JP2011026223A - 皮膚外用剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 サケ目サケ科イワナ属の魚類から得られる不凍タンパク質が、保湿効果、美白効果、抗炎症効果、抗老化効果に優れていることを見出し、保湿剤、美白剤、抗炎症剤、抗老化剤、皮膚外用剤を提供するに至った。
【選択図】なし
Description
<抽出物1>
サケ目サケ科イワナ属の魚類の頭部と腹部及び骨を除去し、皮を除いた身の部分をミキサーにかけ粉砕し、等量の水を加えて、4℃以下で一晩放置した。その後、5000rpm、30分間、スイングローターで遠心分離し、上清を取った。その上清を70℃で10分間処理し、氷上に静置した。その後、1.5mLチューブに分注後、13000rpm、20分間遠心分離を行い、上清を取った。その上清を80℃で15分間処理し、1.5mLチューブに移し、13000rpm、50分間遠心分離して、上清を取った。
<タンパク質の精製>
この上清をSDS−PAGEにより分画した。VIVASPIN6カラムを用いて行い、不凍タンパク(AFPIII)を含む7kDa付近のタンパク質を精製した。その結果を図1に示す。
抽出物1(図1、レーン2)
VIVASPIN6カラムで精製後(図1、レーン5,7)
<タンパク質粗精製物>
実施例1で得られた上清を24時間凍結乾燥したものをタンパク質粗精製物として用いた。
<不凍タンパク質確認試験>
凍結濃縮現象を利用した、不凍タンパク質の確認試験を行った。不凍タンパク質は水を抱え込む機能を持ち、それによって氷の結晶化が進むのを抑制するので、以下のようにインクなど共雑物と共に不凍タンパク質を加え凍結させると凍結しても溶質が均一分散状態を保つことができる。結果を図2に示す。
*インク+水
氷だけが水分子だけを使って結晶成長し、他の溶質を物理的に排除するので溶質と氷は分離する(凍結濃縮現象)。解凍後は、溶質が水面に浮かんだり、底に溜まっていた。
*インク+水+7kDaタンパク質溶液
凍結濃縮現象は起きず、溶質は凍結前と同様にきれいな分散状態を保っていた。
以上のことから、精製したタンパク質中には、不凍タンパク質が含まれていることを確認することができた。
<保湿効果(フィラグリン合成促進作用の評価)>
1.ヒト表皮ケラチノサイトHaCaT細胞を、10%FCSを含むダルベッコMEM培地で、37℃、5%CO2条件下にて培養した。
2.コンフルエントな状態になったところで、抽出物1を添加したダルベッコMEM培地にて、さらに24時間培養した後、総RNAの抽出を行った。総RNAの抽出にはRNAprotect Cell Reagent及びRNeasy Protect Cell Mini Kit(QIAGEN)を用いた。
3.HaCaT細胞から抽出した総RNAを基にRT−PCR法によりフィラグリンmRNA発現量の測定を行った。
4.内部標準としてはGAPDHを用いた。GAPDH mRNA発現量を補正値として用い、フィラグリンmRNAの発現量をブランク(培地のみ処理した)細胞でのmRNA発現量に対する割合として求めた。
評価結果を表1に示す。
<美白効果(ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用の評価)>
クラボウ社製正常ヒト表皮メラニン細胞を1ウェル当り3.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはクラボウ社製Medium154Sを用いた。24時間後、Medium154Sによって各濃度に調整したタンパク質粗精製物培養液に交換し、さらに48時間培養した。次に1質量%Triton−Xを含有するリン酸緩衝液75μLに交換し、細胞を完全に溶解させ、内50μLを粗酵素液として使用した。粗酵素液に基質となる50μLの0.05質量%L−ドーパ含有リン酸緩衝液を加え、37℃で2時間静置した。基質添加直後と反応終了時の405nmの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量は両測定値の差を次式に導入して求めた。
生成されたドーパメラニン量={(反応後405nm値−反応前405nm値)−2.166}/5.238
また、PIERCE社製BCAプロテインアッセイキットにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量を求めた。コントロールの値を100とした時の相対値より、チロシナーゼ活性阻害作用を評価した。その結果を表2に示す。
<美白効果(B16マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用の評価)>
B16マウスメラノーマ細胞(B16F0細胞)を1ディッシュ当り18000個となるように90mmディッシュに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、5%質量FBS添加DMEM培地にて表3に示す濃度になるようにタンパク質粗精製物を添加した培養液に交換し、さらに5日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、1.5mLマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記判定表を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに5%質量FBS添加DMEM培地、ポジティブコントロールに50mM乳酸ナトリウムを含有する5質量%のFBS添加DMEM培地を用いた。これらの肉眼判定結果は判定5及び判定1とし、サンプル判定の指標とした。肉眼判定は下記に示す通り、5段階評価した。
判定及び基準
判定 基準
1 ポジティブコントロールと同程度(ほぼ白)
2 ポジティブコントロールより僅かに黒化する(うすい褐色)
3 ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間(褐色)
4 ネガティブコントロールと比べやや黒化が抑制されている(黒褐色)
5 ネガティブコントロールと同程度(ほぼ黒)
また同時に、沈殿物に組織溶解剤(商品名 Solvable)を添加して煮沸し、室温に戻して96ウェルマイクロプレートに150μL添加して、分光光度計(HITACHI製分光光度計U−3010)により500nmの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。評価結果を表3に示す。
<抗炎症効果(IL−1α生成抑制作用の評価)>
1.ヒト表皮ケラチノサイトHaCaT細胞を、10%FCSを含むダルベッコMEM培地で、37℃、5%CO2条件下にて培養した。
2.コンフルエントな状態になったところで、抽出物1を添加したダルベッコMEM培地にて、さらに24時間培養した後、総RNAの抽出を行った。総RNAの抽出にはRNAprotect Cell Reagent及びRNeasy Protect Cell Mini Kit(QIAGEN)を用いた。
3.HaCaT細胞から抽出した総RNAを基にRT−PCR法によりフィラグリンmRNA発現量の測定を行った。
4.内部標準としてはGAPDHを用いた。GAPDH mRNA発現量を補正値として用い、IL−1αのmRNAの発現量をブランク(培地のみ処理した)細胞でのmRNA発現量に対する割合として求めた。
評価結果を表4に示す。
<抗老化効果(ヒト真皮繊維芽細胞タイプIコラーゲン産生促進作用の評価)>
正常ヒト真皮繊維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には5重量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、0.5質量%のFBS添加DMEM培地にて表5に示す濃度になるようにタンパク質粗精製物を添加した培養液に交換し、さらに24時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプIコラーゲンの定量にはELISA法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し、2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにより、405nmの吸光度を測定した。評価では、サンプル培養液の他にネガティブコントロールとして、0.5質量%FBS添加DMEM培地を、ポジティブコントロールとして50μMのL−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩(VCPMg)を含有する0.5質量%のFBS添加DMEM培地を用いた。評価はコントロールにおける細胞賦活作用を100とした時の相対値を求めて行った。また、BECKMAN社製のCoulter Counter又はPIERCE社製BCAプロテインアッセイキットにて各ウェルの細胞数又は単位タンパク量当りのコラーゲン産生量を求めた。評価はネガティブコントロールの単位当りコラーゲン産生量を100とした時の相対値を求めて行った。
乳液
(1)スクワラン 10.0(質量%)
(2)メチルフェニルポリシロキサン 4.0
(3)水素添加パーム核油 0.5
(4)水素添加大豆リン脂質 0.1
(5)モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン(20E.O.) 1.3
(6)モノステアリン酸ソルビタン 1.0
(7)グリセリン 4.0
(8)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(9)カルボキシビニルポリマー 0.15
(10)精製水 100とする残部
(11)タンパク質粗精製物 1.0
(12)アルギニン(1質量%水溶液) 20.0
製法:(1)〜(6)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(7)〜(11)の水相成分を80℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。冷却後40℃にて、(12)を順次加え、均一に混合する。
化粧水
(1)エタノール 15.0(質量%)
(2)ポリオキシエチレン(40E.O.)硬化ヒマシ油 0.3
(3)香料 0.1
(4)精製水 100とする残部
(5)クエン酸 0.02
(6)クエン酸ナトリウム 0.1
(7)グリセリン 1.0
(8)ヒドロキシエチルセルロース 0.1
(9)タンパク質粗精製物 0.5
製法:(1)に(2)及び(3)を溶解する。さらに(4)〜(8)を順次添加した後、十分に攪拌し、(9)を加え、均一に混合する。
クリーム
(1)スクワラン 10.0(質量%)
(2)ステアリン酸 2.0
(3)水素添加パーム核油 0.5
(4)水素添加大豆リン脂質 0.1
(5)セタノール 3.6
(6)親油型モノステアリン酸グリセリン 2.0
(7)グリセリン 10.0
(8)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(9)アルギニン(20質量%水溶液) 15.0
(10)精製水 100とする残部
(11)カルボキシビニルポリマー(1質量%水溶液) 15.0
(12)タンパク質粗精製物 1.0
製法:(1)〜(6)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(7)〜(10)の水相成分を80℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。(11)を添加して攪拌後、冷却し40℃にて(12)を加え、均一に混合する。
美容液
(1)精製水 100とする残部(質量%)
(2)グリセリン 10.0
(3)ショ糖脂肪酸エステル 1.3
(4)カルボキシビニルポリマー(1質量%水溶液) 17.5
(5)アルギン酸ナトリウム(1質量%水溶液) 15.0
(6)モノラウリン酸ポリグリセリル 1.0
(7)マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル 3.0
(8)N−ラウロイル−L−グルタミン酸
ジ(フィトステリル−2−オクチルドデシル) 2.0
(9)硬化パーム油 2.0
(10)スクワラン(オリーブ由来) 1.0
(11)ベヘニルアルコール 0.75
(12)ミツロウ 1.0
(13)ホホバ油 1.0
(14)1,3−ブチレングリコール 10.0
(15)L−アルギニン(10質量%水溶液) 2.0
(16)タンパク質粗精製物 1.0
製法:(1)〜(6)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(7)〜(14)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。冷却後50℃にて(15)を、40℃にて(16)を加え、均一に混合する。
水性ジェル
(1)カルボキシビニルポリマー 0.5(質量%)
(2)精製水 100とする残部
(3)水酸化ナトリウム(10質量%水溶液) 0.5
(4)エタノール 10.0
(5)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(6)香料 0.1
(7)ポリオキシエチレン(60E.O.)硬化ヒマシ油 1.0
(8)タンパク質粗精製物 0.5
製法:(1)を(2)に加え、均一に攪拌した後、(3)を加える。均一に攪拌した後、(4)に予め溶解した(5)を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた(6)〜(7)を加え、最後に(8)を加えて、均一に攪拌混合する。
クレンジング料
(1)スクワラン 81.0(質量%)
(2)イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル 15.0
(3)精製水 100とする残部
(4)タンパク質粗精製物 1.0
製法:(1)と(2)を均一に溶解する。これに、(3)と(4)を順次加え、均一に混合する。
洗顔フォーム
(1)ステアリン酸 16.0(質量%)
(2)ミリスチン酸 16.0
(3)親油型モノステアリン酸グリセリン 2.0
(4)グリセリン 25.0
(5)水酸化ナトリウム 7.5
(6)ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン 1.0
(7)精製水 100とする残部
(8)タンパク質粗精製物 0.1
製法:(1)〜(4)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(5)〜(7)の水相成分を80℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却後40℃にて(8)を加え、均一に混合する。
メイクアップベースクリーム
(1)スクワラン 10.2(質量%)
(2)セタノール 2.0
(3)グリセリントリ−2−エチルヘキサン酸エステル 2.5
(4)親油型モノステアリン酸グリセリル 1.0
(5)プロピレングリコール 11.0
(6)ショ糖脂肪酸エステル 1.3
(7)精製水 100とする残部
(8)酸化チタン 1.0
(9)ベンガラ 0.1
(10)黄酸化鉄 0.4
(11)香料 0.1
(12)タンパク質粗精製物 1.0
製法:(1)〜(4)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(5)〜(7)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解し、これに(8)〜(10)の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後40℃にて(11)と(12)の成分を加え、均一に混合する。
乳液状ファンデーション
(1)メチルポリシロキサン 2.0(質量%)
(2)スクワラン 5.0
(3)ミリスチン酸オクチルドデシル 5.0
(4)セタノール 1.0
(5)ポリオキシエチレン(20E.O.)
ソルビタンモノステアリン酸エステル 1.3
(6)モノステアリン酸ソルビタン 0.7
(7)1,3−ブチレングリコール 8.0
(8)キサンタンガム 0.1
(9)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(10)精製水 100とする残部
(11)酸化チタン 9.0
(12)タルク 7.4
(13)ベンガラ 0.5
(14)黄酸化鉄 1.1
(15)黒酸化鉄 0.1
(16)香料 0.1
(17)タンパク質粗精製物 0.1
製法:(1)〜(6)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(7)〜(10)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解し、これに(11)〜(15)の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。冷却後40℃にて(16)と(17)の成分を順次加え、均一に混合する。
油中水型エモリエントクリーム
(1)流動パラフィン 34.0(質量%)
(2)マイクロクリスタリンワックス 2.0
(3)ワセリン 5.0
(4)ジグリセリンオレイン酸エステル 5.0
(5)塩化ナトリウム 1.3
(6)塩化カリウム 0.1
(7)プロピレングリコール 3.0
(8)1,3−ブチレングリコール 5.0
(9)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(10)精製水 100とする残部
(11)香料 0.1
(12)タンパク質粗精製物 1.0
製法:(5)と(6)を(11)の一部に溶解して50℃とし、50℃に加熱した(4)に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、70℃にて加熱溶解した(1)〜(3)に均一に分散する。これに(7)〜(9)を(10)の残部に70℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後40℃にて(11)と(12)を加え、均一に混合する。
パック
(1)精製水 100とする残部(質量%)
(2)ポリビニルアルコール 12.0
(3)エタノール 17.0
(4)グリセリン 9.0
(5)ポリエチレングリコール(平均分子量1000) 2.0
(6)タンパク質粗精製物 1.0
(7)香料 0.1
製法:(2)と(3)を混合し、80℃に加温した後、80℃に加温した(1)に溶解する。均一に溶解した後、(4)と(5)を加え、攪拌しながら冷却する。40℃にて(6)と(7)を加え、均一に混合する。
入浴剤
(1)香料 0.3(質量%)
(2)タンパク質粗精製物 3.0
(3)炭酸水素ナトリウム 50.0
(4)硫酸ナトリウム 46.7
製法:(1)〜(4)を均一に混合する。
ヘアーワックス
(1)ステアリン酸 3.0(質量%)
(2)マイクロクリスタリンワックス 2.0
(3)セチルアルコール 3.0
(4)高重合メチルポリシロキサン 2.0
(5)メチルポリシロキサン 5.0
(6)ポリ(オキシエチレン・オキシプロピレン)
メチルポリシロキサン共重合体 1.0
(7)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(8)1,3−ブチレングリコール 7.5
(9)アルギニン 0.7
(10)精製水 100とする残部
(11)タンパク質粗精製物 1.0
(12)香料 0.1
製法:(1)〜(6)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解後する。一方、(7)〜(10)の水相成分を75℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後40℃にて(11)と(12)の成分を加え、均一に混合する。
ヘアートニック
(1)エタノール 50.0(質量%)
(2)精製水 100とする残部
(3)抽出物1 1.0
(4)香料 0.1
製法:(1)〜(4)の成分を混合、均一化する。
Claims (5)
- サケ目(Salmoniformes)サケ科(Salmonidae)イワナ属(Salvelinus)の魚類から得られる不凍タンパク質を含有することを特徴とする、保湿剤。
- サケ目(Salmoniformes)サケ科(Salmonidae)イワナ属(Salvelinus)の魚類から得られる不凍タンパク質を含有することを特徴とする、美白剤。
- サケ目(Salmoniformes)サケ科(Salmonidae)イワナ属(Salvelinus)の魚類から得られる不凍タンパク質を含有することを特徴とする、抗炎症剤。
- サケ目(Salmoniformes)サケ科(Salmonidae)イワナ属(Salvelinus)の魚類から得られる不凍タンパク質を含有することを特徴とする、抗老化剤。
- サケ目(Salmoniformes)サケ科(Salmonidae)イワナ属(Salvelinus)の魚類から得られる不凍タンパク質を含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
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