JP2010281629A - 超薄切片試料作製方法および超薄切片試料作製装置 - Google Patents

Abstract

【課題】超薄切片試料を作製するための作業を簡単化でき、超薄切片試料を短時間で効率よく作製することができる超薄切片試料作製方法および超薄切片試料作製装置を提供すること。
【解決手段】標本Ｐと標本ホルダ１１を冷媒Ｆに浸漬して冷却する。そして、冷媒Ｆ中から標本Ｐと標本ホルダ１１を取り出して、標本Ｐを標本ホルダ１１に当接させ、その当接部分に液体Ｗを滴下する。そして、標本ホルダ１１と標本Ｐの冷熱により液体Ｗを凍結させて、標本Ｐを標本ホルダ１１に固定する。これにより、標本Ｐを標本ホルダ１１に簡便かつ強固に保持させることができる。また、標本Ｐを冷媒Ｆ中に浸漬して冷却するので、標本Ｐを十分に冷却でき、完全に凍結硬化させることができ、標本Ｐの薄切りが容易であり、平滑な切断面を得ることができる。
【選択図】図２

Description

本発明は、標本ブロックを薄切りして電子顕微鏡用の超薄切片試料を作製する超薄切片試料作製方法および超薄切片試料作製装置に関する。

従来から、冷却チャンバ内にミクロトームを収容して、冷却チャンバ内で標本を凍結させたまま薄切りして超薄切片試料を作成するクライオスタットミクロトームが知られている（例えば特許文献１を参照）。

クライオスタットミクロトームは、冷媒の流入によって冷却可能な所定の室内空間を有する冷却チャンバと、冷却チャンバ内に切断すべき標本を保持する標本ホルダと、標本ホルダに対して相対的に移動するカッタホルダと、カッタホルダに装着されて標本ホルダとカッタホルダとの相対的な移動によって標本を薄切りするカッタを有している。

そして、冷却チャンバ内を冷却し、冷却チャンバ内で標本ホルダに保持された標本を凍結硬化させ、標本ホルダとカッタホルダとを相対的に移動させて、カッタで標本を薄切りし、例えば電子顕微鏡用の超薄切片試料を作製するように構成されている。

特開平５−７１８４１号公報

従来のクライオスタットミクロトームでは、冷却チャンバ内に液体窒素ガスを流入させて、冷却チャンバ内の温度を極低温まで低下させ、冷却チャンバ内の標本を冷却し、凍結させた極低温の環境下で切断を行っている。

このような従来方法の場合、冷却チャンバ内の室内空間全体を冷却する必要があり、冷却する体積が大きいことから、例えば一般的な装置では約３時間程度の冷却時間が必要とされ、冷却時間が長くかかるという問題がある。

そして、冷却チャンバ内の室内空間を冷却して間接的に標本を冷却しているので、標本の冷却効率が悪く、標本が完全に冷却されずに凍結硬化が不十分となるおそれがある。例えば、標本の凍結硬化が不十分の場合には、薄切りが困難であり、所定の厚さの超薄切片を得ることができないという問題や、切断中に標本ブロックが弾性変形して切断面の面形状が粗く乱れるという問題が発生する。

また、切断中に標本が動いてしまうのを防ぐために、標本を標本ホルダに確実に固定する必要があり、従来は、ねじやボルトナット等の締結手段によって固定していた。従って、標本の標本ホルダへの取り付けおよび取り外し作業が煩雑で時間がかかり、使い勝手がよくなかった。

また、標本を他の標本に取り替える場合には、冷却チャンバ内の温度を極低温から常温に戻した後で取り替え作業を行う必要がある。例えば一般的な装置では約３時間程度の解凍時間が必要とされ、次の超薄切片試料の作製に取り掛かるための待ち時間が長いという問題がある。従って、従来の装置および方法は、作業効率が悪く、より多くの超薄切片試料を作製することはできなかった。

本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、超薄切片試料を作製するための作業を簡単化でき、超薄切片試料を短時間で効率よく作製することができる超薄切片試料作製方法および超薄切片試料作製装置を提供することである。

上記課題を解決する本発明の超薄切片試料作製方法は、標本を冷却した状態で薄切りして超薄切片試料を作製する超薄切片試料作製方法であって、標本と、標本を保持するための標本ホルダとを冷媒に浸漬して冷却する工程と、冷媒中から標本ホルダと標本を取り出して、標本ホルダに標本を当接させ、その当接部に液体を滴下し、標本ホルダと標本の冷熱により液体を凍結させて、標本を標本ホルダに固定する工程とを含むことを特徴としている。

上記課題を解決する本発明の超薄切片試料作製方法によれば、標本ホルダと標本を冷媒に浸漬して冷却し、標本ホルダと標本を冷媒から取り出して標本ホルダと標本との間に液体を滴下し、標本ホルダと標本の冷熱により液体を凍結させて、標本を標本ホルダに固定するので、標本を標本ホルダに簡便かつ強固に保持させることができる。

そして、例えば試料作製後に流水を掛ける、あるいは水槽の常温水に浸漬する等によって極低温から常温に迅速に戻すことができ、標本ホルダから標本を簡単に取り外すことができる。

また、従来のように、チャンバ内の温度が常温から極低温となるまで待つ必要がなく、同様に、極低温から常温となるまで待つ必要がないので、チャンバ内を冷却する冷却時間とチャンバ内を常温にする解凍時間を削減できる。従って、従来と比較して、標本の標本ホルダへの取り付けおよび取り外し作業が容易であり、作業効率が非常によく、超薄切片試料の生産性を向上させることができる。また、従来のようにチャンバ内全体を冷却する必要がないので、冷媒の使用量も少なくすることができる。

また、本発明によれば、標本を冷媒中に浸漬して冷却するので、標本を十分に冷却でき、完全に凍結硬化させることができる。したがって、標本の薄切りが容易であり、平滑な切断面を得ることができる。

本発明の超薄切片試料作製方法は、標本が固定された標本ホルダに、冷媒の貯留された冷却手段を取り付けて、冷媒の冷熱により標本ホルダと標本を直接または間接的に冷却した状態で標本を薄切りする工程を含むことを特徴としている。

本発明の超薄切片試料作製方法によれば、標本が固定された標本ホルダに、冷媒の貯留された冷却手段を取り付けて、冷媒の冷熱により標本ホルダと標本を直接または間接的に冷却した状態で標本を薄切りするので、標本ホルダと標本を継続して冷却することができ、冷却状態を長時間に亘って維持することができる。従って、適切な微小厚さの超薄切片試料を複数作製することができ、超薄切片試料の生産性を向上させることができる。

上記課題を解決する本発明の超薄切片試料作製装置は、標本ホルダに保持された標本を冷却した状態で薄切りして超薄切片試料を作製する超薄切片試料作製装置であって、標本ホルダは、装置本体に着脱可能に設けられ、装置本体から取り外された状態で予め冷媒に浸漬されて冷却され、冷媒から取り出されて標本との当接部に液体が滴下され、液体の凍結によって標本が接着固定される構成を有することを特徴としている。

本発明の超薄切片試料作製装置によれば、標本ホルダは、装置本体に着脱可能に設けられ、装置本体から取り外された状態で予め冷媒に浸漬されて冷却され、冷媒から取り出されて標本との当接部に液体が滴下され、液体の凍結によって標本が接着固定される構成を有するので、簡便かつ強固に標本を保持することができる。

そして、標本ホルダを装置本体から取り外して、例えば標本ホルダに流水を掛ける、あるいは水槽の常温水に標本ホルダを浸漬する等によって極低温から常温に迅速に戻すことができ、標本ホルダから標本を簡単に取り外すことができる。

また、従来のように、チャンバ内の温度が常温から極低温となるまで待つ必要がなく、同様に、極低温から常温となるまで待つ必要がないので、チャンバ内を冷却する冷却時間とチャンバ内を常温にする解凍時間を削減できる。従って、従来と比較して、標本の標本ホルダへの取り付けおよび取り外し作業が容易であり、作業効率が非常によく、超薄切片試料の生産性を向上させることができる。

本発明の超薄切片試料作製装置によれば、標本ホルダに着脱可能に取り付けられ、冷媒を貯留して冷媒の冷熱により標本ホルダと標本を直接または間接的に冷却する冷却手段を有するので、標本ホルダと標本を継続的に冷却することができ、冷却状態を長時間に亘って維持することができる。従って、適切な微小厚さの超薄切片試料を複数作製することができ、超薄切片試料の生産性を向上させることができる。

本発明の超薄切片試料作製装置では、標本ホルダは、装置本体に基端が保持されて略水平に延在し、先端に標本ホルダが取り付けられる棒形状を有し、冷却手段は、冷媒を貯留可能な上部開放された冷媒容器と、冷媒容器から上方に延出して標本ホルダに引っ掛けることにより冷媒容器を標本ホルダの下に吊り下げ可能な吊り下げ部とを有することが好ましい。

本発明の超薄切片試料作製装置によれば、冷媒容器を標本ホルダの下に吊り下げて配置できるので、冷媒容器の上方から放出される冷媒の冷熱によって、標本ホルダと標本を間接的に冷却することができる。

本発明の超薄切片試料作製装置によれば、標本ホルダに掛けられて垂下し、下端部が冷媒容器の上方から冷媒容器内に挿入されて、冷媒容器内の冷媒に浸漬され、冷媒の冷熱を標本ホルダに伝達する冷熱伝達手段を有するので、冷媒の冷熱を標本ホルダに直接伝達することができる。従って、標本ホルダを積極的に冷却することができ、標本を間接的に冷却し、冷却状態を長時間に亘って維持することができる。従って、標本を所望の微小厚さに薄切りすることができる。

本発明の超薄切片試料作製方法によれば、標本ホルダと標本を冷媒に浸漬して冷却し、標本ホルダと標本を冷媒から取り出して標本ホルダと標本との間に液体を滴下し、標本ホルダと標本の冷熱により液体を凍結させて、標本を標本ホルダに固定するので、標本を簡便かつ強固に保持させることができる。そして、例えば試料作製後に標本ホルダに流水を掛ける、あるいは水槽の常温水に浸漬する等によって常温に迅速に戻すことができ、標本ホルダから標本を簡単に取り外すことができる。

また、従来のように、チャンバ内の温度が常温から極低温となるまで待つ必要がなく、同様に、極低温から常温となるまで待つ必要がないので、チャンバ内を冷却する冷却時間とチャンバ内を常温にする解凍時間を削減できる。従って、従来と比較して、標本の標本ホルダへの取り付けおよび取り外し作業が容易であり、作業効率が非常によく、超薄切片試料の生産性を向上させることができる。

また、標本を冷媒中に浸漬して冷却するので、標本を十分に冷却でき、完全に凍結硬化させることができる。したがって、標本の薄切りが容易であり、平滑な切断面を得ることができる。

そして、本発明の超薄切片試料作製装置によれば、標本ホルダは、装置本体に着脱可能に設けられ、装置本体から取り外された状態で予め冷媒に浸漬されて冷却され、冷媒から取り出されて標本との当接部に液体が滴下され、液体の凍結によって標本が接着固定される構成を有するので、簡便かつ強固に標本を保持することができる。

そして、標本ホルダを装置本体から取り外して、例えば標本ホルダに流水を掛ける、あるいは水槽の常温水に標本ホルダを浸漬する等によって極低温から常温に迅速に戻すことができ、標本ホルダから標本を簡単に取り外すことができる。

また、従来のように、チャンバ内の温度が常温から極低温となるまで待つ必要がなく、同様に、極低温から常温となるまで待つ必要がないので、チャンバ内を冷却する冷却時間とチャンバ内を常温にする解凍時間を削減できる。従って、従来と比較して、標本の標本ホルダへの取り付けおよび取り外し作業が容易であり、作業効率が非常によく、超薄切片試料の生産性を向上させることができる。

本実施の形態における超薄切片試料作製装置の要部を示す斜視図。 本実施の形態における超薄切片試料作製方法を説明するフローチャート。 本実施の形態における超薄切片試料作製方法の各工程を示す概念図。 本実施の形態における超薄切片試料作製方法により作製した超薄切片を電子顕微鏡で観察した観察結果を示す画像。 従来の超薄切片試料作製方法により作製した超薄切片試料を電子顕微鏡で観察した観察結果を示す画像。

次に、本発明の実施の形態について図面を用いて説明する。
図１は、本実施の形態における超薄切片試料作製装置の要部を示す斜視図である。本実施の形態における超薄切片試料作製装置は、既知のクライオスタットミクロトームを利用して、その一部に改良を施したものであり、図１には、既知のカッタ２１と、本発明の特徴的な構成要素の一つである標本ホルダ１１が示されている。

標本ホルダ１１とカッタ２１は、超薄切片試料作製装置の図示していないクライオスタットチャンバ内に設けられている。なお、チャンバは、チャンバ自体が冷却機能を備えている必要はなく、外部から断熱された所定の室内空間を有しているものであればよい。

標本ホルダ１１は、熱容量が比較的大きい材料からなる中実丸棒形状を有している。標本ホルダ１１は、ミクロトームの装置本体（例えば図３（ｄ）を参照）１に基端が着脱自在に保持されて、チャンバ内で略水平に延在するように取り付けられている。そして、装置本体１（例えば図３（ｄ）を参照）によって略水平の姿勢状態を維持したままで上下に往復移動され、上下移動する毎に軸方向前側に向かって予め設定された距離（微小厚さ分）だけ前進移動されるようになっている。

標本ホルダ１１の先端部分には、標本Ｐを保持するための保持部１２が形成されている。保持部１２は、標本ホルダ１１の軸方向に沿って略水平に延在する平滑な当接面１２ａを有しており、標本Ｐを安定した姿勢状態で載せることができるようになっている。標本Ｐは、断面が略一定の棒形状を有しており、基端部が標本ホルダ１１の当接面１２ａの上に載せられて、先端部が標本ホルダ１１の先端部分から突出して標本ホルダ１１の軸方向に沿って延在するように固定される。標本Ｐを標本ホルダ１１に固定する固定方法については後述する。

カッタ２１は、図示していないカッタホルダに取り付けられており、標本ホルダ１１よりも軸方向先端側の位置に配置されて、標本ホルダ１１の先端部分に対向している。カッタ２１は、標本ホルダ１１から離反する方向に移動するに従って漸次下方に移行する傾斜面２２と、標本ホルダ１１の先端部分に対向して垂直に延在する垂直面２３を有している。そして、傾斜面２２と垂直面２３とが交わる部分には、標本ホルダ１１の軸方向に直交して水平方向に延在するように稜線が形成されており、その稜線に沿って刃２４が設けられている。

カッタ２１は、標本ホルダ１１の下方への移動により、標本Ｐの先端部下面に当接して、標本Ｐをその軸方向に微小厚さに薄切りし、超薄切片試料を作製する。作製された超薄切片試料は、カッタ２１の傾斜面２２上を下方に滑動して図示していないポートに収容される。

そして、本実施の形態における超薄切片試料作製装置は、標本Ｐの薄切りを行っている間中、標本ホルダ１１および標本Ｐを冷却するための冷却手段３１を有している。冷却手段３１は、標本ホルダ１１に着脱可能に取り付けられ、例えば液体窒素等の冷媒Ｆを貯留して、冷媒Ｆの冷熱により標本ホルダ１１と標本Ｐを直接または間接的に冷却する構成を有している。

冷却手段３１は、本実施の形態では図１に示すように、冷媒Ｆとして液体窒素を貯留可能な上部開放された冷媒容器３２と、冷媒容器３２から上方に延出して標本ホルダ１１に引っ掛けることにより冷媒容器３２を標本ホルダ１１の下に吊り下げ可能な吊り下げ部３３を有している。

冷媒容器３２は、標本ホルダ１１の直径よりも若干大きな直径を有する上部が開放された有底円筒形状を有しており、所定量の冷媒Ｆを貯留し、さらに上方から冷媒Ｆを注ぎ足すことができるようになっている（例えば図３（ｆ）を参照）。

吊り下げ部３３は、冷媒容器３２の上部から放出される冷媒Ｆの冷熱を、標本ホルダ１１および標本Ｐに間接的に伝達できるように、標本ホルダ１１の下方でかつ、より接近した位置に冷媒容器３２を配置する構成を有している。

吊り下げ部３３は、本実施の形態では、標本ホルダ１１を挿通可能な大きさを有する逆さＵ字形状を有しており、吊り下げ部３３の両端部が冷媒容器３２の上部にそれぞれ接続されている。吊り下げ部３３は、例えばピアノ線や針金などの線状部材からなり、冷媒Ｆによって冷却された冷媒容器３２の冷熱を標本ホルダ１１に効率よく伝達できるように、熱伝達率の高い金属製材料によって構成されている。

そして、冷却手段３１は、冷媒Ｆの冷熱を標本ホルダに直接伝達する冷熱伝達手段３４を有している。冷熱伝達手段３４は、標本ホルダ１１に掛けられて垂下し、冷媒容器３２の上方から冷媒容器３２内に挿入されて、下端部３４ａが冷媒容器３２内の冷媒に浸漬される帯状もしくはひも状の部材からなる。冷熱伝達手段３４は、例えばアルミ箔や、金属メッシュのように、可撓性もしくは屈曲性を有する熱伝達率の高い材料によって構成されている。

次に、標本Ｐを標本ホルダ１１に固定する方法および上記構成を有する超薄切片試料作製装置を用いた超薄切片試料作製方法について図２および図３を用いて以下に説明する。図２は、本実施の形態における超薄切片試料作製方法を説明するフローチャート、図３は、本実施の形態における超薄切片試料作製方法の各工程を示す概念図である。

まず、標本ホルダ１１と標本Ｐを冷媒Ｆに浸漬して冷却する（ステップＳ１０１、Ｓ１０２）。標本ホルダ１１と標本Ｐは、図３（ａ）、（ｂ）に示すように、貯留槽４１に貯留された冷媒Ｆである液体窒素ガスの中に浸漬されて、極低温となるまで冷却される。

そして、標本Ｐを標本ホルダ１１に保持させる（ステップＳ１０３）。ここでは、貯留槽４１の冷媒Ｆから標本ホルダ１１と標本Ｐを取り出して、標本Ｐを標本ホルダ１１の当接面１２ａに当接させる。そして、図３（ｃ）に示すように、標本ホルダ１１と標本Ｐとの当接部分に、例えば水などの液体Ｗを滴下する。液体Ｗは、標本ホルダ１１と標本Ｐの冷熱により凍結し、標本ホルダ１１と標本Ｐとを互いに接着固定する。すなわち、標本ホルダ１１と標本Ｐは、標本ホルダ１１と標本Ｐとの当接部分に液体Ｗを滴下し、その液体Ｗを標本ホルダ１１と標本Ｐの冷熱により凍結させることによって、互いに接着固定される。従って、標本Ｐを標本ホルダ１１に簡便かつ強固に固定させることができる。

次に、図３（ｄ）に示すように、標本ホルダ１１を装置本体１に保持させて、チャンバ内で略水平に延在するように取り付ける（ステップＳ１０４）。装置本体１には、標本ホルダ１１を着脱可能に保持するチャック（図示せず）が設けられており、標本ホルダ１１を簡単に取り付けおよび取り外しできるようになっている。

そして、標本ホルダ１１に冷却手段３１を取り付けて、冷却手段３１による冷却を行う（ステップＳ１０５）。ここでは、略水平に保持された標本ホルダ１１に吊り下げ部３３が吊り下げられて、標本ホルダ１１の下方に冷媒容器３２が配置される。そして、冷媒容器３２の上方から冷媒容器３２内に冷媒Ｆが注ぎ入れられ、所定量の冷媒Ｆが貯留される。なお、冷媒容器３２に冷媒Ｆを貯留してから、標本ホルダ１１に吊り下げる作業を行ってもよい。

冷媒容器３２に貯留された冷媒Ｆの冷熱は、冷媒容器３２から上方に向かって放出され、標本ホルダ１１と標本Ｐを間接的に冷却する。また、吊り下げ部３３を介して標本ホルダ１１に伝達することができ、標本ホルダ１１を効率よく冷却し、標本ホルダ１１を介して標本Ｐに伝達し、標本Ｐを間接的に冷却することができる。

冷熱伝達手段３４は、標本ホルダ１１に掛けられて垂下し、冷媒容器３２の上方から冷媒容器３２内に挿入されて、下端部３４ａが冷媒容器３２内の冷媒Ｆに浸漬される。従って、冷熱伝達手段３４を介して、冷媒Ｆの冷熱を標本ホルダ１１に伝達することができ、標本ホルダ１１を直接冷却し、標本ホルダ１１を介して標本Ｐに伝達し、標本Ｐを間接的に冷却することができる。

そして、標本Ｐを薄切りして超薄切片試料を作製する作業が行われる（ステップＳ１０６）。ここでは、図３（ｅ）に示すように、カッタ２１に対して装置本体１を下方に移動させて、標本Ｐの先端部下面にカッタ２１の刃２４を当接させて、標本Ｐを微小厚さに薄切りし、超薄切片試料を作製する。超薄切片試料は、装置本体１の上下移動および前進移動を繰り返し行うことによって、複数枚を作製することができる。

そして、作製中に、冷媒容器３２内の冷媒Ｆが減少してきた場合には、図３（ｆ）に示すように、冷媒容器３２の上方から冷媒容器３２内に冷媒Ｆを注ぎ入れて補充することができる。従って、標本ホルダ１１と標本Ｐを継続的に冷却することができ、標本Ｐの凍結状態を長時間に亘って維持することができる。

カッタ２１によって薄切りされた超薄切片試料は、カッタ２１の傾斜面２２上を下方に滑動して図示していないポートに収容され、作製完了となる（ステップＳ１０７）。

上記した超薄切片試料作製方法および作製装置によれば、標本ホルダ１１と標本Ｐを冷媒Ｆ中に浸漬して冷却し、標本ホルダ１１と標本Ｐを冷媒Ｆから取り出して標本ホルダ１１と標本Ｐとの間に液体Ｗを滴下し、標本ホルダ１１と標本Ｐの冷熱により液体Ｗを凍結させて、標本Ｐを標本ホルダ１１に固定するので、標本Ｐを標本ホルダ１１に簡便かつ強固に保持させることができる。

そして、例えば試料作製後に流水を掛ける、あるいは水槽の常温水に浸漬する等によって極低温から常温に迅速に戻すことができ、標本ホルダ１１から標本Ｐを簡単に取り外すことができる。

また、従来のように、チャンバ内の温度が常温から極低温となるまで待つ必要がなく、同様に、極低温から常温となるまで待つ必要がないので、チャンバ内全体を冷却する冷却時間とチャンバ内を常温にする解凍時間を削減できる。

例えば、従来の一般的な装置の場合、チャンバ内を冷却するのに約３時間程度の冷却時間を要し、また、チャンバ内を常温に戻すのに約３時間程度の解凍時間を要することから、半日で１試料程度のサンプリングしかできず、作業効率が非常に悪い。

これに対して、本実施の形態の場合、ステップＳ１０１の標本Ｐの冷却は約１時間程度、ステップＳ１０２の標本ホルダ１１の冷却は約５分間程度で行うことができる。そして、ステップＳ１０３の標本Ｐを標本ホルダ１１に保持させる作業、ステップＳ１０４の標本ホルダ１１を装置本体１に取り付ける作業、ステップＳ１０５の冷却手段３１の取り付け作業は、ステップＳ１０３からステップＳ１０５までを約５分間程度で行うことができる。そして、ステップＳ１０６、Ｓ１０７の超薄切片作成作業は、約３０分間程度で行うことができる。

従って、従来と比較して、標本Ｐの標本ホルダ１１への取り付けおよび取り外し作業が容易であり、作業効率が非常によく、超薄切片試料の生産性を向上させることができる。特に、予め複数の標本Ｐを貯留槽４１内の冷媒Ｆに浸漬しておくことによって、標本Ｐを簡単に取り替えることができ、短時間でより多くの超薄切片試料を作製することができる。また、従来のようにチャンバ内全体を冷却する必要がないので、冷媒Ｆの使用量を大幅に抑制することができ、コストを低減することができる。

また、本発明の超薄切片試料作製方法によれば、標本Ｐを冷媒Ｆ中に浸漬して冷却するので、標本Ｐを十分に冷却でき、完全に凍結硬化させることができる。したがって、標本Ｐの薄切りが容易であり、平滑な切断面を得ることができる。

また、標本Ｐが固定された標本ホルダ１１に、冷媒Ｆの貯留された冷却手段３１を取り付けて、冷媒Ｆの冷熱により標本ホルダ１１と標本Ｐを直接または間接的に冷却した状態で標本Ｐを薄切りするので、冷却手段３１が有する冷媒Ｆの冷熱によって標本ホルダ１１と標本Ｐを継続して冷却することができ、冷却状態を長時間に亘って維持することができる。従って、適切な微小厚さの超薄切片試料を複数作製することができ、超薄切片試料の生産性を向上させることができる。

また、本発明の超薄切片試料作製装置によれば、冷却手段３１は、冷媒Ｆを貯留可能な上部開放された冷媒容器３２と、冷媒容器３２から上方に延出して標本ホルダ１１に引っ掛けることにより冷媒容器３２を標本ホルダ１１の下に吊り下げ可能な吊り下げ部３３とを有しているので、冷媒容器３２を標本ホルダ１１の下に配置でき、冷媒容器３２の上方から放出される冷媒Ｆの冷熱によって、標本ホルダ１１と標本Ｐを間接的に冷却することができる。

また、本発明の超薄切片試料作製装置によれば、標本ホルダ１１に掛けられて垂下し、下端部３４ａが冷媒容器３２の上方から冷媒容器３２内に挿入されて、冷媒容器３２内の冷媒Ｆに浸漬され、冷媒Ｆの冷熱を標本ホルダ１１に伝達する冷熱伝達手段３４を有するので、冷却手段３１が有する冷媒Ｆの冷熱を標本ホルダ１１に直接伝達することができる。従って、標本ホルダ１１を積極的に冷却することができ、標本Ｐを間接的に冷却し、冷却状態を長時間に亘って維持することができる。従って、標本Ｐを所望の微小厚さに薄切りすることができる。

なお、上述の実施の形態では、冷熱伝達手段３４を標本ホルダ１１に掛けた場合を例に説明したが、冷熱伝達手段３４を標本Ｐに掛けて、標本Ｐを直接冷却し、標本ホルダ１１を間接的に冷却してもよく、また、冷熱伝達手段３４を標本ホルダ１１と標本Ｐの両方に掛けて、標本ホルダ１１と標本Ｐの両方を直接冷却してもよい。

また、上述の実施の形態では、冷媒Ｆとして液体窒素の場合を例に説明したが、他の冷媒を用いてもよく、また、液体Ｗとして水の場合を例に説明したが、他の液体を用いてもよい。

［実施例］
図４および図５は、超薄切片試料を電子顕微鏡で観察した観察像であり、図４は、本実施の形態に係わる超薄切片試料作製方法および作製装置を用いて作製した超薄切片試料の観察像、図５は、従来装置を用いて従来方法により作製した超薄切片試料の観察像である。図４（ａ）は、倍率２００００倍、図４（ｂ）は、倍率５００００倍の画像であり、図５（ａ）は、倍率１５０００倍、図５（ｂ）は、倍率７０００倍の画像である。

標本は、樹脂部材（ブチルゴム部材）を包埋樹脂１０１で包埋することによって構成されている。従来装置で標本が完全に凍結していない場合には、標本を薄切りすることができず、超薄切片試料の厚さが２００〜３００ナノメートルになっている。従って、電子顕微鏡で観察するには厚すぎであり、図５に示すように、組織を正確に把握することができない。

一方、本実施の形態における超薄切片試料作製方法および作製装置によれば、標本を完全に凍結させた状態で薄切りするので、超薄切片試料の厚さを１００ナノメートル以下となるように薄切りすることができる。従って、図４に示すように、ゴム成分１０２内に分散する金属粒子１０３を明確に認識することができ、樹脂部材の組織を正確に把握することができる。

１ 装置本体（ミクロトーム）
１１ 標本ホルダ
１２ 保持部
１２ａ 当接面
２１ カッタ
２４ 刃
３１ 冷却手段
３２ 冷媒容器
３３ 吊り下げ部
３４ 冷熱伝達手段
Ｆ 冷媒
Ｐ 標本
Ｗ 液体

Claims (6)

1. 標本を冷却した状態で薄切りして超薄切片試料を作製する超薄切片試料作製方法であって、
   前記標本と、該標本を保持するための標本ホルダとを冷媒に浸漬して冷却する工程と、
   前記冷媒中から前記標本ホルダと前記標本を取り出して、前記標本ホルダに前記標本を当接させ、該当接部に液体を滴下し、前記標本ホルダと前記標本の冷熱により前記液体を凍結させて、前記標本を標本ホルダに固定する工程と、
   を含むことを特徴とする超薄切片試料作製方法。
2. 前記標本が固定された標本ホルダに、冷媒の貯留された冷却手段を取り付けて、前記冷媒の冷熱により前記標本ホルダおよび前記標本を直接または間接的に冷却した状態で前記標本を薄切りする工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の超薄切片試料作製方法。
3. 標本ホルダに保持された標本を冷却した状態で薄切りして超薄切片試料を作製する超薄切片試料作製装置であって、
   前記標本ホルダは、装置本体に着脱可能に設けられ、前記装置本体から取り外された状態で予め冷媒に浸漬されて冷却され、該冷媒から取り出されて前記標本との当接部に液体が滴下され、該液体の凍結によって前記標本が接着固定される構成を有することを特徴とする超薄切片試料作製装置。
4. 前記標本ホルダに着脱可能に取り付けられ、冷媒を貯留して該冷媒の冷熱により前記標本ホルダと前記標本を直接または間接的に冷却する冷却手段を有することを特徴とする請求項３に記載の超薄切片試料作製装置。
5. 前記標本ホルダは、装置本体に基端が保持されて略水平に延在し、先端に標本ホルダが取り付けられる棒形状を有し、
   前記冷却手段は、冷媒を貯留可能な上部開放された冷媒容器と、該冷媒容器から上方に延出して標本ホルダに引っ掛けることにより冷媒容器を標本ホルダの下に吊り下げ可能な吊り下げ部とを有することを特徴とする請求項４に記載の超薄切片試料作製装置。
6. 前記標本ホルダに掛けられて垂下し、下端部が前記冷媒容器の上方から該冷媒容器内に挿入されて、前記冷媒容器内の冷媒に浸漬され、前記冷媒の冷熱を前記標本ホルダに伝達する冷熱伝達手段を有することを特徴とする請求項５に記載の超薄切片試料作製装置。

Images