JP2010513847A - 粒度および蛍光の同時測定による病原体検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、流体中の病原菌及び粒子を検出する方法及び装置に関するもので、これにより、単一粒子の粒度及び内部蛍光が決定される。
【選択図】図４

Description

本発明は、概して空中または水中浮遊粒子を検出するシステムおよび方法に関し、より詳細には、空中または水中浮遊粒子を検出して、検出粒子を分類するシステムおよび方法に関する。本発明は、アレルゲンおよび生物兵器剤の検出および分類における特有の有用性を有しており、その他の有用性も考えられるが、そのような有用性に関して説明する。

現在、炭疽菌（炭疽病）等の生物兵器剤の放出を伴う都市型テロ攻撃が現実的な懸案事項である。兵器化された炭疽菌胞子は人間の肺に通路を得ることができるので、非常に危険である。人間にとっての炭疽菌胞子の致死吸入量ＬＤ_５０（攻撃に曝された人の５０％を殺すのに十分な致死量）は、２，５００〜５０，０００胞子だと推定される（非特許文献１を参照）。その他の潜在的な兵器化された生物剤としては、ペスト菌（ペスト）、ボツリヌス菌（ボツリヌス中毒症）、および野兎病菌などがある。この潜在的脅威を考慮して、そのような攻撃を検出するための早期警報システムが現在必要である。製薬、保健医療、食品業界では、環境微生物レベルのリアルタイム検出器が公衆衛生、品質管理および規制目的に有効である。例えば、非経口製剤メーカーは、無菌クリーンルーム内の微生物レベルを監視する必要がある。これらの用途において、環境の微生物を即座に検出することのできる計器が有効なツールであり、微生物が成長して検出されるまでに日数を要する従来の栄養平板培養法よりも優れた利点を有する。

粒度測定と紫外線（ＵＶ）誘発蛍光検出は、空気中の生体物質の存在を検出するのに用いられてきた。これらの技術を兵器化された生物剤の放出による生物テロ攻撃に対する早期警報センサとして用いることを説明しているさまざまな特許が存在する。これらの装置の中には、ＭＩＴ（マサチューセッツ工科大学）リンカーン研究所によって開発された生物剤警報センサ（ＢＡＷＳ）、Ｈｏの蛍光生物学的粒子検出システム（Ｊｉｍ ｙｅｗ−Ｗａｈ Ｈｏ、特許文献１；特許文献２；特許文献３）、ミネソタ州のＴＳＩ社によるＦＬＡＰＳおよびＵＶ−ＡＰＳ（Ｐｅｔｅｒ Ｐ．ＨａｒｉｓｔｏｎおよびＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｒ．Ｑｕａｎｔ、特許文献４）、Ｓｉｌｃｏｔｔによる蛍光センサ（特許文献５）がある。

パルス紫外線レーザを用いたレーザ誘起蛍光に基づいて提案されたバイオセンサは、非特許文献２によって説明される。これは、空気１リットル当たり５つの粒子のエアロゾル濃度を検出することができるが、高価で精巧な計器を必要とする。その他の粒子計数器は、オレゴン州グランツ・パスのＭｅｔ Ｏｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、コロラド州ボールダーのＰａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アナハイムのＴｅｒｒａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ社によって製造されている。

空中アレルゲン粒子を検出し、空気サンプル内の粒子の数が所定の最小値を超える場合は、敏感な人に警告を発するために、さまざまな検出器が設計されている。これらは全て、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒらの特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１で説明される。これらの検出器は全て、光線の一部が空気中の何らかの粒子によって散乱するように環境空気のサンプルを通る光線の方向と、所定のアレルゲンサイズ範囲に対応する所定の角度範囲において散乱する光のみを透過する光線遮断装置と、透過光を検出する検出器とを必要とする。

米国特許第５，７０１，０１２号明細書 米国特許第５，８９５，９２２号明細書 米国特許第６，８３１，２７９号明細書 米国特許第５，９９９，２５０号明細書 米国特許第６，８８５，４４０号明細書 米国特許第５，６４６，５９７号明細書 米国特許第５，９６９，６２２号明細書 米国特許第５，９８６，５５５号明細書 米国特許第６，００８，７２９号明細書 米国特許第６，０８７，９４７号明細書 米国特許第７，０５３，７８３号明細書 国際公開第２００７／０１１８５４パンフレット

Ｔ．Ｖ．Ｉｎｇｒｅｓｂｙら、「Ａｎｔｈｒａｘ ａｓ ａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｗｅａｐｏｎ（生物兵器としての炭疽菌）」（ＪＡＭＡ、第２８１巻、１７３５頁、１９９９年） Ｔ．Ｈ．Ｊｅｙｓら、ＩＲＩＳ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ会報（第１巻、２３５頁、１９９８年）

空中または水中の微生物を検出するために、粒度と、微生物に起因する蛍光の両方を測定するための有効なシステムの工夫が重要である。

本発明は、粒度の測定と、代謝産物やその他の生体分子の内部蛍光の存在の検出とを粒子毎に同時に行なうことができるセンサシステムを提供する。この検出方式の従来技術よりも優れた利点がいくつかある。一例としては、粒子特性評価のために従来技術で用いられた統計モデルに依存せず、粒子の特性評価をする決定論的粒子測定方法論を提供することである。決定論的測定方法論により、従来技術に比べて粒子特性をより明確に付与できるようになり、統計モデルへの依存を減らすことができる。さらに、例えば、花粉（微生物よりも大きな粒度）や煙粒子（微生物よりも小さな粒度）を検出から除外することができるので、微生物検出における偽陽性の可能性が低くなる。そして、粒子の生物学的状態を決定する目的で、粒子を特性評価するために個々の粒子に関して収集されたデータ、例えば、その断面積または体積に応じた粒子からの蛍光シグナルの強度の詳細分析が可能になる。

本発明は、（１）個々の粒度を測定する第１光学系と、（２）個々の粒子からのＵＶレーザ誘起内部蛍光シグナルを検出する第２光学系と、（３）個々の粒子に粒度と蛍光強度の両方を付与するデータ記録形式と、微生物を非微生物（例えば、不活性塵埃粒子）から区別するコンピュータ読み取り可能プログラムコードの３つの主要構成要素からなっている。

本発明の光学アセンブリは、２つの光学サブアセンブリを有する。１つ目は、（ａ）粒度を測定する光学装置である。例えば、本発明の好適な実施形態は周知で頻繁に用いられるミー散乱検出方式を使用するが、目新しいやり方でその方式を利用することで、システムが０．５ミクロン〜２０ミクロンの粒度範囲を有する空中浮遊粒子を非常に精密に測定することができる。異なる種類の微生物は異なる粒度範囲を有するので、粒度において微細な区別をつけるこの能力は、微生物の種類を決定するために重要である。２つ目は、（ｂ）粒度測定と同時に、調べている最中の粒子からの蛍光レベルを測定するために使用される光学装置である。例えば、本発明の好適な実施形態は、粒度を測定しているのと同じ粒子からの蛍光発光を収集するように配置される楕円鏡を使用する。
本発明のさらなる特徴および利点は、添付図面と併せて以下の詳細な説明から明らかとなる。

各空中浮遊不活性粒子および微生物粒子の粒度範囲を示す図である。 微生物の内空気に関する粒子分布を示す粒度と蛍光の同時測定の柱状図である。 パン酵母粉末を含有する空気に関する粒度と蛍光の同時測定の柱状図である。 ７ミクロン粒度の蛍光色素ドープ粒子の粒度と蛍光の同時測定の柱状図である。 粒度と蛍光の同時測定を行なう、本発明に従った光学系の概略図である。 図４の光学系のブロック図である。

図４は、本発明の第１の例示的実施形態に従った流体粒子検出器システム用の光学系の概略図である。このシステムの第１実施形態は、例えば、テロリストやその他の人によって故意に放出された空中または水中浮遊生物テロ剤を検出するように設計されているが、カビや細菌のように自然に存在し得るか、あるいは偶然、不注意、自然または故意に関係し得るその他の空中または水中浮遊粒子の有害レベルを検出する民間用途や、食品製造業および製薬業などの工業用途のみならず、クリーンルーム用途で使用することもできる。

本明細書で用いられる用語「流体浮遊粒子」は、空中浮遊粒子および水中浮遊粒子の両方を意味する。

本明細書で用いられる用語「病原体」は、空中または水中に多量に存在すると、そのような粒子に曝された人間を殺傷することさえできるあらゆる空中または水中浮遊粒子、生物剤、または毒素を指す。

用語「生物剤」は、その起源や生成法が何であれ、任意の微生物、病原体または感染性物質、あるいはそのような任意の微生物、病原体または感染性物質の毒素、生物毒素、または自然に存在するか、生物工学によって作られたか、合成された任意の成分として定義される。そのような生物剤としては、例えば、生物毒素、細菌、ウイルス、リケッチア、胞子、真菌、および原虫のみならず、従来技術で公知のその他のものが挙げられる。

「生物毒素」は、生きた植物、動物、または微生物から生成または抽出された有毒物質であるが、化学的手段によって生成または変質させることもできる。しかしながら、毒素は、一般に宿主生物内で自然に発達する（すなわち、サキシトキシンは海藻によって生成される）が、遺伝子組み換えおよび／または合成的に作られた毒素は実験室環境で生成されている。微生物と比べて、毒素は比較的単純な生化学的組成を有しており、それら自身で繁殖することができない。多くの点で、毒素は化学剤に匹敵する。そのような生物毒素としては、例えば、ボツリヌスおよび破傷風毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、トリコテシンマイコトキシン、リシン、サキシトキシン、志賀および志賀様毒素、デンドロトキシン、エラブトキシンｂのみならず、その他の公知の毒素がある。

本発明の検出器システムは、空中または水中浮遊粒子を検出して、例えば、サンプルで検出された範囲内で各粒度の粒子の数を示す出力を生成し、粒子が生物学的に活性か不活性かを示すように設計される。このシステムはさらに、粒子の数が、通常の背景レベルおよび／または生物有機体や生物剤を上回る危険になりかねない所定の値を超える場合に、警報信号やその他の応答を発することもできる。

図４は、本発明の一例示的実施形態に従った流体粒子検出器システム用のシステム１０の図である。図４に示すように、システム１０は、紫外光源波長を有する電磁放射光線１４を発するレーザ等の紫外光励起源１２を含む。紫外光源は、微生物内の代謝産物の内部蛍光を励起することができる波長を有するように選択される。例えば、励起源１２は、好ましくは約２７０ｎｍ〜約４１０ｎｍ、より好ましくは約３５０ｎｍ〜約４１０ｎｍの波長で動作する。約２７０ｎｍ〜約４１０ｎｍの波長は、微生物が３つの一次代謝産物からなるという前提に基づいて選択される。１つ目は、約２２０ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲で一般に約２７０ｎｍの蛍光を発するトリプトファンである。２つ目は、一般に約３４０ｎｍ（約３２０ｎｍ〜約４２０ｎｍの範囲）の蛍光を発するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）である。３つ目は、一般に約４００ｎｍ（約３２０ｎｍ〜約４２０ｎｍの範囲）の蛍光を発するリボフラビンである。しかしながら、励起源１２は、好ましくは約３５０ｎｍ〜約４１０ｎｍの波長を有する。この波長は、生物剤の前述の３つの一次代謝産物のうちＮＡＤＨおよびリボフラビンの２つの励起を確実にするが、例えばディーゼルエンジン排ガスおよび塵埃やベビーパウダー等のその他の不活性粒子などの干渉による励起を排除する。従って、本発明は好適な実施形態において、励起源１２の波長範囲の公正な選択を行なって、（トリプトファンを励起する能力よりも）ＮＡＤＨおよびリボフラビンからの蛍光を励起しながら、ディーゼルエンジン排ガス等の干渉による励起を排除する能力を保持する。この措置は、（例えば短い紫外波長２６６ｎｍの光によって励起することのできる）ディーゼル排ガスによって発せられる誤警報を減らすために取られる。

図４に示すシステム１０では、粒子サンプリング用にノズル１６からシステム内に環境空気（または液体サンプル）が取り込まれる。ノズル１６はその中央部に開口１８を有しており、レーザ光線が粒子流を通過することができる。レーザ光線のすぐ下流には、ミー散乱粒度検出器２０がある。ミー散乱粒度検出器２０は、光線遮断レンズ２２と、コリメータレンズ２４と、光線１４の一部分を粒子検出器２８に集中させる集光レンズ２６とを含む。

レーザ光線１４の軸外で、到来する粒子流とレーザ光線の交点が楕円の２つの焦点の１つとなる一方、蛍光検出器３２（この場合、光電管）はもう１つの焦点を占めるように、楕円鏡３０が粒子サンプリング領域に置かれる。この設計は、楕円の２つの焦点の一つから発せられる点光源がもう１つの焦点に集中するという事実を利用している。この光学設計において、楕円鏡３０は、微生物からの蛍光シグナルを一点に集めて、それを蛍光検出器３２に集中させる。光学フィルタ３４が蛍光検出器の前方に置かれて、散乱紫外光を遮断し、誘起蛍光を通過させる。

光線遮断レンズ２２は、レーザ光線１４の非散乱成分を反射するように設計されており、電磁放射光線の非散乱成分を反射するためにビニル等の材料を前面に取り付けてもよい。光線遮断レンズ２２のその他の特徴および重要な点は、参照することにより本明細書に援用される、先に挙げたＨａｍｂｕｒｇｅｒらの米国特許の一部と特許文献１２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２７６３８）で開示される。

粒子検出器２０は、例えば、先に挙げた参照することにより本明細書に援用されるＨａｍｂｕｒｇｅｒらの米国特許に記載されるような、粒子のサイズを設定するフォトダイオードを有する。

本発明のミー散乱の使用によって、紫外光照明の検出用の光学部品の配置も促進されて、同時に、生物の代謝にとって必要な中間体であって、細菌および真菌等の微生物に存在する代謝産物ＮＡＤＨ、リボフラビンおよびその他の生体分子の存在に関して個々の粒子が検査される。これらの化合物がバイオエアロゾル中に存在する場合、それらは、紫外光エネルギーによって励起された後に、上記に概説した検出方式に基づいて計器によって検出される自発蛍光を発する。この検出方式では微生物の属や種を識別することができず、ウイルスは微小かつ代謝に乏しいので検出されないが、この検出方式では、各粒子の粒度を測定すると同時に、粒子が生物学的に活性であるか不活性であるかをそれぞれ判定することによって、微生物汚染の有無をユーザに示すことができる。

図５を参照すると、本発明の粒度と蛍光の同時測定方式の機能性が、計器などによる測定結果の図式表現で示される。この動作原理は以下の通りである。計器が環境空気（または液体）を継続的に監視して、個々の空中浮遊粒子の粒度をリアルタイムで測定すると同時に、粒子が蛍光を発しているかどうかを決定する。蛍光シグナルに対して閾値が設定される。蛍光シグナルが設定レベルを下回る場合、粒子は不活性と認識される。この蛍光シグナル閾値は、蛍光シグナル強度、粒子断面積または粒子体積に応じた蛍光強度にすることができる。蛍光シグナル閾値が設定レベルを超える場合、粒子は生物学的に活性であると認識される。粒度と蛍光シグナル強度の統合データは、粒子毎に微生物の有無を決定することになる。図２（ａ）および図２（ｂ）は、本発明に従った検出器の機能性を示す。これらは、この検出方式を用いて測定した環境の空中浮遊粒子データを示す。各グラフにおいて、上層部分は、粒子濃度（空気１リットル当たり）対粒度（１ミクロン〜１３ミクロン）の粒度柱状図を対数目盛で示しており、無地の棒は不活性粒子を表しているのに対して、縞模様の棒は微生物の存在を示している。グラフの下層部分は、１秒以内に検出された粒子のリアルタイムスナップショットであり、各スパイクは１つの単一粒子を表しており、その高さは粒度に対応している。図２（ａ）では、清浄な空気に対してテストが行われたので、微生物がなく、不活性粒子のみが存在した。第２のテストでは、パン酵母粉末（サッカロマイエス・セレビシエ）が空気中に放出された。検出された微生物の存在は、図２（ｂ）の柱状図の縞模様の棒によって示される。

図３は、粒度と蛍光の同時測定方式が可能な検出器に７ミクロンの蛍光色素ドープ・プラスチックビーズが散布されたときに得られたデータ集合を示す。縞模様の棒は、７ミクロンの粒度範囲に分布するそれらの粒子内の蛍光の存在を示している。

本発明の上記の実施形態、特にあらゆる「好適な」実施形態は、実行例の可能性を示すとともに発明の原理の明確な理解のために記載されているに過ぎないことを強調したい。発明の精神および原理から実質的に逸脱することなく、本発明の上記の実施形態に多くの変形および変更を加えることができる。そのような全ての変形および変更は、本明細書において本開示および本発明の範囲に含まれ、添付の請求項によって保護されることを目的とする。

Claims (36)

1. 粒度の測定と粒子からの内部蛍光の検出を同時に行う段階を含む、流体中の不活性粒子から生物学的に活性な粒子を区別する方法。
2. 粒度と、測定値を付与した蛍光強度とに基づいて、粒子を不活性粒子と生物学的に活性な粒子とのいずれかに分類する段階を含む、請求項１記載の方法。
3. 粒度情報を用いて、粒子が微生物であるか否かを判定する、請求項２記載の方法。
4. 粒度情報は、粒子の断面積または粒子の体積から決定される、請求項３記載の方法。
5. 粒子の体積は、まず粒子の直径を測定し、その直径に基づいて粒子の体積を計算する、請求項４記載の方法。
6. 個々の粒子の粒度および蛍光強度データを用いて花粉およびアレルゲンを微生物から区別する、請求項２記載の方法。
7. 個々の粒子の粒度および蛍光シグナルデータを用いて、生物学的に活性な粒子内の生化学化合物の相対存在量を推定する、請求項２記載の方法。
8. 個々の粒子の粒度および蛍光強度値は、粒度および粒度体積によって規格化され、不活性粒子を微生物から区別するのに用いる、請求項２記載の方法。
9. 個々の粒子の粒度および蛍光強度値は、粒度および粒度体積によって規格化され、花粉およびアレルゲンを微生物から区別するのに用いる、請求項２記載の方法。
10. 前記流体は空気である、請求項１記載の方法。
11. 前記流体は水である、請求項１記載の方法。
12. ＵＶ光源で粒子を照射する段階と、粒度と粒子からの内部蛍光を同時に測定する段階とを含む、流体中またはガス内の粒子を検出および分類する方法。
13. 前記粒子は生物学的粒子を含む、請求項１２記載の方法。
14. 前記生物学的粒子は微生物を含む、請求項１３記載の方法。
15. 前記生物学的粒子は、細菌、かび、真菌、胞子から成る属から選択される、請求項１２記載の方法。
16. 蛍光強度を測定する段階を含む、請求項１２記載の方法。
17. 粒度情報と蛍光強度を比較して、起源において粒子を不活性または微生物的に分類する段階を含む、請求項１２記載の方法。
18. 前記粒子を細菌、かび、真菌または胞子に区別する段階を含む、請求項１２記載の方法。
19. 前記粒子を花粉またはアレルゲンに区別する段階を含む、請求項１２記載の方法。
20. 粒子の蛍光反応に基づいて、粒子を分類する段階を含む、請求項１８記載の方法。
21. 粒子の蛍光反応に基づいて、粒子を分類する段階を含む、請求項１９記載の方法。
22. 粒子の直径または体積に基づいて、粒子を分類する段階を含む、請求項１８記載の方法。
23. 粒子の直径または体積によって規格化された蛍光強度に基づいて、粒子を分類する段階を含む、請求項１８記載の方法。
24. 粒子の直径または体積に基づいて、粒子を分類する段階を含む、請求項１９記載の方法。
25. 粒子の直径または体積によって規格化された蛍光強度に基づいて、粒子を分類する段階を含む、請求項１９記載の方法。
26. サンプルセルと、
    サンプルセルの片側にある光源であって、該サンプルに集中光線を送ることによって、該光線の一部分が該サンプル領域内に存在するさまざまな粒度の粒子によってさまざまな角度に散乱するとともに、該光線の非散乱部分が散乱しないまま残る光源と、
    該サンプルセルの反対側にある光線遮断装置であって、該光線の該非散乱部分の少なくとも一部分を遮断し、測定される粒子の範囲を制限する光線遮断装置と、
    該光線遮断装置の後ろの光路に配置された第１検出器であって、前方散乱光の一部分を検出し、所定の粒度範囲内の該光路にある単一粒子の粒度に関する情報を含む出力を生成する第１検出器と、
    該光線の軸外に配置されて、同じ単一粒子からの内部蛍光を検出する第２検出器と、を含む粒子検出器システム。
27. 楕円鏡が、到来する粒子流と該光線の交点が楕円の一方の焦点にあり、該第２検出器がもう一方の焦点にあるように、粒子サンプリング領域内に置かれる、請求項２６記載のシステム。
28. 所定の粒度範囲内で蛍光も発する粒子が検出されると警報信号を発する警報器を、さらに含む、請求項２６記載のシステム。
29. 前記光源は紫外線を放射する、請求項２６記載のシステム。
30. 前記光源はＬＥＤを含む、請求項２６記載のシステム。
31. 前記光源と前記第１検出器との間に選択的に位置する照準レンズをさらに含む、請求項３０記載のシステム。
32. 一時に粒度分布と粒子蛍光を処理し、出力装置に粒子のヒストグラムを表示する処理装置をさらに含む、請求項２６記載のシステム。
33. 前記第１検出器はフォトダイオードを含む、請求項２６記載のシステム。
34. 前記サンプルセルは空気サンプルセルを含む、請求項２６記載のシステム。
35. 前記サンプルセルは水サンプルセルを含む、請求項２６記載のシステム。
36. 検出された粒度および内部蛍光を集約するためにコンピュータ読みとりプログラムコードをさらに含む、請求項２６記載のシステム。

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