JP2010534060A - 成長ホルモン融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
サイトカインと呼ばれる一群の成長因子は、いくつかの多様な細胞機能に関与している。これらの機能には、免疫系の調節、エネルギー代謝の調節ならびに成長および発生の制御が挙げられる。サイトカインは、標的細胞上の細胞表面で発現される受容体を介してその効果を媒介する。サイトカイン受容体は、3つの別々の下位グループに分類することができる。1型(成長ホルモンファミリー)受容体は、その細胞外ドメインのアミノ末端部分にある4つの保存されたシステイン残基およびC末端部分における保存されたTrp−Ser−Xaa−Trp−Serモチーフの存在によって特徴づけられる。繰り返しCysモチーフは、2型(インターフェロンファミリー)およびIII型(腫瘍壊死因子ファミリー)にも存在している。
成長ホルモンのようなサイトカインホルモンは、血漿半減期が短く、頻繁な投与が必要である。例えば、成長ホルモン(GH)交換は連日注射を含む。他のサイトカインと共通して、細胞外ドメインGH受容体は、結合タンパク質として循環し、GHの生物学的半減期を自然に延長する。
i)配列番号1に示される核酸配列、
ii)配列番号2に示される核酸配列、
iii)配列番号3に示される核酸配列、
iv)配列番号4に示される核酸配列、または
v)厳密なハイブリダイゼーション条件下で配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4にハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子から選択され、成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。
超高厳密性(少なくとも90%の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする)
ハイブリダイゼーション:65℃で16時間、5×SSC
2度洗浄:それぞれ室温(RT)で15分間、2×SSC
2度洗浄:それぞれ65℃で20分間、0.5×SSC
高厳密性(少なくとも80%の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする)
ハイブリダイゼーション:65℃〜70℃で16〜20時間、5×〜6×SSC
2度洗浄:それぞれRTで5〜20分間、2×SSC
2度洗浄:それぞれ55℃〜70℃で30分間、1×SSC
低厳密性(少なくとも50%の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする)
ハイブリダイゼーション:RT〜55℃で16〜20時間、6×SSC
少なくとも2度洗浄:それぞれRT〜55℃で20〜30分間、2×〜3×SSC
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸分子は配列番号2に示される核酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸分子は配列番号3に示される核酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸分子は配列番号4に示される核酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の態様によれば、本発明に従った核酸によってコードされるポリペプチドが提供される。
本発明の追加の態様によれば、
i)配列番号5に示されるアミノ酸配列、
ii)配列番号6に示されるアミノ酸配列、
iii)配列番号7に示されるアミノ酸配列、
iv)配列番号8に示されるアミノ酸配列、
v)配列番号9に示されるアミノ酸配列、
vi)配列番号10に示されるアミノ酸配列、
vii)配列番号11に示されるアミノ酸配列、
viii)配列番号12に示されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有するポリペプチドが提供される。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号5に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号9に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号11に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の追加の態様によれば、配列番号5を含むまたはそれからなる2つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号6を含むまたはそれからなる2つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号7を含むまたはそれからなる2つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号8を含むまたはそれからなる2つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号10を含むまたはそれからなる2つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号11を含むまたはそれからなる2つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号12を含むまたはそれからなる2つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、前記ベクターは、本発明に従った核酸分子を発現するように適合させた発現ベクターである。
本発明に従った核酸(複数可)を含むベクターは、特に前記ベクターを使用して、核酸を細胞に導入してゲノム中に組み換え、安定なトランスフェクションを行う場合には、プロモーターまたは他の調節配列を含む必要はない。好ましくは、ベクター中の核酸は、宿主細胞における転写のために適切なプロモーターまたは他の調節エレメントに作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主で機能する二機能性発現ベクターでもよい。「プロモーター」とは、転写開始部位の上流にあって転写に必要な調節領域すべてを含有するヌクレオチド配列を意味する。適切なプロモーターには、真核または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導性、発生的または他のプロモーターが挙げられる。「作動可能に連結された」とは、転写がプロモーターから開始されるように適切に位置づけられ方向づけられた同一核酸分子の一部として結合されていることを意味する。プロモーターに作動可能に連結されたDNAは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。
好ましい実施形態では、プロモーターは構成的、誘導性のまたは調節可能なプロモーターである。
好ましくは、前記細胞は真核細胞である。あるいは、前記細胞は原核細胞である。
本発明の好ましい実施形態では、前記細胞は、真菌細胞(例えば、ピキア(Pichia)菌種、酵母(Saccharomyces)菌種、パンカビ(Neurospora)菌種)、昆虫細胞(例えば、スポドプテラ(Spodoptera)菌種)、哺乳動物細胞(例えば、COS細胞、CHO細胞)、植物細胞からなるグループから選択される。
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬品組成物は、追加の治療薬と組み合わされる。
本発明の医薬品組成物は、投与される際には、薬学的に許容可能な調製物で投与される。そのような調製物は、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、および任意選択で他の治療薬を常に含有していてもよい。
本発明の医薬品組成物は、有効量で投与される。「有効量」とは、単独で、または追加の用量もしくは相乗薬と一緒に、目的の応答を生み出す量の医薬品/組成物である。これには、疾病の進行を一時的に遅くすることだけを含んでいてもよいが、さらに好ましくは、これは疾病の進行を永久に停止することを含む。これは、常法によりモニターすることができる、または診断法に従ってモニターすることができる。
医薬品組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸を含む適切な緩衝剤を含有していてもよい。
医薬品組成物は、任意選択で、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの適切な保存剤を含有していてもよい。
経口投与に適した組成物は、それぞれが所定量の活性化合物を含有する、カプセル、錠剤、トローチ剤などの個別の単位として提示してもよい。他の組成物には、シロップ、エリキシル剤または乳剤などの水性液体または非水性液体中の懸濁剤が挙げられる。
本発明の好ましい方法では、前記ポリペプチドは静脈内に投与される。
本発明の別の好ましい方法では、前記ポリペプチドは皮下に投与される。
本発明の追加の好ましい方法では、前記ポリペプチドは2日間隔を置いて投与され、好ましくは、前記ポリペプチドは1週間間隔で、2週間間隔でまたは1月間隔で投与される。
本発明の好ましい方法では、前記成長ホルモン欠損症は成人成長ホルモン欠損症である。
成長ホルモン欠損症の治療には、例えば、ターナー症候群、プラダーウィリー症候群、子宮内発育遅延、突発性低身長、腎不全、例えば、化学療法治療中およびエイズの治療における異化状態の治療が挙げられる。
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、単数形は、文脈が他の方法で要求しなければ、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されているところでは、本明細書は、文脈が他の方法で要求しなければ、単一性だけではなく複数存在することも企図していると理解されるべきである。
本発明の実施形態は、これから、実施例のみにより、以下の図を参照して本発明の実施形態を説明する。
動物およびヒト試料の使用。ヒト試料の使用は、地元の倫理委員会により承認され、患者がインフォームドコンセントを与えた。実験はすべて、実験または他の科学的目的のために使用される動物保護に関するフランスの法律(1986年11月24日の議会指令N°86/609/EEC)に従って行われた。
材料。材料は、他の方法で述べられていなければ、すべてSigma(Poole、UK)から購入した。組換えGHはPfizerから購入し、結合アッセイにおいて使用される組換え大腸菌(E.coli)由来ヒトGH結合タンパク質はDSL(DSL Research Reagents、Oxfordshire、UK)より贈与され、ヨウ素化GHはNovoNordisk(NovoNordisk Park、Denmark)より贈与された。精製および特徴づけに使用されたGHおよびGHR mAbは、Skriver博士(NovoNordisk Park、Denmark)から贈与されたmAbs B07bおよびB24aならびにmAb263(AbD Serotec、Kidlington、Oxford、UK)以外は自家材料(CS)であった。
転写バイオアッセイ。これらは、ヒトGHRを安定的に発現しているヒト293細胞において前述の通りに実施された16。
被検物質1B7v2および1B7v3は、11.9mMリン酸ナトリウムとカリウム、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、0.01%ポリソルベート80を含有する溶液中で製剤し、溶液のpHは7.4に調整した。
研究デザイン
動物は4つの治療グループ(1媒体、1つの1B7v2試験グループ、1つの1B7v3試験グループ)に割り当て、媒体グループには3匹のオス、2つの治療グループにはグループあたり4匹のオスを含む。服用レベルおよび投与される容量は、下の表に概要を述べた通りであった。
臨床評価項目および測定
1B7v2および1B7v3の血清濃度は有効なELISA法を使用して決定された。それぞれのタンパク質の薬物動態プロファイルは、WinNonlin Pro(v4.0.1)ソフトウェアを使用して、血清中のそれぞれのタンパク質濃度対時間をプロットすることにより決定した。
統計。2つのグループは、その分散が正常に分布している場合は、スチューデント検定と比較し、正常に分布していない場合は、スチューデントサタースウェイト検定により比較した。分布はF検定で試験した。一元配置分散分析(One−way ANOVA)を使用して、3つ以上のグループの平均値を比較し、有意性のレベルがp<0.05の場合には、個々の比較はダネット検定(Dunnett’s test)で実施した。統計検定はすべて、5%レベルの有意性で両側性であり、欠測値のためのインピュテーションは行わなかった。
可動性(Gly4Ser)4リンカーを介してGHR細胞外ドメイン(exGHR1〜238)のA&Bドメインに連結されたヒトGHをコードする組換え遺伝子を作製した(図1c)。このLR融合体はCHO細胞で発現され、GHアフィニティーメディアに対するmAbを使用して、>95%純度まで精製された(図2a)。LR融合体は16の立体構造的感受性mAbを使用してELISAによりスクリーニングされた。これらのmAbはすべて、ヒト血清由来GHBPに対する親和性に匹敵する親和性でLR融合体に結合した。クーマシー染色およびSDS−PAGEゲルのウェスタンブロッティングにより、LR融合タンパク質が、2つのバンド間でほぼ5kDa差のあるほぼ75kDaのダブレットとして分離することが明らかになった。未変性PAGEゲル分析(図2b)は、凝集の証拠を何も示さなかった。LR融合体は、2つの別々の形として現れた。これらの別々のタンパク質形、すなわちファースト(F)とスロー(S)を未変性PAGEゲルから切り出し、次に還元状態下でSDS−PAGEにより再分析した。未変性PAGEからのF形とS形の両方が75kDaダブレットからなっていた(図2c)。溶液中に2種類の形のLR融合体が存在する証拠は、分析ゲルろ過により裏付けられた(図2d)。これらの結果は、溶液中に二量体として存在するLR融合体と一致している。これは、単量体の大きさが75kDaで確認された分析超遠心分離により確認された。
LR融合体のインビトロ生物活性は、GH特異的ルシフェラーゼレポーターアッセイ16を使用して試験した。LR融合体は、この静的アッセイ法ではGHと比べた生物活性のほぼ10%を有していたが、LR融合体は、GHよりも高濃度ではあるが最大応答を刺激することができた(図2e)。LR融合体の薬物動態プロファイルは、単回皮下(sc)または静脈内(iv)注射後、正常ラットで調べた(図3)。実証されたLR融合体は、投与経路に関係なくクリアランスを遅らせ、sc投与後の吸収を遅らせた。ivボーラス後、LR融合体の終末期半減期は21±2時間であり、クリアランスは3.3±0.9ml・時間−1・kg−1であった。LR融合体のクリアランスはGHの300分の1の速さであった2、12。単回sc投与後、LR融合体は、GHと比べてピークが遅れていた(30対1時間)。LR融合体は、それでも8日目に検出可能であり、GHは6時間目に検出不可能であった。LR融合体の並はずれた薬物動態が大きさと関係しているのかどうかを調べた。同一リンカーを有する2つの変異LR融合分子、すなわち、1つはBドメインexGHRのみへのGHのLR融合体(55kDa)およびもう1つはexGHRに連結した直列(GHに連結したGH)(100kDa)を試験した。55kDaと100kDaタンパク質の両方が、最初の75kDaLR融合体と比べると、バイオアッセイにおいて増加したアゴニスト活性を示したが、両方で循環半減期はiv投与後は<4時間であった(使用された試料採取プロトコルがもっと長い半減期を予想していたために、正確な半減期決定は可能ではなかった)。結果によれば、最初の75kDaLR融合体の並はずれた薬物動態は分子量と関係しているだけではなかったことが確認されている。
生物活性を試験するために、LR融合体とGHを下垂体摘出(GH欠損)ラットに投与した。GHの連日投与により、10日にわたる連続成長が誘導された。次に、LR融合体を、隔日sc注射、または10日にわたる2回注射、または単回注射のいずれかでGHと比較した。すべての実験で、等モル用量のGHとLR融合体を使用し、同一総量を10日の期間にわたり与え、220μg/kg/日で、最大成長応答を得るために以前使用された用量に類似する10日にわたりほぼ10nモルであった12。LR融合体は、同一注射プロトコル下でGHよりも大きく、連日GH注射後に見られる増加に類似する体重増加を促進した(図4および表)。GHは、注射後24時間で体重増加を促進するだけと思われた。これとは対照的に、LR融合体は、単回注射として与えられるときでも、10日にわたり連続体重増加をもたらした。類似の成長パターンは、大腿骨、脛骨、胸腺、肝臓および腎臓で見られた(表)。すべての動物からの10日終末期出血は、GH依存バイオマーカー、インスリン様成長因子−1(IGF−1)、ならびにGHおよびLR融合体レベルについて分析された(表)。IGF−1レベルは、単回注射後でもLR融合体投与後有意に上昇し、GHの連日注射後に見られるレベルよりも有意に大きかった。GHのレベルは全注射計画後に終末期出血では検出不可能であり、LR融合体レベルは単回注射の10日後検出可能であった。
LR融合体の設計は、GHRの既知の結晶構造に基づいていた17。4繰り返しを有する可動性Gly4Serリンカー(80Åの予想される長さ)を使用した。この長いリンカーは、GH部分がそれでも細胞表面GHRと相互作用することができるように、GHとGHR間の比較的可動性のテザーとして選んだ(図1e)。類似のGly4Serリンカーは、安定性と免疫原性の欠如のせいで、組換え単鎖Fv抗体産生において使用されたことがあった18。
LR融合体はGHと比べるとインビボではより強力であったが、インビトロでは生物活性が10分の1であった。この矛盾は、LR融合体の二量体化のせいだと考えられる。静的インビトロバイオアッセイでは、ダイマーは、天然GH/GHBP複合体に見られるように生物学的に不活性だと考えられる21、21。しかし、インビボでは、二量体は、生物学的に活性な単量体と平衡状態で不活性ホルモンの貯蔵場所を提供する。
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- i)配列番号1に示される核酸配列、
ii)配列番号2に示される核酸配列、
iii)配列番号3に示される核酸配列、
iv)配列番号4に示される核酸配列、または
v)厳密なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4にハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子
から選択され、成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。 - 配列番号1に示される核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 配列番号2に示される核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 配列番号3に示される核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 配列番号4に示される核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 請求項1に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
- i)配列番号5に示されるアミノ酸配列、
ii)配列番号6に示されるアミノ酸配列、
iii)配列番号7に示されるアミノ酸配列、
iv)配列番号8に示されるアミノ酸配列、
v)配列番号9に示されるアミノ酸配列、
vi)配列番号10に示されるアミノ酸配列、
vii)配列番号11に示されるアミノ酸配列、
viii)配列番号12に示されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有するポリペプチド。 - 配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号11に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 配列番号5を含む2つのポリペプチドを含むホモ二量体。
- 配列番号6を含む2つのポリペプチドを含むホモ二量体。
- 配列番号7を含む2つのポリペプチドを含むホモ二量体。
- 配列番号8を含む2つのポリペプチドを含むホモ二量体。
- 配列番号9を含む2つのポリペプチドを含むホモ二量体。
- 配列番号10を含む2つのポリペプチドを含むホモ二量体。
- 配列番号11を含む2つのポリペプチドを含むホモ二量体。
- 配列番号12を含む2つのポリペプチドを含むホモ二量体。
- 請求項1に記載の核酸分子を含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項24に記載のベクター。
- 請求項25に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞。
- 真核細胞である、請求項26に記載の細胞。
- 原核細胞である、請求項26に記載の細胞。
- 賦形剤または担体を含む、請求項7に記載のポリペプチドを含む医薬品組成物。
- 請求項7に記載の有効量の少なくとも1つのポリペプチドを投与することを含む、成長ホルモン欠損症を患っているヒト対象を治療する方法。
- 前記ポリペプチドが静脈内に投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが皮下に投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが2日の間隔で投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが1週間間隔で投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが2週間間隔で投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが1カ月間隔で投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記成長ホルモン欠損症が小児期成長ホルモン欠損症である、請求項30に記載の方法。
- 前記成長ホルモン欠損症が成人成長ホルモン欠損症である、請求項30に記載の方法。
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