ES2569478T3 - Nuevos compuestos derivados de indol y composiciones farmacéuticas que los contienen - Google Patents

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Jamal Tazi
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Christian Rivalle
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Abstract

Compuesto derivado de indol que corresponde a la fórmula II siguiente:**Fórmula** en la que: - X representa N o el anhidro base N+R8, en el que R8 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o alquilo o metoxi eventualmente sustituido con un grupo fenilo, preferentemente R8 representa un átomo de hidrógeno, - R2, R3 y R4 representan independientemente, un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno o un grupo alquilo de C1-C4, - R5 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, saturado o insaturado, - R6 representa un grupo alquilo de C1-C3, preferentemente un grupo metilo o etilo y de manera particularmente preferida R6 representa un grupo metilo, - R7 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C1-C3, - R9 y R10 representan independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo R11, OR11 o SR11, en los que R11 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de oxígeno, un grupo alquilo de C1-C3 saturado o insaturado, que puede contener uno o varios átomos de azufre, de oxígeno o de nitrógeno; - A representa un anillo en la posición a y que corresponde a en la que: - R1 representa un átomo de hidrógeno, de oxígeno o de halógeno o un grupo alquilo o amina lineal o ramificado y/o insaturado, - R13 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de C1-C4, y/o unas sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos.

Description

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DESCRIPCION
Nuevos compuestos derivados de indol y composiciones farmaceuticas que los contienen
El proceso de degradacion de los ARNm que poseen un codon de terminacion precoz (Nonsense-mediated nRNA decay, NMD) es un proceso de control cualitativo identificado en todos los organismos eucariotas estudiados hoy en dfa (CONTI y IZAURRALDE, 2005; MAQUAT, 2004a). Uno de las funciones de este mecanismo es degradar los ARNm que presentan un codon de terminacion prematuro (PTC) a fin de prevenir la smtesis de protemas truncadas que podnan no ser funcionales o cuya funcion podna ser deleterea para la celula Ademas, la via NMD se ha identificado como estando implicada en la regulacion genica en la levadura, la drosofila y los mairnferos (HE et al., 2003; MENDELL et al., 2002; REHWINKEL et al., 2005; SUREAU et al., 2001; WOLLERTON et al, 2004).
En las celulas de mamfferos, el NMD tiene lugar despues del corte y empalme de los ARN pre-mensajeros y, en la mayona de los casos, esta modulado por un complejo proteico fijado 20 a 24 nucleotidos secuencia arriba de la union exon-exon (Conti and Izaurralde, 2005; Lejeune and Maquat, 2005; Maquat, 2004b). Este completo proteico, denominado complejo de las uniones exonicas (complejo exon-union, EJC) recluta supuestamente las protemas conservadas UPF que tienen un papel esencial, no caracterizado hasta la fecha, en el NMD. Durante lo que se denomina el "primer ciclo de traduccion" (Ishigaki et al., 2001), los PTC son reconocidos y los ARNm diana degradados por una digestion 5' hacia 3' que implica la retirada de la caperuza y de las exorribonucleasas tales como hXRNI y hXRN2/hRAT1, y por una digestion 3' hacia 5' que implica una desadenilacion y el exosoma (Chen y Shyu, 2003; Couttet y Grange, 2004; Lejeune et al., 2003).
UPF1 es una fosfoprotema que sufre un ciclo de fosforilacion/desfosforilacion durante el NMD (Ohnishi et al., 2003; Page et al., 1999; Pal et al., 2001). Se ha demostrado que la UPF1 interactua con unos factores de terminacion de la traduccion en la levadura (Czaplinski et al., 1998) y en los mamfferos (Kashima et al., 2006), y podna hacer la union, por lo tanto, entre la EJC y el complejo de terminacion de la traduccion. Una interaccion directa entre hUPF1 y la protema de union a la caperuza CBP80 se ha demostrado recientemente en las celulas de marnffero (Hosoda et al.,
2005) , lo que indica que hUPF1 establece una interaccion compleja antes o durante el primer ciclo de la traduccion. Se ha demostrado que la fosforilacion de hUPF1 se efectua por hSMG1, una quinasa relacionada con PI3 (Page et al., 1999; Pal et al., 2001; Yamashita et al., 2001), y requiere la presencia de hUPF2 y de hUPF3 (Kashima et al.,
2006) . Por contraste, la desfosforilacion de hUPF1 requiere la presencia de un complejo multi-proteico compuesto de hSMG5, hSMG6, hSMG7 y de la protema fosfatasa (PP)-2A (Chiu et al., 2003; ohnishi et al., 2003). Las protemas hSMG5 y hSMG7 estan localizadas principalmente en el citoplasma, del que una fraccion esta presente en los "processing bodies" (P-bodies) (Unterholzner y Izaurralde, 2004). hSMG6 es asimismo una protema citoplasmica que se concentra en ciertos focos citoplasmicos que parecen distintos de los "P-bodies" y cuya naturaleza todavfa no se ha determinado (Unterholzner y Izaurralde, 2004).
Los "P-bodies" se han descrito en las celulas eucariotas superiores e inferiores (Cougot et al., 2004; Sheth y Parker, 2003). En los marnfferos, estas estructuras citoplasmicas contienen multiples factores implicados en la degradacion de los ARNm que incluyen unos componentes de la maquinaria de retirada de la caperuza como DCP1a (Ingelfinger et al., 2002), DCP2 (Ingelfinger et al., 2002; van Dijk et al., 2002), GE1 (Yu et al., 2005) tambien denominado HEDLS (Fenger-Gron et al., 2005), p54/RCK (Cougot et al., 2004), la desadenilasa CCR4 (Cougot et al., 2004), XRN1 (Bashkirov et al., 1997), el complejo LSM1-7 implicado en diferentes aspectos de los procesos relacionados con el ARN (Cougot et al., 2004; Ingelfinger et al., 2002), y los componentes de la maquinaria NMD que son hUPF1, hSMG5 y hSMG7 (Fukuhara et al., 2005; Unterholzner y Izaurralde, 2004). La funcion de los "P-bodies" es todavfa determinada, pero podna servir de compartimiento de almacenamiento para los ARNm no traducidos y para las protemas implicadas en la degradacion de los ARNm (Brengues et al., 2005; Pillai et al., 2005; Teixeira et al., 2005), y/o en el sitio de degradacion de los ARN (Cougot et al., 2004; Sheth y Parker, 2006).
En la actualidad, cerca de una tercera parte de las enfermedades geneticas humanas tendnan por origen la aparicion de un codon de terminacion precoz (Frischmeyer y Dietz, 1999; Kuzmiak y Maquat, 2006). En la gran mayona de los casos, este codon de terminacion provoca la degradacion del ARNm que lo lleva por el mecanismo de NMD. Prosigue entonces una ausencia de la expresion del gen en cuestion, y esto incluso cuando la mutacion en cuestion permitina la traduccion de una protema truncada funcional. La inhibicion del mecanismo de NMD en pacientes que padecen tales patologfas debena permitir restaurar la expresion de la protema truncada funcional y constituye como tal una via interesante.
Por el documento WO2005/023255 se conocen unos derivados de indol para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el proceso de corte y empalme. Estas moleculas tienen en particular la capacidad de inhibir los procesos de corte y empalme de los ARN pre-mensajeros.
Los inventores han puesto en evidencia que unos derivados de indol particulares eran capaces de inhibir espedficamente el nMd in vitro e in vivo, y que dichos compuestos permitfan aumentar el nivel de expresion del ARNm de la distrofina que presenta unos codones de terminacion prematuros en unas lmeas celulares de pacientes que padecen distrofia muscular de Duchenne (DMD).
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En consecuencia, un primer objeto de la invention se refiere a compuestos derivados de indol que corresponden a la formula II siguiente:
imagen1
Formula II
en la que:
* X representa N o el anhidro base N+R8,
en el que R8 representa un atomo de hidrogeno, un grupo hidroxilo o alquilo o metoxi eventualmente sustituido con un grupo fenilo, preferentemente R8 representa un atomo de hidrogeno,
* R2, R3 y R4 representan independientemente, un atomo de hidrogeno o un atomo de halogeno o un grupo alquilo de C1-C4,
* R5 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo, saturado o insaturado,
* R6 representa un grupo alquilo de C1-C3, preferentemente un grupo metilo o etilo y de manera particularmente preferida R6 representa un grupo metilo,
* R7 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo de C1-C3 eventualmente sustituido,
* R9 y R10 representan independientemente un atomo de hidrogeno, un grupo R11, OR11 o SR11,
en los que R11 representa un atomo de hidrogeno, un atomo de oxigeno, un grupo alquilo de C1-C3 saturado o insaturado, que puede contener uno o varios atomos de azufre, de oxigeno o de nitrogeno;
* A representa un anillo en la position a y que corresponde a
imagen2
en la que:
R1 representa un atomo de hidrogeno, de oxigeno o de halogeno o un grupo alquilo o amina lineal o ramificado y/o insaturado,
R13 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo de C1-C4, y
unas sales farmaceuticamente aceptables de dichos compuestos.
Por "atomo de halogeno" se entiende el grupo F, Cl, Br e I, y mas particularmente el Cl.
Por "grupo alquilo insaturado" se entiende un grupo alquilo que presenta al menos un doble enlace.
En el caso en el que X representa el anhidro base N+R8 y en el que R5 representa un hidrogeno, existe un equilibrio entre las dos formas siguientes:
imagen3
Ventajosamente, R2, R3 y R4 representan un atomo de hidrogeno.
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Preferentemente, R2, R3 y/o R4 representan independientemente los unos de los otros un atomo de halogeno seleccionado del grupo que comprende F, Cl, Br e I, preferentemente dicho atomo de halogeno es un atomo de Cl.
Ventajosamente, R5 representa un grupo metilo, etilo, propilo o butilo y, de manera particularmente preferida, R5 representa un atomo de hidrogeno.
Ventajosamente, R7 representa un grupo metilo o etilo y de manera particularmente preferida R7 representa un grupo metilo.
Ventajosamente, R1 es un atomo de hidrogeno, de oxigeno o de halogeno.
En un primer modo de realization particular, cuando R9 representa un grupo diferente de un atomo de hidrogeno, entonces R10 representa un atomo de hidrogeno.
Ventajosamente, R9 representa un grupo OR11, en el que R11 representa un grupo metilo.
Preferentemente, el compuesto de la formula I responde a la formula siguiente:
imagen4
En un segundo modo de realizacion particular, cuando R10 representa un grupo diferente de un atomo de hidrogeno, entonces R9 representa un atomo de hidrogeno.
Ventajosamente, R9 y R10 representan ambos un atomo de hidrogeno. El compuesto de la formula general II responde entonces a la formula siguiente:
Formula Ia
en la que R2, R3, R4, R5, R6, R7, X y el anillo A son tales como se han definido anteriormente, y pertenecen tambien a la invention.
Un compuesto preferido de formula Ia es la 5,8-dimetil-6-(5-metil-piridin-2-ilamino)-isoquinolina.
Otro compuesto preferido de formula Ia es la 5,8-dimetil-6-(piridin-2-ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona.
Preferentemente, R9 y R10 representan un hidrogeno y X representa N o el anhidro base N+R8.
La presente solicitud describe tambien los compuestos para los cuales R9 y R10 representan juntos un enlace carbono, respondiendo entonces el compuesto de la formula general II a la formula Ib siguiente:
imagen5
imagen6
Formula Ib
en la que R2, R3, R4, R5, R6, R7, X y el anillo A son tales como se han definido anteriormente. Ventajosamente, el anillo A representa el grupo:
imagen7
en el que R1 representa un oxigeno, una amina, o un grupo alquilo lineal o ramificado y/o insaturado, y R13 representa un grupo alquilo de C1-C4 eventualmente sustituido.
5
Mas ventajosamente, el anillo A representa el grupo:
imagen8
10 en el que R1 representa un atomo de hidrogeno, de ox^geno o de halogeno o un grupo alquilo o amina lineal o ramificado y/o insaturado, preferentemente un atomo de hidrogeno o un halogeno, preferentemente un atomo de cloro.
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En otro modo de realization preferido, A se selecciona del grupo que comprende:
imagen9
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La presente invention describe tambien los compuestos derivados de indol de la formula II, que responden a la formula I siguiente:
imagen10
Formula I
en la que R2, R3, R4, R5, R6, R7, X y el anillo A son tales como se han definido anteriormente;
25 X, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y el anillo A son tales como se han definido anteriormente;
y/o sales farmaceuticamente aceptables de dichos compuestos.
Se entiende por la formula I, unos compuestos de formula:
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imagen11
Entre los compuestos derivados de indol, se citan:
35 * 6-Cloro-5, 10-dimetil-11H-pirido[3,,2']:4,5]pirrolo[3,2-g]isoquinolina (compuesto 70);
* 5,10-dimetil-11H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[3,2-g]isoquinolina (compuesto 71);
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* 5,8-Dimetil-6-(piridin-2-ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona; (compuesto 72),
* 8-dimetil-6-(3-metoxi-piridin-2-ilamino)-isoquinolin-1-ona (compuesto 497); y
* 5,8-dimetil-6(5-metil-piridin-2-ilamino)-isoquinolina (compuesto 500)
Preferentemente, el compuesto derivado de indol se selecciona del grupo constituido de la 5,8-dimetil-6-(piridin-2- ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona, de la 5,8-dimetil-6-(3-metoxi-piridin-2-ilamino)-isoquinolin-1-ona y de la 5,8-dimetil-6- (5-metil-piridin-2-ilamino)-isoquinolina.
Ventajosamente, el compuesto derivado de indol es la 5,8-Dimetil-6-(piridin-2-ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona.
Un segundo objeto de la invention consiste en una composition farmaceutica que comprende al menos un derivado de indol tal como se ha descrito anteriormente y, eventualmente, un soporte farmaceuticamente aceptable.
A trtulo de ejemplo de soporte farmaceuticamente aceptable, la composicion puede comprender unas emulsiones, unas microemulsiones de aceite en agua, unos lipidos anhidros y unas emulsiones de agua en aceite, u otros tipos de emulsiones.
La composicion segun la invencion puede comprender ademas uno o varios aditivos tales como los diluyentes, los excipientes, los estabilizadores y los conservantes. Tales aditivos son bien conocidos por el experto en la materia y se describen en particular en "Ullmann's Enciclopedia of Industrial Cemistri, 6a edition" (diferentes editores, 19891998, Marcel Dekker); y en "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Deliveri Sistem" (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS).
La presente invencion describe la utilization de al menos un derivado de indol tal como se ha descrito anteriormente para la preparation de un medicamento destinado a tratar, en un sujeto, una enfermedad genetica que resulta de al menos una mutation que conlleva la aparicion de un codon de termination precoz.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, el termino "sujeto" corresponde a un mamifero tal como un roedor, un felino, un canino, un primate o un humano, preferentemente dicho sujeto es un humano.
Tales enfermedades geneticas que resultan de al menos una mutacion que conlleva la aparicion de un codon de terminacion precoz son bien conocidas y representarian cerca de la tercera parte de las enfermedades geneticas actualmente. A trtulo de ejemplo de tales enfermedades geneticas, se puede citar la p-talasemia, el smdrome de Marfan, la distrofia muscular de Duchenne (DMD), la distrofia muscular de Becker (BMD), la enfermedad de Ulrich, el smdrome de Hurler o la fibrosis qtistica (CF), mas conocida bajo el nombre de mucoviscidosis, y para unos pacientes que presentan un codon de terminacion precoz en el gen implicado en dichas enfermedades geneticas.
Preferentemente, dicha mutacion permite a pesar de todo obtener una protema truncada funcional.
Los compuestos segun la invencion tienen en efecto la capacidad de inhibir el mecanismo de NMD y permitir la traduction de ARNm que presenta unos codones de terminacion precoz.
Por protema funcional, se entiende una protema que permite restaurar un fenotipo salvaje.
Ventajosamente, se entiende por "protema funcional" una protema que presenta una actividad suficiente con respecto a la protema salvaje para asegurar la misma funcion que esta ultima y que permite obtener un fenotipo salvaje.
Un tercer objeto de la invencion consiste en la utilizacion de un compuesto derivado de indol que corresponde a la formula II siguiente:
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en la que:
- X representa N, CR8 o el anhidro base N+R8,
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en el que R8 representa un atomo de hidrogeno, un grupo hidroxilo o alquilo o metoxi eventualmente sustituido con un grupo fenilo, preferentemente R8 representa un atomo de hidrogeno,
- R2, R3 y R4 representan independientemente un atomo de hidrogeno o un atomo de halogeno o un grupo alquilo de C1-C4,
- R5 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo, saturado o insaturado,
- R6 representa un grupo alquilo de C1-C3, preferentemente un grupo metilo o etilo y de manera particularmente preferida R6 representa un grupo metilo,
- R7 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo de C1-C3,
- R9 y R10 representan juntos un enlace carbono o representan independientemente un atomo de hidrogeno, un grupo R11, OR11 o SR11,
en los que R11 representa un atomo de hidrogeno, un atomo de oxfgeno, un grupo alquilo de C1-C3 saturado o insaturado, que puede contener uno o varios atomos de azufre, de oxfgeno o de nitrogeno,
- A representa un anillo en la posicion a y que corresponde a
imagen13
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o
en las que:
- R1 representa un atomo de hidrogeno, de oxfgeno o de halogeno o un grupo alquilo o amina lineal o ramificado y/o insaturado,
- R13 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo de C1-C4, y/o unas sales farmaceuticamente aceptables de dichos compuestos,
para su utilizacion para tratar, en un sujeto, una enfermedad genetica seleccionada del grupo que comprende la p- talasemia, el smdrome de Marfan, la distrofia muscular de Duchenne (DMD), la distrofia muscular de Becker (BMD), la enfermedad de Ullrich, el smdrome de Hurler y la fibrosis qrnstica (CF).
La presente invencion se refiere asimismo a la utilizacion de un compuesto de formula II tal como ha definido anterormente, caracterizada por que dicho compuesto se selecciona del grupo que comprende:
* 6-Cloro-5,10-dimetil-11H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[3,2-g]isoquinolina;
* 5,10-dimetil-11H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[3,2-g]isoquinolina;
* 5,8-Dimetil-6-(piridin-2-ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona;
* 5,8-Dimetil-6-(3-metoxi-piridin-2-ilamino)-isoquinolin-1-ona; y
* 5,8-dimetil-6-(5-metil-piridin-2-ilamino)-isoquinolina.
La invencion describe asimismo un metodo de tratamiento terapeutico de un sujeto para una enfermedad genetica que resulta de al menos una mutacion que conlleva la aparicion de un codon de terminacion precoz que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica, tal como se ha descrito anteriormente.
Por "cantidad terapeuticamente eficaz" se entiende una cantidad que permite inducir la inhibicion de NMD. El experto en la materia sera capaz de determinar dicha cantidad terapeuticamente eficaz a la luz de sus conocimientos generales y metodos descritos en los ejemplos.
Los compuestos podran ser administrados mediante cualquier metodo de administracion como, por ejemplo, por via intramuscular, intravenosa, oral, etc.
Los ejemplos siguientes se dan a tttulo de ilustracion y no limitan el alcance de la presente invencion.
Ejemplos:
I-MATERIAL Y METODOS 5
I-1 Compuestos indoles
Todos los compuestos indoles polidclicos utilizados se suspendieron en DMSO a 20 mg/ml, y despues se prepararon con una dilucion 5 mM en 10% DMSO (v/v).
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Los compuestos ensayados se presentan en la tabla I siguiente:
Tabla I
Compuestos
Formula
Nomenclatura
13 fuera de la invencion
imagen15
N-(5,6-Dimetil-5H-pirido[3',4':4,5]pirrolo[2,3-g]isoquinolin-10-
il)-N'-etil-propano-1,3-diamina
15 fuera de la invencion
N'-(5,6-Dimetil-5H-pirido[3',4':4,5]pirrolo[2,3-g]isoquinoiin-10-
il)-N,N-dietil-propano-1,3-diamina
17 fuera de la invencion
1-(3-Dietilamino-propilamino)-5-metil-6H-pirido[4,3-
b]carbazol-9-ol
29 fuera de la invencion
imagen16
10-Cloro-2,6-dimetil-2H-pirido[3',4':4,5]pirrolo[2,3-
g]isoquinolina
35 fuera de la invencion
1-(3-Dimetilamino-propilamino)-5-metil-6H-pirido[4,3-
b]carbazol-9-ol
fuera de la invencion 37
imagen17
N'-(5,6-Dimetil-5H-pirido[3',4':4,5]pirrolo[2,3-g]isoquinolin-10-
il)-N,N-dimetil-propano-1,3-diamina
Compuestos
Formula
Nomenclatura
39 fuera de la invencion
imagen18
N,N-Dietil-N'-(9-metoxi-5,6-dimetil-6H-pirido[4,3-b]carbazol-
1-il)-etano-1,2-diamina
67 fuera de la invencion
6-Cloro-10-metil-11H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[3,2-g]isoquinolina
70 invencion
6-Cioro-5,10-dimetil-11H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[3,2-
g]isoquinolina
71 invencion
5,10-dimetil-11H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[3,2-g]isoquinolina
72 invencion
imagen19
5,8-Dimetil-6-(piridin-2-ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona
81 fuera de la invencion
Allil-(9-metoxi-5,11-dimetil-6H-pirido[4,3-b]carbazol-1-il)-
amina
497 invencion
5,8-dimetil-6-(3-metoxi-piridin-2-ilamino)-isoquinolin-1-ona
500 invencion
imagen20
5,8-dimetil-6-(5-metil-piridin-2-ilamino)-isoquinolina
I-3 Smtesis de los compuestos segun la presente invencion
La smtesis de los compuestos 17, 35 y 39 se describe en la publication siguiente: RIVALLE et al., J. Med. Cem. 5 1983, 26, 181-185.
El compuesto 81 se obtiene mediante el mismo procedimiento general que los compuestos 17, 35 y 39, a partir del
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compuesto descrito como 8a en la publicacion y alilamina.
La smtesis de los compuestos 67, 70 y 71 se describe en RIVALLE et al., Tetrahedron 1981; 37, 2097-2103
La smtesis de los compuestos 13, 15 y 37 se describe en BISAGNI et al. Heterocicles 1988, 27, 1671-1678.
El compuesto 29 se obtiene mediante el procedimiento de smtesis siguiente: el compuesto descrito en la publicacion de RIVALLE et al.,( J. Med. Cem. 1983, 26, 181-185) se pone en suspension en DMF. Se anade un exceso de yoduro de metilo (10 eq.). El medio de reaccion se calienta a 80°C durante 1h y despues se enfna hasta temperatura ambiente. Se anade una solucion de N2CO3 2M y el medio de reaccion se lleva a 80°C durante 18h. El producto se extrae mediante diclorometano.
Los compuestos 72, 497 y 500 se obtienen mediante el procedimiento de smtesis siguiente:
La bromopiridina (1 equivalente) y la amina (1 equivalente) adecuadas se colocan en terc-butanol en presencia de 2 mol% de Pd(Oac)2 del 3,5 mol% de Xantphos y de 2,4 equivalentes de Cs2CO3. El medio de reaccion se lleva a 90°C durante 48 horas y despues se filtra sobre celita y se purifica sobre columna de sflice ((C2C^/ EtOH 95:5).
Para la smtesis del compuesto 72, se utilizan la 2-bromopiridina y la 6-amino-5,8-dimetil-2H-isoquinolin-1-ona como amina. Esta amina esta descrita en DUCROCQ et al. (Tetrahedron 1979, 35, 142).
Para la smtesis del compuesto 497 se utilizan la 2-bromo-3-metoxipiridina y la 6-amino-5,8-dimetil-2H-isoquinolin-1- ona como amina.
Para la smtesis del compuesto 500, se utilizan la 2-bromo-5-metilpiridina y la 5,8-dimetil-isoquinolin-6-ilamina como amina. Esta amina esta descrita en BALKAN et al. (Australian Journal of Chemistry 1969, 22, 2489).
I-3 Construcciones
Las construcciones p-globina Norm y Ter se han obtenido mediante amplificacion por PCR de las construcciones p- globina WT y NS39 (Thermann et al., 1998) utilizando el cebador sentido
5'GCAACCTCAAGCTTACACCATGGTGCACCTGAC3' (SEQ ID n° 1) y el cebador antisentido 5'AGAAAGCAGATCTGCTTAGTGATACTTGTG3' (SEQ ID n° 2). Los fragmentos amplificados se han clonado en las posiciones HindMI/BglM de un plasmido pRSVbgal modificado que comprende 24 sitios MS2 (Fusco et al., 2003).
I-4 Medicion NMD por RT-PCR
Las celulas HeLa se han cultivado en cajas de 60 mm en un medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO-BRL) suplementado con el 10% (v/v) de suero fetal de ternera a 37°C y 5% CO2. Las celulas (1 x 106) se transfectaron entonces con 3|jg de plasmidos ensayos pmCMV-Gl (Norm o 39Ter)(Sun y al., 1998) o 3 |ig de plasmidos ensayos pmCMV-GPx1 (Norm o 46Ter)(Moriarti y al., 1998) y de 1 |ig de plasmido de referencia phCMV- MUP (Belgrader y Maquat, 1994) utilizando el kit LIPOFECTAMINA PLUS REAGENT (INVITROGEN) segun las instrucciones del fabricante. Se trataron las celulas, 24 horas despues de la transfeccion, durante 20 horas con 5 |iM de cada uno de los compuestos a ensayar o con DMSO 0,01% (v/v) como control. El ARN se ha amplificado utilizando TRI Reagent (SIGMA-ALDRIC) segun las instrucciones del fabricante, despues se ha efectuado una transcripcion inversa de los ARNm Gl, GPx1 y MUP antes de una amplificacion por PCR en presencia de nucleotido dCTP radiomarcado al 32P. Las condiciones de PCR y el metodo de analisis se han descrito anteriormente (Ishigaki y al., 2001). Los productos de PCR se han cuantificado sobre Tiphoon 9200 (Amersham Biosciences).
I-5 Ensayo de eficacia de traduccion
Las celulas HeLa se transfectaron con 2 |ig de plasmido pFluc y 1 |ig de plasmido pRluc. 24 horas despues, de la transfeccion, las celulas se incubaron en presencia de DMSO 0,01% (v/v), o de diferentes compuestos a ensayar (5 |iM) durante 20 horas o de 100 |ig/ml de cicloheximida durante 4 horas antes de recoger las celulas. La actividad luciferasa se cuantifico sobre el equivalente de 2x105 celulas sobre un microLumat LB 96P (EG&G Bertold) utilizando el kit Dual Glo Luciferasa (Promega) segun las instrucciones del fabricante. La actividad luciferasa se normalizo despues frente al nivel de ARNm Fluc y Rluc.
I-6 Actividad luciferasa para medir la integridad de la via de degradacion siRNA en presencia de los compuestos inhibidores de NMD
Las celulas se cultivan en placas de 6 pocillos y se transfectan utilizando el kit Lipofectamina Plus reagent (Invitrogen) con 50ng de ARN reportador RLperfect (Pillai y al., 2005), 200 ng de plasmido pG13 que codifica para la 'Firefli luciferasa' y 4 |ig de plasmido pTzU6. 24 horas despues de la transfeccion, los compuestos a ensayar se
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anadieron a los pocillos correspondientes. 48 horas despues de la transfeccion, se midio la actividad luciferasa con el kit Dual Glo Luciferasa (Promega) segun las instrucciones del fabricante.
I-7 Medicion del nivel de fosforilacion de FLAG-hUPF 1 por analisis del gel 2D
Se transfectaron unas celulas 293T (106) con 1|ig de plasmido pFLAG-hUpfl (Sun y al., 1998) utilizando el kit Lipofectamina Plus Reagent (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. Despues de 12 horas, el suero se retiro del medio de cultivo durante 24 horas antes de anadir 5 |iM de compuestos a ensayar o, como control, de DMSO al 10% (v/v) durante 3 horas a 37°C y el 5% de CO2. Entonces, se anade el 10% de suero de nuevo durante 1 hora a 37°C y 5% el CO2. Las protemas totales se purificaron con un tampon de lisis que comprende 8M urea, un 2% CAPS y 40mM Tris base. La migracion en la primera dimension se efectuo segun el protocolo descrito por AMERSHAM-BIOSCIENCES para la electroforesis en 2D con un pH Gradiente inmovilizado. Se utilizo la Immobiline™ DriStrip pH 3-10 (18 cm) para separar las protemas segun su punto isoelectrico. Entonces, se efectuo la segunda dimension cargando la primera dimension en un gel SDS-PAGe al 10%. Finalmente, las protemas se transfieren en una membrana de nitrocelulosa antes de su incubacion con un anticuerpo anti-FLAG (SIGMA- ALDRIC) en TBS que contiene el 0,05% TWEEN durante una noche a 4°C, seguida de una incubacion con un anticuerpo de cabra anti-raton conjugado con peroxidasa (PIERCE). Las protemas se detectan entonces utilizando el sustrato "SuperSignal West Femto Maximum Sensitiviti Substrate" (PIERCE).
I-8 Determinacion de la etapa de bloqueo de NMD
Este experimento se realiza como se ha descrito anteriormente (Hosoda et al., 2005).
I-9 Inmunofluorescencia, ensayo FISH y analisis de imagen
Unas celulas HeLa se han cultivado en laminas de vidrio de 12 mm en DMEM al 10% (v/v) FBS. Las celulas (105) se transfectaron de manera transitoria con 500 ng de plasmidos pGFP-GE1 (Iu et al., 2005), pYFP-hSmg5, pYFP- hSmg6, YFP-hSmg7 (Unterholzner y Izaurralde, 2004), pGFP-CCR4, pCFP-DCP1la (Cougot et al., 2004), pCI-neo- FLAG-hUpf1 (Sun et al., 1998), pcDNA3-hUpf3a-FLAG, pcDNA3-hUpf3b-FLAG (Likke-Andersen et al., 2000), pmCMV-Gl (Norm o 39Ter) (Sun et al., 1998) o pmCMV-GPx1 (Norm o 46Ter) (Moriarti et al., 1998). 24 horas despues de la transfeccion, las celulas se tratan con 5|iM de compuestos a ensayar o de DMSO al 0,001% (v/v) como control. Despues de 20 horas, las celulas se fijaron utilizando una solucion de formalina (SIGMA-ALDRIC) durante 10 min. a temperatura ambiente y permeabilizadas con una solucion de etanol al 70% durante una noche a 4°C.
Para los ensayos de inmunofluorescencia, las celulas fijadas se incubaron con un anticuerpo de raton anti-FLAG (SIGMA-ALDRIC) durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron tres veces en PBS y despues se incubaron con un anticuerpo de raton conjugado con Cy3 o con FITC (JACKSON IMMUNORESEARc) durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, las celulas se lavaron tres veces en PBS antes de ser incubadas en Hoecst (2 ng/|il) (SIGMA-ALDRIC) durante 2 minutos a temperatura ambiente.
Para los experimentos de FISH, las celulas fijadas se incubaron en un tampon de pre-hibridacion (ARNt 125 |ig/ml, ADN de arenque 500 |ig/ml, BSA 1 mg/ml, dextran sulfato 0,1 g/ml, el 50% formamida, 2X tampon SSC) a 37°C durante 1 hora en un incubador de cultivo de tejido. Despues, las celulas fijadas se incuban durante la noche en un incubador de cultivo de tejido con el tampon de hibridacion (tampon de prehibridacion con sondas marcadas con Cy3), se lavan tres veces en un tampon 2X SSC a 37°C, tres veces en un tampon 1X SSC a temperatura ambiente y finalmente se incuban con Hoecst (2ng/|il) (SIGMA-ALDRIC) durante dos minutos a temperatura ambiente. La sonda 5'CGATCTGCGTTCTACGGTGGT3' (SEQ ID n° 3) marcada con Cy3 en los extremos 5' y 3' se ha utilizado para detectar los ARNm G1 Ter o GPX1 Ter.
Las celulas fijadas se observaron con un microscopio DMRA (Leica), un objetivo de aceite PL APO 63x (NA 1.32) con unos filtros A4 (para hoecst), GFP y Y3 (para Cy3).
I- 10 Inmunopurificacion y analisis por transferencia Western
La inmunopurificacion de hUPF1 y el analisis por transferencia Western se efectuaron segun un protocolo descrito anteriormente (Lejeune y Maquat, 2004) utilizando un anticuerpo anti-hUPF1 (Ohnishi et al., 2003). Los analisis por transferencia Western se realizaron utilizando una dilucion al 1/250 de anticuerpo de conejo anti-hUPF1, anti- hSMG5, anti-hSMG6 o anti-hSMG7 (Ohnishi et al., 2003), una dilucion al 1/1000 de anticuerpos de conejo anti- hUPF3/3X (Ishigaki et al., 2001) o de anticuerpos de raton anti-TUBULIN (SIGMA-ALDRIC). Las protemas se detectaron utilizando el sustrato «SuperSignal West Pico Cemiluminescent Substrate» o «SuperSignal West Femto Maximum Sensitiviti Substrate» (PIERCE).
II- RESULTADOS
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II-1 Identificacion de nuevos inhibidores de NMD:
Se han transfectado unas celulas Hela mediante dos plasmidos ensayos que codifican para los ARN de la p-globina (Gl) y de la glutationa peroxidasa 1 (GPx1), y que presentan un codon de terminacion prematura (Ter) o no (Norm). El ARNm Gl esta sujeto a un NMD asociado al nucleo en las celulas no eritroides (Termann et al., 1998; Zhang et al., 1998) mientras que el ARNm GPx1 esta sujeto a un NMD citoplasmico (Moriarti et al., 1998). Ademas, un plasmido de referencia que codifica para el ARNm de una protema urinaria principal (MUP) tambien se ha introducido en las celulas (Ishigaki et al., 2001).
24 horas despues de la transfeccion, las celulas se incuban durante 20 horas con DMSO(-) como control, o con 5 |iM de los compuestos indoles presentes en la tabla I. Despues de 20 horas, los ARN totales se purificaron finalmente y se analizaron por RT-PCR.
Los resultados para los diferentes compuestos ensayados se resumen en la tabla II.
Tabla II
Compuestos Estabilizacion del ARNm G1 Ter Estabilizacion del ARNm GPx1 Ter

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70 +++ ++

71 +++ ++

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497 +++ ++

500 +++ ++
Los resultados han mostrado que, entre los 30 compuestos ensayados, cinco de ellos permiten estabilizar tanto el nivel de ARNm G1 Ter como de GPx1 Ter y esto de manera dosis dependiente. Este resultado se ha podido confirmar mediante la tecnica de RPA. Estos resultados permiten concluir que los compuestos 70, 71, 72, 497 y 500 constituyen unos inhibidores del NMD y esto tanto a nivel nuclear como citoplasmico. Cabe senalar que el nivel de inhibicion observado para estos compuestos era similar a los obtenidos con otros inhibidores de NMD tales como la cicloheximida o la inactivacion por siRNA de la expresion de los genes que codifican para hDCP2 o hPARN (Ishigaki et al., 2001; Lejeune et al., 2003) y que estos compuestos no mostraban ninguna toxicidad celular en las condiciones experimentales (concentracion maxima ensayada de 125 |iM).
A este nivel, la especificidad de los compuestos identificados se ha ensayado en diferentes sistemas (ausencia de inhibicion del corte y empalme, ausencia de la inhibicion de la traduccion y ausencia de formacion de granulos de estres) y ha permitido poner en evidencia que estos compuestos constituyen nuevos inhibidores espedficos de NMD.
II-2 Inhibicion del NMD secuencia arriba de hUPF1:
Con el objetivo de identificar el modo de inhibicion de los compuestos identificados, dichos compuestos se han ensayado en un sistema que mimetiza el reclutamiento secuencial de los factores de NMD en un ARNm (Kim et al., 2005; Likke-Andersen et al., 2000). Para ello, se han transfectado unas celulas con dos tipos de construcciones de las cuales una codificaba para el ARNm de la Firefly Luciferasa (Fluc) mRNA que contiene 8 sitios de union para la protema MS2 sobre su 3'UTR, y la segunda codificaba bien para la protema MS2, o bien para una de las protemas de fusion siguiente: MS2-hUPF1, MS2-hUPF2 o MS2-hUPF3X. Ademas, las celulas HeLa tambien se transfectaron con una construccion que codifica para el ARNm de la Renilla Luiferasa (Rluc) a fin de normalizar el nivel de ARN analizado.
Las celulas se incubaron despues durante 20 horas con el compuesto 70 o DMSO (-) como control negativo. El nivel
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de los ARNm Rluc y Fluc se midio entonces como se ha descrito anteriormente (Hosoda et al., 2005). A tftulo de control, la expresion de cada una de las protemas de fusion MS2 se ha determinado por transferencia Western.
Los resultados han mostrado que, en cada caso, el compuesto 70 no afectaba el nivel de expresion de las protemas de fusion MS2, el cual nunca era superior al nivel de expresion de las protemas endogenas. Como se espera y en presencia de DMSO, el nivel de expresion de los ARNm Fluc era inferior en las celulas que expresan una de las protemas de fusion MS2-hUPF fusion con respecto a las celulas que expresan unicamente MS2. Sin embargo, los resultados han revelado que el compuesto 70 interfiere con la degradacion inducida por MS2-hUPF2 o MS2- hUPF3X, pero no tiene efecto sobre la degradacion inducida por MS2-hUPF1. Cabe senalar que la relacion de los ARNm FLuc/RLuc y el nivel de inhibicion inducido por el compuesto 70 son muy similares a los observados en respuesta a una inactivacion por siRNA de la expresion del gen que codifica para hCBP80 (Hosoda et al., 2005).
Finalmente, los resultados indican que la inhibicion del NMD por el compuesto 70 secuencia abajo del reclutamiento de hUPF3X o de hUPF2 y secuencia abajo de las funciones de hUPFI.
II-3 El compuesto 70 no previene la interaccion entre hUPFI y hUPF3X:
Frente a los resultados anteriores, se ha considerado que el compuesto 70 podfa prevenir el reclutamiento de hUPFI a EJC por medio de su interaccion con otras protemas hUPF. Con ese objetivo, la protema hUPFI se ha inmunoprecipitado a partir de extractos de celulas HeLa en condiciones que preservan la integridad de los mRNP (Lejeune and Maquat, 2004).
El compuesto 70 o DMSO (-) se anadio a los cultivos de celulas 20 horas antes de la inmunoprecipitacion (IP). En la medida en la que se ha demostrado que la protema hUPF2 no era esencial en algunos casos de NMD (Gehring et al., 2005), el analisis se focalizo en presencia de la protema hUPF3X en cada inmunoprecipitacion. Como control de especificidad, se ha demostrado la ausencia de protema tubulina en cada una de las inmunoprecipitaciones y se ha realizado una inmunoprecipitacion no espedfica con suero de conejo normal en la que no se ha detectado ninguna protema.
Los resultados han mostrado que la protema hUPF3X estaba presente en las inmunoprecipitaciones de hUPFI incluso cuando las celulas estaban previamente incubadas con el compuesto 70.
En consecuencia, la interaccion entre hUPFI y hUPF3X no es suprimida por el compuesto 70, lo que sugiere que este compuesto no inhibe el reclutamiento de hUPFI a EJC.
II-4 El compuesto 70 estabiliza las formas hiperfosforiladas de hUPFI:
En la medida en la que hUPFI requiere un ciclo de fosforilacion y de desfosforilacion durante el NMD (Ohnishi et al., 2003), se ha ensayado el nivel de fosforilacion en respuesta a la presencia del compuesto 70. Para ese fin, el nivel de fosforilacion de hUPFI se ha detectado en celulas incubadas con el compuesto 70 o con DMSO (-) por un analisis en gel 2D. En la medida en la que la fosforilacion de hUPFI esta influenciada por el suero (Pal et al., 2001), se han utilizado unas celulas 293T en lugar de HeLa debido a su capacidad para bloquear su division celular en la misma etapa del ciclo celular en ausencia de suero. Las celulas se han transfectado por el vector de expresion pCI- neo-FLAG-hUpfl (Sun et al., 1998), sincronizados en ausencia de suero 12 horas despues de la transfeccion durante 24 horas. Finalmente, se ha anadido DMSO o 5 |im del compuesto 70 durante 3 horas antes de anadir suero durante una hora.
Los resultados han mostrado que, sin adicion de suero, la protema FLAG-hUPF1 migra formando solo un punto que corresponde a la protema no fosforilada (Pal et al., 2001). Despues de la adicion de suero, se observa una fosforilacion intermedia de la protema FLAG-hUPF1 cuando las celulas se han incubado con DMSO y la estabilizacion de isoformas fosforiladas suplementarias de FLAG-hUPF1 cuando las celulas se han incubado con el compuesto 70.
En consecuencia, el compuesto 70 permite por lo tanto estabilizar unas isoformas hiperfosforiladas de la protema hUPF1.
En la medida en la que se ha propuesto que la protema hUPF1 se localizana a nivel de los "P-bodies" cuando esta hiperforforilada (Unterholzner y Izaurralde, 2004), se ha ensayado la localizacion celular de la protema GLAF-hUPF1 en celulas HeLa en presencia y en ausencia del compuesto 70.
Los resultados muestran que la protema hUPF1 exogena esta distribuida de manera igual en el citoplasma cuando las celulas se han incubado con DMSO, como se ha demostrado anteriormente para unas celulas no tratadas (Mendell et al., 2002), salvo en experimentos de coexpresion con la protema hSMG7, la cual induce el reclutamiento de la protema hUPF1 a nivel de los "P-bodies" (Unterholzner y Izaurralde, 2004). Sin embargo, y cuando las celulas se han tratado previamente con el compuesto 70, se observan unas concentraciones citoplasmicas de FLAG-hUPF1 en unas estructuras que colocalizan con GFP-GE1, YFP-hSMG7 o CFP-hDCP1a, los cuales constituyen unos
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marcadores comunes de los "P-bodies".
En consecuencia, el compuesto 70 induce la acumulacion de las isoformas hiperfosforiladas de hUPFI a nivel de los "P-bodies", bien por la estimulacion de la fosforilacion, o bien por la inhibicion de la desfosforilacion.
A fin de determinar cual de estos dos mecanismos sena inducido por los compuestos identificados, se ha efectuado un analisis complementario de los inmunoprecipitados de la protema hUPFI a partir de celulas HeLa incubadas o no en presencia del compuesto 70.
En una primera fase, se ha efectuado el analisis de hUPFI con su complejo de desfosforilacion. Los resultados han mostrado que hSMG5, hSMG6 y hSMG7 pueden ser detectados en las celulas tratadas con el DMSO, pero que hSMG5 era, no obstante, indetectable cuando las celulas HeLa se incubaban previamente con el compuesto 70.
En consecuencia, los resultados muestran que el compuesto 70 desestabiliza la interaccion entre hUPFI y hSMG5. Finalmente, la presencia de hSMGI y de hUPF3X en las inmunoprecipitaciones efectuadas sobre las celulas incubadas o no con el compuesto 70 sugiere en gran medida que los compuestos identificados no tienen influencia sobre la interaccion entre hUPFI y su complejo de fosforilacion (figura 3A). Los resultados obtenidos abogan por el hecho de que el estado de hiperfosforilacion de hUPFI observado estana relacionado con un defecto de desfosforilacion, debido a la ausencia de interaccion entre hUPFI y hSMG5, mas que para una activacion de la fosforilacion. Esta conclusion esta finalmente en acuerdo con la identificacion de hSMG5 como componente esencial para la desfosforilacion de hUPFI (Ohnishi et al., 2003).
II-5 hSMG5 esta excluido de los "P-bodies" en presencia del compuesto 70:
Se sabe que hSMG5 y hSMG7 estan localizados en el citoplasma y mas espedficamente a nivel de los "P-bodies" (Unterholzner y Izaurralde, 2004).
Se han transfectado unas celulas HeLa con los vectores de expresion que codifican para YFP-hSMG5, YFP-hSMG6 o YFP-hSMG7 (Unterholzner y Izaurralde, 2004) y CFP-hDCP1a como marcador de los "P-bodies". Despues de 24 horas, las celulas se incubaron en presencia de DMSO o de 5 |iM del compuesto 70.
Como se ha demostrado anteriormente, en ausencia de los inhibidores, YFP-hSMG5, YFP-hSMG6 e YFP-hSMG7 estan concentrados en los foci citoplasmicos (Fukuhara et al., 2005; Unterholzner y Izaurralde, 2004), foci que se han identificado como principalmente unos "P-bodies" cuando CFP-DCP1a se utiliza como marcador de los "P- bodies".
En presencia del compuesto 70, los foci citoplasmicos que contienen YFP-hSMG6 o YFP-hSMG7 colocalizan con el marcador de los "P-bodies" CFP-DCP1a. Sin embargo, hSMG5 no se observa ya en los foci citoplasmicos, pero presenta una amplia distribucion citoplasmica en las celulas tratadas con el compuesto 70.
En la medida en la que se ha demostrado que el compuesto 70 inhibe el NMD e induce la concentracion de hUPFI en los P-bodies, como se demuestra con la protema hUPFI exogena o endogena, se ha ensayado la localizacion de las tres protemas hSMG endogenas a nivel del foci citoplasmico. Esta localizacion no se habfa observado nunca debido a una expresion demasiado baja de estas protemas. Tratando las celulas con el compuesto 70, era previsible obtener una estabilizacion de estos factores dentro de los P-bodies.
Los resultados han mostrado que las protemas endogenas no son detectadas a nivel del foci citoplasmico para las celulas tratadas con el DMSO. Por el contrario, y cuando las celulas se incuban con el compuesto 70, los resultados muestran una concentracion de las protemas hSMG6 y hSMG7 a nivel de los "P-bodies" mientras que hSMG5 no es detectado a nivel de los foci citoplasmicos, lo que confirma los resultados obtenidos con las protemas exogenas.
Finalmente, los resultados muestran que el compuesto 70 modifica la localizacion celular de hSMG5 excluyendo los "P-bodies". Esta observacion es consistente con la perdida de interaccion entre UPF1 y SMG5 cuando las celulas son incubadas con el compuesto 70.
II-6 hUPF3 y hUPF3X localizan a nivel de los "P-bodies" cuando el NMD esta bloqueado por el compuesto 70
Ya que algunos factores del NMD, como hUPFI, hSMG5, hSMG6 o hSMG7 se localizan a nivel de los "P-bodies" (Unterholzner y Izaurralde, 2004), se ha considerado que otros factores de NMD puedan pasar en los "P-bodies" de manera transitoria al menos. Como el compuesto 70 bloquea el NMD a una etapa en la que hUPFI esta confinado a nivel de los "P-bodies", se ha ensayado la localizacion celular de hUPF3 y de hUPF3X en las celulas tratadas y no tratadas. Se ha demostrado que estas dos protemas son principalmente unas protemas nucleares en las celulas no tratadas (Serin et al., 2001).
Unas celulas HeLa se transfectaron con unos vectores de expresion que codifican para hUPF3-FLAG o hUPF3X- FLAG, y con uno de los marcadores de "P-bodies" siguiente: YFP-hSMG6, YFP-hSMG7, GFP-GE1 y CFP-hDCP1a.
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Las celulas se han tratado con DMSO o el compuesto 70 antes de realizar unos experimented de inmunofluorescencia. Como para las celulas no tratadas (Serin et al., 2001), hUPF3 o hUPF3X se localizan esencialmente a nivel del nucleo cuando las celulas son incubadas con DMSO (-). Por el contrario, y despues de la incubacion de las celulas en presencia del compuesto 70, los resultados han mostrado una localizacion citoplasmica de hUPF3 y de hUPF3X con acumulaciones en foci, que corresponde a unos "P-bodies".
II-7 los ARNm que contienen PTC se acumulan en los "P-bodies" en presencia del compuesto 70:
En la medida en la que los factores del NMD se acumulan a nivel de los "P-bodies" en presencia del compuesto 70, se ha estudiado la localizacion de los sustratos de NMD. En la levadura, en efecto, se ha puesto en evidencia recientemente que cuando los factores de NMD se acumulaban en los "P-bodies", los ARNm que contienen unas PTC se acumulaban tambien en los "P-bodies" cuando el NMD estaba bloqueado (Shet and Parker, 2006).
Unas celulas HeLa se transfectaron con los vectores pmCMV-Gl Ter o pmCMV-GPxl Ter, y la localizacion de los ARNm resultante se analizo con los marcadores de "P-bodies" siguientes: GFP-GE1, YFP-hSMG6, YFP-hSMG7, CFP-hDCP1a, GFP-hCCR4, FLAG-hUPFI, hUPF3-FLAG y hUPF3X-FLAG.
Los resultados han mostrado que en ausencia de inhibidores, no se ha podido detectar ningun ARNm que contiene PTC, probablemente debido a su degradacion rapida por el NMD. Por el contrario, y despues del tratamiento con el compuesto 70, los ARNm que contienen unos PTC son estabilizados y detectados esencialmente a nivel de agregados citoplasmicos que co-localizan con cada una de las protemas de fusion de hUPF ensayadas.
Finalmente, los resultados han mostrado que los ARNm que contienen unas PTC estaban presentes en los "P- bodies" o adyacentes a estos ultimos cuando el NMD estaba inhibido por el compuesto 70.
La acumulacion de los ARNm que contienen unos PTC a nivel de los "P-bodies" cuando el NMD esta bloqueado en unas celulas de mairnfero tambien se ha confirmado mediante un enfoque mas resolutivo. En este ultimo, los ARNm estan marcados con 24 repeticiones MS2, lo que permite la deteccion de moleculas de ARNm unicas por hibridacion in situ (Fusco et al., 2003).
Los resultados han mostrado que, en las celulas control, los ARN que contienen unas PTC son detectados esencialmente a nivel del nucleo, y las moleculas citoplasmicas detectadas no se acumulan a nivel de los "P-bodies". Cuando el NMD esta inhibido por el compuesto 70, los resultados han mostrado una acumulacion de los ARNm que contienen unos PTC a nivel del citoplasma y, mas espedficamente, en unas estructuras que co-localizan con los "P- bodies".
En consecuencia, estos resultados confirman que los ARNm sujetos a NMD se acumulan a nivel de los "P-bodies" cuando la degradacion esta inhibida, y esta conclusion no parece ser espedfica de las celulas.
Finalmente, los resultados han mostrado que no se detecta ningun ARNm salvaje en los "P-bodies" despues de la incubacion con el compuesto 70, lo que confirma una funcion de inhibidor espedfica de NMD de los compuestos identificados mas que una funcion general de inhibicion de la degradacion de los ARNm.
II-8 Estabilizacion de ARNm de distrofina que presenta un codon de terminacion prematura:
El gen de la distriofina esta compuesto de 79 exones, de los cuales los exones 70 a 79 codifican para una parte de la protema que no es esencial para la funcion de esta protema en el musculo.
Entre los pacientes que padecen distrofia muscular de Duchenne (DMD), existen unos pacientes que llevan una mutacion no sentido en uno de los exones 70 a 79. Por lo tanto, estos pacientes no expresan la protema distrofina debido a la degradacion del ARNm por el NMD, y esto aunque la protema truncada sea funcional. En consecuencia, una inhibicion de NMD en estos pacientes permitina sintetizar esta protema truncada pero funcional.
Se han utilizado dos lmeas celulares procedentes de pacientes que padecen DMD debido, respectivamente, a una retencion del intron 70 que aporta un codon de terminacion y de una delecion de los exones 75 a 76 que provoca un desplazamiento del marco de lectura y, por lo tanto, la aparicion de un codon de terminacion precoz que activa el NMD sobre este ARNm.
Estas dos lmeas celulares se han tratado durante 48 horas con el compuesto 70, 71 o 72, o en presencia de DMSO. Los ARN se extrajeron despues y se realizo una RT-PCR en condicion cuantitativa.
Los resultados han mostrado una estabilizacion del ARNm distrofina de un factor 4 aproximadamente, tras el tratamiento con los compuestos 70, 71 o 72.
II-9 Inhibicion de NMD in vivo:
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Se han utilizado dos modelos murinos para el mecanismo de NMD para estudiar el efecto in vivo del compuesto 70. El primer modelo se denomina raton mdx. Estos ratones llevan una mutacion no sentido en el exon 23 del gen de la distrofina. Este codon no sentido induce la degradacion del ARNm distrofina por el NMD. Estos ratones han recibido en el musculo una inyeccion de DMSO (50 (|il), 20, 200 o 2000 nmoles de compuesto 70. Despues de 6, 24 y 32 horas, se han sacrificado unos ratones, el musculo inyectado se extrajo a fin de extraer los ARN y las protemas. Los resultados preliminares muestran una estabilizacion del ARNm distrofina en los ratones inyectados por el compuesto 70 y no en los ratones inyectados por el DMSO. Ademas, la protema distrofina truncada es ella misma detectada en estos ratones inyectados por el compuesto 70 y no en los ratones que han recibido el DMSO.
El segundo modelo murino que ha sido utilizado se define por la presencia de una mutacion no sentido en el exon 3 del gen |i del receptor a los opiaceos (MOR). Este codon de terminacion activa el NMD sobre este ARNm MOR. El gen MOR esta expresado solo en el sistema nervioso central que hace de este modelo una herramienta muy interesante a fin de estudiar la posibilidad, para un compuesto qmmico, de atravesar la barrera hemato-encefalica. Se ha seguido el mismo procedimiento que para los ratones mdx, salvo que la inyeccion se realiza por via subcutanea a nivel del cuello de los ratones y el cerebro se ha extrafdo en las diferentes fases del experimento. De nuevo, los primeros resultados muestran una estabilizacion del ARNm MOR en los ratones inyectados por el compuesto 70 y no en los ratones inyectados solo con DMSO. El analisis por transferencia Western de la protema MOR muestran la presencia de la protema truncada en estos mismos ratones inyectados por el compuesto 70 y no en los ratones que han recibido solo DMSO. Estos resultados muestran que el compuesto 70 es activo in vivo y que puede atravesar la barrera hemato-encefalica, lo que hace de este compuesto un potencial agente terapeutico para unas enfermedades que afectan al sistema nervioso central y relacionadas con el NMD.
III- Discusion
Este estudio ha permitido poner en evidencia la capacidad de inhibicion de NMD de derivados indoles. Estos compuestos actuan impidiendo la interaccion entre hUPFI y hSMG5, lo que llega a la exclusion de hSMG5 de los p- bodies y a la estabilizacion de las formas hiperfosforiladas de hUPFI.
Finalmente, los resultados han permitido poner en evidencia que estos derivados indoles son capaces de inhibir el NMD in vivo y pasar la barrera hematoencefalica, lo que hace de ellos buenos candidatos en el tratamiento de numerosas patologfas asociadas a NMD.
Estos compuestos, ademas, resultan ser excelentes herramientas para estudiar el mecanismo de NMD por un enfoque que jamas ha sido posible debido a la falta de herramienta para inhibir espedficamente este proceso. Por lo tanto, es perfectamente concebible una ventaja para los laboratorios que trabajan sobre este mecanismo de NMD.
Referencias:
Balkan, F.; Elmes, B.C.; Loder, J. W. Australian Journal of Chemistry 1969, 22, 2489.
Bashkirov, V.I., H. Scherthan, J.A. Solinger, J.M. Buerstedde, and W.D. Heyer. 1997. A mouse cytoplasmic exoribonuclease (mXRNIp) with preference for G4 tetraplex substrates. J Cell Biol. 136:761-73.
Belgrader, P., y L.E. Maquat. 1994. Nonsense but not missense mutations can decrease the abundance of nuclear mRNA for the mouse major urinary protein, while both types of mutations can facilitate exon skipping. Mol Cell Biol. 14:6326-36.
Brengues, M., D. Teixeira, y R. Parker. 2005. Movement of eukaryotic mRNAs between polysomes and cytoplasmic processing bodies. Science. 310:486-9.
Bisagni, E., Rautureau, M., Huel, C. Heterocycles 1988, 27, 1671-1678
Chen, C.Y., y A.B. Shyu. 2003. Rapid deadenylation triggered by a nonsense codon precedes decay of the RNA body in a mammalian cytoplasmic nonsense-mediated decay pathway. Mol Cell Biol. 23:4805-13.
Chiu, S.Y., G. Serin, O. Ohara, y L.E. Maquat. 2003. Characterization of human Smg5/7a: a protein with similarities to Caenorhabditis elegans SMG5 and SMG7 that functions in the dephosphorylation of Upfl . Rna. 9:77-87.
Conti, E., y E. Izaurralde. 2005. Nonsense-mediated mRNA decay: molecular insights and mechanistic variations across species. Curr Opin Cell Biol. 17:316-25.
Cougot, N., S. Babajko, y B. Seraphin. 2004. Cytoplasmic foci are sites of mRNA decay in human cells. J Cell Biol. 165:31-40.
Couttet, P., y T. Grange. 2004. Premature termination codons enhance mRNA decapping in human cells. Nucleic Acids Res. 32:488-94.
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Czaplinski, K., M.J. Ruiz-Echevarria, S.V. Paushkin, X. Han, Y. Weng, H.A. Perlick, H.C. Dietz, M.D. Ter-Avanesyan, y S.W. Peltz. 1998. The surveillance complex interacts with the translation release factors to enhance termination and degrade aberrant mRNAs. Genes Dev. 12:1665-77.
Ducrocq, C., Bisagni, E., Rivalle. C., Lhoste, J.M. Tetahedron 1979, 35, 142
Fenger-Gron, M., C. Fillman, B. Norrild, y J. Lykke-Andersen. 2005. Multiple processing body factors and the ARE binding protein TTP activate mRNA decapping. Mol Cell. 20:905-15.
Fukuhara, N., J. Ebert, L. Unterholzner, D. Lindner, E. Izaurralde, y E. Conti. 2005. SMG7 is a 14-3-3-like adaptor in the nonsense-mediated mRNA decay pathway. Mol Cell. 17:537-47.
Fusco, D., N. Accornero, B. Lavoie, S.M. Shenoy, J.M. Blanchard, R.H. Singer, y E. Bertrand. 2003. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13:161-7.
Frischmeyer, P.A. y Dietz, H.C. 1999. Nonsense-mediated mRNA decay in health and disease. Human Molecular Genetics, 8(10):1893-1900.
Gehring, N.H., J.B. Kunz, G. Neu-Yilik, S. Breit, M.H. Viegas, M.W. Hentze, y A.E. Kulozik. 2005. Exon-junction complex components specify distinct routes of nonsense-mediated mRNA decay with differential cofactor requirements. Mol Cell. 20:65-75.
He, F., X. Li, P. Spatrick, R. Casillo, S. Dong, y A. Jacobson. 2003. Genome-wide analysis of mRNAs regulated by the nonsense-mediated and 5' to 3' mRNA decay pathways in yeast. Mol Cell. 12:1439-52.
Hosoda, N., Y.K. Kim, F. Lejeune, y L.E. Maquat. 2005. CBP80 promotes interaction of Upf1 with Upf2 during nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells. Nat Struct Mol Biol. 12:893-901.
Ingelfinger, D., D.J. Arndt-Jovin, R. Luhrmann, y T. Achsel. 2002. The human LSm1-7 proteins colocalize with the mRNA-degrading enzymes Dcp1/2 and Xrnl in distinct cytoplasmic foci. Rna. 8:1489-501.
Ishigaki, Y., X. Li, G. Serin, y L.E. Maquat. 2001. Evidence for a pioneer round of mRNA translation: mRNAs subject to nonsense-mediated decay in mammalian cells are bound by CBP80 and CBP20. Cell. 106:607-17.
Kashima, I., A. Yamashita, N. Izumi, N. Kataoka, R. Morishita, S. Hoshino, M. Ohno, G. Dreyfuss, y S. Ohno. 2006. Binding of a novel SMG-1-Upfl-eRF1-eRF3 complex (SURF) to the exon junction complex triggers Upf1 phosphorylation and nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev. 20:355-67.
Kedersha, N., G. Stoecklin, M. Ayodele, P. Yacono, J. Lykke-Andersen, M.J. Fitzler, D. Scheuner, R.J. Kaufman, D.E. Golan, y P. Anderson. 2005. Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling. J Cell Biol. 169:871-84.
Kim, Y.K., L. Furic, L. Desgroseillers, y L.E. Maquat. 2005. Mammalian Staufen1 recruits Upf1 to specific mRNA 3'UTRs so as to elicit mRNA decay. Cell. 120:195-208.
Kuzmiak, H.A., y L.E. Maquat. 2006. Applying nonsense-mediated mRNA decay research to the clinic: progress and challenges. Trends Mol Med.
Lejeune, F., X. Li, y L.E. Maquat. 2003. Nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells involves decapping, deadenylating, and exonucleolytic activities. Mol Cell. 12:675-87.
Lejeune, F., y L.E. Maquat. 2004. Immunopurification and analysis of protein and RNA components of mRNP in mammalian cells. Methods Mol Biol. 257:115-24.
Lejeune, F., y L.E. Maquat. 2005. Mechanistic links between nonsense-mediated mRNA decay and pre-mRNA splicing in mammalian cells. Curr Opin Cell Biol. 17:309-15.
Lykke-Andersen, J., M.D. Shu, y J.A. Steitz. 2000. Human Upf proteins target an mRNA for nonsense-mediated decay when bound downstream of a termination codon. Cell. 103:1121-31.
Maquat, L.E. 2004a. Nonsense-Mediated mRNA Decay: A Comparative Analysis of Different Species. Current Genomics. 5:175-190.
Maquat, L.E. 2004b. Nonsense-mediated mRNA decay: splicing, translation and mRNP dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 5:89-99.
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Mendell, J.T., C.M. ap Rhys, y H.C. Dietz. 2002. Separable roles for rentl/hUpfl in altered splicing and decay of nonsense transcripts. Science. 298:419-22.
Mendell, J.T., N.A. Sharifi, J.L. Meyers, F. Martinez-Murillo, y H.C. Dietz. 2004. Nonsense surveillance regulates expression of diverse classes of mammalian transcripts and mutes genomic noise. Nat Genet. 36:1073-8.
Moriarty, P.M., C.C. Reddy, y L.E. Maquat. 1998. Selenium deficiency reduces the abundance of mRNA for Se- dependent glutathione peroxidase 1 by a UGA-dependent mechanism likely to be nonsense codon-mediated decay of cytoplasmic mRNA. Mol Cell Biol. 18:2932-9.
Ohnishi, T., A. Yamashita, I. Kashima, T. Schell, K.R. Anders, A. Grimson, T. Hachiya, M.W. Hentze, P. Anderson, y S. Ohno. 2003. Phosphorylation of hUPF1 induces formation of mRNA surveillance complexes containing hSMG-5 and hSMG-7. Mol Cell. 12:1187-200.
Page, M.F., B. Carr, K.R. Anders, A. Grimson, y P. Anderson. 1999. SMG-2 is a phosphorylated protein required for mRNA surveillance in Caenorhabditis elegans and related to Upflp of yeast. Mol Cell Biol. 19:5943-51.
Pal, M., Y. Ishigaki, E. Nagy, y L.E. Maquat. 2001. Evidence that phosphorylation of human Upf1 protein varies with intracellular location and is mediated by a wortmannin-sensitive and rapamycin-sensitive PI 3-kinase-related kinase signaling pathway. Rna. 7:5-15.
Pillai, R.S., S.N. Bhattacharyya, C.G. Artus, T. Zoller, N. Cougot, E. Basyuk, E. Bertrand, y W. Filipowicz. 2005. Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells. Science. 309:1573-6.
Rehwinkel, J., I. Letunic, J. Raes, P. Bork, y E. Izaurralde. 2005. Nonsense-mediated mRNA decay factors act in concert to regulate common mRNA targets. Rna. 11:1530-44.
Rivalle, C., Ducrocq, C., Lhoste, J. M., Wendling, F.,Bisagnie, E., Chermann, J. C. Tetrahedron 1981; 37, 2097-2103
Rivalle, C., Wendling, F., Tambourin, P., Lhoste, J. M., Bisagni, E. J. Med. Chem. 1983, 26, 181-185Serin, G., A. Gersappe, J.D. Black, R. Aronoff, and L.E. Maquat. 2001. Identification and characterization of human orthologues to Saccharomyces cerevisiae Upf2 protein and Upf3 protein (Caenorhabditis elegans SMG-4). Mol Cell Biol. 21:209-23.
Sheth, U., y R. Parker. 2003. Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies. Science. 300:805-8.
Sheth, U., y R. Parker. 2006. Targeting of aberrant mRNAs to cytoplasmic processing bodies. Cell. 125:1095-109.
Soret, J., N. Bakkour, S. Maire, S. Durand, L. Zekri, M. Gabut, W. Fic, G. Divita, C. Rivalle, D. Dauzonne, C.H. Nguyen, P. Jeanteur, y J. Tazi. 2005. Selective modification of alternative splicing by indole derivatives that target serine-arginine-rich protein splicing factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8764-9.
Sun, X., H.A. Perlick, H.C. Dietz, y L.E. Maquat. 1998. A mutated human homologue to yeast Upf1 protein has a dominant-negative effect on the decay of nonsense-containing mRNAs in mammalian cells. Ploc Natl Acad Sci U S A. 95 :10009-14.
Sureau, A., R. Gattoni, Y. Dooghe, J. Stevenin, y J. Soret. 2001. SC35 autoregulates its expression by promoting splicing events that destabilize its mRNAs. Embo J. 20:1785-96.
Teixeira, D., U. Sheth, M.A. Valencia-Sanchez, M. Brengues, y R. Parker. 2005. Processing bodies require RNA for assembly and contain nontranslating mRNAs. Rna. 11:371-82.
Thermann, R., G. Neu-Yilik, A. Deters, U. Frede, K. Wehr, C. Hagemeier, M.W. Hentze, y A.E. Kulozik. 1998. Binary specification of nonsense codons by splicing and cytoplasmic translation. Embo J. 17:3484-94.
Tourriere, H., K. Chebli, L. Zekri, B. Courselaud, J.M. Blanchard, E. Bertrand, y J. Tazi. 2003. The RasGAP- associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. J Cell Biol. 160:823-31.
Unterholzner, L., y E. Izaurralde. 2004. SMG7 acts as a molecular link between mRNA surveillance and mRNA decay. Mol Cell. 16:587-96.
van Dijk, E., N. Cougot, S. Meyer, S. Babajko, E. Wahle, y B. Seraphin. 2002. Human Dcp2: a catalytically active mRNA decapping enzyme located in specific cytoplasmic structures. Embo J. 21:6915-24.
Wollerton, M.C., C. Gooding, E.J. Wagner, M.A. Garcia-Blanco, y C.W. Smith. 2004. Autoregulation of polypyrimidine tract binding protein by alternative splicing leading to nonsense-mediated decay. Mol Cell. 13:91-100.
Yamashita, A., T. Ohnishi, I. Kashima, Y. Taya, y S. Ohno. 2001. Human SMG-1, a novel phosphatidylinositol 35 kinase-related protein kinase, associates with components of the mRNA surveillance complex and is involved in the regulation of nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev. 15:2215-28.
Yu, J.H., W.H. Yang, T. Gulick, K.D. Bloch, y D.B. Bloch. 2005. Ge-1 is a central component of the mammalian cytoplasmic mRNA processing body. Rna. 11:1795-802.
10
Zhang, J., X. Sun, Y. Qian, y L.E. Maquat. 1998. Intron function in the nonsense-mediated decay of beta-globin mRNA: indications that pre-mRNA splicing in the nucleus can influence mRNA translation in the cytoplasm. Rna. 4:801-15.
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Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. Compuesto derivado de indol que corresponde a la formula II siguiente:
    imagen1
    Formula II
    en la que:
    - X representa N o el anhidro base N+R8,
    en el que R8 representa un atomo de hidrogeno, un grupo hidroxilo o alquilo o metoxi eventualmente sustituido con un grupo fenilo, preferentemente R8 representa un atomo de hidrogeno,
    - R2, R3 y R4 representan independientemente, un atomo de hidrogeno o un atomo de halogeno o un grupo alquilo de C1-C4,
    - R5 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo, saturado o insaturado,
    - R6 representa un grupo alquilo de C1-C3, preferentemente un grupo metilo o etilo y de manera particularmente preferida R6 representa un grupo metilo,
    - R7 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo de C1-C3,
    - R9 y R10 representan independientemente un atomo de hidrogeno, un grupo R11, OR11 o SR11,
    en los que R11 representa un atomo de hidrogeno, un atomo de oxigeno, un grupo alquilo de C1-C3 saturado o insaturado, que puede contener uno o varios atomos de azufre, de oxigeno o de nitrogeno;
    - A representa un anillo en la posicion a y que corresponde a
    imagen2
    en la que:
    - R1 representa un atomo de hidrogeno, de oxigeno o de halogeno o un grupo alquilo o amina lineal o ramificado y/o insaturado,
    - R13 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo de C1-C4, y/o unas sales farmaceuticamente aceptables de dichos compuestos.
  2. 2. Un compuesto derivado de indol segun la reivindicacion 1, de formula Ia siguiente
    imagen3
    en la que R2, R3, R4, R5, R6, R6, X y el anillo A son tales como se han definido en la reivindicacion 1.
  3. 3. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que R2, R3 y R4 representan indepenientemente los unos de los otros un atomo de hidrogeno o un atomo de halogeno.
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  4. 4. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que R5 representa un grupo metilo, etilo, propilo o butilo y, preferentemente R5 representa un atomo de hidrogeno.
  5. 5. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que R7 representa un grupo metilo o etilo y preferentemente R7 representa un grupo metilo.
  6. 6. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que R1 es un atomo de hidrogeno, de oxigeno o de halogeno.
  7. 7. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que A se selecciona del grupo que comprende
    imagen4
  8. 8. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el compuesto se selecciona del grupo que comprende:
    - 5,8-Dimetil-6-(piridin-2-ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona;
    - 5,8-Dimetil-6-(3-metoxi-piridin-2-ilamino)-isoquinolin-1-ona; y
    - 5,8-dimetil-6-(5-metil-piridin-2-ilamino)-isoquinolina, y preferentemente dicho compuesto es la 5,8-dimetil-6-(3- metoxi-piridin-2-ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona;
  9. 9. Composition farmaceutica que comprende al menos un derivado de indol tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, eventualmente un soporte farmaceuticamente aceptable.
  10. 10. Compuesto derivado de indol que corresponde a la formula II siguiente:
    imagen5
    en la que:
    - X representa N, CR8 o el anhidro base N+R8,
    en el que R8 representa un atomo de hidrogeno, un grupo hidroxilo o alquilo o metoxi eventualmente sustituido con un grupo fenilo, preferentemente R8 representa un atomo de hidrogeno,
    - R2, R3 y R4 representan independientemente, un atomo de hidrogeno o un atomo de halogeno o un grupo alquilo de C1-C4,
    - R5 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo, saturado o insaturado,
    - R6 representa un grupo alquilo de C1-C3, preferentemente un grupo metilo o etilo y de manera particularmente preferida R6 representa un grupo metilo,
    - R7 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo de C1-C3,
    - R9 y R10 representan juntos un enlace carbono o representan independientemente un atomo de hidrogeno, un grupo R11, OR11 o SR11,
    en los que R11 representa un atomo de hidrogeno, un atomo de oxigeno, un grupo alquilo de C1-C3 saturado o
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    insaturado, que puede contener uno o varios atomos de azufre, de o^geno o de nitrogeno; - A representa un anillo en la posicion a y que corresponde a
    imagen6
    en la que:
    - R1 representa un atomo de hidrogeno, de oxigeno o de halogeno o un grupo alquilo o amina lineal o ramificado y/o insaturado,
    - R13 representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo de C1-C4, y/o unas sales farmaceuticamente aceptables de dichos compuestos,
    para su utilizacion para tratar, en un sujeto, una enfermedad genetica seleccionada del grupo que comprende la p- talasemia, el smdrome de Marfan, la distrofia muscular de Duchenne (DMD), la distrofia muscular de Becker (BMD), la enfermedad de Ullrich, el smdrome de Hurler y la fibrosis quistica (CF).
  11. 11. Utilizacion de un compuesto segun la reivindicacion 10, caracterizada por que dicho compuesto se selecciona del grupo que comprende:
    - 6-Cloro-5,10-dimetil-11H-pirido[3',2']:4,5]pirrolo[3,2-g]isoquinolina;
    - 5,10-dimetil-11H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[3,2-g]isoquinolina;
    - 5,8-Dimetil-6-(piridin-2-ilamino)-2H-isoquinolin-1-ona;
    - 5,8-dimetil-6-(3-metoxi-piridin-2-ilamino)-isoquinolin-1-ona; y
    - 5,8-dimetil-6(5-metil-piridin-2-ilamino)-isoquinolina.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2266972A1 (en) * 2009-06-12 2010-12-29 Splicos New chemical molecules that inhibit the splicing mechanism for treating diseases resulting from splicing anomalies
MX2019008390A (es) * 2009-06-12 2019-09-09 Abivax Compuestos utiles para tratar cancer.
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KR101982461B1 (ko) * 2009-06-12 2019-05-24 아비박스 조기 노화, 구체적으로 조로증을 치료하는데 유용한 화합물
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EP2465502A1 (en) 2010-12-15 2012-06-20 Société Splicos Compounds useful for treating AIDS
AU2012230259B2 (en) * 2011-03-24 2017-04-06 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Dominant negative HSP110 mutant and its use in prognosing and treating cancers
CN102960745A (zh) * 2012-08-16 2013-03-13 熊智惠 果蔬兔肉干的制作方法
US9216180B2 (en) 2012-10-02 2015-12-22 New York University Pharmaceutical compositions and treatment of genetic diseases associated with nonsense mediated RNA decay
EP2757161A1 (en) 2013-01-17 2014-07-23 Splicos miRNA-124 as a biomarker of viral infection
HRP20211839T1 (hr) 2013-07-05 2022-03-04 Abivax Biciklički spojevi korisni za liječenje bolesti uzrokovanih retrovirusima
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Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2149150C (en) * 1992-11-27 2000-08-01 David R. Carver Injectable taxol composition with improved stability
US7247741B2 (en) * 2005-01-21 2007-07-24 Ptc Therapeutics, Inc. Acetylamino benzoic acid compounds and their use for nonsense suppression and the treatment of disease
CA2493457A1 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Ptc Therapeutics, Inc. Acetylamino benzoic acid compounds and their use for nonsense suppression and the treatment of disease
FR2859474B1 (fr) * 2003-09-04 2006-01-13 Centre Nat Rech Scient Utilisation de composes derives d'indole pour la preparation d'un medicament utile pour le traitement de maladies genetiques resultant de l'alteration des processus d'epissage

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