する検体としては、例えば生物細胞の抽出物、特に動物細胞の抽出物、とりわけヒト細胞の抽出物を好ましく例示することができる。これらの抽出物は、分離・精製の対象とならない粗雑物を含んでおり、これらは機器への負荷を軽減し、また、ゲル中のスポットの詰まりを抑制するために、できるだけ除去しておくことが好ましい。

検体中のこれらの粗雑物は、膨潤ゲル作成時の油性成分の注入によりある程度は排除されるが、検体に対しては更に、予め酸沈殿、エタノール沈殿、アセトン沈殿等の沈殿処理を施して粗雑物を除去しておくことが好ましい。

本発明の実施形態を説明する図である。

第１実施例及び比較例に係る２次元電気泳動の結果を示す。

第１実施例と比較例との対比評価の結果を示す。

第１実施例と比較例との対比評価の結果を示す。

次に、本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。

〔等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法〕
本発明に係る等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法は、等電点電気泳動に供する細胞抽出物等の検体を膨潤用の緩衝液（Buffer）で溶解して膨潤用検体溶液を調製し、乾燥固化した等電点電気泳動用ゲルに対して前記の膨潤用検体溶液を適用してゲルを膨潤させる際に、等電点電気泳動用ゲルの長手方向の側端部から油性成分を流し込むという方法である。特に好ましくは、油性成分を等電点電気泳動用ゲルの長手方向の両側の側端部から同時に流し込む。

ここにおいて「等電点電気泳動用ゲルの長手方向」とは、一般的に棒状に形成される等電点電気泳動用ゲルの軸方向を言い、より本質的にはゲルにおける等電点電気泳動の泳動方向をいう。又、ゲルの「側端部」とはゲルの長手方向の側端の端面部であって、ゲルの表面部ではない。換言すれば、油性成分がゲルの表面から裏面方向へ広がるのでなく、ゲルの側端部から中央部方向に向かって浸透するように、油性成分を流し込むのである。

油性成分の種類は特段に限定されないが、特に好ましくはシリコンオイルである。シリコンオイルとしては、ジメチコン等を好ましく例示することができる。油性成分としては、その他にも、ミネラルオイル（流動パラフィン）等を好ましく例示することができる。

等電点電気泳動用ゲルの膨潤用の緩衝液の種類は、使用目的に適う限りにおいて限定されず、この種の目的で市販されている各種の緩衝液の内から、DeStreak Rehydration Solution（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等の任意の緩衝液を選択して使用することができる。

本発明に係る等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法の一実施形態を図１に基いて説明する。この実施形態において、乾燥固化した等電点電気泳動用の棒状のゲル１を、それに相応する長い浅皿形状であってゲル１より幾分長い容器２中で、膨潤用検体溶液によって膨潤させる。ゲル１は支持用のプラスチック製プレートを伴うこともあるが、プレートの図示は省略する。又、図１においては図１（ｂ）が斜視図であり、図１（ａ）及び図１（ｃ）〜図１（ｅ）はいずれも容器２の手前側の壁部を取り除いて示す側面図である。

まず、図１（ａ）に示すように、容器２に対して、ピペット等の適宜な注液具３を用いて、検体を溶解した膨潤用検体溶液４を適当な量だけ注加する。次に、図１（ｂ）に示すように乾燥固化した等電点電気泳動用の棒状のゲル１を上記の容器２に収容し、膨潤用検体溶液４で膨潤させる。膨潤用検体溶液４あるいはこれによって膨潤したゲル１を、図に点々模様を付して示す。次いで図１（ｃ）に示すように、別の注液具５を用いて、容器２におけるゲル１の両側の側端部から同時に油性成分６を流し込む。そうすると、図１（ｄ）、図１（ｅ）に示すように油性成分６がゲル１の両側端部から中央部に向かって広がって行き、ゲル１の全体を覆う。油性成分６あるいはこれが浸透したゲル１を、図に斜線模様を付して示す。

〔等電点電気泳動用ゲル〕
本発明において用いられる等電点電気泳動用ゲルは、単独に等電点電気泳動を行うためのゲルであっても良いし、２次元電気泳動における１次元目の等電点電気泳動に用いるゲルであっても良い。

ゲルの種類は、等電点電気泳動用ゲルとして利用できるものである限りにおいて限定されないが、例えば、ポリアクリルアミドゲルを好ましく例示することができる。

泳動に用いられるゲルは、例えば、両性担体（キャリアアンフォライト）をポリアクリルアミドゲルに添加して、電場をかけて所望のｐＨ勾配を形成する手法や、種々の等電点の側鎖を持つアクリルアミド誘導体等のモノマー誘導体を用いてポリアクリルアミドゲル等のゲル作成と同時にｐＨ勾配を固定的に形成する手法（ＩＰＧ法）により作成したゲルが好ましく用いられる。

等電点電気泳動用ゲルは、必ずしも限定されないが、ゲル長が５〜１０ｃｍの範囲内、特に５〜８ｃｍの範囲内であることが、ゲル長の短縮化に基く電気泳動時間の短縮、高スループット化のために好ましい。ゲルのｐＨの範囲は、例えば３〜１０にわたるものとすることができる。泳動方向に対するゲルのｐＨ勾配も限定されないが、好ましくは、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５〜７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合に「ａ＜ｂ」及び「ｂ＞ｃ」の関係を満たすものであり、より好ましくは、ゲルの全長を１とした場合に、ａが０．１５〜０．３の範囲内、ｂが０．４〜０．７の範囲内、ｃが０．１５〜０．３の範囲内であるものであり、とりわけ好ましくは、「ａ+ｃ≦ｂ」の関係を満たすものである。

このようなゲルのｐＨ勾配の設定は、例えば生物細胞の抽出物に含まれる各種蛋白質の等電点の分布が、蛋白質の種類においても、その量においてもｐＨ５〜７の領域に相対的に集中していることに対応したものであり、実質的に高分離能を損なうことなくゲル長を短縮化できる。

〔等電点電気泳動方法〕
本発明の等電点電気泳動方法において、泳動に用いられる機器は特に限定されない。しかし、小型装置・高分解能・高スループットを実現するためには、ゲル長５〜１０ｃｍのゲルの使用に合致した電気泳動用機器が好ましい。

等電点電気泳動のプロトコルは特に限定されないが、高分解能、高スループットを実現するためには、電気泳動のプロトコルにも留意する必要がある。検体溶液を調製する段階において、分離・精製の対象とならない荷電性の物質である粗雑物はできるだけ除くことが好ましい。しかし、検体中に当該粗雑物が少量残存することがあるので、等電点電気泳動において機器に大きな負荷を与えることなく除くことが好ましい。粗雑物はゲル中の移動速度が速い。よって、等電点電気泳動のプロトコルの早い段階に比較的弱い電圧を１時間半〜３時間半ほどかける定電圧工程を行うことで、粗雑物を機器に負荷をかけることなく除くことができる。仮に、この工程において高い電圧を使用すると、粗雑物が急速に電極側に移動し、強い電流が流れることになるので機器に負荷がかかるとともに、蛋白質ごとの分離が悪くなる（ゲル中のスポットの詰まりが生じる）おそれがある。

等電点電気泳動では、検体を含むゲル１本につき１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇工程を始め、当該電圧上昇工程の最終電圧が３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内とすることが好ましい。また、分離対象物質の等電点がずれないように、ゲルの温度を一定に保つことが好ましい。

上記の実施形態により、以下の効果を期待できる。即ち、電圧が上昇し始める前に１００Ｖ〜６００Ｖという低い定電圧で定電圧工程を行うことで、正に荷電した粗雑物は陰極に素早く移動させ、負に荷電した粗雑物は陽極に素早く移動させる。このことにより、機器や検体中の分離対象物質に負荷をかけずにゲルから粗雑物を除くことができる。又、単位時間当たりの電流変化の測定により粗雑物の除去を判断できるので、不十分な定電圧工程となることはなく、かつ、長すぎる定電圧工程となることもない。更に、最終電圧を３０００Ｖ〜６０００Ｖという高い値に設定することで、より短い泳動時間で高いＶｈｒ値を得ることができ、等電点電気泳動の高スループットを実現できる。

電圧上昇工程における電圧上昇の態様は特に限定されないが、電圧の上昇を徐々に行うことが好ましい。具体的には、電気泳動装置の電流値の上限をゲル１本につき４０〜８０μＡの範囲内の値に設定する。そして、ゲル温度が一定に保たれるようにして、最終電圧まで電圧を上昇させることが好ましい。

〔２次元電気泳動〕
等電点電気泳動は、２次元電気泳動における１次元目の電気泳動として行うこともできる。この場合、２次元目の電気泳動は、必ずしも限定されないがＳＤＳ−ＰＡＧＥであることが好ましい。１次元目の等電点電気泳動が小型装置で行われ、高分解能を有し、高スループットを実現している場合、２次元目の電気泳動も装置を小型化でき、高分解能、高スループットを実現できる。よって、本発明は単独に行う等電点電気泳動のみならず、２次元電気泳動における１次元目の電気泳動にも適用できる。２次元電気泳動を行う場合、等電点電気泳動に続いて、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われるので、以下、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥについて説明する。

〔２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスでは、接着用（封入用）アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃である高融点アガロースを用い、かつ、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に前記１次元目電気泳動ゲルを設置することが好ましい。

上記の実施形態によって、２次元目電気泳動中に発生する熱により接着用アガロースのゲル化が弱くなる（ゲルがゆるくなる）ことが防止される。従って、そのような不具合に起因する２次元目電気泳動での検出スポットの広がり、検出限界の上昇、検出蛋白質の減少等の不具合を抑制できる。又、接着用アガロースの先入れにより、高融点アガロースが２次元目電気泳動用ゲルと接触して迅速に冷却されるため、ＳＤＳ平衡化緩衝液に尿素を加えていた場合でも、その熱分解が起こりにくい。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う機器は特に限定されない。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うＰＡＧ（ポリアクリルアミドゲル）に関し、モノマーであるアクリルアミドと架橋剤の総濃度（Ｔ％）や、アクリルアミドと架橋剤の総重量中で架橋剤が占める割合（Ｃ％）等は特に限定されない。

〔２次元目電気泳動用ゲル基端部のゲル濃度〕
１次元目電気泳動用ゲルのゲル長が短く設定されている場合には、2次元目として行うＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、その電気泳動用ゲルにおける泳動方向基端部のゲル濃度が３〜６％程度の低濃度であることが好ましい。ゲル濃度とは、直接的には当該ゲルの重合反応時のモノマー濃度を意味するが、重合反応時のモノマー濃度が高い程ゲルの網目構造は密になるので、実質的にはゲルの網目構造の密度を意味する。

上記の実施形態によれば、次の効果を期待できる。即ち、１次元目等電点電気泳動用ゲルのゲル長を、例えば５〜１０ｃｍ程度と短くすると、１次元目の電気泳動時間を短縮してハイスループット化等が可能となる一方、蛋白質のスポットの相互間隔がコンパクトになり、スポット中の蛋白質濃度も高くなる。これに対して2次元目電気泳動用ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度が高い（ゲルの網目が密である）と、スポット中に濃縮された蛋白質の2次元目電気泳動用ゲルへの移行に対して高いバリア性を示し、蛋白質の移行漏れが顕著になったり、スポットが泳動方向に対して横向きにブロードしてしまう。上記の実施形態により、このような不具合が解消される。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、検体に界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、検体に含まれる蛋白質の高次構造を解くと共に、蛋白質のアミノ酸残基の荷電もＳＤＳによって相対的に減少させたもとで、分子篩い効果を利用して電気泳動を行うものである。

〔検体の調製〕
等電点電気泳動に供される検体は特に限定されないが、動物、植物、微生物由来の抽出物や、化学的又は生化学的に合成された化合物、蛋白質、核酸等を含む種々の検体を適用できる。検体としては、生物細胞、特に動物細胞、とりわけヒト細胞の抽出物であることが好ましい
等電点電気泳動においては、検体中の蛋白質等の分離対象物質が有する等電点を利用して分離を行う。正に荷電した分離対象物質は陰極側に移動し、他方、負に荷電した分離対象物質は陽極側に移動する。そして、等電点（ｐＩ）と等しいｐＨのゲルの位置で分離対象物質の正味の電荷がゼロとなり、泳動を止める。よって泳動開始後は荷電状態の化合物が移動するので、電流が流れることとなる。

泳動用ゲルにおいては分子量により泳動の速度が異なるが、ナトリウムイオン等の分子量の小さい物質は篩にかからないので素早くゲル中を移動する。また、ゲノムＤＮＡは分子量が大きいが、大きく負に荷電しているため、陽極に素早く移動する。よって、検体の調製においては、機器への負荷を軽減し、また、ゲル中のスポットの詰まりを抑制するために、分離・精製の対象とならない粗雑物を除くことが好ましい。そのために、透析、沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、親水−疎水相互作用を利用した分画等、種々の前処理を適用することができる。蛋白質が分離・精製の対象となる場合は、酸による沈殿及び有機溶媒による沈殿を好ましく例示できる。ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）による沈殿及びアセトンによる沈殿を更に好ましい手法として例示できる。

分離・精製に供される検体は、等電点電気泳動に使用するゲルの膨潤用の緩衝液に溶解して膨潤用検体溶液とし、ゲルの膨潤とともにゲル中に検体を取り込ませることができる。また、検体を適当な溶液に溶解し、膨潤後のゲルに適用することもできる。

以下に本発明の実施例と比較例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例、比較例によって限定されない。

〔第１実施例〕
(蛋白質の抽出)
ヒトケラチノサイトからなる再構成３次元培養皮膚（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製の商品名LabCyte EPI-MODEL 12）の培養物１枚（約１ｃｍ^２）を、蛋白質抽出液であるmammalian cell lysis kit；MCL1（ＳＩＧＭＡ−ALDRICH社製）５００μｌに浸漬し、４℃で２時間、ｖｏｌｔｅｘを使用して振とう破砕した。この振とう破砕の後、蛋白質抽出液を回収した。上記のmammalian cell lysis kit；MCL1の組成は下記の通りである。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ
２５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
０．５％（ｗ／ｖ） Deoxycholic acid sodium salt
１％（ｖ／ｖ） Igepal CA-630（ＳＩＧＭＡ−ALDRICH社製の界面活性剤(Octylphenoxy)polyethoxyethanol）
適量のProtease Inhibitor
その後、2D-CleanUPキット〔ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社（以下、ＧＥ社と省略する）製〕を使用して２回の沈殿操作を行った。第１回目の沈殿操作は、回収した上記蛋白質抽出液にＴＣＡを加えて沈殿を行い、当該操作で生じた沈殿（ＴＣＡ沈殿）を回収した。第２回目の沈殿操作は、回収した前記ＴＣＡ沈殿にアセトンを加えて沈殿を行い、当該操作で得られた沈殿（検体）を回収した。回収した当該検体は全量５００μｇであった。

（検体溶液の調製）
得られた検体の一部３０μｇを、１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution（ＧＥ社製）１３０μｌに溶解し、１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
７Ｍ Ｔｈｉｏｕｒｅａ
２Ｍ Ｕｒｅａ
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ：
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
０．５％（ｖ／ｖ） ＩＰＧbuffer；ＧＥ社製
適量のDeStreakReagent；ＧＥ社製
適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）
（１次元目等電点電気泳動用ゲルの調製）
本実施例で用いる１次元目の等電点電気泳動用ゲル（ポリアクリルアミドゲル）を調製した。このゲルは長さが７ｃｍ、径が約０．３cmの棒状ゲルであり、Ｔ=４％、Ｃ＝３％であって、次のｐＨ勾配上の特徴を備えている。
ｐＨの範囲：３〜１０
ｐＨ３〜５のゲル長：１．７ｃｍ
ｐＨ５〜７のゲル長：３．６ｃｍ
ｐＨ７〜１０のゲル長：１．７ｃｍ
（１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透）
前記の図１に示す実施形態の要領に従って、１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）１３０μｌに浸漬した後、当該ゲルの長手方向の両側の側端部から同時に、ピペットを用いてシリコンオイルを流し込んだ。流し込んだシリコンオイルはゲルの内側に向かって広がった。シリコンオイルがゲルを覆った状態で、一晩、室温にて検体溶液をゲルに浸透させた。その後、シリコンオイルは廃棄した。

（一次元目の等電点電気泳動）
本実施例においては、電気泳動機器としてＧＥ社製のIPGphor と Cup Loading Manifold Light Kitを使用した。

検体を浸透させたゲルの両端に水で湿らせた濾紙を設け、電極はゲルとの間に当該濾紙を挟んだ状態でセットした。その後、ゲル及び濾紙の全体をシリコンオイルで浸漬した。

等電点電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、電圧プログラムを、（１）３００Ｖ定電圧で７５０Ｖｈｒまで定電圧工程を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流変化幅が５μＡであった）、（２）３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまで、１次元目の等電点電気泳動を行った。

（等電点電気泳動ゲルのＳＤＳ平衡化）
上記の１次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、１５分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１％（ｗ／ｖ） ＤＴＴ
次に、上記還元剤を含む平衡化緩衝液を除き、ゲルをアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に浸漬して、１５分・室温にて振とうし、ＳＤＳ平衡化したゲルを得た。上記アルキル化剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
２．５％（ｗ／ｖ） Iodoacetamide
（２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
本実施例においては、電気泳動機器としてInvitrogen社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。２次元目泳動用ゲルはInvitrogen社製NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelsを使用した。また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
５０ｍＭ ＭＯＰＳ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１ｍＭ ＥＤＴＡ
（２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
又、本実施例においては泳動用緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製：融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃のいわゆる高融点アガロース）と適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥのｗｅｌｌ中を十分に上記泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次に、ｗｅｌｌの中に充分に溶解させた接着用アガロース溶液を添加した。次に、ＳＤＳ平衡化したゲルをアガロース中に浸漬させ、ピンセットでＳＤＳ平衡化したゲルと２次元目泳動用ゲルを密着させた。当該両ゲルが密着した状態でアガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。

（ゲルの蛍光染色）
SyproRuby（Invitrogen社製）を用いてゲルの蛍光染色を行った。

まず、使用するタッパーを事前に９８％（ｖ／ｖ）のエタノールで十分に洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ機器から泳動後の２次元目泳動用ゲルを取り外して、洗浄したタッパーにおき、５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液に３０分間浸漬する処理を２回行った。その後、当該水溶液を水に置換し、１０分間浸漬した。次に、２次元目泳動用ゲルを４０ｃｃのSyproRuby（Invitrogen社製）に浸漬し、室温で一晩振とうした。次に、SyproRubyを除き、２次元目泳動用ゲルを水で洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液で３０分間振とうした。更に当該水溶液を水に置換し、３０分以上振とうした。

（解析）
上記一連の処理を施した２次元目泳動用ゲルをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。２次元電気泳動の結果を図２（ａ）に示す。図２（ａ）の左端にマーカーの分子量（KDa）を示す。

〔第２実施例〕
第２実施例では、２Ｄ−ＤＩＧＥを行った。第２実施例においては、第１実施例に記載した手順の内、「（検体溶液の調製）」の項の手順を下記「（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）」の項の手順に変更し、又、「（ゲルの蛍光染色）」のプロセスを省略した以外は、第１実施例と同様の手順の操作を行った。

（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）
得られた検体の全量を下記の組成の溶液１００μｌに溶解した。
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
２Ｍ ThioUrea
７Ｍ Urea
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ
溶解したサンプル２０μｇに対しCydye（ＧＥ社製）１６０ｐｍｏｌを添加し、その溶液の入った容器を氷上で３０分間静置した。その後１０ｍＭリジン水溶液を０．５μｌ添加して更に１０分間、容器を氷上で静置した。このような処理を行った後、溶液を等電点電気泳動に適した量である１３０μｌまでDeStreak Rehydration Solutionでメスアップした。メスアップ後充分に攪拌し、氷上で１０分以上静置して、１次元目の等電点電気泳動用の検体溶液とした。

〔第１実施例に対する比較例〕
本比較例では、第１実施例における「（１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透）」の項の手順を以下のように変更して行った点以外は、検体の調製からゲルの蛍光染色及び解析に至る全てのステップを第１実施例と全く同様に行った。

（１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透）
１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）１３０μｌを１次元目等電点電気泳動用ゲルに膨潤させた。次いでピペットを用いて当該ゲルの表面にシリコンオイルを流し込んだ。流し込んだシリコンオイルはゲルの表面から広がった。シリコンオイルがゲルを覆った状態で、一晩、室温にて検体溶液をゲルに浸透させた。

この比較例における２次元電気泳動の結果を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）の左端にはマーカーの分子量（KDa）を示す。前述した図２（ａ）と比較して、図２（ｂ）ではバックグラウンドのノイズがやや高いことが認められる。これは、図２（ｂ）の比較例においては、検体溶液で膨潤させた１次元目等電点電気泳動用ゲルに対して表面にシリコンオイルを流し込んだため、検体溶液のゲルへの染み込みが甘く、１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤が十分でないためにゲルの膨潤が不足する部分ができ、その部分でタンパク質の流れが悪くなり、それにより検体溶液の一部が拡散してしまったためであると考えられる。

〔第１実施例と、これに対する比較例との対比評価〕
（ゲルに染み込まなかった検体溶液量）
上記の第１実施例と比較例について、検体溶液で膨潤させた１次元目等電点電気泳動用ゲルにシリコンオイルを適用した後、１時間、４時間及び８時間経過後に前記図１に示す容器２からゲル１を取り除き、容器２に残った検体溶液（着色液である）を透明カップに回収して、その回収量を対比した。

図３（ａ）に第１実施例の結果を、図３（ｂ）に比較例の結果をそれぞれ示す。図３（ａ）及び図３（ｂ）には、透明カップにほぼ一杯に満たされた、回収されたシリコンオイルと、その底部に比重差により沈んでいる、回収された着色検体溶液が見えている。１時間、４時間及び８時間経過後のいずれの時点でも、比較例における検体溶液の回収量（ゲルに染み込まなかった検体溶液量）が第１実施例に対比して顕著に多く、検体溶液のゲルへの染み込みが遅いことが分かる。

（電気泳動速度の違い）
上記の第１実施例と比較例について、検体溶液による膨潤処理とシリコンオイルの適用処理後に一晩経過させた１次元目等電点電気泳動用ゲルを３００Ｖで１．０時間の電気泳動にかけた時点での結果を図４に示す。図４（ａ）が第１実施例の結果、図４（ｂ）が比較例の結果である。これらの図において、縦向きの短い縞模様はゲルのバーコード（識別情報）を表す。

又、バーコードの上半部に重なるように表れている帯状の着色部が泳動中の検体溶液に配合されていた色素を示し、この帯状の着色部が短い程、泳動速度が大きいことを示す。

図４（ｂ）の比較例は、図４（ａ）の第１実施例との対比において、泳動速度が顕著に小さいことが分かる。これは、１次元目等電点電気泳動用ゲルに対する検体溶液の染み込みおよびゲルの膨潤が悪かったためであると考えられる。

本発明によって、検体のゲル全体への染み込みが迅速かつ良好に完了し、かつ検体成分の脱落を生じない等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法が提供される。

１ ゲル
２ 容器
３ 注液具
４ 膨潤用検体溶液
５ 注液具
６ 油性成分

Claims (5)

1. 等電点電気泳動用ゲルに対して、検体を膨潤用緩衝液で溶解してなる膨潤用検体溶液を適用した後、前記等電点電気泳動用ゲルの長手方向の側端部から油性成分を流し込むことを特徴とする等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法。
2. 前記等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法において、等電点電気泳動用ゲルの長手方向の両側の側端部から同時に油性成分を流し込むことを特徴とする請求項１に記載の等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法。
3. 前記等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法において、油性成分がシリコンオイルであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法。
4. 前記等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法において、等電点電気泳動用ゲルが２次元電気泳動に用いるものであることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法。
5. 前記等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法において、検体が生物細胞の抽出物であって、該抽出物は酸沈殿、エタノール沈殿、アセトン沈殿又はそれらの組み合わせによる沈殿処理を受けたものであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成方法。