JP2010519214A

JP2010519214A - 新規インドール誘導化合物およびそれを含有する薬剤組成物

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Publication number: JP2010519214A
Application number: JP2009549836A
Authority: JP
Inventors: ルジューヌ、ファブリス; タージ、ジャマル; グリアソン、デイビッド; リバル、クリスティアン; モトー−ベッツェル、フローランス
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2007-02-19
Filing date: 2008-02-19
Publication date: 2010-06-03
Anticipated expiration: 2028-02-19
Also published as: CA2677877A1; ES2569478T3; JP5544170B2; CN101652364A; EP2121685B1; FR2912746B1; US20110003843A1; WO2008101935A3; EP2121685A2; FR2912745A1; WO2008101935A2; US8895726B2; FR2912746A1; CN101652364B; CA2677877C

Abstract

本発明は、下記一般式(II)で示されるインドール誘導体化合物に関する。
【化２３】

式中、Ｘは、Ｎ，ＣＲ８、またはＮ⁺Ｒ８を意味し；ここで、Ｒ８は、水素原子、ヒドロキシルもしくはアルキルもしくはメトキシ基（場合によりフェニル基で置換されていてもよい）を意味し；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、水素原子またはハロゲン原子または場合により置換されていてもよいアルキル、アミン、アルケン、エステル、スルホンアミド、エーテルまたはベンジル基を意味し；Ｒ５は水素原子または場合により置換されていてもよいアルキル、アミン、ベンジル基を意味し；Ｒ６は、場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基を意味し；Ｒ７は、水素原子または場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基を意味し、環Ａがｂ位置にある時にはＲ７は存在せず；Ａは環を意味し；Ｒ９およびＲ１０は、一緒に炭素結合を意味するか、または独立して、Ｒ１１、ＯＲ１１、ＳＲ１１基を意味し、ここで、Ｒ１１は水素原子、場合により置換されていてもよく、１もしくは２以上のイオウ、酸素もしくは窒素原子を含有していてもよい飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３アルキル基を意味する。本発明はまた、該化合物の薬剤に許容される塩、それらの異性体および／またはそれらの混合物；かかる化合物を含む薬剤組成物；ならびにかかる化合物の、早期終止コドンの発生を引き起こす少なくとも１つの突然変異に起因する遺伝子病の治療用薬剤の製造への使用にも関する。

Description

早期停止コドンを有するｍＲＮＡの分解過程（ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構、ＮＭＤ）は、今日まで研究されてきたすべての真核生物において同定された定性的な制御過程である（CONTI and IZAURRALDE, 2005; MAQUAT, 2004a）。このメカニズムの役割の１つは、機能を有しないか、またはその機能が当該細胞に対して有害かもしれない、端欠（末端が途切れた）タンパク質の合成を防止するように、中途終止コドン（ＰＴＣ）を有するｍＲＮＡを分解することである。また、ＮＭＤ経路は、酵母、ショウジョウバエ（ドロソフィラ）および哺乳動物における遺伝子調節に関与することも同定された（HE et al., 2003; MENDELL et al., 2002; REHWINKEL et al., 2005; SUREAU et al., 2001; WOLLERTON et al., 2004）。

哺乳動物細胞において、ＮＭＤはプレメッセンジャーＲＮＡのスプライシング後に起こり、ほとんどの場合、エクソン−エクソン接合部から２０〜２４ヌクレオチド上流に固定されたタンパク質複合体により調節される（Conti and Izaurralde, 2005; Lejeune and Maquat, 2005; Maquat 2004b）。エクソン接合部複合体（exon-junction complex, ＥＪＣ）と呼ばれるこのタンパク質複合体は、ＮＭＤにおいて現在まで特性決定がなされていない、決定的役割を果たす残留ＵＰＦタンパク質を補充（リクルート）すると考えられている。《第１翻訳回路》（Ishigaki et al., 2001）と呼ばれる期間中に、ＰＴＣが認識され、標的ｍＲＮＡが、ｈＸＲＮ１およびｈＸＲＮ２／ｈＲＡＴ１のようなエキソリボヌクレアーゼおよびキャップの除去を含む５'から３'方向の消化と、脱アデニル化およびエキソソームを含む３'から５'方向の消化とにより分解される（Chen and Shyu, 2003; Couttet and Grange, 2004; Lejeune et al., 2003）。

ＵＰＦ１はＮＭＤ中にリン酸化／脱リン酸化回路を受けるリンタンパク質である（Ohnishi et al., 2003; Page et al., 1999; Pal et al., 2001）。ＵＰＦ１が酵母中（Czaplinski et al., 1998）および哺乳動物中（Kashima et al., 2006）で翻訳終了因子と相互作用し、従ってＥＪＣと翻訳終了複合体との間の接続体もしれないことが実証された。ｈＵＰＦ１とキャップ結合性タンパク質ＣＢＰ８０との間の直接相互作用が哺乳動物細胞で最近実証され（Hosoda et al., 2005）、これはｈＵＰＦ１が前記第１翻訳回路の前またはその間に複雑な相互作用を確立することを示している。ｈＵＰＦ１のリン酸化がＰＩ３に関係するキナーゼであるｈＳＭＧ１により行われ（Page et al., 1999; Pal et al., 2001; Yamashita et al., 2001）、ｈＵＰＦ２およびｈＵＰＦ３の存在を必要とする（Kashima et al., 2006）ことが実証された。これに対して、ｈＵＰＦ１の脱リン酸化は、ｈＳＭＧ５、ｈＳＭＧ６、ｈＳＭＧ７および(ＰＰ)−２Ａホスファターゼタンパク質からなる多タンパク質複合体の存在を必要とする（Chiu et al., 2003; Ohnishi et al., 2003）。ｈＳＭＧ５およびｈＳＭＧ７タンパク質は、その画分がプロセシングボディー（processing body）(Ｐボディー) 中に存在する細胞質中に主に局在化している（Unterholzner and Izaurralde, 2004）。ｈＳＭＧ６も細胞質タンパク質であるが、これは、Ｐボディーとは異なると思われるがその性質はまだわかっていない或る種の細胞質フォーカス中に集中している（Unterholzner and Izaurralde, 2004）。

《Ｐボディー》は高等および下等真核細胞中で説明されてきた（Cougot et al., 2004; Sheth and Parker, 2003）。哺乳動物では、これらの細胞質構造はＤＣＰ１ａ（Ingelfinger et al., 2002）、ＤＣＰ２（Ingelfinger et al., 2002; van Dijk et al., 2002）、ＨＥＤＬＳ（Fenger-Gron et al., 2005）とも呼ばれるＧＥ１（Yu et al., 2005）、ｐ５４／ＲＣＫ（Cougot et al., 2004）、デアデニラーゼＣＣＲ４（Cougot et al., 2004）、ＸＲＮ１（Bashkirov et al., 1997）、ＲＮＡに関係するプロセスの異なる側面に関与するＬＳＭ１−７複合体（Cougot et al., 2004; Ingelfinger et al., 2002）、ならびにｈＵＰＦ１、ｈＳＭＧ５およびｈＳＭＧ７であるＮＭＤマシナリーの構成要素（Fukuhara et al., 2005; Unterholzner and Izaurralde, 2004）のようなキャップを除去するための作用機序の構成要素を含むｍＲＮＡの分解に関与する複数の因子を含有する。Ｐボディーの機能はまだ未確定であるが、非翻訳ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの分解（Brengues et al., 2005; Pillai et al., 2005; Teixeira et al., 2005）、ならびに／またはＲＮＡの分解部位（Cougot et al., 2004; Sheth and Parker, 2006）に関与するタンパク質のための貯蔵区画として使用されているのかもしれない。

今日、人の遺伝子病の１／３近くは早期停止コドンの出現に起因するようである（Frischmeyer and Dietz, 1999; Kuzmiak and Maquat, 2006）。症例の大多数では、停止コドンは、それを含んでいるｍＲＮＡのＮＭＤ作用機序による分解を引き起こす。その結果、関連遺伝子の発現の欠如を生じ、問題の突然変異が機能的端欠タンパク質（functional truncated protein）の翻訳が可能である場合であっても、そうである。このような病因を抱えた患者のＮＭＤ作用機序を阻害することにより、機能的端欠タンパク質の発現を回復することが可能になるように思われるので、これは興味ある道筋となる。

本発明者らは、特定のインドール誘導体がin vitroおよびin vivoでＮＭＤを特異的に阻害することができ、この化合物がドゥシャンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に罹患した患者由来の細胞系における中途停止コドンを有するジストロフィンのｍＲＮＡ発現レベルの増大を可能にすることを示した。

よって、本発明の第１の目的は、下記一般式ＩＩに対応するインドール誘導体化合物ならびに該化合物の薬剤に許容される塩、それらの異性体および／またはそれらの混合物に関する。

式中、
・Ｘは、Ｎ，ＣＲ８、または無水塩基Ｎ⁺Ｒ８を意味し；
・ここで、Ｒ８は、水素原子、ヒドロキシルもしくはアルキルもしくはメトキシ基（場合によりフェニル基で置換されていてもよい）を意味し、好ましくは、Ｒ８は水素原子を意味し；
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、水素原子またはハロゲン原子または場合により置換されていてもよいアルキル、アミン、アルケン、エステル、スルホンアミド、エーテル基、例えば、メトキシもしくはトリフルオロメトキシ、またはベンジル基を意味し；
・Ｒ５は水素原子または場合により置換されていてもよい飽和もしくは不飽和アルキル基、アミン、ベンジル基を意味し；
・Ｒ６は、場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基、好ましくはメチルもしくはエチル基を意味し、より好ましくは、Ｒ６はメチル基を意味し；
・Ｒ７は水素原子または場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基を意味し、環Ａがｂ位置にある時にはＲ７は存在せず；
・Ｒ９およびＲ１０は、一緒に炭素結合を意味するか、または独立して水素原子、Ｒ１１、ＯＲ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１Ｒ１２基を意味し、
ここで、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して水素原子、酸素原子、場合により置換されていてもよく、１もしくは２以上のイオウ、酸素もしくは窒素原子を含有していてもよい飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３アルキル基を意味する。好ましくは、Ｒ１１および／またはＲ１２は、置換アルキル基、特にハロゲン、好ましくはフッ素で置換されたアルキル基を意味する。

Ａは、Ａがａまたはｂ位置にある時には、次式に対応する環を意味する。

ここで、
Ｒ１は水素、酸素もしくはハロゲン原子、または場合により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖および／もしくは不飽和アルキルもしくはアミン基を意味し、そして
ＺはＲ１基を意味する。

「ハロゲン原子」とは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ基を意味し、より具体的にはＣｌである。
「不飽和アルキル基」は、少なくとも１つの二重結合を有するアルキル基を意味する。

有利には、ＸはＮまたは無水塩基Ｎ⁺Ｒ８を意味する。
Ｘが無水塩基Ｎ⁺Ｒ８を意味し、Ｒ５が水素を意味する場合、下記の２つの形態の間の平衡が成立する。

有利には、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、水素原子またはハロゲン原子または場合により置換されていてもよいアルキル、アミン、アルケンもしくはベンジル基を意味する。

さらに有利には、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、水素原子またはハロゲン原子またはＣ１〜Ｃ４アルキル基を意味し、好ましくはＲ２、Ｒ３およびＲ４は水素原子を意味する。

好ましくは、Ｒ２、Ｒ３および／またはＲ４は互いに独立して、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩよりなる群から選ばれたハロゲン原子を意味し、好ましくはこのハロゲン原子はＣｌ原子である。

有利には、Ｒ５は、水素原子、またはメチル、エチル、プロピルもしくはブチル基のような飽和もしくは不飽和アルキル基を意味し、より好ましくは、Ｒ５は水素原子を意味する。

有利には、Ｒ７はメチルまたはエチル基を意味し、より好ましくは、Ｒ７はメチル基を意味する。
有利には、Ｒ１は水素、酸素またはハロゲン原子を意味する。

有利には、Ｒ９および１０は互いに独立して、水素原子、Ｒ１１、ＯＲ１１またはＳＲ１１基を意味する。
第１の具体的態様では、Ｒ９が水素原子以外の基を意味する場合に、Ｒ１０は水素原子を意味する。

有利には、Ｒ９はＯＲ１１基を意味し、ここでＲ１１は水素原子、場合により置換されていてもよく、１もしくは２以上のイオウ、酸素もしくは窒素原子を含有していてもよい飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、好ましくはメチル基を意味する。
好ましくは、一般式Ｉの化合物は次式に合致する。

第２の具体的態様では、Ｒ１０が水素原子以外の基を意味する場合に、Ｒ９は水素原子を意味する。
有利には、Ｒ９およびＲ１０はどちらも水素原子を意味する。そうなると、一般式ＩＩの化合物は次の一般式Ｉａに合致する。

ここで、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｘおよび環Ａは先に定義したとおりである。
一般式Ｉａの好ましい化合物は５,８−ジメチル−６−(５−メチルピリジン−２−イルアミン)イソキノリンである。

一般式Ｉａの別の好ましい化合物は、５,８−ジメチル−６−(ピリジン−２−イルアミン)−２Ｈ−イソキノリン−１−オンである。
好ましくはＲ９およびＲ１０は水素を意味し、ＸはＮまたは無水塩基Ｎ⁺Ｒ８を意味する。

第３の具体的態様では、Ｒ９およびＲ１０は一緒に炭素結合を意味し、そうなると一般式ＩＩの化合物は下記一般式Ｉｂに合致する。

ここで、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｘおよび環Ａは先に定義したとおりである。
さらに有利には、環Ａはａ位置にある。
第４の具体的態様では、環Ａは次式を意味する。

ここで、Ｒ１は水素、酸素もしくはハロゲン原子、または場合により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖および／もしくは不飽和アルキルもしくはアミン基を意味する。
環Ａが次式を有する場合、

それは次のいずれかの基を平等に意味する。

ここでＲ１３は水素原子または場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基を意味し、Ｒ１は先に定義したとおりである。
有利には、環Ａは下記の基を意味する。

ここで、Ｒ１は酸素原子、アミン基または場合により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖および／もしくは不飽和アルキル基を意味し、Ｒ１３は場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基を意味する。
さらにより有利には、環Ａは下記の基を意味する。

ここで、Ｒ１は水素、酸素もしくはハロゲン原子、または場合により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖および／もしくは不飽和アルキルもしくはアミン基、好ましくは水素原子またはハロゲン、好ましくは塩素原子を意味する。
別の好ましい態様では、Ａは下記よりなる群から選ばれる。

本発明に係る１態様において、一般式ＩＩのインドール誘導体化合物は下記一般式Ｉに合致する化合物ならびに該化合物の薬剤に許容される塩、それらの異性体および／またはそれらの混合物である。

ここで、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｘおよび環Ａは先に定義したとおりである。
一般式Ｉにより、次式の化合物が示される。

別の好ましい態様によると、本発明に係るインドール誘導体化合物は下記よりなる群から選ばれる：
６−クロロ−５,１０−ジメチル−１１Ｈ−ピリド[３',２':４,５]ピロロ[３,２−ｇ]イソキノリン（化合物７０）；
５,１０−ジメチル−１１Ｈ−ピリド[３',２':４,５]ピロロ[３,２−ｇ]イソキノリン（化合物７１）；
５,８−ジメチル−６−(ピリジン−２−イルアミノ)−２Ｈ−イソキノリン−１−オン（化合物７２）；
８−ジメチル−６−(３−メトキシ−ピリジン−２−イルアミノ)−イソキノリン−１−オン（化合物４９７）；および
５,８−ジメチル−６−(５−メチル−ピリジン−２−イルアミノ)−イソキノリン（化合物５００）。

好ましくは、インドール由来の本化合物は下記よりなる群から選ばれる：５,８−ジメチル−６−(ピリジン−２−イルアミノ)−２Ｈ−イソキノリン−１−オン；６−(３−メトキシ−ピリジン−２−イルアミノ)−イソキノリン−１−オン；および５,８−ジメチル−６−(５−メチル−ピリジン−２−イルアミノ)−イソキノリン。

有利には、インドール由来の本化合物は、５,８−ジメチル−６−(ピリジン−２−イルアミノ)−２Ｈ−イソキノリン−１−オンである。
本発明の第２の目的は、既に述べた少なくとも１種のインドール誘導体および場合により薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物にある。

薬学的に許容される担体の例として、本組成物はエマルジョン、マイクロエマルジョン、水中油型エマルジョン、無水脂質および油中水型エマルジョン、または他の種類のエマルジョンを含有しうる。

本発明に係る組成物は、希釈剤、賦形剤、安定剤および保存剤のような１種または２種以上の添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤は当業者には周知であり、特に《Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第６版》(異なる編集者、1989-1998、Marcel Dekker)および《Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems》(ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS)に説明されている。

第３の目的は、先に述べた少なくとも１種のインドール誘導体を、患者における早期終止コドンの発生を引き起こす少なくとも１つの突然変異に起因する遺伝子病の治療用薬剤の製造に使用することである。

本出願で使用する用語「患者」とは、齧歯動物、ネコ類、イヌ類、霊長類、およびヒトのような哺乳動物に対応し、好ましくは、該患者はヒトである。
このような早期停止コドンの発生を引き起こす少なくとも１つの突然変異に起因する遺伝子病は周知であって、現時点では遺伝子病の１／３近くを占めていよう。このような遺伝子病の例としては、β−サラセミア、マルファン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ウルリッヒ病、ハーラー症候群、またはムコビシドーシスの名前の方がよく知られている膵嚢胞性線維腫（ＣＦ）を挙げることができ、これらの遺伝子病に関与する遺伝子の中途停止コドンを有する患者が治療対象となる。

好ましくは、いずれの該突然変異でも、機能的端欠タンパク質が得られうる。
本発明に係る化合物は実際にＮＭＤ作用機序を阻害して、中途停止コドンを有するｍＲＮＡの翻訳を可能にする能力を有する。

機能的タンパク質とは野生表現型の回復・修復が可能であるタンパク質を意味する。
有利には、《機能的タンパク質》は、野生タンパク質と比較して、それと同じ機能を発揮するのに十分な活性を有し、かつ野生表現型を得るのを可能にするタンパク質を意味する。

本発明の第４の目的は、先に述べた薬剤組成物を治療有効量で投与することからなる、早期停止コドンの発生を引き起こす少なくとも１つの突然変異に起因する遺伝子病に対して患者を治療するための治療方法に関する。

《治療有効量》とは、ＮＭＤの阻害を誘導しうる量を意味する。当業者であれば、一般的知識と実施例に記載された方法に照らして治療有効量を決定することができよう。
本化合物は任意の投与方式、例えば、筋肉内、静脈内、経口経路などを経て投与することができる。

以下の実施例は例示として示すものであり、本発明の範囲を制限するものではない。

Ｉ：材料および方法
Ｉ−１：インドール化合物
使用した全ての多環式インドール化合物は２０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に懸濁させ、次いで１０％（v／v）ＤＭＳＯ中５ｍＭの希釈度に調製した。
試験した化合物は次の表１に示す。

Ｉ−２：本発明に係る化合物の合成
化合物１７、３５および３９の合成は、下記刊行物：RIVALLE et al., J. Med. Chem. 1983, 26, 181-185に記載されている。

化合物８１は、上記刊行物の８ａに記載された化合物とアリルアミンとから出発して、化合物１７、３５および３９と同じ一般的手順により得られる。
化合物６７、７０および７１の合成はRIVALLE et al., Tetrahedron 1981; 37, 2097-2103に記載されている。

化合物１３、１５および３７の合成は、BISAGNI et al., Heterocycles 1988, 27, 1671-1678に記載されている。
化合物２９は下記の合成法により得られる：RIVALLE et alの刊行物（J. Med. Chem. 1983, 26, 181-185）の１ａに記載された化合物をＤＭＦに懸濁させる。過剰のヨウ化メチル（１０当量）を加える。反応媒質を８０℃に１時間加熱した後、室温に冷却する。２ＭＮａ₂ＣＯ₃溶液を加え、反応媒質を８０℃に１８時間加熱する。生成物をジクロロメタンで抽出する。

化合物７２、４９７および５００は、下記の合成方法により得られる：適当なブロモピリジン（１当量）および適当なアミン（１当量）を、２モル％のＰｄ(Ｏａｃ)₂、３.５モル％のXantphosおよび２.４当量のＣｓ₂ＣＯ₃の存在下でtert−ブタノール中に加える。反応媒質を９０℃に４８時間加熱し、次いでセライト（celite）で濾過した後、シリカカラム（ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＥｔＯＨ９５：５）で精製する。

化合物７２の合成に対しては、２−ブロモピリジンとアミンとして６−アミノ−５,８−ジメチル−２Ｈ−イソキノリン−１−オンを使用する。このアミンはDUCROCQ et al., （Tetrahedron 1979, 35, 142）に記載されている。

化合物４９７の合成に対しては、２−ブロモ−３−メトキシピリジンとアミンとして６−アミノ−５,８−ジメチル−２Ｈ−イソキノリン−１−オンを使用する。
化合物５００の合成に対しては、２−ブロモ−５−メチルピリジンとアミンとして５,８−ジメチル−イソキノリン−６−イルアミンを使用する。このアミンは、BALKAN et al., （Australian Journal of Chemistry, 1969, 22, 2489）に記載されている。

Ｉ−３：構築物
構築物β−グロビンＮｏｒｍおよびＴｅｒは、センスプライマー 5'GCAACCTCAAGCTTACACCATGGTGCACCTGAC3'（配列番号１）およびアンチセンスプライマー5'AGAAAGCAGATCTGCTTAGTGATACTTGTG3'（配列番号２）を使用して、構築物β−グロビンＷＴおよびＮＳ３９（Thermann et al., 1998）のＰＣＲ増幅により得られた。増幅された断片を２４ＭＳ２サイトを含む修飾プラスミドｐＲＳＶｂｇａｌのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ位置においてクローニングした。

Ｉ−４：ＲＴ−ＰＣＲによるＮＭＤ測定
ＨｅＬａ細胞を、ウシ胎仔血清１０％（v／v）を加えたＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地、GIBCO-BRL）を入れた６０ｍｍの皿において３７℃、５％ＣＯ₂で増殖させた。次いで、この細胞（１×１０⁶）に、３μｇの試験プラスミドｐｍＣＭＶ−Ｇ１（Ｎｏｒｍもしくは３９Ｔｅｒ）(sun et al., 1998）または３μｇの試験プラスミドｐｍＣＭＶ−ＧＰｘ１（Ｎｏｒｍもしくは４９Ｔｅｒ）(Moriarty et al., 1998）および１μｇの参照プラスミドｐｈＣＭＶ−ＭＵＰ（Belgrader and Maquat, 1994）を、LIPOFECTAMINE PLUS REAGENT (INVITROGEN) キットを用いてこの製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を各試験化合物５μＭまたは対照として０.０１％（v／v）ＤＭＳＯにより２０時間処理した。全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（SIGMA-ALDRICH）を用いてこの製造業者の指示に従って精製した後、ＰＣＲ増幅前に、³²Ｐ−放射性標識ｄＣＴＰヌクレオチドの存在下で、前記ｍＲＮＡＧ１、ＧＰｘ１およびＭＵＰの逆転写を行った。ＰＣＲ条件および分析法は既に報告されたものである（Ishigaki et al., 2001）。ＰＣＲ産物をTyphoon 9200 (Amersham Biosciences) で定量した。

Ｉ−５：翻訳効率試験
ＨｅＬａ細胞に、２μｇのプラスミドｐＦｌｕｃおよび１μｇのプラスミドｐＲｌｕｃをトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を０.０１％（v／v）ＤＭＳＯもしくは試験する各種化合物（５μＭ）の存在下で２０時間、または１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドの存在下で４時間インキュベーションした後で、細胞を集めた。ルシフェラーゼ活性を２×１０⁵細胞の量で、Dual Glo Luciferaseキット (Promega) を用いて、この製造業者の指示に従って、microLumat LB 96P (EG&G Berthold) 上で定量した。その後、ルシフェラーゼ活性をＦｌｕｃおよびＲｌｕｃｍＲＮＡの濃度に対して正規化した。

Ｉ−６：ＮＭＤ阻害性化合物の存在下でのｓｉＲＮＡ分解経路の完全性を測定するためのルシフェラーゼ活性
細胞を６ウェルプレートで増殖し、Lipofectamine Plus Reagent (Invitrogen) キットを用いて、５０ｎｇのＲＬｐｅｒｆｅｃｔリポーターＲＮＡ（Pillai et al., 2005）、２００ｎｇのｐＧ１３プラスミド（「ホタルルシフェラーゼ」をコードする）および４μｇのｐＴｚＵ６プラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、該当するウェルに試験化合物を加えた。トランスフェクションから４８時間後、Dual Glo Luciferaseキット (Promega) を用いてこの製造業者の指示に従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。

Ｉ−７：２Ｄゲル分析によるＦＬＡＧ−ｈＵＰＦ１のリン酸化レベルの測定
２９３Ｔ細胞（１０⁶）に、Lipofectamine Plus Reagent (Invitrogen) キットを用いてこの製造業者の指示に従って、１μｇのｐＦＬＡＧ−ｈＵｐｆ１プラスミド（Sun et al., 1998）をトランスフェクションした。１２時間後、血清を培地から２４時間の間、除去した。その後、５μＭの試験化合物または対照として１０％（v／v）ＤＭＳＯを３７℃および５％ＣＯ₂で３時間添加した。次いで、１０％血清を３７℃および５％ＣＯ₂で１時間再び添加した。全タンパク質を、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳおよび４０ｍＭＴｒｉｓ塩基を含有する細胞溶解緩衝液で精製した。固定したｐＨ勾配による２Ｄ電気泳動のためのAMERSHAM-BIOSCIENCESにより記載された手順に従って一次元目の泳動を行った。それらの等電点に応じたタンパク質の分離のためにｐＨ３〜１０のImmobiline^TM DryStrip (１８ｃｍ)を使用した。次いで、１０％SDS−PAGEゲル上に一次元目のものを載せて二次元目の泳動を行った。最後にタンパク質をニトロセルロース膜上に移してから、０.０５％ＴＷＥＥＮを含有するＴＢＳ中でそれらを抗ＦＬＡＧ抗体（SIGMA-ALDRICH）と共に４℃で一晩インキュベーションし、次いでペルオキシダーゼに結合した抗マウス・ヤギ抗体（PIERCE）と共にインキュベーションした。その後、《SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate》(PIERCE）を用いてタンパク質を検出した。

Ｉ−８：ＮＭＤブロッキング段階の決定
本実験は既に報告されているようにして実施した（Hosoda et al., 2005）。
Ｉ−９：画像解析での免疫蛍光ＦＩＳＨ試験
１２ｍｍのガラススライド上で１０％（v／v）ＦＢＳＤＭＥＭ中においてＨｅＬａ細胞を増殖させた。この細胞（１０⁵）に、５００ｎｇのプラスミドｐＧＦＰ−ＧＥ１（Yu et al., 2005）、ｐＹＦＰ−ｈＳｍｇ５、ｐＹＦＰ−ｈＳｍｇ６、ｐＹＦＰ−ｈＳｍｇ７（Unterholzner and Izaurralde, 2004）、ｐＧＦＰ−ＣＣＲ４、ｐＣＦＰ−ＤＣＰ１ａ（Cougot et al., 2004）、ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＦＬＡＧ−ｈＵｐｆ１（Sun et al., 1998）、ｐｃＤＮＡ３−ｈＵｐｆ３ａ−ＦＬＡＧ、ｐｃＤＮＡ３−ｈＵｐｆ３ｂ−ＦＬＡＧ（Lykke-Andersen et al., 2000）、ｐｍＣＭＶ−Ｇ１（Ｎｏｒｍもしくは３９Ｔｅｒ）(Sun et al., 1998）、またはｐｍＣＭＶ−ＧＰｘ１（Ｎｏｒｍもしくは４６Ｔｅｒ）(Moriarty et al., 1998) により一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を５μＭの各試験化合物または対照として０.００１％（v／v）のＤＭＳＯにより処理した。２０時間後、ホルマリン溶液（SIGMA-ALDRICH）を用いて細胞を室温で１０分間固定し、７０％エタノール溶液により４℃で一晩、透過性化した。

免疫蛍光試験に対しては、前記固定細胞を抗ＦＬＡＧマウス抗体（SIGMA-ALDRICH）と共に室温で２時間インキュベーションし、ＰＢＳ中で３回洗浄した後、Ｃｙ３またはＦＩＴＣに結合したマウス抗体（JACKSON IMMUNORESEARCH）と共に室温で１時間インキュベーションした。最後に、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄してから、Hoechst（２μｇ／μＬ）(SIGMA-ALDRICH) 中、室温で２分間インキュベーションした。

ＦＩＳＨ実験に対しては、前記固定細胞を、組織培養インキュベーター内でプレハイブリダイゼーション緩衝液（ｔＲＮＡ：１２５μｇ／ｍＬ、ニシンＤＮＡ：５００μｇ／ｍＬ、ＢＳＡ：１ｍｇ／ｍＬ、硫酸デキストラン：０.１ｇ／ｍＬ、５０％ホルムアミド、２ＸＳＳＣ緩衝液）中、３７℃で１時間インキュベーションした。次に、固定細胞を組織培養インキュベーター内でハイブリダイゼーション緩衝液（プレハイブリダイゼーション緩衝液プラスＣｙ３で標識されたプローブ）と共に一晩インキュベーションし、３７℃のＳＳＣ２Ｘ緩衝液中で３回、室温の１ＸＳＳＣ緩衝液中で３回洗浄し、最後にHoechst（２ｎｇ／μＬ）(SIGMA-ALDRICH) 中、室温で２分間インキュベーションした。５'および３'末端がＣｙ３で標識されたプローブ 5'CGATCTGCGTTCTACGGTGGT3'（配列番号３）を、Ｇ１ＴｅｒまたはＧＰＸ１ＴｅｒｍＲＮＡを検出するために使用した。

固定細胞は、Ａ４フィルター（Hoechst用）、ＧＦＰ及びＹ３フィルター（Ｃｙ３用）を装着した油浸対物レンズＰＬＡＰＯ６３ｘ（ＮＡ１.３２）とＤＭＲＡ顕微鏡（Leica）により観察した。

Ｉ−１０：免疫精製およびウェスタンブロット分析
ｈＵＰＦ１の免疫精製およびウェスタンブロット分析は、抗ｈＵＰＦ１抗体（Ohnishi et al., 2003）を用いて、既に報告されている手順 (Lejeune and Maquat, 2004) に従って行った。ウェスタンブロット分析は、抗ｈＵＰＦ１、抗ｈＳＭＧ５、抗ｈＳＭＧ６もしくは抗ｈＳＭＧ７ウサギ抗体（Ohnishi et al., 2003）の１／２５０希釈液、抗ｈＵＰＦ３／３Ｘウサギ抗体（Ishigaki et al., 2001）もしくは抗ＴＵＢＩＬＩＮマウス抗体 (SIGMA-ALDRICH) の１／１０００希釈液を用いて行った。タンパク質の検出は《SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate》または《SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate》(PIERCE）を用いて行った。

ＩＩ：結果
ＩＩ−１：新規ＮＭＤ阻害剤の同定
ＨｅＬａ細胞を、β−グロビン（Ｇ１）およびグルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰｘ１）のＲＮＡをコードし、中途（Ｔｅｒ）またはそうでない（Ｎｏｒｍ）終止コドンを有する２種類の試験プラスミドでトランスフェクションした。Ｇ１ｍＲＮＡは非赤血球系細胞における核に関連したＮＭＤを受けやすく（Thermann et al., 1998; Zhang et al., 1998）、一方ＧＰｘ１ｍＲＮＡは細胞質ＮＭＤを受けやすい（Moriarty et al., 1998）。さらに、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）のｍＲＮＡをコードする参照プラスミドも細胞に導入した（Ishigaki et al., 2001）。

トランスフェクションから２４時間後、細胞を対照としてＤＭＳＯ（−）と共に、または表１に示したインドール化合物５μＭと共に、２０時間インキュベーションした。２０時間後、全ＲＮＡを最終的に精製し、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
各種の試験化合物についての結果を表２にまとめて示す。

上の結果は、試験した３０の化合物のうち５つの化合物がＴｅｒＧ１ｍＲＮＡレベルとＴｅｒＧＰｘ１ｍＲＮＡレベルの両方を安定化させることができたこと、これが用量依存性であったことを示している。この結果は、ＲＰＡ法によりさらに確認することができた。これらの結果は、化合物７０、７１、７２、４９７および５００がＮＭＤの阻害剤であり、核と細胞質の両方でそうであるという結論を与える。これらの化合物について認められた阻害レベルは、シクロヘキシミドのような他のＮＭＤ阻害剤またはｈＤＣＰ２もしくはｈＰＡＲＮをコードする遺伝子の発現のｓｉＲＮＡによる不活性化（Ishigaki et al., 2001; Lejeune et al., 2003）で得られたものに似ていたこと、およびこれらの化合物が実験条件下（試験最大濃度１２５μＭ）で全く細胞毒性を示さなかったことにも留意すべきである。

このレベルで、阻害剤として同定された化合物の特異性を異なるいくつかの系（イントロン・スプライシング阻害の欠如、翻訳阻害の欠如、およびストレス顆粒生成の欠如）で試験して、これらの化合物が新規な特異的ＮＭＤ阻害剤であることを示すことができた。

ＩＩ−２：ｈＵＰＦ１より上流でのＮＭＤ阻害
同定された化合物の阻害モードを特定する目的で、これらの化合物をｍＲＮＡ上でＮＭＤ因子の逐次的補充（リクルートメント）を模擬した系で試験した（Kim et al., 2005; Lykke-Andersen et al., 2000）。そうするために、細胞に、１つはホタル (Firefly) ルシフェラーゼ (Ｆｌｕｃ) のｍＲＮＡ、即ち、その３'ＵＴＲ上でＭＳ２タンパク質に対する８結合部位を含んだｍＲＮＡに対してコードされた構築物、もう１つはＭＳ２タンパク質または下記融合タンパク質：ＭＳ２−ｈＵＰＦ１、ＭＳ２−ｈＵＰＦ２もしくはＭＳ２−ｈＵＰＦ３Ｘ、の１つのいずれかに対してコードされた構築物、という２種類の構築物をトランスフェクションした。さらに、分析されたＲＮＡレベルを正規化するために、ＨｅＬａ細胞にレニラ（Renilla, ウミシイタケ）ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）のｍＲＮＡをコードする構築物もトランスフェクションした。

これらの細胞を次いで、化合物７０または陰性対照としてＤＭＳＯ（−）と共に２０時間インキュベーションした。その後、ＲｌｕｃおよびＦｌｕｃｍＲＮＡのレベルを、既に報告されたようにして（Hosoda et al., 2005）測定した。対照として、前記ＭＳ２融合タンパク質のそれぞれの発現をウェスタンブロットにより求めた。

その結果が示したところでは、各場合において、化合物７０はＭＳ２融合タンパク質の発現レベルに影響を及ぼさなかった。発現レベルは内因性タンパク質の発現レベルより大きくなることは全くなかった。予想通り、ＤＭＳＯの存在下では、ＦｌｕｃｍＲＮＡの発現レベルは、ＭＳ２を発現するだけの細胞と比べて、ＭＳ２−ｈＵＰＦ融合タンパク質のいずれかを発現する細胞内では低かった。他方、上の結果は、化合物７０がＭＳ２−ｈＵＰＦ２またはＭＳ２−ｈＵＰＦ３Ｘにより誘導された分解を阻害するが、ＭＳ２−ｈＵＰＦ１により誘導された分解には影響を及ぼさないことを示した。Ｆｌｕｃ／ＲｌｕｃｍＲＮＡの比および化合物７０により誘導された阻害レベルは、ｈＣＢＰ８０をコードする遺伝子の発現のｓｉＲＮＡによる不活性化に応答して認められたもの（Hosoda et al., 2005）に非常に類似していることに留意すべきである。

最後に、上の結果は、化合物７０によるＮＭＤ阻害が、ｈＵＰＦ３ＸまたはｈＵＰＦ２の補充よりは下流でｈＵＰＦ１よりは上流において機能することを示している。
ＩＩ−３：化合物７０はｈＵＰＦ１とｈＵＰＦ３Ｘとの間の相互作用を防止しない
先に結果に照らして、化合物７０は、ｈＵＰＦ１のＥＪＣへの補充を、他のｈＵＰＦタンパク質とのその相互作用を介して防止することができるのだろうと思われた。この目的で、ＨｅＬａ細胞抽出物からｍＲＮＡの完全性を保存する条件下でｈＵＰＦ１タンパク質を免疫沈降させた（Lejeune and Maquat, 2004）。

免疫沈降（ＩＰ）の２０時間前に細胞の培養物に化合物70またはＤＭＳＯ（−）を加えた。ｈＵＰＦ２タンパク質がある種のＮＭＤの場合には不可欠ではないことが実証されていた（Gehring et al., 2005）ので、分析は各免疫沈降物中におけるｈＵＰＦ３Ｘタンパク質の存在に焦点をおいた。特異性対照として、各免疫沈降物においてチューブリンタンパク質の不存在が実証された。タンパク質が全く検出されない正常ウサギ血清を用いて非特異的免疫沈降を行った。

結果は、細胞を化合物７０と共に事前インキュベーションした場合であっても、ｈＵＰＦ３Ｘタンパク質がｈＵＰＦ１免疫沈降物中に存在することを示した。
従って、ｈＵＰＦ１とｈＵＰＦ３Ｘとの相互作用は、化合物７０によって完全に破壊されることはなく、このことはこの化合物がｈＵＰＦ１のＥＪＣへの補充を阻害しないことを示唆している。

ＩＩ−４：化合物７０はｈＵＰＦ１の高リン酸化形態を安定化する
ｈＵＰＦ１がＮＭＤ中にリン酸化および脱リン酸化サイクルを必要とする（Ohnishi et al., 2003）ので、化合物７０の存在下でのリン酸化レベルを試験した。この目的で、化合物７０と共に、またはＤＭＳＯ（−）と共にインキュベーション細胞において２Ｄゲル分析によりｈＵＰＦ１のリン酸化レベルを試験した。ｈＵＰＦ１のリン酸化は血清により影響される（Pal et al., 2001）ので、ＨｅＬａ細胞の代わりに２９３Ｔ細胞を使用した。それらが血清の不存在下で細胞サイクルの同じ段階でそれらの細胞分裂をブロックすることができるためである。細胞を発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ−ＦＬＡＧ−ｈＵｐｆ１（Sun et al., 1998）によりトランスフェクションし、２４時間のトランスフェクションから１２時間後に血清の不存在によって同調させた。最後に、ＤＭＳＯまたは５μＭの化合物７０を３時間加えてから、１時間血清を加えた。

結果は、血清を添加しないと、ＦＬＡＧ−ｈＵＰＦ１タンパク質は移動し、非リン酸化タンパク質に対応する単一の点を形成する（Pal et al., 2001）ことを示した。血清を添加すると、細胞をＤＭＳＯと共にインキュベーションした場合にはＦＬＡＧ−ｈＵＰＦ１タンパク質の中間リン酸化が認められ、細胞を化合物７０と共にインキュベーションした場合にはＦＬＡＧ−ｈＵＰＦ１のさらにリン酸化されたアイソフォーム（isoform）の安定化が認められる。

従って、化合物７０では、ｈＵＰＦ１タンパク質の高リン酸化アイソフォームを安定化することができる。
タンパク質ｈＵＰＦ１は、高リン酸化された場合にＰボディー（P-body）に局在化するらしいことが示唆された (Unterholzner and Izaurralde, 2004) ので、ＨｅＬａ細胞中でのＦＬＡＧ−ｈＵＰＦ１タンパク質の細胞局在化を化合物７０の存在下および不存在下で試験した。

結果は、細胞をＤＭＳＯと共にインキュベーションした場合には外因性ｈＵＰＦ１タンパク質は細胞質中に等しく分布することを示す。このことは、ｈＳＭＧ７タンパク質との共発現の実験においてＰボディーでｈＵＰＦ１タンパク質の補充を誘導する（Unterholzner and Izaurralde, 2004）のを除いて、未処理細胞について既に実証されていた（Mendell et al., 2002）のと同様であった。他方、細胞を事前に化合物７０で処理した場合には、Ｐボディーの共通マーカーであるＧＦＰ−ＧＥ１、ＵＦＰ−ｈＳＭＧ７またはＣＦＰ−ｈＤＣＰ１ａを共局在化する構造中にＦＬＡＧ−ｈＵＰＦ１の細胞質濃度が認められる。

従って、化合物７０はリン酸化の刺激または脱リン酸化の阻害のいずれかによりＰボディーでのｈＵＰＦ１の高リン酸化アイソフォームの蓄積を誘導する。
同定された化合物によって上の２つの作用機序のいずれが誘導されるのかを決定するために、化合物７０の存在下でインキュベーションし、またはしていないＨｅＬａ細胞からのｈＵＰＦ１タンパク質の免疫沈降物の補足的分析を実施した。

第１段階では、その脱リン酸化複合体と一緒のｈＵＰＦ１の分析を行った。結果は、ＤＭＳＯで処理された細胞中ではｈＳＭＧ５，ｈＳＭＧ６およびｈＳＭＧ７が検出される場合があるが、ＨｅＬａ細胞を事前に化合物７０と共にインキュベーションした場合には、ｈＳＭＧ５が検出不能となったことを示した。

従って、この結果は、化合物７０がｈＵＰＦ１とｈＳＭＧ５との相互作用を不安定化することを示している。最後に、化合物７０と共にインキュベーションし、またはしていない細胞で行われた免疫沈降物中にｈＳＭＧ１およびｈＵＰＦ３Ｘが存在することは、この同定された化合物が、ｈＵＰＦ１とそのリン酸化複合体との相互作用に影響を及ぼさないことを強く示唆する（図３Ａ）。得られた結果は、観察されたｈＵＰＦ１高リン酸化状態が、リン酸化の活性化ではなく、特にｈＵＰＦ１とｈＳＭＧ５との相互作用の不存在下での脱リン酸化の欠如に関係することを支持している。最後に、この結論は、ｈＵＰＦ１の脱リン酸化に対する必須要素であるとするｈＳＭＧ５の同定（Ohnishi et al., 2003）と合致するものである。

ＩＩ−５：ｈＳＭＧ５は化合物７０の存在下でＰボディーから排除される
ｈＳＭＧ５およびｈＳＭＧ７が細胞質、より具体的にはＰボディーに局在化していることは公知である（Unterholzner and Izaurralde, 2004）。

ＨｅＬａ細胞にＹＦＰ−ｈＳＭＧ５、ＹＦＰ−ｈＳＭＧ６またはＹＦＰ−ｈＳＭＧ７（Unterholzner and Izaurralde, 2004）をコードする発現ベクターならびにＰボディーのマーカーであるＣＦＰ−ｈＤＣＰ１ａをトランスフェクションした。２４時間後、細胞をＤＭＳＯまたは５μＭの化合物７０の存在下でインキュベーションした。

既に実証されているように、阻害剤の不存在下では、ＹＦＰ−ｈＳＭＧ５、ＹＦＰ−ｈＳＭＧ６およびＹＦＰ−ｈＳＭＧ７は細胞質フォーカス中に集中し（Fukuhara et al., 2005; Unterholzner and Izaurralde, 2004）、このフォーカスはＰボディーのマーカーとしてＣＦＰ−ＤＣＰ１ａを使用した時に大部分のＰボディー中にあると同定された。

化合物７０の存在下で、ＹＦＰ−ｈＳＭＧ６またはＹＦＰ−ｈＳＭＧ７を含有する細胞質フォーカスはＰボディーのマーカーＣＦＰ−ｈＤＣＰ１ａと共局在化する。他方、ｈＳＭＧ５は細胞質フォーカス中には認められなくなるが、化合物７０で処理された細胞中では広い細胞質分布を有する。

化合物７０が、外因性または内因性ｈＵＰＦ１タンパク質で実証されたように、ＮＭＤを阻害してＰボディー中のｈＵＰＦ１濃度を誘導することが実証されたので、細胞質フォーカスでの上記３種類の内因性タンパク質ｈＳＭＧの局在化を試験した。この局在化は、これらのタンパク質の発現が極めて低いため、これまで全く観察されたことがなかった。細胞を化合物７０で処理することにより、Ｐボディー内でのこれらの因子の安定化が得られることが考えられた。

結果は、ＤＭＳＯで処理された細胞については細胞質フォーカスで前記内因性タンパク質が検出されないことを示した。他方、細胞を化合物７０と共にインキュベーションすると、結果は、ＰボディーでｈＳＭＧ６およびｈＳＭＧ７タンパク質の濃度を示したが、ｈＳＭＧ５は細胞質フォーカスでは検出されないことを示した。これは外因性タンパク質で得られた結果を確認するものである。

最後に、化合物７０が、ｈＳＭＧ５の細胞局在化を、それをＰボディーから排除することにより変化させることも、上の結果は示している。この知見は、該細胞を化合物７０と共にインキュベーションするとＵＰＦ１とＳＭＧ５との相互作用が消失することとも合致する。

ＩＩ−６：ＮＭＤを化合物７０でブロックするとｈＵＰＦ３およびｈＵＰＦ３ＸがＰボディーに局在化する
ｈＵＰＦ１，ｈＳＭＧ５、ｈＳＭＧ６またはｈＳＭＧ７のようなＮＭＤのある種の因子はＰボディーで局在化する（Unterholzner and Izaurralde, 2004）ので、他のＮＭＤ因子も少なくとも一時的にはＰボディー内に入り込むかもしれないと考えられた。化合物７０は、ｈＵＰＦ１がＰボディーで拘束される段階でＮＭＤをブロックすることから、処理細胞および未処理細胞におけるｈＵＰＦ３およびｈＵＰＦ３Ｘの細胞局在化について試験した。どちらのタンパク質も未処理細胞中では主に核タンパク質であることが実証されていた（Serin et al., 2001）。

ＨｅＬａ細胞に、ｈＵＰＦ３−ＦＬＡＧまたはｈＵＰＦ３Ｘ−ＦＬＡＧをコードする発現ベクター、またはＰボディーの下記マーカー：ＹＦＰ−ｈＳＭＧ６、ＹＦＰ−ｈＳＭＧ７、ＧＦＰ−ＧＥ１およびＣＦＰ−ｈＤＣＰ１ａ、の１つをトランスフェクションした。この細胞を、免疫蛍光実験を行う前にＤＭＳＯまたは化合物７０で処理した。未処理細胞（Serin et al., 2001）に関しては、細胞をＤＭＳＯ（−）と共にインキュベーションした場合には、ｈＵＰＦ３またはｈＵＰＦ３Ｘは本質的に核に局在化している。他方、細胞を化合物７０の存在下でインキュベーションすると、結果は、Ｐボディーに対応するフォーカス中における蓄積を伴うｈＵＰＦ３およびｈＵＰＦ３Ｘの細胞質局在化を示した。

ＩＩ−７：ＰＴＣを含むｍＲＮＡは化合物７０の存在下でＰボディー中に蓄積する
ＮＭＤ因子が化合物７０の存在下でＰボディーに蓄積することから、ＮＭＤ基質の局在化を検討した。酵母では、ＮＭＤ因子がＰボディー中に蓄積する時に、ＮＭＤをブロックするとＰＴＣを含んだｍＲＮＡがＰボディー中に蓄積することが実際に最近実証された（Sheth and Parker, 2006）。

ＨｅＬａ細胞に、ＴｅｒｐｍＣＭＶ−Ｇ１またはＴｅｒｐｍＣＭＶ−ＧＰｘ１ベクターをトランスフェクションし、得られたｍＲＮＡの局在化をＰボディーの下記マーカー：ＧＦＰ−ＧＥ１、ＹＦＰ−ｈＳＭＧ６、ＹＦＰ−ｈＳＭＧ７、ＣＦＰ−ｈＤＣＰ１、ＧＦＰ−ｈＣＣＲ４、ＦＬＡＧ−ｈＵＰＦ１、ｈＵＰＦ３−ＦＬＡＧおよびｈＵＰＦ３Ｘ−ＦＬＡＧ、により分析した。

結果は、阻害剤の不存在下では、ＰＴＣを含んだｍＲＮＡは、恐らくそれらのＮＭＤによる急速な分解のために、検出することができないことを示した。他方、化合物７０で処理すると、ＰＴＣを含んだｍＲＮＡは安定化され、試験したｈＵＰＦ融合タンパク質のそれぞれと共局在化している細胞質凝集物で本質的に検出されるようになる。

最後に、ＮＭＤを化合物７０で阻害した時には、ＰＴＣを含有するｍＲＮＡがＰボディー中またはその近くに存在することも、結果が示した。
ＮＭＤを哺乳動物細胞内でブロックするとＰボディーでＰＴＣを含んだｍＲＮＡが蓄積することは、より解像度の高い手法によっても確認された。この手法では、ｍＲＮＡを２４ＳＭ２反復により標識すると、in situハイブリダイゼーションにより、ユニークｍＲＮＡ分子の検出が可能となる（Fusco et al., 2003）。

結果は、対照細胞中では、ＰＴＣを含んだｍＲＮＡは本質的に核で検出され、検出された細胞質分子はＰボディーでは蓄積していないことを示した。ＮＭＤを化合物７０で阻害すると、結果は、ＰＴＣを含んだｍＲＮＡが細胞質のレベルで、より具体的にはＰボディーと共局在化している構造中に蓄積することを示した。

従って、これらの結果は、ＮＭＤを受けやすいｍＲＮＡはそれらの分解を阻害するとＰボディーで蓄積することを確認するものであり、この結論は細胞特異的ではないようである。

最後に、結果は、化合物７０と共にインキュベーションした後は野生型ｍＲＮＡがＰボディー中に全く検出されないことを示した。このことは、ｍＲＮＡ分解阻害の一般的な機能ではなく、ここで同定された化合物の特異的なＮＭＤ阻害機能であることを確認するものである。

ＩＩ−８：中途停止コドンを有するジストロフィンのｍＲＮＡ安定化
ジストロフィンの遺伝子は、筋肉内でのこのタンパク質の機能に必須ではないタンパク質の部分をコードするエクソン７０〜７９を包含する、７９個のエクソンからなる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に罹患した患者の中には、エクソン７０〜７９の１つにナンセンス突然変異を持つ患者がいる。それにもかかわらず、これらの患者は、ＮＭＤによる該ｍＲＮＡの分解のために、ジストロフィンタンパク質を発現せず、この端欠タンパク質が機能的タンパク質であるにもかかわらずそうである。従って、これらの患者におけるＮＭＤ阻害によって、この端欠ではあるが機能的なタンパク質の合成が可能となろう
それぞれ停止コドンを与えるイントロン７０の遺残およびリーディングフレームのシフトを引き起こし、結果としてこのｍＲＮＡについて早期停止コドン活性化ＮＭＤの発生を引き起こすエクソン７５〜７６の欠失のためにＤＭＤに罹患した患者から得られた２種類の細胞系を使用した。

これらの細胞系のどちらも、化合物７０、７１または７２で、或いはＤＭＳＯの存在下で４８時間処理した。次いで、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを定量的条件下で行った。
結果は、化合物７０、７１または７２による処理後、ジストロフィンｍＲＮＡが約４倍安定化されることを示した。

ＩＩ−９：in vivoＮＭＤ阻害
化合物７０のin vivo作用を検討するためにＮＭＤメカニズム（作用機序）のマウスモデル２種類を使用した。第１のモデルをｍｄｘマウスと呼ぶ。これらのマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３にナンセンス突然変異を保有する。このナンセンスコドンはＮＭＤによるジストロフィンｍＲＮＡの分解を誘導する。これらのマウスには、ＤＭＳＯ（５０μL）、２０、２００または２０００ｎｍｏｌの化合物７０を筋肉内注射した。６、２４、および３２時間後、マウスを致死させ、ＲＮＡおよびタンパク質を抽出するために、注射した筋肉のサンプリングを行った。この予備的な結果は、化合物７０を注射したマウスにおけるジストロフィンｍＲＮＡの安定化と、ＤＭＳＯを注射したマウスにおける安定化の不存在を示す。さらに、この端欠ジストロフィンタンパク質それ自体が、化合物７０を注射したマウス中では検出されるのに対し、ＤＭＳＯを受けたマウス中では検出されない。

使用した第２の種類のマウスモデルは、オピエート受容体（ＭＯＲ）の遺伝子μのエクソン３におけるナンセンス突然変異の存在によって規定される。この停止コドンは、このＭＯＲｍＲＮＡ上でＮＭＤを活性化させる。このＭＯＲ遺伝子は中枢神経系で発現されるだけであり、このことによって、このモデルは血液脳関門を通過する化学的化合物の可能性を検討するための非常に興味あるツールとなる。注射をマウスの頸部に皮下注射で行い、実験の異なる段階で脳のサンプリングを行うことを除いて、ｍｄｘマウスと同じ手順に従った。この場合もやはり、最初の結果は、化合物７０を注射したマウスにおけるＭＯＲｍＲＮＡの安定化と、ＤＭＳＯのみを注射したマウスでの安定化の不存在とを示す。ＭＯＲタンパク質のウェスタンブロット分析は、化合物７０を注射した同じマウス中の端欠タンパク質の存在とＤＭＳＯを受けただけのマウスにおけるその不存在とを示す。これらの結果は、化合物７０がin vivoで活性であって、これが血液脳関門を通過することができ、それによりこの化合物は、中枢神経系が冒されるＮＭＤに関係する疾患の潜在的な治療剤となることを示している。

ＩＩＩ：考察
本研究では、インドール誘導体のＮＭＤ阻害可能性を実証することができた。これらの化合物は、ｈＳＭＧ５のＰボディーからの排除とｈＵＰＦ１の高リン酸化形態の安定化とを生ずる、ｈＵＰＦ１とｈＳＭＧ５との間の相互作用を阻害することにより作用する。

最後に、上の実験結果は、これらのインドール誘導体がＮＭＤのin vivo阻害が可能であって、血液脳関門を通過することができ、従ってＮＭＤに関係する多くの病気の治療に対する良好な候補となることも実証できた。

さらに、これらの化合物は、ＮＭＤの作用機序を、これまではこの過程を特異的に阻害するためのツールがなかったために全く不可能であった手法によって研究するための優れたツールとなることも証明される。従って、このＮＭＤ作用機序について研究する研究室に対する利点は極めて顕著である。

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Claims

下記一般式ＩＩに対応するインドール誘導体化合物ならびに該化合物の薬剤に許容される塩、それらの異性体および／またはそれらの混合物：

式中、
・Ｘは、Ｎまたは無水塩基Ｎ⁺Ｒ８を意味し；
・ここで、Ｒ８は、水素原子、ヒドロキシルもしくはアルキルもしくはメトキシ基（場合によりフェニル基で置換されていてもよい）を意味し、好ましくは、Ｒ８は水素原子を意味し；
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、水素原子またはハロゲン原子または場合により置換されていてもよいアルキル、アミン、アルケン、エステル、スルホンアミド、エーテルもしくはベンジル基を意味し；
・Ｒ５は水素原子または場合により置換されていてもよい飽和もしくは不飽和アルキル基、アミン、ベンジル基を意味し、好ましくはＲ５は水素または飽和もしくは不飽和アルキル基を意味し；
・Ｒ６は、場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基、好ましくはメチルもしくはエチル基を意味し、より好ましくはＲ６はメチル基を意味し；
・Ｒ７は水素原子または場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基を意味し、環Ａがｂ位置にある時にはＲ７は存在せず；
・Ｒ９およびＲ１０は、独立して水素原子、Ｒ１１、ＯＲ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１Ｒ１２基を意味し、
ここで、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して水素原子、酸素原子、場合により置換されていてもよく、１もしくは２以上のイオウ、酸素もしくは窒素原子を含有していてもよい飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３アルキル基を意味し、
Ａは、Ａがａまたはｂ位置にある時には、次式に対応する環を意味し、

ここで、
Ｒ１は水素、酸素もしくはハロゲン原子、または場合により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖および／もしくは不飽和アルキルもしくはアミン基を意味し、
Ｒ１３は水素原子または場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基を意味し、そして
ＺはＲ１基を意味する。
Ｒ９および１０が互いに独立して、水素原子、Ｒ１１、ＯＲ１１またはＳＲ１１基を意味し、Ｒ１１は請求項１に定義された通りである、請求項１に記載のインドール誘導体化合物。
下記一般式Ｉａで示される、請求項１または２に記載のインドール誘導体化合物。

式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｘおよび環Ａは先に定義したとおりである。
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が互いに独立して、水素原子またはハロゲン原子または場合により置換されていてもよいアルキル、アミン、アルケンもしくはベンジル基を意味することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が互いに独立して、水素原子またはハロゲン原子またはＣ１〜Ｃ４アルキル基を意味し、好ましくはＲ２、Ｒ３およびＲ４は水素原子を意味することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
Ｒ２、Ｒ３および／またはＲ４が互いに独立して、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩよりなる群から選ばれたハロゲン原子を意味し、好ましくはこのハロゲン原子はＣｌ原子であることを特徴とする、請求項５に記載の化合物。
Ｒ５が、水素原子またはメチル、エチル、プロピルもしくはブチル基のような飽和もしくは不飽和アルキル基を意味し、より好ましくはＲ５が水素原子を意味することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
Ｒ７がメチルまたはエチル基を意味し、好ましくがＲ７はメチル基を意味することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
Ｒ１が水素、酸素またはハロゲン原子を意味することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
環Ａが位置ａにあることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
環Ａが次式で示されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物。

式中、Ｒ１およびＲ１３は請求項１に定義された通りである。
環Ａが下記よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１に記載の化合物。
化合物が下記よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物：
・５,８−ジメチル−６−(ピリジン−２−イルアミノ)−２Ｈ−イソキノリン−１−オン；
・５,８−ジメチル−６−(３−メトキシピリジン−２−イルアミノ)−イソキノリン−１−オン；および
・５,８−ジメチル−６−(５−メチル−ピリジン−２−イルアミノ)−イソキノリン。
本化合物が５,８−ジメチル−６−(ピリジン−２−イルアミノ)−２Ｈ−イソキノリン−１−オンであることを特徴とする、請求項１３に記載の化合物。
請求項１〜１４のいずれかに記載の少なくとも１種のインドール誘導体化合物および場合により薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物。
下記一般式ＩＩで示されるインドール誘導体化合物、該化合物の薬剤に許容される塩、それらの異性体および／またはそれらの混合物の、患者における早期終止コドンの発生を引き起こす少なくとも１つの突然変異に起因する遺伝子病の治療用薬剤の製造への使用：

式中、
・Ｘは、Ｎ，ＣＲ８、または無水塩基Ｎ⁺Ｒ８を意味し；
・ここで、Ｒ８は、水素原子、ヒドロキシルもしくはアルキルもしくはメトキシ基（場合によりフェニル基で置換されていてもよい）を意味し、好ましくは、Ｒ８は水素原子を意味し；
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、水素原子またはハロゲン原子または場合により置換されていてもよいアルキル、アミン、アルケン、エステル、スルホンアミド、エーテルまたはベンジル基を意味し；
・Ｒ５は水素原子または場合により置換されていてもよい飽和もしくは不飽和アルキル基、アミン、ベンジル基を意味し；
・Ｒ６は、場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基、好ましくはメチルもしくはエチル基を意味し、より好ましくはＲ６はメチル基を意味し；
・Ｒ７は水素原子または場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ３アルキル基を意味し、環Ａがｂ位置にある時にはＲ７は存在せず；
・Ｒ９およびＲ１０は、一緒に炭素結合を意味するか、または独立して水素原子、Ｒ１１、ＯＲ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１Ｒ１２基を意味し、
ここで、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して水素原子、酸素原子、場合により置換されていてもよく、１もしくは２以上のイオウ、酸素もしくは窒素原子を含有していてもよい飽和もしくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３アルキル基を意味し、
Ａは、Ａがａまたはｂ位置にある時には、次式に対応する環を意味する。

ここで、
Ｒ１は水素、酸素もしくはハロゲン原子、または場合により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖および／もしくは不飽和アルキルもしくはアミン基を意味し、
Ｒ１３は水素原子または場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基を意味し、そして
ＺはＲ１基を意味する。
該化合物が下記一般式Ｉに対応する、請求項１６に記載のインドール誘導体化合物、該化合物の薬剤に許容される塩、それらの異性体および／またはそれらの混合物の使用：

式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｘおよび環Ａは請求項１に定義したとおりである。
ＸがＮまたはＮ⁺Ｒ８を意味し、Ｒ８が請求項１に定義したとおりであることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の化合物の使用。
Ｒ９およびＲ１９が共に水素原子を意味することを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれかに記載の化合物の使用。
環Ａがａ位置にあることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の化合物の使用。
該化合物が下記の群から選ばれることを特徴とする請求項１６に記載の化合物の使用：
・６−クロロ−５,１０−ジメチル−１１Ｈ−ピリド[３',２':４,５]ピロロ[３,２−ｇ]イソキノリン；
・５,１０−ジメチル−１１Ｈ−ピリド[３',２':４,５]ピロロ[３,２−ｇ]イソキノリン；
・５,８−ジメチル−６−(ピリジン−２−イルアミノ)−２Ｈ−イソキノリン−１−オン；
・６−(３−メトキシ−ピリジン−２−イルアミノ)−イソキノリン−１−オン；および
・５,８−ジメチル−６−(５−メチル−ピリジン−２−イルアミノ)−イソキノリン。
請求項１〜１４のいずれかに記載の化合物の、患者における早期終止コドンの発生を引き起こす少なくとも１つの突然変異に起因する遺伝子病の治療用薬剤の製造への使用。
前記遺伝子病が、β−サラセミア、マルファン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ウルリッヒ病、ハーラー症候群および膵嚢胞性線維腫（ＣＦ）から選ばれ、これらの遺伝子病に関与する遺伝子の中途終止コドンを有する患者用であることを特徴とする、請求項１５〜２２のいずれかに記載の化合物の使用。