JP2010515879A - プリオンタンパク質を取り出すための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「pH7.4では、DEAEセファロースもPrPCに結合していないように思われる」
と述べている。
「異なるリガンド、マトリックス、および吸着の原理を使用したにもかかわらず」
調査した吸着材すべてがPrPScの分離をもたらしたことに注目した。
「TSE病原体全体(…)、特にnvCJDの物理化学的特性に関してはまだ多くのことが知られていない。そのようなデータがない場合、存在する可能性があるいかなるnvCJD病原体をも完全に除去する特定の工程段階の個別であれ組み合わせてであれの能力については不確実性が存在することは不可避である(強調は追加したもの)」
と書き留めている。
a)前記プリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体へのセファロースの特異的高親和性結合を可能にする条件の下で、プリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体を含む生体由来物質をセファロースに接触させる段階と、
b)前記セファロースから前記生体由来物質を取り出す段階と
を含む方法であって、前記生体由来物質が、(i)哺乳動物尿もしくはその分画または(ii)細胞培養由来物質から選択される方法により解決される。
(I)細胞および/または哺乳動物由来物質を含む培養系のための培地
(II)哺乳動物または哺乳動物由来細胞
(III)哺乳動物由来物質またはその混合物、好ましくは部分的に単離されたおよび/または精製された哺乳動物由来物質またはその混合物、
から選択される、好ましくは、ペプチド、タンパク質、糖類、ホルモン、および脂肪酸からなる群から選択される前記方法に関する。
a)アッセイするセファロースを提供し、前記セファロースコア上のいかなるリガンドも、それがあれば、除去し、不活化しかつ/またはマスクすることと、
b)使用するPrPScを、非特異的除去、たとえば、沈殿、非特異的結合等を回避する濃度まで希釈することと、
c)a)のセファロースとb)のPrPScを、お互いの結合を可能にする条件の下でおよび時間、適切な緩衝液中でインキュベートすることと、
d)前記セファロースからあらゆる非結合タンパク質を洗い流すための、1回または複数回の洗浄段階、好ましくは3〜10緩衝液容量インキュベーション緩衝液と、
e)任意選択で、前記セファロース上のいかなる非特異的結合部位も除去するまたは遮断するために、過剰の、好ましくは1000倍過剰の非特異的結合タンパク質、好ましくはBSA(ウシ血清アルブミン)で洗浄することと、
f)セファロース結合PrPScを除去するために、カオトロピック剤、好ましくは尿素および/または塩化グアニジウムおよび/またはSDSを含む緩衝液による溶出段階と、
g)前記溶出された緩衝液中のPrPScを検出し、それによって、PrPSc自体へのセファロースの高親和性結合を実証することと
を含むと考えられる。
(実施例1)
PrPScへの異なるセファロースの全体的高親和性結合
種々のセファロースに対するプリオンタンパク質の結合親和性および特異性を、1000倍過剰なBSAの存在の下で組換えプリオンタンパク質を使って調べた。組換えプリオンタンパク質PrPピュア(alicon ag社、製品コードP0001)およびPrPベータ(alicon ag社、P0019およびP0027)を、それぞれPrPCおよびPrPScに対するモデル物質として使用した。ウシPrP(25〜241)およびマウスPrP(89〜231)のベータ型ならびにウシPrP(25〜241)のピュア型は、電気泳動移動性が異なるために、SDS-PAGEによりはっきりと区別することができる。
-前記セファロースマトリックスの接近可能性
-セファロース固定化金属イオンの存在
-前記セファロース上の負電荷の存在
により調節される。
-セファロース固定化金属イオンの存在
-前記セファロース上の負電荷の存在
により調節される。
血液中での自然プリオンタンパク質の濃縮
健康なヒトおよび動物の血液中のPrPCの量はごくわずかにすぎない。どんな濃縮段階もなければ、ウェスタンブロットなどの従来の分析方法を使ってもPrPCは検出されない。しかし、ウシPrP(25〜241)ピュア型で前充填されたNi Sepharose High Performanceを20ml血液に適用すれば、PrPCは目に見えるようになる。
脳ホモジネートでスパイクした後の血液中のPrPScの濃縮
血液中の天然PrPScの性質は分かっていないが、天然PrPScは脳に存在するPrPScと類似の生化学的特性を有する可能性があると思われる。脳ホモジネート由来PrPSc(PrPSc濃度1pg/mlと1ng/mlの間)をモデル基質として使って、ウシPrP(25〜241)を前充填されたNi Sepharose High Performanceへのその結合を分析した。
濃縮プリオンタンパク質の高次構造特異的溶出
前の実施例で述べたように、Ni Sepharose High Performanceは、組換えタンパク質PrPベータおよびPrPピュアに、ならびに天然PrPCおよびPrPScに高親和性で結合する。
BSE感染ウシ由来の血液中の天然PrPScの検出
BSEプリオンに感染したウシの血液中のPrPScの量は、ごくわずかである。いかなる濃縮段階もなければ、ウェスタンブロットなどの従来の分析方法を使ってもPrPScは検出されない。しかし、ウシPrP(25〜241)ピュア型を前充填したNi Sepharose High Performanceを、実験的にBSEに感染したウシの20ml血液に適用すれば、PrPScは目に見えるようになる。
血液中の天然プリオンタンパク質のろ過による除去
前の実施例から、少量の使用されたセファロースマトリックスがナノグラムの範囲で結合能を有することが判明した。したがって、前記セファロースは、ヒトおよび動物血漿などの体液からの全プリオンタンパク質の完全な除去のために適用することができる。
尿中の天然プリオンタンパク質のろ過による除去
1人のドナー由来のヒト尿1mlを、2000gで5分間遠心分離した。上澄み尿を20mMリン酸ナトリウムpH8.0で緩衝し、約3ng PrPScを含有する3μl 10%スクレイピー脳ホモジネートでスパイクした。その溶液を5分間回転させた。PrPSc濃縮のために、Zn2+を充填した30μlのIMAC Sepharose high performanceを添加し、溶液を30分間回転させた。樹脂を2000gでの2分間の遠心分離により分離し、樹脂結合タンパク質は、プロテイナーゼKでの消化(25μg/ml、65℃ 10分間)後ウェスタンブロット法により分析した。
Claims (19)
- 生体由来物質からプリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体を除去するための、以下の段階、
a)プリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体を含む生体由来物質を、前記プリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体へのセファロースの特異的高親和性結合を可能にする条件の下で、セファロースに接触させる段階と、
b)前記セファロースから生体由来物質を取り出す段階とを、
含む方法であって、
生体由来物質が(i)哺乳動物尿もしくはその分画または(ii)細胞培養由来物質から選択される方法。 - 前記細胞培養由来物質が、
(I)細胞および/または哺乳動物由来物質を含む培養系のための培地、
(II)哺乳動物または哺乳動物由来細胞、
(III)哺乳動物由来物質またはその混合物、好ましくは部分的に単離されたおよび/もしくは精製された哺乳動物由来物質またはその混合物
から選択され、好ましくはペプチド、タンパク質、糖類、ホルモンおよび脂肪酸からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記生体由来物質が、組換え細胞または組換えにより生成されるペプチド、タンパク質、(多)糖類、ホルモンもしくは脂肪酸である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記生体由来物質が、CHO、COS、Hela、3T3、HEK、Jurkat-、BRLおよびBHK-細胞からなる群から選択される天然または組換え細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体由来物質が、ホルモン、好ましくは性ホルモン、さらに好ましくはゴナドトロピン、エストロゲン、ゲスターゲン、アンドロゲン、さらに好ましくは尿由来のホルモンからなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セファロースが、非連結セファロースから選択され、好ましくはSepharose2B(登録商標)、4B(登録商標)、6B(登録商標)、SepharoseCL-4B(登録商標)、Sepharose-6B(登録商標)、Superdex75(登録商標)、Sephacryl 100HR(登録商標)およびSephadexG10(登録商標)からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セファロースが、リガンド修飾セファロースから選択され、好ましくは金属キレート化セファロース、レクチンアガロース、イミノ二酢酸セファロース、プロテインAアガロース、ストレプトアビジンセファロース、スルホプロピルセファロースおよびカルボキシメチルセファロースからなる群から選択され、さらに好ましくは金属キレート化セファロースから選択され、もっとも好ましくは前記セファロースがZnセファロースである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- プリオンPrPScタンパク質に結合するための少なくとも1つの追加のリガンドが、前記セファロースに直接的または間接的に結合している、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加のリガンドが、プリオンタンパク質、プリオンタンパク質の機能的誘導体、Hisタグ付きプリオンタンパク質、プリオンタンパク質結合タンパク質、プリオンタンパク質結合抗体、およびプリオンタンパク質特異的リガンドからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記追加のリガンドが、プリオンタンパク質および/またはその機能的誘導体である、請求項9に記載の方法。
- 前記追加のリガンドが、セファロースに直接的または間接的に、好ましくはスペーサー部分により結合している、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体が、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ハムスター、シカ、またはラット起源由来のプリオンタンパク質およびその誘導体からなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記機能的誘導体が、アミノ酸の1つまたは複数の欠失、置換および/もしくは挿入ならびに/または1つまたは複数のアミノ酸の共有結合的修飾によりプリオンタンパク質に由来している、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記機能的誘導体が、ヒトPrPの1つまたは複数のオクタペプチド繰り返し配列、好ましくはアミノ酸51〜90、および/またはC末端ドメイン、好ましくはアミノ酸121〜230を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- プリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体へのセファロースの結合のための条件が、生理的条件、好ましくはpH5〜8および2〜39℃、さらに好ましくはpH約7および約2〜8℃である、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記条件が、少なくとも1種の洗浄剤および/または細胞溶解緩衝液の存在を含む、請求項17に記載の方法。
- 請求項1から16のいずれか一項に従って、プリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体を生体由来物質から除去するための、PrPScへの特異的高親和性結合を有するセファロースの使用。
- 生体由来物質がもはや尿由来液体成分を実質的に含まないという条件で、哺乳動物尿由来生体由来物質からなる群から選択される生体由来物質から、プリオンPrPScタンパク質および/またはその機能的誘導体を除去するための、請求項17に記載のセファロースの使用。
- 前記セファロースが、好ましくは二価金属イオン、さらに好ましくはNi2+、Co2+、Zn2+、およびMn2+からなる群から選択される金属イオン、もっとも好ましくはZn2+を含む金属キレート化セファロースである、請求項17または18に記載の使用。
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