JP2010532337A - 血漿からの溶液中のadamts13の量を減少させるためのクロマトグラフィ担体の使用 - Google Patents
血漿からの溶液中のadamts13の量を減少させるためのクロマトグラフィ担体の使用 Download PDFInfo
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Abstract
DEAE基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂から成るイオン交換クロマトグラフィ担体と、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液との、ヒトのフォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中のADAMTS13の量を減らすための使用。
Description
本発明はタンパクの精製方法に関するものである。
本発明は特に、フォンビルブラント因子(facteur von Willebrand、VWF)の溶液中に存在するADAMTS13の量を減少させる方法と、サンプル中に存在するADAMTS13の量を減らすためのクロマトグラフィ担体および緩衝液の使用とに関するものである。
本発明は特に、フォンビルブラント因子(facteur von Willebrand、VWF)の溶液中に存在するADAMTS13の量を減少させる方法と、サンプル中に存在するADAMTS13の量を減らすためのクロマトグラフィ担体および緩衝液の使用とに関するものである。
フォンビルブラント因子(VWF)は血漿中を循環する最も大きい分子であるということは知られている。VWFはジスルフィド架橋で結合された複数のマルティマー(multimeres)から成り、その基礎要素は約250キロダルトン(KDa)の分子量を有する。血漿中で最も小さいVWFの形は500KDaのダイマーであり、最も大きい形は上記ダイマーのマルティマーで、その分子量は2000万ダルトンに達する。マルティマーのサブユニットの集合は細胞生産に特異的である。VWFは巨核球中および血管内皮細胞中で合成され、重合される。
この因子は2つの異なる機能によって止血に大きな役割を演ずる。すなわち、接着タンパクとして血小板を血管内皮下層に接着、凝集させ(従って、損傷した血管中で生じる止血プロセスの主役となり)、また、ファクターVIII(FVIII)の安定化と循環血液の運搬を保証する。
VWF先天的な欠失(量的な欠失)またはこのファクターの構造的な異形(質的な欠失)でフォンウィルブラント病気となり、皮膚-粘膜の出血となって現れる。この病気は極めて異質な臨床的発現をし、外科手術時に非常に問題となる。フォンウィルブラント病気の治療は主止血(出血時)および凝集(活性化部分トロンボプラスチン時間およびFVIII、FVIII:C)の凝固活性)の異常を正す点にあることは論争の余地がない。
この病気はVWF-エンリッチなヒト血漿誘導体(例えば、血漿を低温沈殿画分、VWFの含有量が充分なFVlIl濃縮物(FVIII/VWF濃縮物)またはVWF濃縮物(無FVIII)を使用した置換治療で治療される。
フォンウィルブラント病気はタンパク不在か質的異常かによってFVIII欠失が付随する場合とない場合がある。一般に、これらの両方の凝固因子の欠失に苦しむ患者はFVIII/VWF濃縮物で治療される。反対に、VWF-欠損患者が一般にFVIIIを発現し、FVIIIのないVWF濃縮物を使用するのが好ましい。この患者の場合、上記濃縮物を使用することでVWF-欠損のみが補正し、FVIII過剰を避けることができる。FVIII過剰になると重大な合併症、例えば静脈血栓症や肺塞栓症が生じることがある。
しかし、VWFがADAMTS13のようなタンパクタンパク分解酵素によって変性されると、VWF濃縮物は溶液中で一般に非常に不安定になる。
ADAMTS13は天然ではヒトの血漿中にできるメタロプロテアーゼファミリのプロテアーゼである。その機能はVWFのハイパーアクティヴな長いマルティマーをより小さくより活性の低いマルティマーに転換することにある。ADAMTS13はインビボおよびインビトロ例えば、VWF濃縮物またはFVIII/VWF濃縮物のような血漿由来のVWF-含有溶液中でVWFを変性する。これらの血漿誘導体は一般に凍結乾燥粉末にして長年保存できるが、ADAMTS13が存在するため凍結乾燥粉末の溶解時にVWFの安定度は変化する。このVWFの安定性の問題のためにいくらかの治療処置、例えば数日間の連続または不連続な注射処置注入液処理はできない。この治療はVWFの定数循環レベルを維持でき、従って不連続注射投与を行なった時に治療ウインドウ外のレベルになることを防ぐことができる。
本発明者は、VWF-含有血漿由来の組成物中に存在するADAMTS13タンパクの量を減らして、長時間にわたってその安定性を改善するための効率的な手段を開発した。
本発明の対象は、DEAE基を有する大きな細孔(pore)を有するビニル重合体タイプの樹脂から成るイオン交換クロマトグラフィ担体と、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液との、ヒトのフォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中のADAMTS13の量を減らすための使用にある。
本発明の他の対象は、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液中で、DEAE基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂上でイオン交換クロマトグラフ分離を行なう段階を有する、ヒトのVWF-含有血漿由来の溶液中のADAMTS13量を減らすための方法。
本発明の他の対象は、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液中で、DEAE基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂上でイオン交換クロマトグラフ分離を行なう段階を有する、ヒトのVWF-含有血漿由来の溶液中のADAMTS13量を減らすための方法。
驚くことに、タイプのイオン交換クロマトグラフィ担体を特定の条件下で使用することでVWFを豊富に含む組成物中に存在するADAMTS13タンパク分子を除去、または、ADAMTS13タンパクの量を効率的に減らすことができるということを本発明者は発見した。
従って、本発明はDEAE(ジエチル・アミノエチル)基を有する大きな細孔(pore)を有するビニル重合体タイプの樹脂から成るイオン交換クロマトグラフィ担体と、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液との、ヒトのフォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中のADAMTS13の量を減らすための使用に関するものである。
本発明はさらに、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液中で、DEAE基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂上でイオン交換クロマトグラフ分離を行なう段階を有する、ヒトのVWF-含有血漿由来の溶液中のADAMTS13量を減らすための方法に関するものである。
イオン交換クロマトグラフィ担体は0.01Mのクエン酸トリナトリウム、0.11Mの塩化ナトリウム、0.001Mの塩化カルシウム、0.12Mのグリシンおよび0.016Mのリシンから成る平衡化緩衝液でpH7±0.1に平衡させたDEAE-フラクトゲル(Fractogel、登録商標)TSK650の樹脂(DEAE-トーヨーパール、Toyopearl 650ともよばれる)であるのが有利である。
DEAE-フラクトゲル(Fractogel、登録商標)TSK650は合成親水性ゲルである。この担体はDEAE基、例えば−O−CH2−CH2N+(C2H5)2HClがグラフトしたオリゴエチレングリコール、グリシジンメタクリレートおよびペンタエリスリトールジメタクリレートのコポリマーで、わずかにアルカリ性のアニオン交換樹脂である。このDEAE-フラクトゲル(Fractogel、登録商標)TSK650は2つの粒度(再水和後):タイプS(0.025〜0.050mm)およびタイプM(0.045〜0.090mm)で入手でき、本発明ではこれら両方のタイプを使用できる。
本発明の血漿由来の溶液には血漿誘導体、例えば低温沈殿画分(非精製画分)と精製された凍結沈降誘導体が含まれる。本発明は特にVWFを含む血漿由来の溶液に関するものである。
本発明の好ましい実施例では、血漿の予備精製済み低温沈殿画分を必要に応じてウィルス失活処理してから平衡化したイオン交換クロマトカラムに導入する。次いで、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0.14〜0.15Mまで上げることで保持された画分を溶出される。この階段で初期の血漿サンプル中に存在していたADAMTS13量に対してADAMTS13量を500倍以上に減らすことができる([表1]参照)。
本発明の一つの実施例では、上記緩衝液を上記のように平衡化した条件下で、2回の連続したイオン交換クロマトグラフ階段を実行することで、フォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中に存在するADAMTS13の量を減少させる。
この実施例では第1カラムの使用後に得られる溶出画分を第1カラムと同一の第2クロマトカラムに第1カラムと同じ条件下で再び導入できるが、濾過液を取出した後に平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、クロマトグラフィ担体上に吸着したタンパクを緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0.15〜0.17Mに上げて溶出させる。この追加のクロマトグラフで最初の血漿サンプル中に存在する最初のADAMTS13量と比べてADAMST13の量を2000倍以上減らすことができる([表1]参照)。
本発明では最初の血漿サンプル中に存在するADAMTS13の量と比較したADAMTS13量の減少度は200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、好ましくは700倍以上、800倍以上、900倍以上、1000倍以上、1500倍以上、2000倍以上、2500倍以上になる。
本発明の関連実施例では、VWFが豊富な組成物を成形するために、イオン交換クロマトグラフィ担体からまたは第2の階段で使用したイオン交換クロマトグラフィ担体から溶出した画分をイオン交換クロマトグラフィ段階を実行するのに使用したのと同様な平衡化した平衡化緩衝液の存在下でのゼラチン‐セファロース担体のアフィニティークロマトグラフィ階段に送ることができる。このゼラチン‐セファロースクロマトグラフィ担体はフィブロネクチン分子を含む残留物を保持することができる。この後のクロマトグラフィ階段の実行にはゼラチンとゲル担体タイプとを組合せたものを選択することは重要ではない。アフィニティークロマトグラフィの担体はゼラチン-ウルトゲル(Ultrogel、登録商標)、ゼラチン‐スフェロデックス(Spherodex、登録商標)およびゼラチン‐フラクトゲル(Fractogel、登録商標)から選択できる。ゼラチン‐スフェロデックス(Spherodex、登録商標)担体を使用するのが好ましい。
インビトロ試験では、VWF-含有濃縮物を溶解した時に、得られたVWF-含有濃縮物の安定性が確認された(実施例3)。
本発明のADAMTS13タンパクの量を減らす方法を実行することによって、多様な血漿、特にヒトの血漿に由来する溶液からADAMTS13タンパクの量が減少し、VWFを豊富に含む組成物が得られる。この組成物はVWFの安定性が長時間維持されるので、VWFの静脈内投与を実行する医療で液体の形で利用できる。
本発明はさらに、生物活性なVWF‐欠損に関連する病気の予防または治療用医薬品の製造での、本発明に定義の方法によって得られる、VWFがリッチでADAMTS13タンパク含有量が減った液体組成物の使用にも関するものである。この医薬品は静脈内投与にに適した形をしているのが有利である。一つの実施例では、この医薬品は凍結乾燥した形でそれに適切な量の滅菌したパイロージェンフリーな水を加えて静脈内投与に適した液体組成物にする。他の実施例では静脈内投与に直接使用可能な液体の形の医薬品にする。
本発明はさらに、本発明定義の方法に従って得られるVWFが豊富でADAMTS13タンパクを除いた組成物を、患者に投与する階段を有することを特徴とする、生物学的に活性なVWF‐欠損に関連疾患を予防または治療方法に関するものである。
上記予防または治療方法での組成物の投与階段は静脈内投与階段にするのが有利である。静脈内投与階段は連続した注射階段すなわち少なくとも8時間から200時間の連続した時間から成るのが好ましい。この階段の継続時間は患者に応じて変える。
連続注射投与階段は一般に少なくとも8時間から120時間までで、通常は24時間までである。
本発明の有利な実施例では、本発明の方法に従って得られるVWFを豊富に含み、ADAMTS13を除いた組成物を充填した単一のコンテナ(容器)またはフラスコを用いて連続注射投与階段を実行する。連続注入投与階段の全継続時間にわたって単一組成物のバッチを収容した単一コンテナを使用できるのは本発明のVWF組成物が高い安定性を有するおかげである。
フォンビルブラント因子がリッチな組成物の投与階段を有する治療方法自体は公知で、例えば下記文献に記載されている。
Martinowitz and aI. (1997, Transfusion Medicine Review, Vol. 11: 56-63) and Martinowitz and aI. (1994, Internationar Daynal of Pediatric Hematology/Oncology, Vol. 1: 471-478
Martinowitz and aI. (1997, Transfusion Medicine Review, Vol. 11: 56-63) and Martinowitz and aI. (1994, Internationar Daynal of Pediatric Hematology/Oncology, Vol. 1: 471-478
一般に、VWFが豊富でADAMTS13タンパクを除去した組成物を、フォンウィルブラントファクターが20〜200VWF:RCoIU/kg/24時となるように、患者に連続注射する。
本発明方法で得られる組成物は直接または間接的に用い、VWF含有量は10〜250IU/ml、例えば100IU/mlにする。
本発明方法で得られる組成物は直接または間接的に用い、VWF含有量は10〜250IU/ml、例えば100IU/mlにする。
以下の本発明の実施例を示すが、本発明が下記実施例に限定すると解釈してはならない。
実施例1
ADAMTS13を含まないVWF濃縮物の製造
出発材料
クエン酸ナトリウム(4%)または抗凝固CPD溶液(シトラート、リン酸塩、デキストロース)の存在下に血液を採取し、試料採集の後少なくとも6時間凍結した。遠心分離して血漿を得た後、−60℃で凍結し、−35℃で保存した。1800〜2000リットルを含むバッチをプールし、本発明方法を実行する一回分の量の各4000リットルの血漿にした。血漿を少なくとも12時間−7℃のチャンバー内に放置してゆっくりと規則的に温めて解かし、一定撹拌下に恒温室中で0〜2℃の温度で解凍した。コールド遠心分離で凍結沈降物(約9g/リットル血漿に対応)を回収した。
ADAMTS13を含まないVWF濃縮物の製造
出発材料
クエン酸ナトリウム(4%)または抗凝固CPD溶液(シトラート、リン酸塩、デキストロース)の存在下に血液を採取し、試料採集の後少なくとも6時間凍結した。遠心分離して血漿を得た後、−60℃で凍結し、−35℃で保存した。1800〜2000リットルを含むバッチをプールし、本発明方法を実行する一回分の量の各4000リットルの血漿にした。血漿を少なくとも12時間−7℃のチャンバー内に放置してゆっくりと規則的に温めて解かし、一定撹拌下に恒温室中で0〜2℃の温度で解凍した。コールド遠心分離で凍結沈降物(約9g/リットル血漿に対応)を回収した。
遠心後、回収した凍結沈降物を再溶解し、主たる汚染菌すなわちプロトロンビン複合体(特にファクタVII)(ファクタXII)成分を除去するために水酸化アルミニウム上に吸着させた。次いで、上澄を15℃に冷却した(フィブリノーゲンの一部とフィブロネクチンの除去)。
ウイルス失活処理
FVIII−VWF‐含有溶液に対してリピド・エンベロープ・ウィルスに対して効率的なことに知られている溶剤‐洗浄処理し(Horowitz、et al.(1985), Transfusion、25、516-522)、0.3%のトリ-n-ブチルリン酸(TnBP)と1%のTween80の存在下で25℃で8時間の培養した。
FVIII−VWF‐含有溶液に対してリピド・エンベロープ・ウィルスに対して効率的なことに知られている溶剤‐洗浄処理し(Horowitz、et al.(1985), Transfusion、25、516-522)、0.3%のトリ-n-ブチルリン酸(TnBP)と1%のTween80の存在下で25℃で8時間の培養した。
クロマトグラフ分離方法
最初のクロマトグラフはDEAE‐フラクトゲル(Fractogel(M)TSK650のカラム(Merk)で実行した。平衡化緩衝液はクエン酸トリナトリウム(0.01M)、塩化カルシウム(0.001M)、塩化ナトリウム(0.11M)、グリシン(0.12M)およびL−リシン(0、016M)を含んでいる。VWF、FVIIIおよびフィブロネクチンは、カラムの上へ保持され、汚染菌タンパク類(主としてフィブリノーゲンおよび免疫グロブリンG)はカラムにほとんど固定されないか、固定されず、ウィルスの失活処理残渣は同じ緩衝液を使用した複数回の連続洗浄で除去された。
最初のクロマトグラフはDEAE‐フラクトゲル(Fractogel(M)TSK650のカラム(Merk)で実行した。平衡化緩衝液はクエン酸トリナトリウム(0.01M)、塩化カルシウム(0.001M)、塩化ナトリウム(0.11M)、グリシン(0.12M)およびL−リシン(0、016M)を含んでいる。VWF、FVIIIおよびフィブロネクチンは、カラムの上へ保持され、汚染菌タンパク類(主としてフィブリノーゲンおよび免疫グロブリンG)はカラムにほとんど固定されないか、固定されず、ウィルスの失活処理残渣は同じ緩衝液を使用した複数回の連続洗浄で除去された。
カラムは100cm/時の線形流速で運転した。カラムに吸着されたVWF−含有画分は緩衝液中のNaCl濃度を0.15Mまで上げて溶出させた。
この最初のカラムから溶出したVWF含有画分を第2カラムに再注入した。第2カラムは最初のものと類似し、類似条件下で、平衡化緩衝液でわずかに希釈した後、VWF画分のイオン強度を0.11M塩化ナトリウムの当量に調節した。
カラムに吸着されたVWF含有画分は緩衝液中のNaCl濃度を0.15Mまで上げて溶出させた。溶出液を電気泳動分析した結果、フィブロネクチンおよびインターαトリプシンインヒビター(ITI)の汚染は小さいことがわかった。
この第2溶出液を第3の精製階段へ送った。この第3の精製階段では上記カラムの溶出緩衝液で平衡させたゼラチン‐セファロースCL4Bカラム(Pharmacia)でフィブロネクチンを除去した。このアフィニティークロマトグラフィゲルのフィブロネクチン保持能力は>5mg/mlで、画分中の汚染菌を検知限界値(<4mg)まで下げることができる。
この最後の階段からの濾過液中にADAMTS13を含まないVWF濃縮物を回収した。これは凍結乾燥せずに直接治療できる。最後的に得られた濾液は安定化剤の添加は全く必要としない。
実施例2
VWF濃縮物中のADAMTS13の減少量の測定
この実施例の目的は実施例1で製造したVWF濃縮物中に存在するADAMTS13量の減少ファクタを測定することにある。
VWF濃縮物中のADAMTS13の減少量の測定
この実施例の目的は実施例1で製造したVWF濃縮物中に存在するADAMTS13量の減少ファクタを測定することにある。
出発材料
実施例1の各クロマトグラフィ階段の前後の溶液/濃縮物に対応する4つの画分と、最初の血漿画分とを回収した。各画分で1mLのサンプル(A、B、C、D、E)を採取した。
A:最初の血漿
B:溶剤/洗剤と最初のDEAEクロマトグラフィとの間の凍結沈降物
C:最初のDEAEクロマトグラフィからの溶出液
D:第2回目のDEAEクロマトグラフィからの溶出液
E:VWF−含有ゼラチン−セファロースカラムの画分
実施例1の各クロマトグラフィ階段の前後の溶液/濃縮物に対応する4つの画分と、最初の血漿画分とを回収した。各画分で1mLのサンプル(A、B、C、D、E)を採取した。
A:最初の血漿
B:溶剤/洗剤と最初のDEAEクロマトグラフィとの間の凍結沈降物
C:最初のDEAEクロマトグラフィからの溶出液
D:第2回目のDEAEクロマトグラフィからの溶出液
E:VWF−含有ゼラチン−セファロースカラムの画分
ADAMTS13タンパクアッセイ
各サンプル中のADAMTS濃度をウサギ抗ヒトADAMTS13抗体を使用してIMUBINDR ADAMTS13 ELISAキット (American Diagnostica)で測定した。同時に、VWF:RCo濃度も測定した(実施例3のアッセイプロトコル参照)。
各サンプル中のADAMTS濃度をウサギ抗ヒトADAMTS13抗体を使用してIMUBINDR ADAMTS13 ELISAキット (American Diagnostica)で測定した。同時に、VWF:RCo濃度も測定した(実施例3のアッセイプロトコル参照)。
結果
各アッセイの結果は[表1]に示してある。
各アッセイの結果は[表1]に示してある。
結論
最初のクロマトグラフィ後のADAMTS13の減少ファクタは700以上である。第2回クロマトグラフィ後の減少ファクタは約2500である。一方、第3回クロマトグラフィではADAMTS13量は減らなかった。この実施例は上記クロマトグラフィカラムと緩衝液とを使用したときのADAMTS13タンパクの除去効率が高いことを表している。
最初のクロマトグラフィ後のADAMTS13の減少ファクタは700以上である。第2回クロマトグラフィ後の減少ファクタは約2500である。一方、第3回クロマトグラフィではADAMTS13量は減らなかった。この実施例は上記クロマトグラフィカラムと緩衝液とを使用したときのADAMTS13タンパクの除去効率が高いことを表している。
実施例3
ADAMTS13を含まないVWF濃縮物の安定性
この実施例の目的は、実施例1に従った製造されたADAMTS13を含まないVWF凍結乾燥濃縮物を注射器すなわちバッチで所定投与量に分割する時または注入ポンプを使用して連続注入で製品を投与する時のルーチン条件下で各種コンテナ中に再構築した後の生物学的製剤の安定性を評価することにある。
ADAMTS13を含まないVWF濃縮物の安定性
この実施例の目的は、実施例1に従った製造されたADAMTS13を含まないVWF凍結乾燥濃縮物を注射器すなわちバッチで所定投与量に分割する時または注入ポンプを使用して連続注入で製品を投与する時のルーチン条件下で各種コンテナ中に再構築した後の生物学的製剤の安定性を評価することにある。
材料
テストした医薬:
下記の3つの異なるVWF濃縮物のバッチをテストした:
バッチ#1:VWF:RCo 1010 IU/10mlフラスコ
バッチ#2:VWF:RCo 1080 IU/10mlフラスコ
バッチ#3:VWF:RCo 1000 IU/10mlフラスコ
使用した注入材料:
注入液ポンプCADD PRIZM(登録商標)VIP((SIMS Deltec、Inc. St.Paul,.MN, USA)
ポリ塩化ビニールのMEDICATION カセット(登録商標) 50ml貯蔵器、
ポンプ用サイホン防止弁付ポリ塩化ビニールのデルタ延長コード114cm/45
ポリプロピレンの3P Plastipak lOmlLuer Lock H810LL
自動注入装置:
リストセチン・コファクタ活性アッセイ(VWF:RCo)用およびVWFテスト・アッセイ(VWF:Ag)用BCSアナライザー(Dade Behring, Marbug GmbH)。
リストセチン・コファクタ活性アッセイ(VWF:RCo)
(1)BCフォン・ウィルブラント試薬(Dade Behring Marburg社)
(2)サンプル希釈用NaCI
(3)サンプル希釈:最少「ウシ血清」98%
(4)アルブミン(ウシ血清)は予め生理的食塩水(NaCI 0.9%)中に希釈。
テストした医薬:
下記の3つの異なるVWF濃縮物のバッチをテストした:
バッチ#1:VWF:RCo 1010 IU/10mlフラスコ
バッチ#2:VWF:RCo 1080 IU/10mlフラスコ
バッチ#3:VWF:RCo 1000 IU/10mlフラスコ
使用した注入材料:
注入液ポンプCADD PRIZM(登録商標)VIP((SIMS Deltec、Inc. St.Paul,.MN, USA)
ポリ塩化ビニールのMEDICATION カセット(登録商標) 50ml貯蔵器、
ポンプ用サイホン防止弁付ポリ塩化ビニールのデルタ延長コード114cm/45
ポリプロピレンの3P Plastipak lOmlLuer Lock H810LL
自動注入装置:
リストセチン・コファクタ活性アッセイ(VWF:RCo)用およびVWFテスト・アッセイ(VWF:Ag)用BCSアナライザー(Dade Behring, Marbug GmbH)。
リストセチン・コファクタ活性アッセイ(VWF:RCo)
(1)BCフォン・ウィルブラント試薬(Dade Behring Marburg社)
(2)サンプル希釈用NaCI
(3)サンプル希釈:最少「ウシ血清」98%
(4)アルブミン(ウシ血清)は予め生理的食塩水(NaCI 0.9%)中に希釈。
VWF抗原アッセイ(VWF:Ag)
(1)VWF試薬:下記から成るAg Dade Behring(Dade Behring Marburg):
1フラスコVWF:ラテックス試薬用Ag希釈剤4m1:ラテックス希釈用のグリシンを含む溶液
1フラスコVWF:Agラテックス試薬2ml:(ウサギ)抗ヒトVWF抗体で被覆された小径ポリスチレン粒子の懸濁液
1フラスコVWF:Ag緩衝液5m1:グリシン緩衝液
(2)再構築後の貯蔵:+2/+8℃で15日
(3)サンプル希釈用Owren Kroller緩衝液
(4)サンプル希釈:最少ウシ血清98%
アルブミン(ウシ血清)は予め食塩水で希釈(NaCl 0.9%)。
(1)VWF試薬:下記から成るAg Dade Behring(Dade Behring Marburg):
1フラスコVWF:ラテックス試薬用Ag希釈剤4m1:ラテックス希釈用のグリシンを含む溶液
1フラスコVWF:Agラテックス試薬2ml:(ウサギ)抗ヒトVWF抗体で被覆された小径ポリスチレン粒子の懸濁液
1フラスコVWF:Ag緩衝液5m1:グリシン緩衝液
(2)再構築後の貯蔵:+2/+8℃で15日
(3)サンプル希釈用Owren Kroller緩衝液
(4)サンプル希釈:最少ウシ血清98%
アルブミン(ウシ血清)は予め食塩水で希釈(NaCl 0.9%)。
マルティマー・アッセイ
試薬と緩衝液は下記のもの:
緩衝液TBS 50mM(pH 7.4)
(1) 5%脱脂乳=飽和緩衝液
(2) 0.05% Tween200=洗浄用緩衝液
アルカリホスファターゼ634.0052に結合した抗VWFポリクローナル抗体
顕色キット−バイオレッド(-20℃で保存)
標準血漿および品質管理
ヒト標準血漿(Dade Behring Marburg):OMS 97/586標準品で較正。
対照:
(1)VEQ A(ノーマル対照)(Dade Behring Marburg):標的値:RCo:71%(64〜79)およびAg:90% (83〜97)
(2)VEQ B(異常対照)(Dade Behring Marburg)標的値:RCo:22%(17〜27)およびAg:33% (30〜35)
研究技術条件
室温:23±2℃
光源から離す。
層流空気流下で再構築(クラスA、ISO 5)、管理環境ルーム(クラスC、ISO 7)(よい製造プラクティスで実行:特別ガイドライン:滅菌医薬品生産、Official Bulletin N .degree. 2007/1 bis)。
試薬と緩衝液は下記のもの:
緩衝液TBS 50mM(pH 7.4)
(1) 5%脱脂乳=飽和緩衝液
(2) 0.05% Tween200=洗浄用緩衝液
アルカリホスファターゼ634.0052に結合した抗VWFポリクローナル抗体
顕色キット−バイオレッド(-20℃で保存)
標準血漿および品質管理
ヒト標準血漿(Dade Behring Marburg):OMS 97/586標準品で較正。
対照:
(1)VEQ A(ノーマル対照)(Dade Behring Marburg):標的値:RCo:71%(64〜79)およびAg:90% (83〜97)
(2)VEQ B(異常対照)(Dade Behring Marburg)標的値:RCo:22%(17〜27)およびAg:33% (30〜35)
研究技術条件
室温:23±2℃
光源から離す。
層流空気流下で再構築(クラスA、ISO 5)、管理環境ルーム(クラスC、ISO 7)(よい製造プラクティスで実行:特別ガイドライン:滅菌医薬品生産、Official Bulletin N .degree. 2007/1 bis)。
方法
サンプルの調整−研究技術条件
全体で6つの調合剤をテストした:各バッチは注射器およびカセット中でテストした。
ADAMTS13を含まないVWFの凍結乾燥濃縮物は粉末で、水を用いて注射可能な医薬調節物へ再構成した。
注射器:
T0で、製品を所定溶剤(注射用水)および材料(殺菌濾過器とエッジ−タイプ濾過器とを有するベント管を備えた移送システム)で再構成し、層状気流フード下(クラスA)、制御された気圧ルーム(クラスC)で注射器中に入れた。研究は静的状態下で3日(72時間)実行した。調合品は室温で光源から離して保存した。
サンプルの調整−研究技術条件
全体で6つの調合剤をテストした:各バッチは注射器およびカセット中でテストした。
ADAMTS13を含まないVWFの凍結乾燥濃縮物は粉末で、水を用いて注射可能な医薬調節物へ再構成した。
注射器:
T0で、製品を所定溶剤(注射用水)および材料(殺菌濾過器とエッジ−タイプ濾過器とを有するベント管を備えた移送システム)で再構成し、層状気流フード下(クラスA)、制御された気圧ルーム(クラスC)で注射器中に入れた。研究は静的状態下で3日(72時間)実行した。調合品は室温で光源から離して保存した。
カセット:
T0で、製品を注射器の場合と類似の条件下で再構成した。第1階段は静的状態下で0〜48時間実行した。第2階段は動的状態下で48〜120時間の間実行した。ポンプ第2日に動かし、研究の最終日(l2O時間)まで低速(0.1ml/時間)を維持した。調合品は室温で、光源から離して保存した。
サンプルの調整:
VWF:RCoおよびVWF:Agアッセイ用サンプルを再構築直後(T0)に採取し、その後は下記時点で採取した:
(1)注射器中に再構築後T12、24、36、48、60、72時間、
(2)カセット中に再構築後T12、24、36、48、60、72、84、96、108、120時間
各ポイントで3組のサンプル(250μl)を番号を付きグラジュエートエッペンドルフマイクロチューブ中に採取し、直ちに凍結した(−80℃)。マルティマーアッセイ用サンプルは下記で行なった:
(1)注射器の場合 T0、72時間)
(2)カセットの場合 T0、60、120時間
サンプルは-80℃で直ちに凍結した。
T0で、製品を注射器の場合と類似の条件下で再構成した。第1階段は静的状態下で0〜48時間実行した。第2階段は動的状態下で48〜120時間の間実行した。ポンプ第2日に動かし、研究の最終日(l2O時間)まで低速(0.1ml/時間)を維持した。調合品は室温で、光源から離して保存した。
サンプルの調整:
VWF:RCoおよびVWF:Agアッセイ用サンプルを再構築直後(T0)に採取し、その後は下記時点で採取した:
(1)注射器中に再構築後T12、24、36、48、60、72時間、
(2)カセット中に再構築後T12、24、36、48、60、72、84、96、108、120時間
各ポイントで3組のサンプル(250μl)を番号を付きグラジュエートエッペンドルフマイクロチューブ中に採取し、直ちに凍結した(−80℃)。マルティマーアッセイ用サンプルは下記で行なった:
(1)注射器の場合 T0、72時間)
(2)カセットの場合 T0、60、120時間
サンプルは-80℃で直ちに凍結した。
標準血漿および対照
VEQA、VEQB対照および標準血漿を1mlの冷えていない蒸留水で再構成し、1時間安定させた。VWF:RCo活性アッセイのためにアッセイと同じ日に標準範囲で実行した。較正はBCSデバイスを用いて標準品をOwren Koller緩衝液で自動希釈して行なった。VEQAおよびVEQB対照の解析で較正を確認した。注射器に対応するサンプル解析の終わりに対照を再度流した。その後、カセットに対応するサンプル解析を行ない、血小板試薬の新しい再構築を確認した。フォン・ウィルブラント・テスト・アッセイのための標準範囲はVEQAおよびVEQB対照の解析で確認した。
VEQA、VEQB対照および標準血漿を1mlの冷えていない蒸留水で再構成し、1時間安定させた。VWF:RCo活性アッセイのためにアッセイと同じ日に標準範囲で実行した。較正はBCSデバイスを用いて標準品をOwren Koller緩衝液で自動希釈して行なった。VEQAおよびVEQB対照の解析で較正を確認した。注射器に対応するサンプル解析の終わりに対照を再度流した。その後、カセットに対応するサンプル解析を行ない、血小板試薬の新しい再構築を確認した。フォン・ウィルブラント・テスト・アッセイのための標準範囲はVEQAおよびVEQB対照の解析で確認した。
VWF:RCoアッセイ
アッセイ原則:
リストセチン(抗生剤)の存在下でサンプル中に存在するVWFはフォン・ウィルブラントBC試薬に含まれる安定化した血小板のアグルチネーションを導く。アグルチネーションプロセスは反応液の濁度を低下させる。凝固アナライザ(Dade Behring BSC)は光学濃度の変化を測定し、ノーマルに対するサンプル中のリストセチンコファクタ活性を自動的にパーセントで計算する。10〜150%の標準の血漿から6ポイント範囲をセットアップする(10、20、40、60、100、150%)。
方法:
VWF BC試薬は凍結乾燥した形の安定化された血小板と、リストセチンと、EDTAとから成る。4mlの蒸留水で再構築した後に、フォン・ウィルブラントBC試薬で15分間撹拌なしで安定させる。その後、ボルテックスを用いて5秒間二回非常にゆっくりと撹拌してからBCSデバイスに導入する。BCSデバイスは30分毎に撹拌しなければならない。サンプルの希釈用に使用するNaClをBCSデバイスに導入する。
アッセイ原則:
リストセチン(抗生剤)の存在下でサンプル中に存在するVWFはフォン・ウィルブラントBC試薬に含まれる安定化した血小板のアグルチネーションを導く。アグルチネーションプロセスは反応液の濁度を低下させる。凝固アナライザ(Dade Behring BSC)は光学濃度の変化を測定し、ノーマルに対するサンプル中のリストセチンコファクタ活性を自動的にパーセントで計算する。10〜150%の標準の血漿から6ポイント範囲をセットアップする(10、20、40、60、100、150%)。
方法:
VWF BC試薬は凍結乾燥した形の安定化された血小板と、リストセチンと、EDTAとから成る。4mlの蒸留水で再構築した後に、フォン・ウィルブラントBC試薬で15分間撹拌なしで安定させる。その後、ボルテックスを用いて5秒間二回非常にゆっくりと撹拌してからBCSデバイスに導入する。BCSデバイスは30分毎に撹拌しなければならない。サンプルの希釈用に使用するNaClをBCSデバイスに導入する。
VWF:Agアッセイ
アッセイ原則:
フォン・ウィルブラント抗原を含むサンプル中へ試薬を添加して共有結合した特異抗体(ウサギAb)で被覆された小径のポリスチレン粒子をアグルチネーションさせる。このアグルチネーションをBCSデバイス上の比濁分析で測定する。この比濁分析値はサンプルのVWF Agレベルに正比例する。10%から180%の標準血漿から5点範囲をセットアップする(10、40、70、150、180%)。
方法:
全部の希釈剤フラスコをラテックス試薬フラスコ中へ注ぎ、気泡の発生を避けながら撹拌する。15分間室温に置いた後、混合液を自動デバイスに導入した。
アッセイ原則:
フォン・ウィルブラント抗原を含むサンプル中へ試薬を添加して共有結合した特異抗体(ウサギAb)で被覆された小径のポリスチレン粒子をアグルチネーションさせる。このアグルチネーションをBCSデバイス上の比濁分析で測定する。この比濁分析値はサンプルのVWF Agレベルに正比例する。10%から180%の標準血漿から5点範囲をセットアップする(10、40、70、150、180%)。
方法:
全部の希釈剤フラスコをラテックス試薬フラスコ中へ注ぎ、気泡の発生を避けながら撹拌する。15分間室温に置いた後、混合液を自動デバイスに導入した。
サンプル処理
サンプルを37℃で5分間解凍し、ボルテックスで撹拌し、ウシ血清で1/100に希釈する、最低98%(予め生理的食塩水で希釈)。ボルテックスで撹拌後、サンプルをBCSデバイスに導入する。
マルチマー
サンプルの調整:
サンプルをサンプル希釈用緩衝液+ブロムフェノールブルーで1/10に希釈して、VWF:Agレベルを約0.1 IU/mlに調節する。次いでサンプルを60℃で30分加熱する。
サンプルを37℃で5分間解凍し、ボルテックスで撹拌し、ウシ血清で1/100に希釈する、最低98%(予め生理的食塩水で希釈)。ボルテックスで撹拌後、サンプルをBCSデバイスに導入する。
マルチマー
サンプルの調整:
サンプルをサンプル希釈用緩衝液+ブロムフェノールブルーで1/10に希釈して、VWF:Agレベルを約0.1 IU/mlに調節する。次いでサンプルを60℃で30分加熱する。
電気泳動:
30μLのサンプルをアガロースゲルウエルに入れる。電気泳動終了後直ぐにゲルを蒸留水を入れたビーカー中に浸し、少なくとも1時間穏やかな撹拌下に濯ぐ。次いで、ゲルを冷えた気流下で乾燥し、飽和緩衝液で1時間飽和させる。ゲルを穏やかな撹拌下に一晩培養し、50mM TBS緩衝液中でアルカリホスファターゼに結合されたポリクローン性抗VWF抗体(抗VWF-PA)の浴中に希釈する。希釈後、ゲルを少なくとも2時間、複数の洗浄緩衝液浴で撹拌下に培養する。100mlの0.1Mトリス、pH9.5、1mlの溶液A+1mlの溶液B(キット溶液)を加えて顕色溶液を作った。
30μLのサンプルをアガロースゲルウエルに入れる。電気泳動終了後直ぐにゲルを蒸留水を入れたビーカー中に浸し、少なくとも1時間穏やかな撹拌下に濯ぐ。次いで、ゲルを冷えた気流下で乾燥し、飽和緩衝液で1時間飽和させる。ゲルを穏やかな撹拌下に一晩培養し、50mM TBS緩衝液中でアルカリホスファターゼに結合されたポリクローン性抗VWF抗体(抗VWF-PA)の浴中に希釈する。希釈後、ゲルを少なくとも2時間、複数の洗浄緩衝液浴で撹拌下に培養する。100mlの0.1Mトリス、pH9.5、1mlの溶液A+1mlの溶液B(キット溶液)を加えて顕色溶液を作った。
発現および結果
VWF:RCoおよびVWF:Agの結果の解析:
線型回帰法を用いてゼロ次反応に対応する統計解析、すなわち最も単純な解析:y=a+bxを行なった。スチュデンドテストによるスロープとの大きな差はないことをチェックした。N-2 ddに対してt 0.05。
マルティマーの結果の解析:
各プレートをスキャンして各種マルティマーに対応するバンドの濃度プロット線を得る。各バンドで積分値を総面積のパーセントで表した。各バンドは重いものから最も軽いものへ1〜Xで識別した。
VWF:RCoおよびVWF:Agの結果の解析:
線型回帰法を用いてゼロ次反応に対応する統計解析、すなわち最も単純な解析:y=a+bxを行なった。スチュデンドテストによるスロープとの大きな差はないことをチェックした。N-2 ddに対してt 0.05。
マルティマーの結果の解析:
各プレートをスキャンして各種マルティマーに対応するバンドの濃度プロット線を得る。各バンドで積分値を総面積のパーセントで表した。各バンドは重いものから最も軽いものへ1〜Xで識別した。
結果は下記の完全性に関するパーセントで与えられる:
(1)第15番のバンド〜X番のバンドまでのマルティマー(?15-mers)
(2)第10番のバンド〜X番のバンドまでのマルティマー(?10-mers)
(3)第5番のバンド〜X番のバンドまでのマルティマー(?5-mers)
結果
対照の結果:データは示していない。
アッセイ結果
10mlの水で注射可能な薬物調整品に再構築後のフラスコはリストセチンコファクタ活性1000IUに対応する100 UI/mlのヒトフォンビルブラント因子を含む。この研究は再構築後の医薬品の安定性を評価する方法に関するFDA(QID)およびEMEA(CPMP/ICH/420/02)の推薦方法に応じて実行した。
結果は生データを[表2][表3]に示す。[図1][図2]は安定性値とセチンコファクタ活性およびウィルブラント抗原に依存する時間との関係を示している。
(1)第15番のバンド〜X番のバンドまでのマルティマー(?15-mers)
(2)第10番のバンド〜X番のバンドまでのマルティマー(?10-mers)
(3)第5番のバンド〜X番のバンドまでのマルティマー(?5-mers)
結果
対照の結果:データは示していない。
アッセイ結果
10mlの水で注射可能な薬物調整品に再構築後のフラスコはリストセチンコファクタ活性1000IUに対応する100 UI/mlのヒトフォンビルブラント因子を含む。この研究は再構築後の医薬品の安定性を評価する方法に関するFDA(QID)およびEMEA(CPMP/ICH/420/02)の推薦方法に応じて実行した。
結果は生データを[表2][表3]に示す。[図1][図2]は安定性値とセチンコファクタ活性およびウィルブラント抗原に依存する時間との関係を示している。
回帰スロープテストはランダムかつ異常な変動の仮定下でほぼゼロである(α=5%、p>0.05)。これで、研究したパラメータは時間範囲(72〜120時間)内かつアッセイ条件下では実質的に劣化がないことが確認された(VWF:RCOおよびVWF Ag)。
マルティマー結果
マルティマーの結果は[表4]に示してある。
マルティマーの結果は[表4]に示してある。
異なるコンテナ(注射器およびカセット)の研究を通じて各マルティマー間(高分子量、中分子量および低分子量)で大きな違いは観測されなかった。
結論
我々の研究結果は、ADAMTS13を含まないVWF凍結乾燥濃縮物を一定時間(注射器用は72時間、カセット用は120時間)後に所定操作条件下で再構成したものは生物学的安定性(質的および量的)があることを証明した。
この結果は注射器で分別投与量での投与(例えば定期的投与)が可能であることを示し、注入ポンプまたはフォンウィルブラント病気用連続注入で自動投与(血友病では既に実施されている)が実行できることを示している。
我々の研究結果は、ADAMTS13を含まないVWF凍結乾燥濃縮物を一定時間(注射器用は72時間、カセット用は120時間)後に所定操作条件下で再構成したものは生物学的安定性(質的および量的)があることを証明した。
この結果は注射器で分別投与量での投与(例えば定期的投与)が可能であることを示し、注入ポンプまたはフォンウィルブラント病気用連続注入で自動投与(血友病では既に実施されている)が実行できることを示している。
Claims (16)
- DEAE基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂から成るイオン交換クロマトグラフィ担体と、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液との、ヒトのフォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中のADAMTS13の量を減らすための使用。
- イオン交換クロマトグラフィ担体がDEAE-フラクトゲル(Fractogel、登録商標)カラムである請求項1に記載の使用。
- クロマトグラフィ用緩衝液が0.01Mのクエン酸トリナトリウム、0.001 Mの塩化カルシウム、0.12Mのグリシンおよび0.016Mのリシンおよび0.11M〜0.17Mの塩化ナトリウムから成る請求項1または2に記載の使用。
- クロマトグラフィ担体上に吸着された画分を緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0.14〜0.17Mへ上げで溶出する請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- 緩衝液のpH値が6.9〜7.1にする請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 上記イオン交換クロマトグラフィ担体と上記緩衝液とを使用してADAMTS13を2回の連続したクロマトグラフ分離階段で除去する請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
- 初期の血漿中に含まれるADAMTS13量と比較してADAMTS13量の減少率が200倍以上である請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用。
- 初期の血漿中に含まれるADAMTS13量と比較してADAMTS13量の減少率が500倍以上である請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用。
- クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液中で、DEAE基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂上でイオン交換クロマトグラフ分離を行なう段階を有する、ヒトのVWF-含有血漿由来の溶液中のADAMTS13量を減らすための方法。
- イオン交換クロマトグラフィ担体がDEAE‐フラクトゲル(Fractogel、登録商標)である請求項9に記載の方法。
- クロマトグラフィ用緩衝液が0.01Mのクエン酸トリナトリウム、0.001Mの塩化カルシウム、0.12Mのグリシンおよび0.016Mのリシンおよび0.11M〜0.17Mの塩化ナトリウムから成る請求項9または10に記載の方法。
- クロマトグラフィ担体上に吸着された画分を緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0.14〜0.17Mへ上げて溶出する請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 緩衝液のpH値が6.9〜7.1である請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 上記イオン交換クロマトグラフィ担体と上記緩衝液とを使用してADAMTS13を2回の連続したクロマトグラフ分離階段で除去する請求項9〜13のいずれか一項に記載の方法。
- ADAMTS13量の減少率が初期の血漿中に含まれるADAMTS13量に比べて200倍以上である請求項9〜14のいずれか一項に記載の方法。
- ADAMTS13量の減少率が初期の血漿中に含まれるADAMTS13量に比べて500倍以上である請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法。
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