JP2011006353A - セリシン由来のポリペプチドおよび角層剥離酵素保護剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明によるセリシン由来のポリペプチドは、アミノ酸組成として塩基性アミノ酸を10〜20モル%含み、重量平均分子量が1,000〜70,000であり、かつ、その0.5重量%水溶液の600nmにおける吸光度が、pH2.5〜8.0の範囲において0.2以下であるという性質を有するものである。本発明の角層剥離酵素保護剤は、本発明によるポリペプチドを有効成分とする。
【選択図】なし
Description
本発明はこれらの知見に基づくものである。
(1) アミノ酸組成として塩基性アミノ酸を10〜20モル%含み、
(2) 重量平均分子量が1,000〜70,000であり、かつ
(3) 0.5重量%水溶液の600nmにおける吸光度が、pH2.5〜8.0の範囲において、0.2以下である。
繭糸から水を用いてセリシンを抽出し、
得られた抽出液を陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収することにより得られるものである。
繭糸から水を用いて抽出し、重量平均分子量が約1,000〜70,000のセリシンを含む抽出液を得、
得られた抽出液を、そのpHが5〜8の中性付近とした後に、弱塩基性の陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収することにより得られるものである。
繭糸から水を用いてセリシンを抽出し、
得られた抽出液を陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収する
ことを含んでなる、製造方法が提供される。
繭糸から水を用いて抽出し、重量平均分子量が約1,000〜70,000のセリシンを含む抽出液を得、
pHを5〜8とした抽出液を、弱塩基性の陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収する
ことを含んでなる。
本発明によるセリシン由来のポリペプチドは、前記したように、アミノ酸組成として塩基性アミノ酸を10〜20モル%含み、重量平均分子量が1,000〜70,000であり、かつ、その0.5重量%水溶液の600nmにおける吸光度が、pH2.5〜8.0の範囲において0.2以下であるという性質を有するものである。
セリシンは、そもそも、他のタンパク質と比較して、セリンに富む(約30モル%)という特徴的なアミノ酸組成を有するため、水素結合を介してプロテアーゼと相互作用し、酵素の立体構造を安定化させる効果があると考えられる。さらに、抽出セリシンから選択的に分画した本発明によるポリペプチドは、塩基性アミノ酸、すなわち、ヒスチジンやアルギニン、リジンを高い割合で含むため、プラス電荷による電気的な分子間相互作用が引き起こされ、プロテアーゼの構造安定化に寄与すると考えられる。なお、これら作用メカニズムに関する説明は、一つの理論的考察であって、本発明を限定するものではない。
なおポリペプチドにおけるアミノ酸組成は、例えば、高速液体クロマトグラフアミノ酸分析システムLC−10(株式会社島津製作所製)を用い、ポストカラム誘導体化−蛍光検出法にてアミノ酸を測定することができる。
なおポリペプチドの重量平均分子量は、例えば、高速液体クロマトグラフCLASS−LC10(株式会社島津製作所製)を用いたGPC分析によって測定し求めることができる。
本発明によるポリペプチドは、例えば、次のようにして調製することができる。
はじめに、繭糸からセリシンを抽出する。
非結晶性タンパク質であるセリシンは、親水性溶媒、好ましくは水を用いて繭糸から抽出することができる。例えば、蚕繭や生糸など、繭糸を含んでなる原料を熱水に浸漬して処理することにより、原料中のセリシンを加水分解させて水中に溶出させることができる。このとき、必要に応じて、酸、アルカリまたは酵素を併用してもよい。
分画方法は特に限定されるものでなく、例えば、塩析、有機溶媒沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、逆浸透、限外濾過、超遠心分離、電気透析などを挙げることができる。これらは2種以上組み合わせて用いてもよい。なかでも、本発明によるポリペプチドを、収率よく、かつ簡単に得ることができることから、イオン交換クロマトグラフィーによる分画が好ましい。
繭糸から水を用いてセリシンを抽出し、
得られた抽出液を陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収することを含んでなる、製造方法が提供される。好ましくは、この製造方法は、
繭糸から水を用いて抽出し、重量平均分子量が約1,000〜70,000のセリシンを含む抽出液を得、
pHを5〜8とした抽出液を、弱塩基性の陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収することを含んでなる。
本発明によるポリペプチドは、後述する実施例の評価試験に示されるように、実際に、皮膚のターンオーバーの調節に関与するプロテアーゼを、乾燥から保護し活性低下を防止することができ、また、乾燥により活性が低下したプロテアーゼに対しては本来の活性を回復させることができる。
(1) セリシン(比較例)
家蚕の切り繭50gを水洗した後、1kgの水に浸漬し、溶液のpHが9.5になるように水酸化ナトリウムを添加した。この条件にて繭を2時間煮沸し、セリシンの抽出および加水分解を行った。
得られた抽出液に、塩酸を添加して中和した。次いで、抽出液を平均孔径0.2μmのフィルターを用いて濾過し、不溶物を除去した。さらに、抽出液をゲル濾過クロマトグラフィーを原理とする脱塩カラムPD−10(GE Healthcare社製)を用いて脱塩し、セリシン水溶液を得た。このセリシン水溶液を凍結乾燥して、セリシンの粉末10gを得た。
前記セリシンの粉末0.3gを水30gに溶解させて、セリシン水溶液(セリシンの濃度:1重量%)を調製した。このセリシン水溶液を、弱塩基性陰イオン交換樹脂micro prep DEAE support(Biorad社製)3mlに添加し、転倒混和して、セリシンに含まれる目的外のポリペプチドを陰イオン交換樹脂に吸着させた。
回収した膜透過画分を凍結乾燥してポリペプチド(ポリペプチドA)の粉末0.17gを得た。
前記セリシンの粉末1gを水20gに溶解させて、セリシン水溶液(セリシンの濃度:5重量%)を調製した。このセリシン水溶液を、弱塩基性陰イオン交換樹脂micro prep DEAE support(Biorad社製)10mlに添加し、転倒混和して、セリシンに含まれる本発明によるポリペプチド以外のポリペプチド(ポリペプチドB)を陰イオン交換樹脂に吸着させた。
回収した膜透過画分を凍結乾燥してポリペプチドBの粉末0.28gを得た。
(1) プロテアーゼ活性低下防止効果
前記で得られたセリシン、ポリペプチドAおよびポリペプチドBを、100mM Tris−HCl緩衝液(pH7.0)に、濃度が0.5重量%となるようにそれぞれ溶解させて、ポリペプチド溶液を調製した。各ポリペプチド溶液に、最終濃度が100μg/mlとなるようにトリプシン(シグマ社製)をそれぞれ添加した。同時に、前記緩衝液に前記濃度のトリプシンを添加した酵素溶液(ポリペプチドなし)を調製した。
比較対照として、前記酵素溶液(ポリペプチドなし)10μlに、前記緩衝液を180μl添加したものを調製した(乾燥処理なし)。
反応終了後、遊離したp−ニトロアニリドの発色(吸光波長420nm)をマイクロプレートリーダーIWAKI ASAHI TECHNO GLASS EZS-ABS(IWAKI社製)を用いて測定した。各サンプルについて、比較対照の活性値を100とし、乾燥処理後のプロテアーゼの活性値の比率を算出した。この値が高いほど、プロテアーゼの活性低下防止効果に優れていることを意味する。
結果から明らかなように、本発明によるポリペプチドAは、分画前のセリシンや調製過程で除去されるポリペプチドBと比較して、プロテアーゼの活性値が顕著に高く、プロテアーゼ活性低下防止効果に優れることが確認された。
100mM Tris−HCl緩衝液(pH7.0)に、最終濃度が100μg/mlとなるようにトリプシン(シグマ社製)を添加して、酵素溶液を調製した。
この酵素溶液を96wellマイクロプレートに10μlずつ分注し、40℃の恒温器内に2時間静置して乾燥処理した。次いで、前記セリシン、ポリペプチドAおよびポリペプチドBを、前記緩衝液に濃度が0.5重量%となるようにそれぞれ溶解させて調製した溶液、ならびに前記緩衝液(ポリペプチドなし)を、190μlずつ添加し、酵素を再溶解させた。
比較対照として、前記酵素溶液10μlに、前記緩衝液を180μl添加したものを調製した(乾燥処理なし)。
反応終了後、遊離したp−ニトロアニリドの発色(吸光波長420nm)をマイクロプレートリーダーIWAKI ASAHI TECHNO GLASS EZS-ABS(IWAKI社製)を用いて測定した。各サンプルについて、比較対照の活性値を100とし、乾燥処理後のプロテアーゼの活性値の比率を算出した。この値が高いほど、プロテアーゼの活性回復効果に優れていることを意味する。
結果から明らかなように、本発明によるポリペプチドAは、分画前のセリシンや調製過程で除去されるポリペプチドBと比較して、プロテアーゼの活性値が顕著に高く、プロテアーゼ活性回復効果に優れることが確認された。
前記で得られたセリシンおよびポリペプチドAを用いて、表2に示す組成の化粧水を調製した。同時にポリペプチドを添加しない化粧水を調製した。
これらを用いて、乾燥による肌荒れに対する効果の検証を行った。
結果から明らかなように、本発明によるポリペプチドAを配合した化粧水は、分画前のセリシンを配合した化粧水と比較して、有意に肌荒れ改善効果に優れていることが確認された。
Claims (9)
- 下記性質を有する、セリシン由来のポリペプチド:
(1) アミノ酸組成として塩基性アミノ酸を10〜20モル%含み、
(2) 重量平均分子量が1,000〜70,000であり、かつ
(3) 0.5重量%水溶液の600nmにおける吸光度が、pH2.5〜8.0の範囲において、0.2以下である。 - 繭糸から水を用いてセリシンを抽出し、
得られた抽出液を陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収することにより得られる、請求項1に記載のポリペプチド。 - 繭糸から水を用いて抽出し、重量平均分子量が約1,000〜70,000のセリシンを含む抽出液を得、
得られた抽出液を、そのpHが5〜8の中性付近とした後に、弱塩基性の陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収することにより得られる、請求項1または2に記載のポリペプチド。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分とする、角層剥離酵素保護剤。
- 皮膚のターンオーバーの調節に関与するプロテアーゼの、皮膚における乾燥による活性低下を防止するか、または、前記プロテアーゼの低下した活性を回復させるために用いられる、請求項4に記載の保護剤。
- 請求項4または5に記載の角層剥離酵素保護剤を含んでなる、皮膚外用剤組成物。
- 乾燥による肌荒れを予防改善するために用いられる、請求項6に記載の皮膚外用剤組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチドの製造方法であって、
繭糸から水を用いてセリシンを抽出し、
得られた抽出液を陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収する
ことを含んでなる、製造方法。 - 繭糸から水を用いて抽出し、重量平均分子量が約1,000〜70,000のセリシンを含む抽出液を得、
pHを5〜8とした抽出液を、弱塩基性の陰イオン交換樹脂と接触させ、陰イオン交換樹脂に吸着しなかった画分を回収する
ことを含んでなる、請求項8に記載の製造方法。
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