EP2167657A2 - Utilisation d'un support de chromatographie pour reduire la quantite d'adamts13 dans une solution derivee du plasma - Google Patents

Utilisation d'un support de chromatographie pour reduire la quantite d'adamts13 dans une solution derivee du plasma

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EP2167657A2
EP2167657A2 EP08806168A EP08806168A EP2167657A2 EP 2167657 A2 EP2167657 A2 EP 2167657A2 EP 08806168 A EP08806168 A EP 08806168A EP 08806168 A EP08806168 A EP 08806168A EP 2167657 A2 EP2167657 A2 EP 2167657A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amount
vwf
buffer
adamts13
plasma
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08806168A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Françoise BRIDEY
Roland Schmitthaeusler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB Biotechnologies SAS
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by LFB Biotechnologies SAS filed Critical LFB Biotechnologies SAS
Publication of EP2167657A2 publication Critical patent/EP2167657A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)

Definitions

  • the present invention relates to the field of protein purification.
  • the invention relates to a method for reducing the amount of ADAMTSI 3 present in a von Willebrand factor solution (VWF) and the use of chromatography media and specific buffers for reducing the amount of ADAMTSI 3 present in such samples.
  • VWF von Willebrand factor solution
  • VWF Von Willebrand factor
  • S-S bridges a set of multimers linked by S-S bridges, whose base element has a molecular weight of around 250 kilodaltons (KDa).
  • KDa kilodaltons
  • the smallest form of VWF in plasma is a dimer of 500 KDa and the largest forms are multimers of this dimer whose molecular weight can reach 20 million daltons.
  • This assembly of the subunits into multimers may be specific for the producer cells, the VWF being synthesized and polymerized in the megakaryocytes and in the endothelial cells.
  • This factor plays a key role in hemostasis by two distinct functions: as adhesion protein it allows adhesion and aggregation of blood platelets on the vascular subendothelium (and thus participates in the process of primary hemostasis at level of the damaged vessels) and, on the other hand, it ensures the stabilization and transport of Factor VIII (FVIII) in the bloodstream.
  • a VWF (quantitative) congenital deficiency or a structural abnormality of this factor (qualitative) leads to von Willebrand disease, which manifests as mucocutaneous haemorrhage. This disease is very heterogeneous in its clinical expression and poses serious problems in case of surgery. Treatment of Willebrand disease is required to correct abnormalities in primary hemostasis (bleeding time) and coagulation (activated partial thromboplastin time and FVIII coagulant activity, FVIII: C).
  • the disease is treated by substitution therapy with VWF-enriched human plasma derivatives (eg cryoprecipitated plasma fraction, FVIII concentrates containing sufficient VWF (FVIII / VWF concentrate) or VWF concentrates (lacking FVIII ).
  • VWF-enriched human plasma derivatives eg cryoprecipitated plasma fraction, FVIII concentrates containing sufficient VWF (FVIII / VWF concentrate) or VWF concentrates (lacking FVIII ).
  • Willebrand disease may or may not be associated with FVIII deficiency depending on whether the protein is absent or qualitatively abnormal, respectively.
  • FVIII / VWF concentrate When the patient with VWF expresses normally FVIII it is better to use a VWF concentrate devoid of FVIII.
  • the use of such a concentrate makes it possible to compensate for the only VWF deficiency and to avoid excess FVIII.
  • Excess FVIII can lead to serious complications such as venous thrombosis or pulmonary embolism.
  • VWF concentrates are generally very unstable in solution if the VWF is denatured by proteolytic enzymes such as I ⁇ DAMTS13.
  • L ⁇ DAMTS13 is a protease of the family of metal loproteases that is naturally present in human plasma. Its role is to convert VWF's long hyper-active multimers into smaller, less active multimers.
  • ADAMTS 13 is able to denature VWF in vivo but also in vitro, for example in solutions derived from plasma containing VWF, such as VWF concentrates or FVIII / VWF concentrates. Although these plasma derivatives can generally be stored as a freeze-dried powder for several years, the presence of ADAMTS13 affects the stability of VWF when the freeze-dried powder is dissolved. This VWF stability problem precludes certain forms of therapeutic treatment, for example continuous or discontinuous infusion therapy for several days.
  • This mode of treatment allows the maintenance of constant circulating levels of VWF to avoid the occurrence of rates outside the therapeutic areas when the administration is performed by discontinuous injection.
  • the Applicant has therefore sought to develop efficient means for reducing the amount of ADAMTS13 protein present in compositions derived from the plasma containing VWF, in order to increase their properties of stability over time.
  • the subject of the invention is the use of an ion exchange chromatography medium comprising a large-pore vinyl polymer resin carrying DEAE groups and a buffer comprising trisodium citrate.
  • sodium chloride, calcium chloride, glycine and lysine to reduce the amount of ADAMTS13 present in a solution derived from plasma containing human VWF and ADAMTS13.
  • the invention also relates to a method for reducing the amount of ADAMTS13 present in a solution derived from plasma containing human VWF comprising an ion exchange chromatography step on a large-pore vinyl polymer type resin bearing DEAE groups made in a buffer comprising trisodium citrate, sodium chloride, calcium chloride, glycine and lysine
  • Figure 1 illustrates a study of the stability of the RCo activity of the VWF concentrate.
  • Figure 1 shows a graph showing the concentration according to VWF time: RCo of a VWF concentrate lacking ADAMTS13 stored in cassettes or syringes.
  • FIG. 2 illustrates a study of the VWF antigen stability of the VWFLa concentrate.
  • FIG. 2 represents a graph showing the concentration as a function of time of the VWF: Ag of a VWF concentrate containing no ADAMTS13 stored in cassettes or cassettes. syringes.
  • the present invention relates to the use of an ion exchange chromatography medium comprising a large-pore vinyl polymer type resin bearing DEAE (diethylaminoethyl) groups and a buffer comprising trisodium citrate, sodium, calcium chloride, glycine and lysine to reduce the amount of ADAMTS13 present in a solution derived from plasma containing human VWF.
  • DEAE diethylaminoethyl
  • the present invention also relates to a method for reducing the amount of ADAMTS13 present in a solution derived from plasma containing human VWF comprising an ion exchange chromatography step on a large-pore vinyl polymer type resin bearing DEAE moieties. made in a buffer comprising trisodium citrate, sodium chloride, calcium chloride, glycine and lysine.
  • the ion exchange chromatography support is a DEAE-Fractogel® TSK 650 resin (also called DEAE-Toyopearl 650) equilibrated with equilibration buffer comprising 0.01 M trisodium citrate, sodium chloride 0.1 M, 0.001 M calcium chloride, 0.12 M glycine and 0.016 M lysine at pH 7 ⁇ 0.1.
  • DEAE-Fractogel® TSK 650 is a hydrophilic synthetic gel.
  • the support is a copolymer of oligoethylene glycol, glycidinemethacrylate and pentaerythritol dimethacrylate on which are grafted DEAE groups such as -O-CH 2 -CH 2 N + (C 2 H 5 ) 2 HCl, which constitutes an anion exchanger weakly alkaline.
  • DEAE-Fractogel® TSK 650 is available in two particle sizes (after rehydration): Type S (0.025-0.050 mm) and Type M (0.045-0.090 mm); both types can be used for the present invention.
  • the plasma-derived solutions include blood plasma derivatives, such as the cryoprecipitate fraction (unpurified fraction) and derivatives thereof. purified cryoprecipitate.
  • the present invention particularly relates to plasma-derived solutions that may contain VWF.
  • the cryoprecipitated fraction of the plasma, prepurified, optionally having undergone viral inactivation treatment is applied to the balanced ion exchange chromatography column.
  • the fraction retained is then eluted by increasing the concentration of sodium chloride in the 0.14-0.15M buffer.
  • This step makes it possible to reduce the amount of ADAMTS13 by more than 500 times compared to the amount of ADAMTS13 initially contained in the starting plasma sample (Table 1).
  • the quantity of ADAMTS13 present in a solution derived from the plasma containing von Willebrand factor is reduced by carrying out two successive stages of ion exchange chromatography, under the conditions described above, in particular with the balancing buffer described above.
  • the fraction eluted after the use of the first column can be applied again to a second chromatography column identical to the first one, under the same conditions as on the first, except that after elimination of the filtrate and rinsing of the column with the equilibration buffer, the proteins adsorbed on the chromatographic support are eluted by increasing the concentration of sodium chloride of the buffer at 0.15-0.17 M.
  • This additional chromatography allows to reduce the amount of ADAMST13 by more than 2000-fold compared to the amount of ADAMTS13 contained in the starting plasma sample (Table 1).
  • the reduction of the amount of ADAMTS13 is greater than 200 times, 300 times, 400 times, 500 times, 600 times, preferably greater than 700 times, 800 times, 900 times, 1000 times, 1500 times, 2000 2500 times compared to the amount of ADAMTS13 contained in the starting plasma sample.
  • the fraction eluted from the ion exchange chromatography support, or the ion exchange chromatography medium used secondly, according to the embodiment of the invention can then be subjected to a gelatin-Sepharose support affinity chromatography step, in the presence of a balancing buffer identical to the equilibration buffer used for carrying out the step or steps (s). ) of ion exchange chromatography.
  • the gelatin-Sepharose chromatography support has the ability to retain contaminating residual fibronectin molecules.
  • the choice of the gel carrier tuple associated with the gelatin is not an essential characteristic for carrying out this subsequent chromatography step.
  • a support for affinity chromatography it is also possible to use a support chosen from gelatin-Ultrogel®, gelatin-Spherodex® and gelatin-Fractogel®.
  • a gelatin-sepharose® carrier is preferably used. In vitro tests confirmed the stability of the concentrate containing VWF thus obtained when it is dissolved (Example 3).
  • compositions derived from plasma are obtained from compositions having a reduced content of ADAMTS13 protein and which are enriched in VWF.
  • Such compositions because of the time-stability properties of VWF, can be used in liquid form to perform medical treatments by administering VWF intravenously.
  • the subject of the present invention is also the use of a liquid composition with reduced content of ADAMTS13 protein and enriched with VWF, as obtained by the method defined in the present description, for the manufacture of a medicament intended to prevent or prevent to treat a pathology related to a biologically active VWF deficiency.
  • said medicament is in a form adapted to its intravenous administration.
  • said drug is in a lyophilized form, to which the appropriate amount of sterile and pyrogen-free water is added to provide a liquid composition suitable for intravenous administration.
  • said drug is in a liquid form that can be used directly for intravenous administration.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating a disease related to a biologically active VWF deficiency, characterized in that it comprises a step in which a composition enriched with VWF is administered to a patient who requires it. and depleted of ADAMTS13 protein, as obtained according to the method defined in the present description.
  • the step of administering the composition consists of an intravenous administration step.
  • the intravenous administration step consists of a continuous infusion step, that is to say a continuous infusion stage for a duration of at least 8 hours and up to 200 hours. the duration of this step being adapted to the state of the patient.
  • the continuous infusion administration step generally has a duration of from 8 hours to 120 hours, and usually up to 24 hours.
  • the step of administration by continuous infusion is carried out with a single container or bottle of a composition enriched in VWF and depleted in ADAMTS13 obtained according to the method of the invention.
  • a single container containing a single batch of the composition during the entire duration of the continuous infusion administration step is made possible due to the high stability of the VWF in the composition.
  • Therapeutic methods comprising a step of administering a composition enriched with von Willebrand factor are, in themselves, known in the state of the art. Such methods have been described for example by Marti nowitz et al.
  • the composition enriched in VWF and depleted in protein ADAMTS13 is administered to the patient, by continuous infusion, so as to administer to said patient an amount of von Willebrand factor ranging from 20 to 200 VWF: RCo IU / kg, / 24 h.
  • the compositions used, obtained directly or indirectly by the process of the invention advantageously have a VWF content ranging from 10 to 250 IU / ml, for example 100 IU / ml.
  • Plasma Blood was collected in the presence of sodium citrate (4%) or CPD anticoagulant solution (citrate, phosphate, dextrose) and frozen no later than 6 hours after collection. Plasma was obtained after centrifugation, and frozen at -60 ° C and stored at -35 ° C. The batches of plasma contain from 1800 to 2000 liters and are collected in batches of 4000 liters for each implementation of the process. For thawing, the plasma was placed in a chamber at -7 ° C for at least 12 hours to ensure a slow and steady warming and then thawed in a thermostatically controlled chamber at 0-2 ° C with constant stirring. Cryoprecipitate (which represents approximately 9 g / l of plasma) was recovered by cold centrifugation.
  • Cryoprecipitate which represents approximately 9 g / l of plasma
  • cryoprecipitate was redissolved and adsorbed on aluminum hydroxide to remove the main contaminants, i.e. components of the prothrombin complex (particularly Factor VII), Factor XII.
  • the supernatant was then cooled to 15 ° C (which partly eliminates fibrinogen and fibronectin). -Validation inactivation treatment.
  • the solution containing FVIII-VWF was subjected to a solvent-detergent treatment known for its effectiveness against lipid-enveloped viruses (Horowitz et al., 1985, Transfusion, 25, 516-522.) And which comprises an incubation of 8 hours at 25 ° C. in the presence of 0.3% th-n-butyl phosphate (TnBP) and 1% Tween 80. Chromatographic separation method. The first chromatography was carried out on a DEAE-Fractogel (M) TSK 650 (Merk) column.
  • the equilibration buffer contains trisodium citrate (0.01 M), calcium chloride (0.001 M), sodium chloride (0.1 M), glycine (0.12 M) and L -lysine (0.016M). VWF, FVIII and fibronectin are retained by the column; the contaminating proteins (mainly fibrinogen and IgG) weakly or not fixed by the column and the residues of the viral inactivation treatment are removed by several successive washings with the same buffer.
  • the column was used with a linear flow rate of 100 cm / hour.
  • the column adsorbed fraction, containing VWF, is eluted by an increase in the NaCl concentration of the 0.15M buffer.
  • the fraction containing the VWF eluted from this first column is reinjected into a second column, identical to the first and under the same conditions, after a slight dilution with the equilibration buffer, to adjust the ionic strength of the VWF fraction to the equivalent of 0.1 M sodium chloride.
  • the VWF-containing column-adsorbed fraction is eluted by an increase in the NaCl concentration of the 0.15 M buffer.
  • This second eluate is subjected to a third purification step on a column of gelatin-Sepharose CL4B (Pharmacia) equilibrated with the elution buffer of the previous column, to eliminate fibronectin.
  • This affinity chromatography gel has a fibronectin retention capacity of> 5 mg / ml which makes it possible to reduce this contaminant to undetectable quantities ( ⁇ 4 mg / l) in the fraction.
  • the VWF concentrate lacking ADAMTS13 is found in the filtrate of this last stage and can be directly conditioned and lyophilized.
  • the final concentrate obtained requires no addition of stabilizer.
  • the purpose of this example is to measure the reduction factor of ADAMTS13 present in a VWF concentrate made according to Example 1.
  • starting plasma B cryoprecipitate between the solvent / detergent and the first DEAE
  • C eluate of the first DEAE chromatography
  • the ADAMTS concentration of each sample was measured with an IMUBIND® ADAMTS13 ELISA Kit (American Diagnostica) using rabbit anti-human ADAMTS13 antibodies.
  • the ADAMTS13 reduction factor is calculated by dividing the ADAMTS / VWF: RCo value of the fraction by the ADAMTS / VWF: RCo value for the plasma fraction.
  • the reduction factor of ADAMTS13 after the first chromatography is greater than 700. This reduction factor is of the order of 2500 after the second chromatography. By cons the third chromatography does not reduce the amount of ADAMTS13. This example shows the high efficiency of the chromatography columns and buffers used for the removal of ADAMTS13.
  • the objective of this example is to evaluate the biological stability after reconstitution of the freeze-dried VWF concentrate free of ADAMTS13 manufactured according to Example 1 in different containers and in a state of common practice during fractionation of doses in syringe or batch or when administering the product as a continuous infusion using an infusion pump.
  • VWF RCo 1010 Ul / 10 ml bottle
  • VWF RCo: 1000 IU / 10 ml bottle
  • BCS automaton (Dade Behring, Marburg GmbH) for the assays of the ristocetin co-factor activity (VWF: Rco) and the Willebrand Antigen assays (VWF: Ag).
  • VWF Willebrand Antigen Assay
  • VWF reagent Ag Dade Behring (Dade Behring Marburg GmbH) containing: - 1 vial
  • VWF Ag diluent for latex reagent 4ml: solution containing glycine, for the dilution of the reagent Latex
  • the freeze-dried concentrate of VWF lacking ADAMTS13 is a powder to be reconstituted extemporaneously with water for injections.
  • Syringes at TO, the products were reconstituted with the supplied solvent (water for injection) and the equipment (transfer system equipped with a sterilizing filter vent and a filter needle), then transferred to syringes in a fume hood. laminar airflow (Class A), in a controlled atmosphere room (Class C). The study was performed in static conditions for 3 days (72h), the preparations were stored at room temperature and protected from light.
  • VEQ A, VEQ B and the standard plasma were reconstituted with 1 ml of non-cold distilled water and then allowed to stabilize for 1 hour.
  • assay of the VWF RCo activity
  • a standard range was carried out the same day as the assays. Calibration was performed by dilution of the standard with buffer
  • VEQ A and VEQ B controls validated the calibration.
  • the controls were ironed at the end of the passage of the samples corresponding to the syringes, then before those corresponding to the cassettes, thus validating a new reconstitution of the platelet reagent.
  • the standard range was validated by the passage of the VEQ A and VEQ B controls.
  • the VWF present in the sample causes, in the presence of the ristocetin (antibiotic), an agglutination of the stabilized platelets contained in the reagent BC von Willebrand reagent.
  • the agglutination process decreases the turbidity of the reaction mixture.
  • the coagulation device (Dade Behring BCS automaton) measures the change in Optical Density and automatically calculates the cofactor activity of the sample ristocetin in% of normal. We achieved a range of 6 points from standard plasma of 10 to 150% (10, 20, 40, 60, 100 and 150%).
  • VWF reactive BC contains stabilized platelets, ristocetin and EDTA, in freeze-dried form. After reconstitution with 4 ml of distilled water, the reactive BC von Willebrand reagent is allowed to stabilize for 15 minutes without stirring. It is then shaken twice 5 sec vortex very gently, then is placed on the BCS. This must be stirred every 30 min. The NaCl used to dilute the samples is also placed on the BCS.
  • Von Willebrand causes the agglutination of small polystyrene particles coated with specific antibodies (rabbit Ac), fixed not covalent bond.
  • This agglutination is measured by turbidimetry on the BCS. Turbidimetry is directly proportional to the level of VWF Ag present in the sample. A 5-point range was made from standard plasma of 10% to 180% (10, 40, 70, 150 and 180%).
  • Sample Preparation Samples were diluted 1: 10 in sample dilution buffer + bromophenol blue to adjust the VWF: Ag level to about 0.1 IU / ml. The samples were then heated for 30 minutes at 60 ° C.
  • Electrophoresis 30 ⁇ L of samples were deposited in the wells of the agarose gel. As soon as the electrophoresis was stopped, the gel was immersed in a beaker of water distilled and rinsed for at least 1 hour with gentle agitation. The gel was then dried under a stream of cold air and then saturated for 1 hour in the saturation buffer. The gel was incubated overnight with gentle shaking in a bath of polyclonal anti-VWF antibodies bound to alkaline phosphatase (anti-VWF-PA) diluted in 50 mM TBS buffer. After incubation, the gel was incubated, with stirring, with several successive baths of wash buffer, for at least 2 hours. The revealing solution was prepared by adding to 100 ml of 0.1 M Tris pH 9.5, 1 ml of solution A + 1 ml of solution B (solutions of the kit).
  • FIGS. 1 and 2 Stabilities as a function of time according to co-factor activity of ristocetin and von Willebrand antigens are shown in FIGS. 1 and 2.
  • Table 2 Syringe Dosage Results (Raw, Mean, and Standard Deviation)

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Abstract

L'invention consiste en une utilisation d'un support de chromatographie d'échanges d'ions comprenant une résine de type polymère vinylique à larges pores portant des groupements DEAE et d'un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant du facteur von Willebrand humain.

Description

Utilisation d'un support de chromatographie pour réduire la quantité d'ADAMTSI 3 dans une solution dérivée du plasma
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la purification de protéines.
L'invention est en particulier relative à un procédé permettant de réduire la quantité d'ADAMTSI 3 présent dans une solution de facteur von Willebrand (VWF) et à l'utilisation de supports de chromatographie et de tampons spécifiques pour la réduction de la quantité d'ADAMTSI 3 présents dans de tels échantillons.
ART ANTERIEUR
Le facteur von Willebrand (VWF) est la plus grande molécule connue en circulation dans le plasma. Il est constitué d'un ensemble de multimères liés par des ponts S-S, dont l'élément de base a un poids moléculaire voisin de 250 kilodaltons (KDa). La plus petite forme de VWF, dans le plasma, est un dimère de 500 KDa et les formes les plus grandes sont des multimères de ce dimère dont le poids moléculaire peut atteindre 20 millions de daltons. Cet assemblage des sous-unités en multimères peut être spécifique des cellules productrices, le VWF étant synthétisé et polymérisé dans les mégacaryocytes et dans les cellules endothéliales. Ce facteur joue un rôle essentiel dans l'hémostase par deux fonctions distinctes : comme protéine d'adhésion il permet l'adhésion et l'agrégation des plaquettes sanguines sur le sous-endothelium vasculaire (et participe ainsi au processus de l'hémostase primaire au niveau des vaisseaux lésés) et, d'autre part, il assure la stabilisation et le transport du Facteur VIII (FVIII) dans la circulation sanguine. Une déficience congénitale en VWF (quantitative) ou une anomalie structurale de ce facteur (qualitative) entraîne la maladie de Willebrand qui se manifeste par des hémorragies cutanéo-muqueuses. Cette maladie est très hétérogène dans son expression clinique et pose de graves problèmes en cas d'intervention chirurgicale. Le traitement de la maladie de Willebrand s'impose pour corriger les anomalies de l'hémostase primaire (temps de saignement) et de la coagulation (temps de céphaline activé et activité coagulante du FVIII, FVIII : C).
La maladie se traite par thérapie de substitution par des dérivés de plasma humain enrichis en VWF (par exemple la fraction cryoprécipitée du plasma, des concentrés de FVIII contenant suffisamment de VWF (concentré de FVIII/VWF) ou des concentrés de VWF (dépourvus de FVIII).
La maladie de Willebrand peut s'accompagner ou pas d'un déficit en FVIII selon que la protéine est absente ou qualitativement anormale respectivement. Généralement les patients déficients pour ces deux facteurs de la coagulation sont traités avec un concentré de FVIII/VWF. Par contre lorsque le patient déficient en VWF exprime normalement le FVIII il est préférable d'utiliser un concentré de VWF dépourvu de FVIII. Pour ces patients, l'utilisation de tel concentré permet de compenser le seul déficit en VWF et d'éviter les excès de FVIII. Les excès de FVIII peuvent engendrer de graves complications telles que la thrombose veineuse ou l'embolie pulmonaire. Néanmoins, les concentrés de VWF sont généralement très instables en solution si le VWF est dénaturé par des enzymes protéolytiques telles que IΑDAMTS13.
LΑDAMTS13 est une protéase de la famille des métal loprotéases qui est naturellement présente dans le plasma humain. Son rôle est de convertir les longs multimères hyper actifs de VWF en multimère plus petits moins actifs. L'ADAMTS 13 est capable de dénaturer le VWF in vivo mais également in vitro, par exemple dans les solutions dérivées du plasma contenant du VWF, comme les concentrés de VWF ou les concentrés de FVIII/VWF. Bien que ces dérivés du plasma peuvent généralement être conservés sous forme de poudre lyophilisée pendant plusieurs années, la présence d'ADAMTS13 affecte la stabilité du VWF lors de la mise en solution de la poudre lyophilisée. Ce problème de stabilité du VWF exclut certaines formes de traitement thérapeutique, par exemple le traitement par perfusion continue ou discontinue pendant plusieurs jours. Ce mode de traitement permet le maintien de taux circulants constants de VWF permettant d'éviter la survenue de taux en dehors des zones thérapeutiques lorsque l'administration est réalisée par injection discontinue. La Demanderesse a donc cherché à mettre au point des moyens efficaces pour réduire la quantité de protéine ADAMTS13 présente dans des compositions dérivées du plasma contenant du VWF, afin d'accroître leurs propriétés de stabilité dans le temps.
RESUME DE L'INVENTION L'invention a pour objet l'utilisation d'un support de chromatographie d'échanges d'ions comportant une résine de type polymère vinylique à larges pores portant des groupements DEAE et d'un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain et de l'ADAMTS13.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présent dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain comprenant une étape de chromatographie d'échanges d'ions sur une résine de type polymère vinylique à large pores portant des groupements DEAE réalisée dans un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre une étude de la stabilité de l'activité RCo du concentré de VWF. : La figure 1 représente un graphique représentant la concentration en fonction du temps du VWF:RCo d'un concentré de VWF dépourvu d'ADAMTS13 conservé dans des cassettes ou des seringues.
La Figure 2 illustre une étude de la stabilité de l'antigène VWF du concentré de VWFLa Figure 2 représente un graphique représentant la concentration en fonction du temps du VWF:Ag d'un concentré de VWF dépourvu d'ADAMTS13 conservé dans des cassettes ou des seringues.
DESCRIPTION DE L'INVENTION La Demanderesse a trouvé de manière surprenante que certains types de supports de chromatographie d'échanges d'ions utilisés dans des conditions spécifiques possèdent la capacité d'éliminer les molécules de la protéine ADAMTS13, ou de réduire efficacement la quantité de la protéine ADAMTS13, qui est présente dans des compositions enrichies en VWF. Ainsi, présente invention concerne l'utilisation d'un support de chromatographie d'échanges d'ions comprenant une résine de type polymère vinylique à larges pores portant des groupements DEAE (diéthylaminoéthyl) et d'un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain.
La présente invention concerne également un procédé pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présent dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain comprenant une étape de chromatographie d'échanges d'ions sur une résine de type polymère vinylique à large pores portant des groupements DEAE réalisée dans un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine.
Avantageusement, le support de chromatographie d'échanges d'ions est une résine de DEAE-Fractogel® TSK 650 (appelée aussi DEAE-Toyopearl 650) équilibrée avec du tampon d'équilibrage comprenant du citrate trisodique 0,01 M, du chlorure de sodium 0,1 1 M, du chlorure de calcium 0,001 M, de la glycine 0,12 M et de la lysine 0,016 M, à pH 7 ± 0,1.
Le DEAE-Fractogel® TSK 650 est un gel synthétique hydrophile. Le support est un copolymère d'oligoethylèneglycol, de glycidineméthacrylate et de pentaérythritol- diméthacrylate sur lequel sont greffés des groupements DEAE comme -0-CH2- CH2N+(C2Hs)2 HC1 , ce qui constitue un échangeur d'anions faiblement alcalin. Le DEAE-Fractogel® TSK 650 est disponible sous deux tailles de particules (après réhydratation) : le type S (0,025-0,050 mm) et le type M (0,045-0,090 mm) ; les deux types peuvent être utilisés pour la présente invention.
Selon l'invention, les solutions dérivées du plasma englobent les dérivés du plasma sanguin, tels que la fraction cryoprécipitée (fraction non purifiée) et les dérivés purifiés du cryoprécipité. La présente invention concerne en particulier les solutions dérivées du plasma susceptibles de contenir du VWF.
Dans un mode de réalisation préféré, la fraction cryoprécipitée du plasma, prépurifiée, ayant optionnellement subi un traitement d'inactivation virale, est appliquée sur la colonne de chromatographie échangeuse d'ion équilibrée. La fraction retenue est ensuite éluée par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,14-0,15 M. Cette étape permet de réduire la quantité d'ADAMTS13 de plus de 500 fois par rapport à la quantité d'ADAMTS13 initialement contenue dans l'échantillon de plasma de départ (tableau 1 ). Dans un mode de réalisation particulier, on réduit la quantité de ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant le facteur von Willebrand en réalisant deux étapes successives de chromatographie d'échanges d'ions, dans les conditions décites ci-dessus, notamment avec le tampon d'équilibrage décrit ci-dessus.
Conformément au mode de réalisation ci-dessus, la fraction éluée après l'utilisation de la première colonne peut être de nouveau appliquée sur une seconde colonne de chromatographie identique à la première, dans les mêmes conditions que sur la première, excepté qu'après élimination du filtrat et le rinçage de la colonne avec le tampon d'équilibrage, les protéines adsorbées sur le support chromatographique sont éluées par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,15-0,17 M. Cette chromatographie supplémentaire permet de réduire la quantité d'ADAMST13 de plus de 2000 fois par rapport à la quantité d'ADAMTS13 contenue dans l'échantillon plasma de départ (tableau 1 ).
Selon l'invention la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 200 fois, 300 fois, 400 fois, 500 fois, 600 fois, de préférence supérieure à 700 fois, 800 fois, 900 fois, 1000 fois, 1500 fois, 2000 fois, 2500 fois par rapport à la quantité d'ADAMTS13 contenue dans l'échantillon de plasma de départ.
Pour la fabrication d'une composition enrichie en VWF, la fraction éluée à partir du support de chromatographie d'échanges d'ions, ou bien du support de chromatographie d'échanges d'ions utilisé en second lieu, selon le mode de réalisation de l'invention considéré, peut ensuite être soumise à une étape de chromatographie d'affinité sur support de gélatine-sépharose, en présence d'un tampon d'équilibrage identique au tampon d'équilibrage utilisé pour la réalisation de la ou des étape(s) de chromatographie d'échanges d'ions. Le support de chromatographie de gélatine- sépharose a la capacité de retenir les molécules de fibronectine résiduelle contaminantes. Le choix du tupe de support de gel associé à la gélatine n'est pas une caractéristique essentielle pour la réalisation de cette étape de chromatographie ultérieure. : On peut également utiliser, comme support de chromatographie d'affinité, un support choisi parmi la gélatine-Ultrogel®, la gélatine-Spherodex® etla gélatine- Fractogel®. On utilise de préférence un support de gélatine-sépharose®. Des tests in vitro ont confirmé la stabilité du concentré contenant du VWF ainsi obtenu lorsqu'il est mis en solution (exemple 3).
En mettant en œuvre le procédé de réduction de la quantité de protéine ADAMTS13 selon l'invention, on obtient, à partir de diverses solutions liquides issues de plasma, tout particulièrement de plasma humain, des compositions ayant une teneur réduite en protéine ADAMTS13 et qui sont enrichies en VWF. De telles compositions, du fait des propriétés de stabilité dans le temps du VWF, sont utilisables sous une forme liquide pour réaliser des traitements médicaux par administration de VWF par voie intra-veineuse. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition liquide à teneur réduite en protéine ADAMTS13 et enrichie en VWF, telle qu'obtenue par le procédé défini dans la présente description, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une pathologie liée à un déficit en VWF biologiquement actif. Avantageusement, ledit médicament se présente sous une forme adaptée à son administration par voie intra-veineuse. Dans certains modes de réalisation, ledit médicament se présente sous une forme lyophilisée, à laquelle on ajoute la quantité appropriée d'eau stérile et apyrogène afin de réaliser une composition liquide adaptée pour une administration par voie intra-veineuse. Dans d'autres modes de réalisation, ledit médicament se présente sous une forme liquide qui peut être utilisée directement pour l'administration par voie intra-veineuse.
La présente invention est également relative à une méthode pour prévenir ou traiter une maladie liée à un déficit en VWF biologiquement actif, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape dans laquelle on administre, à un patient qui le nécessite, une composition enrichie en VWF et appauvrie en protéine ADAMTS13, telle qu'obtenue selon le procédé défini dans la présente description.
Avantageusement, selon la méthode de traitement ou de prévention ou de traitement ci-dessus, l'étape d'administration de la composition consiste en une étape d'administration par voie intraveineuse. Préférentiellement, l'étape d'administration par voie intra-veineuse consiste en une étape de perfusion continue, c'est-à-dire une étape de perfusion continue pendant une durée d'au moins 8 heures et pouvant aller jusqu'à 200 heures, la durée de cette étape étant adaptée à l'état du patient.
L'étape d'administration par perfusion continue a généralement une durée allant de 8 heures à 120 heures, et usuellement jusqu'à 24 heures.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'étape d'administration par perfusion continue est réalisée avec un unique conteneur ou flacon d'une composition enrichie en VWF et appauvrie en ADAMTS13 obtenue selon le procédé de l'invention. L'utilisation d'un conteneur unique contenant un lot unique de la composition, pendant la totalité de la durée de l'étape d'administration par perfusion continue, est rendue possible du fait de la grande stabilité du VWF dans la composition. Des méthodes thérapeutiques comprenant une étape d'administration d'une composition enrichie en facteur de Willebrand sont, en elles-mêmes, connue dans l'état de la technique. De telles méthodes ont été décrites par exemple par Marti nowitz et al.
(1997, Transfusion Medicine Review, Vol. 1 1 : 56-63) et Marti nowitz et al. (1994, International Journal of Pédiatrie Hematology/Oncology, Vol. 1 : 471 -478).
Généralement, la composition enrichie en VWF et appauvrie en protéine ADAMTS13 est administrée au patient, par perfusion continue, de manière à administrer audit patient une quantité de Facteur de Willebrand allant de 20 à 200 VWF :RCo UI/kg,/24 h. Les composition utilisées, obtenues directement ou indirectement par le procédé de l'invention, possèdent avantageusement une teneur en VWF allant de 10 à 250 Ul/ml, par exemple 100 Ul/ml.
Les exemples suivant illustrent des modes de réalisation de la présente invention sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : fabrication d'un concentré de VWF dépourvu d'ADAMTS13 -Matériau de départ.
Le sang a été prélevé en présence de citrate de sodium (4%) ou de solution anticoagulante CPD (citrate, phosphate, dextrose), et congelé au plus tard 6 heures après son prélèvement. Le plasma a été obtenu après centrifugation, et congelé à - 60 °C puis conservé à -35 °C. Les lots de plasma contiennent de 1800 à 2000 litres et sont rassemblés par lots de 4000 litres pour chaque mise en oeuvre du procédé. En vue de la décongélation, le plasma a été placé dans une chambre à -7°C pendant au moins 12 heures pour assurer un réchauffement lent et régulier puis il est dégelé dans une enceinte thermostatée à 0-2 °C, sous agitation constante. Le cryoprécipité (qui représente environ 9 g/litre de plasma) a été récupéré par centrifugation à froid. Après centrifugation, le cryoprécipité récupéré a été remis en solution et adsorbé sur hydroxyde d'aluminium pour éliminer les principaux contaminants, c'est-à-dire les composants du complexe prothrombinique (particulièrement le Facteur VII), le Facteur XII. Le surnageant a été ensuite refroidi à 15°C (ce qui élimine en partie le fibrinogène et la fibronectine). -Traitement d'inactivation virale.
La solution contenant le FVIII-VWF a été soumise à un traitement par solvant- détergent connu pour son efficacité contre les virus à enveloppe lipidique (Horowitz et al., 1985, Transfusion, 25, 516-522.) et qui comprend une incubation de 8 heures à 25 °C en présence de 0,3 % th-n-butyl phosphate (TnBP) et de 1 % de Tween 80. -Procédé de séparation chromatoqraphique. La première chromatographie a été réalisée sur une colonne de DEAE- Fractogel(M) TSK 650 (Merk). Le tampon d'équilibrage contient du citrate trisodique (0,01 M), du chlorure de calcium (0,001 M), du chlorure de sodium (0,1 1 M), de la glycine (0,12 M) et de la L-lysine (0, 016 M). Le VWF, le FVIII et la fibronectine sont retenus par la colonne ; les protéines contaminantes (principalement le fibrinogène et des IgG) faiblement ou pas fixées par la colonne et les résidus du traitement d'inactivation virale sont éliminés par plusieurs lavages successifs avec le même tampon.
La colonne a été utilisée avec une vitesse de flux linéaire de 100 cm/heure. La fraction adsorbée sur la colonne, contenant du VWF, est éluée par une augmentation de la concentration en NaCI du tampon à 0,15M.
La fraction contenant le VWF élue de cette première colonne est réinjectée sur une seconde colonne, identique à la première et dans les mêmes conditions, après une légère dilution avec le tampon d'équilibrage, pour ajuster la force ionique de la fraction VWF à l'équivalent de 0,1 1 M en chlorure de sodium.
La fraction adsorbée sur la colonne, contenant du VWF est éluée par une augmentation de la concentration en NaCI du tampon à 0,15 M.
L'analyse électrophorétique de cet éluat révèle la présence d'une légère contamination par de la fibronectine et de l'inter-alpha trypsine inhibiteur (ITI). Ce second éluat est soumis à une troisième étape de purification sur colonne de gélatine-Sepharose CL4B (Pharmacia) équilibrée avec le tampon d'élution de la colonne précédente, pour éliminer la fibronectine.
Ce gel de chromatographie d'affinité a une capacité de rétention de la fibronectine de > 5 mg/ml ce qui permet de réduire ce contaminant à des quantités indétectables (< 4 mg/l) dans la fraction.
Le concentré de VWF dépourvu d'ADAMTS13 se retrouve dans le filtrat de cette dernière étape et peut être directement conditionné et lyophilisé.
Le concentré final obtenu ne nécessite aucune addition de stabilisant.
Exemple 2 : mesure de la réduction de la quantité d'ADAMTS13 dans la concentré de VWF
L'objectif de cet exemple est de mesurer le facteur de réduction des ADAMTS13 présent dans un concentré de VWF fabriqué selon l'exemple 1 .
- Matériau de départ. Quatre fractions correspondant aux solutions/concentrés avant et après chaque étape de chromatographie de l'exemple 1 ainsi qu'une fraction du plasma de départ ont été prélevées. A chaque fraction a été prélevé un échantillon de 1 mL étiquetés A, B, C, D et E.
A : plasma de départ B : cryoprécipité entre le Solvant/détergent et la première DEAE C : éluat de la première chromatographie DEAE
D : éluat de la deuxième chromatographie DEAE
E : fraction de la colonne Gelatine-Sépharose contenant le VWF
- Dosage des ADAMTS13.
La concentration d'ADAMTS de chaque échantillon a été mesurée avec un kit IMUBIND® ADAMTS13 ELISA (American Diagnostica) utilisant des anticorps de lapin anti-ADAMTS13 humain.
Parallèlement la concentration de VWF :RCo a été mesurée (voir le protocole du dosage dans l'exemple 3).
- Résultats
Les résultats des différents dosages sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous.
Tableau 1 : dosage des ADAMTS13 et du VWF aux différentes étapes du procédé de l'exemple 1 et calcul du facteur de réduction des ADAMTS13
NB : Le facteur de réduction des ADAMTS13 est calculé en divisant la valeur ADAMTS/VWF:RCo de la fraction par la valeur ADAMTS/VWF:RCo pour la fraction de plasma.
- Conclusion
Le facteur de réduction des ADAMTS13 après la première chromatographie est supérieur à 700. Ce facteur de réduction est de l'ordre de 2500 après la deuxième chromatographie. Par contre la troisième chromatographie ne permet pas de réduire la quantité d'ADAMTS13. Cet exemple montre la grande efficacité des colonnes de chromatographie et des tampons utilisés pour l'élimination des ADAMTS13.
Exemple 3 : Stabilité du concentré de VWF dépourvu d'ADAMTS13
L'objectif de cet exemple est d'évaluer la stabilité biologique après reconstitution du concentré lyophilisé de VWF dépourvu d'ADAMTS13 fabriqué selon l'exemple 1 dans différents contenants et en condition de pratique courante lors de fractionnement des doses en seringue ou en discontinue ou lors de l'administration du produit en perfusion continue à l'aide d'une pompe à perfusion. Matériel
Médicaments testés : Trois lots différents de concentrés de VWF ont été testés : - Lot n°1 : VWF:RCo 1010 Ul/Flacon de 10 ml
- Lot n°2 : VWF:RCo 1080 Ul/Flacon de 10 ml
- Lot n°3 : VWF:RCo: 1000 Ul/Flacon de 10 ml
Le matériel de perfusion utilisé - Pompe à perfusion CADD PRIZM™ VIP (SIMS Deltec, Inc, St Paul, MN,
USA)
- Réservoirs MEDICATION CASSETTE™ 50 ml en polychlorure de vinyl
• Prolongateur DeIt pour pompe avec valve anti-syphonage 1 14 cm/45 in en polychlorure de vinyl - Seringues 3P Plastipak 10ml Luer Lock H81 OLL en polypropylène
Automate utilisé pour les dosages : automate BCS (Dade Behring, Marburg GmbH) pour les dosages de l'activité co-facteur de la ristocétine (VWF:Rco) et les dosages du Willebrand Antigène (VWF:Ag).
Dosage de l'activité cofacteur de la ristocétine (VWF:Rco)
> BC Réactif von Willebrand (Dade Behring Marburg GmbH).
> NaCI utilisé pour la dilution des échantillons
> Dilution des échantillons: « Bovin Sérum » minimum 98%. L'albumine (Bovin Sérum) a été préalablement diluée dans du sérum physiologique. (NaCI 0,9%)
Dosage du Willebrand Antigène (VWF:Ag)
> Réactif VWF: Ag Dade Behring (Dade Behring Marburg GmbH) contenant: - 1 flacon VWF : Ag diluant pour réactif latex 4ml : solution contenant de la glycine, pour la dilution du réactif Latex
• 1 flacon VWF: Ag de réactif latex 2ml : suspension de petites particules de polystyrène recouvertes d'anticorps (de lapin) anti-VWF humain
• 1 flacon VWF: Ag tampon 5ml : tampon glycine > Conservation après reconstitution : 15 jours à + 21+ 8°C
> Tampon « Owren Kroller » sert à la dilution des échantillons
> Dilution des échantillons: « Bovin Sérum » minimum 98%.
L'albumine (Bovin Sérum) a été préalablement diluée dans du sérum physiologique (NaCI 0,9%). Dosage des Multimères
Les réactifs et Tampons sont les suivants : Tampon TBS 50 m M, pH 7,4 • 5% lait écrémé = Tampon de saturation - 0,05% Tween 20 = Tampon de lavage
Anticorps polyclonaux anti-VWF couplés à la phosphatase alcaline 634.0052 Kit de révélation - Biorad (stocké à -20 °C)
Plasma Standard et Contrôles qualité Plasma Standard Humain (Dade Behring Marburg GmbH) : étalonnage par rapport au standard OMS 97/586. Contrôles:
- VEQ A (Contrôle Normal) (Dade Behring Marburg GmbH)
Valeurs cibles : RCo: 71 % (64-79) et Ag: 90% (83-97)
- VEQ B (Contrôle Pathologique) (Dade Behring Marburg GmbH)
Valeurs cibles : Rco: 22% (17-27) et Ag: 33% (30-35)
Conditions techniques étudiées
Température ambiante : 23± 2°C
A l'abri de la lumière
Reconstitution sous hotte à flux d'air laminaire (classe A ; ISO 5), dans une salle à atmosphère contrôlée (Classe C ; ISO 7). (Selon les Bonnes Pratiques de Fabrication : lignes directives particulières : Fabrication des Médicaments stériles ;
Bulletin officiel N ° 2007/1 bis).
Méthode Préparation des échantillons - Conditions techniques étudiées
Au total, six préparations ont été testées : chaque lot a été testé à la fois dans une seringue et une cassette.
Le concentré lyophilisé de VWF dépourvu d'ADAMTS13 est une poudre à reconstituer extemporanément avec de l'eau pour préparations injectables.
Seringues : à TO, les produits ont été reconstitués avec le solvant fourni (eau pour préparation injectable) et le matériel (système de transfert muni d'un évent à filtre stérilisant et une aiguille-filtre), puis transférés dans les seringues sous hotte à flux d'air laminaire (classe A), dans une salle à atmosphère contrôlée (Classe C). L'étude a été réalisée en conditions statiques pendant 3 jours (72h), les préparations ont été conservées à température ambiante et à l'abri de la lumière.
Cassettes : à TO, les produits ont été reconstitués dans les mêmes conditions que pour les seringues. La première étape a été réalisée dans des conditions « statiques », de 0 à 48 heures. La deuxième étape, de 48 à 120 heures a été réalisée dans des conditions « dynamiques » : la pompe a été mise en fonctionnement à J2 et maintenue à un débit faible (0,1 ml/heure) jusqu'à la fin de l'étude (120ème heure). Les préparations ont été conservées à température ambiante et à l'abri de la lumière.
Préparation des échantillons :
Les prélèvements pour les dosages du VWF:RCo et VWF:Ag ont été effectués juste après la reconstitution (TO) puis à :
• T12, 24, 36, 48, 60, 72 heures après reconstitution pour les seringues
T12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 heures après reconstitution pour les cassettes.
Un échantillon (250 μl) a été prélevé en triple pour chaque point, dans des microtubes Eppendorf numérotés et gradués, puis immédiatement congelé à - 80 °C.
Les prélèvements pour le dosage de multimères ont été effectués à :
• TO, 72 Heures pour les seringues
TO, 60, 120 Heures pour les cassettes. Les prélèvements ont été immédiatement congelés à -80°C.
Le plasma standard et les contrôles
Les contrôles VEQ A, VEQ B et le plasma standard ont été reconstitués avec 1 ml d'eau distillée non froide puis sont laissés à stabiliser pendant 1 heure. Pour le dosage de l'activité VWF:RCo une gamme étalon a été réalisée le jour même des dosages. La calibration a été réalisée par une dilution du standard avec du tampon
Owren Koller automatiquement par le BCS. Le passage des contrôles VEQ A et VEQ B a permis de valider la calibration. Les contrôles ont été repassés à la fin du passage des échantillons correspondants aux seringues, puis avant ceux correspondants aux cassettes, validant ainsi une nouvelle reconstitution du réactif plaquettes. Pour le dosage de l'Antigène Willebrand, la gamme étalon a été validée par le passage des contrôles VEQ A et VEQ B.
Dosage du VWF:Rco
Principe du dosage : le VWF présent dans l'échantillon provoque, en présence de la ristocétine (antibiotique), une agglutination des plaquettes stabilisées contenues dans le réactif BC réactif von Willebrand. Le processus d'agglutination diminue la turbidité du mélange réactionnel. L'appareil de coagulation (automate Dade Behring BCS) mesure la modification de la Densité Optique et calcule automatiquement l'activité cofacteur de la ristocétine de l'échantillon en % de la normale. Nous avons réalisé une gamme en 6 points à partir du plasma standard de 10 à 150% (10, 20, 40, 60, 100 et 150%).
Méthode : le BC réactif VWF contient des plaquettes stabilisées, de la ristocétine et de l'EDTA, SOUS forme lyophilisée. Après reconstitution avec 4 ml d'eau distillée, le réactif BC réactif von Willebrand est laissé 15 min à stabiliser sans agiter. Il est ensuite agité 2 fois 5 sec au vortex très doucement, puis est posé sur le BCS. Ce dernier doit être agité toutes les 30 min. Le NaCI servant à la dilution des échantillons, est également posé sur le BCS.
Dosage du VWF: Ag Principe du dosage : l'addition de réactif à l'échantillon qui contient l'antigène de
Von Willebrand entraîne l'agglutination des petites particules de polystyrène recouvertes d'anticorps spécifiques (Ac lapin), fixés pas liaison covalente.
Cette agglutination est mesurée par turbidimétrie sur le BCS. La turbidimétrie est directement proportionnelle au taux d'Ag VWF présent dans l'échantillon. Une gamme en 5 points a été réalisée à partir du plasma standard de 10% à 180% (10, 40, 70, 150 et 180%).
Méthode : la totalité du flacon diluant a été versée dans le flacon de réactif latex, puis mise sous agitation en évitant les bulles. Après 15 min de repos à température ambiante, le mélange a été déposé sur l'automate.
Traitement des échantillons
Les échantillons ont été décongelés 5 min à 37°C puis agités au vortex et enfin dilués au 1/100ème dans du « Bovin Sérum » Minimum 98% (préalablement diluée sans du sérum physiologique). Après agitation au vortex les échantillons sont déposés sur le BCS.
Les Multimères
Préparation des échantillons : les échantillons ont été dilués au 1/10ème en tampon de dilution des échantillons + bleu de bromophénol de façon à ajuster le taux de VWF:Ag à environ 0,1 Ul/ml. Les échantillons ont été ensuite chauffés 30 minutes à 60 °C.
Electrophorèse : 30 μL d'échantillons ont été déposés dans les puits du gel d'agarose. Dès l'arrêt de l'électrophorèse, le gel a été plongé dans un bêcher d'eau distillée et rincé au moins 1 heure sous agitation légère. Le gel a été ensuite séché sous courant d'air froid puis a été saturé 1 heure dans le tampon de saturation. Le gel a été incubé pendant une nuit, sous agitation douce, dans un bain d'anticorps anti-VWF polyclonaux lié à la phosphatase alcaline (anti-VWF-PA) dilués en tampon TBS 50 mM. Après incubation, le gel a été incubé, sous agitation avec plusieurs bains successifs de tampon de lavage, durant au moins 2 heures. La solution de révélation a été préparée en ajoutant à 100 ml de Tris 0,1 M pH 9,5, 1 ml de solution A + 1 ml de solution B (solutions du kit).
Expression et analyse des résultats
Exploitation des résultats pour VWF:Rco et VWF:Ag : pour l'analyse statistique une méthode de régression linéaire a été utilisée répondant à une réaction d'ordre 0, la plus simple : y = a + bx. On a vérifié qu'il n'y ai pas de différence significative entre les pentes à l'aide du test de Student, avec t 0,05 pour N-2 dd.
Exploitation des résultats des Multimères : Chaque plaque a été « scannée » afin d'obtenir un tracé densitométrique des bandes correspondant aux différents multimères. Pour chaque bande, l'intégration a été exprimée en pourcentage de la surface totale. Les bandes ont été identifiées de 1 à X, de la plus légère à la plus lourde. Les résultats sont donnés en pourcentage de la totalité :
• des multimères de la 15θmθ bande incluse à la Xème (> 15-mères)
• des multimères de la 10θmθ bande incluse à la Xème (> 10-mères)
• des multimères de la 5θmθ bande incluse à la Xème (> 5-mères)
Résultats
Résultats des contrôles : données non montrées
Résultats des dosages Après reconstitution avec 10 ml d'eau pour préparations injectables, un flacon contient 1000 Ul de facteur Willebrand humain ce qui correspond à une activité co- facteur de la ristocétine égale à 100UI/ml. Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations émises par la FDA (Q1 D) et l'EMEA (CPMP/ICH/420/02) concernant l'évaluation de la stabilité de médicaments après reconstitution. Les résultats sont exprimés dans les tableaux n °2 et 3 pour les données brutes.
Les stabilités en fonction du temps selon l'activité co-facteur de la ristocétine et selon le Willebrand antigènes sont représentés dans les figures n °1 et 2. Tableau 2: Résultats des dosages des seringues (Données brutes, Moyennes et Ecart-type)
Tableau 3: Résultats des dosages des cassettes (Données brutes, Moyennes et Ecart-type)
Les tests sur les pentes de régression ne sont pas significativement différentes de zéro avec α = 5% et p>0,05 sous l'hypothèse de variations aléatoires et non normales cela confirme l'absence d'un phénomène de dégradation significatif des paramètres étudiés (VWF:RCo et VWF:Ag) dans les délais (72h et 12Oh) et les conditions de l'essai.
Résultat des multimères
Les résultats des multimères sont représentés dans le tableau n°4. Tableau 4 : Résultats des multimères
Lot Seringue/Cassette Temps(heure) Multimères 1,5% (%PN)
> 15 > 10 > 5
S1 0 54 71 93
S1 72 43 63 91
1 K1 0 39 68 m
K1 SO 31 sa »o
K1 120 36 58 BS
S2 0 38 61 94
S2 72 29 47 76
2 K2 TO θâ sa 91
K2 6Q 30 5δ m
K≥ 120 39 64 m
S3 0 48 63 95
S3 72 36 55 89
3 KS D 63 74 m
K3 eo 61 75 05
K3 150 80 77 08
Aucune différence significative n'est observée sur les différents multimères (Haut
Poids Moléculaire, Intermédiaire et Faible Poids Moléculaires) tout au long de l'étude dans les différents contenants (seringue et cassette).
Conclusion Les résultats de notre étude ont montré la stabilité biologique (qualitative et quantitative) du concentré lyophilisé de VWF dépourvu d'ADAMTS13 reconstitué pour la période étudiée (durant 72h pour les seringues et 12Oh pour les cassettes) dans les conditions opératoires prédéfinies.
Ces résultats ont montré qu'il est possible de fractionner des doses en seringues (administrées en pédiatrie par exemple) ; et de mettre en place d'éventuelles administrations automatisées de bolus au moyen d'une pompe à perfusion voire de la perfusion continue dans la maladie de Willebrand (comme cela est déjà fait pour l'Hémophilie)

Claims

Revendications
1. Utilisation d'un support de chromatographie d'échanges d'ions comprenant une résine de type polymère vinylique à larges pores portant des groupements DEAE et d'un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant du facteur von Willebrand humain.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le support de chromatographie d'échanges d'ions est une colonne de DEAE-Fractogel®.
3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le tampon de la chromatographie comprend du citrate trisodique 0,01 M, du chlorure de calcium 0,001 M, de la glycine 0,12 M et de la lysine 0,016 M et du chlorure de sodium en concentration variant de 0,1 1 M à 0,17 M.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la fraction qui s'est adsorbée sur le support de chromatographie est éluée par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,14-0,17 M.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que le pH du tampon est compris entre 6,9 et 7,1 .
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que IΑDAMS13 est éliminé par deux étapes successives de séparation chromatographique utilisant ledit support de chromatographie d'échanges d'ions et ledit tampon.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 200 fois par rapport à la quantité d'ADAMSTI 3 du plasma de départ.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 500 fois par rapport à la quantité d'ADAMSTI 3 du plasma de départ.
9. Procédé pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présent dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain comprenant une étape de chromatographie d'échanges d'ions sur une résine de type polymère vinylique à large pores portant des groupements DEAE réalisée dans un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la chromatographie d'échanges d'ions est un support de DEAE-Fractogel®.
1 1. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que le tampon de la chromatographie comprend du citrate trisodique 0,01 M, du chlorure de calcium 0,001 M, de la glycine 0,12 M et de la lysine 0,016 M et du chlorure de sodium en concentration variant de 0,1 1 M à 0,17 M.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 1 1 , caractérisé en ce que la fraction qui s'est adsorbée sur le support de chromatographie est éluée par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,14-0,17 M.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que le pH du tampon est compris entre 6,9 et 7,1.
14. Procédé selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que IΑDAMS13 est éliminé par deux étapes successives de séparation chromatographique utilisant ledit support de chromatographie d'échanges d'ions et ledit tampon.
15. Procédé selon l'une des revendications 9 à 14, caractérisé en ce que la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 200 fois par rapport à la quantité d'ADAMSTI 3 du plasma de départ.
16. Procédé selon l'une des revendications 9 à 15, caractérisé en ce que la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 500 fois par rapport à la quantité d'ADAMSTI 3 du plasma de départ.
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