JP2010279375A - Pnaダイマーおよびpnaオリゴマー合成に関する方法、組成物およびライブラリー - Google Patents
Pnaダイマーおよびpnaオリゴマー合成に関する方法、組成物およびライブラリー Download PDFInfo
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Abstract
【課題】PNAダイマーおよびPNAオリゴマー合成に関する方法、組成物およびライブラリーを提供すること。
【解決手段】本発明は、PNAダイマーおよびPNAオリゴマー合成の分野に関係する。本出願は、固体支持体組成物を開示し、この組成物は、a)酸を形成する切断可能なリンカー;およびb)PNAダイマーであって、上記切断可能なリンカーにより上記固体支持体に切断可能に連結されたN末端の塩基不安定性保護基を含むPNAダイマーを含む。ここで、上記固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、PNAダイマーおよびPNAオリゴマー合成の分野に関係する。本出願は、固体支持体組成物を開示し、この組成物は、a)酸を形成する切断可能なリンカー;およびb)PNAダイマーであって、上記切断可能なリンカーにより上記固体支持体に切断可能に連結されたN末端の塩基不安定性保護基を含むPNAダイマーを含む。ここで、上記固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい。
【選択図】なし
Description
(発明の開示)
(I.本明細書で用いられる特定の略語のリスト)
Fmoc=9−フルオレニルメトキシカルボニル
Bhoc=ベンズヒドロキシカルボニル
Mmt=モノメトキシトリチル
TFA=トリフルオロ酢酸
bocまたはt−boc=ter−ブトキシカルボニル
PAL=5−(4’−アミノメチル−3’,5’−ジメトキシフェノキシ)吉草酸
MBHA=メトキシベンズヒドリルアミン
DHPP=4−(1’、1’−ジメチル−1’−ヒドロキシプロピル)−フェノキシアセチル−アラニル−アミノメチル樹脂
DNA=2’−デオキシリボ核酸
RNA=リボ核酸
PNA=ペプチド核酸
PEG=ポリエチレングリコール
DBU=1,8−ジアザビシクロ−[5.4.0]−ウンデク−7−エン
MeOH=メタノール
ACN=アセトニトリル
(I.本明細書で用いられる特定の略語のリスト)
Fmoc=9−フルオレニルメトキシカルボニル
Bhoc=ベンズヒドロキシカルボニル
Mmt=モノメトキシトリチル
TFA=トリフルオロ酢酸
bocまたはt−boc=ter−ブトキシカルボニル
PAL=5−(4’−アミノメチル−3’,5’−ジメトキシフェノキシ)吉草酸
MBHA=メトキシベンズヒドリルアミン
DHPP=4−(1’、1’−ジメチル−1’−ヒドロキシプロピル)−フェノキシアセチル−アラニル−アミノメチル樹脂
DNA=2’−デオキシリボ核酸
RNA=リボ核酸
PNA=ペプチド核酸
PEG=ポリエチレングリコール
DBU=1,8−ジアザビシクロ−[5.4.0]−ウンデク−7−エン
MeOH=メタノール
ACN=アセトニトリル
(II.定義)
本明細書を解釈する目的のために以下の定義が適用され、そして適切な場合はつねに、単数で用いられる用語は複数をも含み、そしてその逆も同じである。
本明細書を解釈する目的のために以下の定義が適用され、そして適切な場合はつねに、単数で用いられる用語は複数をも含み、そしてその逆も同じである。
a.本明細書で用いられるとき、「核酸塩基」は、核酸技術を利用するか、またはペプチド核酸技術を利用し、それによって核酸に配列特異的に結合し得るポリマーを生成する者に共通して公知である天然に存在するヘテロ環部分および天然に存在しないヘテロ環部分を意味する。適切な核酸塩基の非制限的な例は:アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)を含む。適切な核酸塩基のその他の非制限的な例は、Buchardtら(米国特許第6,357,163号)の図2(A)および2(B)に示されるような核酸塩基を含む。
b.本明細書で用いられるとき、「核酸塩基配列」は、オリゴマーまたポリマー中の核酸塩基含有サブユニットの任意のセグメントを意味する。適切なオリゴマーまたはポリマーの非制限的な例は、オリゴデオキシヌクレオチド(例えば、DNA)、オリゴリボヌクレオチド(例えば、RNA)、ペプチド核酸(PNA)、PNAキメラ、PNAオリゴマー、核酸アナログおよび/または核酸模倣物を含む。
c.本明細書で用いられるとき、「標的配列」は、決定されることが求められるポリ核酸塩基鎖の核酸塩基配列である。標的配列の性質は、制限ではないことが理解されるべきである。標的配列を含むポリ核酸塩基鎖は、任意の供給源から提供され得る。例えば、この標的配列は、核酸(例えば、DNAまたはRNA)、PNA、核酸アナログまたはその他の核酸模倣物の一部として存在し得る。この標的配列を含むサンプルは、天然から提供され得るか、または、それは、製造プロセスから合成または供給され得る。標的配列が核酸のサブ配列であるとき、この核酸は、任意の供給源か得られ得る。例えば、この核酸は、核酸増幅プロセスから生成され得るか、細胞または生物中に含まれ得るか、またはそうでなければ細胞または生物から抽出され得る。この核酸の供給源であり得る非限定的な核酸増幅プロセスの例は、制限されずに、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、転写媒介増幅(TMA)、Q−βレプリカーゼ増幅(Q−β)およびローリングサークル増幅(RCA)を含む。
d.本明細書で用いられるとき、「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基含有サブユニットを含む単一ポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸の一本鎖核酸鎖はポリ核酸塩基鎖である。
e.本明細書で用いられるとき、「核酸」は、ヌクレオチド、またはそのアナログから形成される骨格を有する核酸塩基配列含有オリゴマーまたはポリマーである。好ましい核酸はDNAおよびRNAである。任意の疑いを避けるために、PNAは、核酸模倣物であり、そして核酸または核酸アナログではない。
f.本明細書で用いられるとき、「ペプチド核酸」または「PNA」は、2つ以上のPNAサブユニット(残基)を含む任意のオリゴマーまたはポリマーを意味し、制限されずに、米国特許第5,539,082号、同第5,527,675号、同第5,623,049号、同第5,714,331号、同第5,718,262号,同第5,736,336号、同第5,773,571号、同第5,766,855号、同第5,786,461号、同第5,837,459号、同第5,891,625号、同第5,972,610号、第同5,986,053号、同第6,107,470号、同第6,201,103号、同第6,228,982号および同第6,357,163号でペプチド核酸として言及されるか、または請求の範囲に記載の任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントを含み;これらすべては、本明細書中に参考として援用される。用語「ペプチド核酸」または「PNA」はまた、以下の刊行物中に記載のような核酸模倣物の2つ以上のサブユニットを含む任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントに適用される:Lagriffoulら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、4:1081〜1082(1994);Petersenら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、6:793〜796(1996);Diderichsenら、Tett.Lett.37:475〜478(1996);Fujiiら、Bioorg.Med.Chem.Lett.7:637〜627(1997);Jordanら、Bioorg.Med.Chem.Lett.7:687〜690(1997);Krotzら、Tett.Lett.36:6941〜6944;Lagriffoulら、Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1081〜1082(1994);Diederichsen、U.、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、7:1743〜1746(1997);Loweら、J.Chem.Soc.Perkin Trans.1、(1997)1:539〜546;Loweら、J.Chem.Soc.Perkin Trans.11:547〜554(1997);Loweら、J.Chem.Soc.Perkin Trans.11:555〜560(1997);Howarthら、J.Org.Chem.62:5441〜5450(1997);Altmann、K−Hら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、7:1119〜1122(1997);Diederichen、U.、Bioorganic & Med.Chem.Lett.、8:165〜168(1998);Diederichsenら、Angew.Chem.Int.Ed.、37:302〜305(1998);Cantinら、Tett.Lett.38、4211〜4214(1997);Ciapettiら、Tetrahedron、53:1167〜1176(1997);Lagriffouleら、Chem.Eur.J.、3:912〜919(1997);Kumarら、Organic Letters3(9):1269〜1272(2001);およびWO96/04000に開示のようなShahらのPeptide−Based Nucleic Acid Mimics(PENAM)。
特定の実施形態では、「ペプチド核酸」または「PNA」は、以下の式の2つ以上の共有結合したサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマーセグメントである:
その他の特定の実施形態では、PNAサブユニットは、N−[2−(アミノエチル)]グリシン骨格のN−α−グリシン窒素にメチレンカルボニル結合により付着した天然に存在するか、または天然に存在しない核酸塩基からなり;これは、現在、ペプチド核酸サブユニットの最も一般的に用いられる形態である。
g.本明細書で用いられるとき、「末端保護基」は、PNAモノマーまたはPNAオリゴマーの末端求核官能基に共有結合した保護基を意味する。例えば、PNAモノマーを連結することで用いられ得るPNAモノマーまたはオリゴマーの末端一級アミンは、末端保護基で代表的に保護される末端求核官能基である。
h.本明細書で用いられるとき、「核酸塩基保護基」は、PNAモノマーまたはオリゴマーの核酸塩基の官能基に共有結合し、特定の化学反応(例えば、連結/縮合またはカップリング)の間に官能基を非反応性にする保護基を意味する。例えば、代表的には、アデニン、シトシンおよびグアニンの環外アミノ基は、PNAオリゴマーの化学的アセンブリの間に適切な保護基で保護される。しかし、核酸塩基は、そうである必要はないが、本明細書中に記載されるような連結/縮合反応の間に保護され得る。
i.本明細書で用いられるとき、「PNAダイマー」は、一緒に共有結合した2つのPNAサブユニットを意味する。このPNAダイマーは、完全に保護されるか、部分的に保護されるか、または保護されなくてもよい。完全に保護されるとは、本発明者らは、代表的にはPNAオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このPNAダイマーのすべての反応性官能基が、末端保護基および/または核酸塩基保護基で保護されていることを意味する。部分的に保護されるとは、本発明者らは、代表的にはPNAオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このPNAダイマーの少なくとも1つの反応性官能基が、保護基を含まないことを意味する。保護されないとは、通常、PNAオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このPNAダイマーのすべての反応性官能基が、保護基を含まないことを意味する。代表的には固相化学的アセンブリの間に保護基を用いて保護されるPNAダイマーの官能基の例は、このオリゴマーのN末端アミノ基および核酸塩基の環外アミノ基を含む。
j.本明細書で用いられるとき、「Fmoc(Bhoc)PNAモノマー」または「Fmoc(Bhoc)モノマー」は、N末端アミン基を保護するためにFmoc保護基を含むPNAモノマーを、適用可能である場合、核酸塩基の環外アミン基の1つ以上を保護するためのBhoc保護基を意味し、制限されずに、Applied Biosystems、Foster City、CAから市販され、入手可能なようなFmocモノマーを含む。疑いを避けるために、Fmoc(Bhoc)PNAモノマーは、Fmocチミン、Fmocウラシル、Fmoc2−チオチミンまたはFmoc2−チオウラシルモノマーを含むことが、これらモノマーは、Bhoc保護基を必要とする環外アミン基を所有しないという事実にかかわらず、意図される。
k.本明細書で用いられるとき、Mmt/BhocPNAモノマーは、N末端アミン基を保護するためのMmt保護基を、そして適用可能である場合、核酸塩基の環外アミン基の1つ以上を保護するためのBhoc保護基(実施例3を参照のこと)を含むPNAモノマーを意味する。疑いを避けるために、Mmt/BhocPNAモノマーは、Mmtチミン、Mmtウラシル、Mmt2−チオチミンまたはMmt2−チオウラシルモノマーを含むことが、これらモノマーは、Bhoc保護基を必要とする環外アミン基を所有しないという事実にかかわらず、意図される。
l.本明細書で用いられるとき、「PNAキメラ」は、2つ以上のPNAサブユニットおよび1つ以上の核酸サブユニット(すなわち、DNAまたはRNA)を含むオリゴマー、またはそのアナログを意味し、これらは、異なるクラスのサブユニットから選択され、しかも共有結合またはリンカーによって結合されている。例えば、PNA/DNAキメラは、化学的結合またはリンカーにより、少なくとも1つの2’−デオキシリボ核酸サブユニットに共有結合された少なくとも2つのPNAサブユニットを含む(PNA/DNAキメラ調製に関する例示の方法および組成物については、WO96/40709を参照のこと)。
m.本明細書で用いられるとき、「酸を形成する切断可能なリンカー」は、固体支持体に付着され、ポリマーの化学的アセンブリの間に、固体支持体にオリゴマーまたはポリマー(例えば、PNA)をこの支持体に切断可能に連結する部分であって、そしてここで、この共有結合は、化学的処置によって切断され得、それによって、オリゴマーまたはポリマーを離脱し(一般に、化学的アセンブリが終了した後)、ここで、この離脱したポリマーは、固体支持体からの離脱に際し、その前の付着の点で酸部分を含む、部分を意味する。例えば、PNA C末端酸オリゴマーは、PNAオリゴマーが酸を形成する切断可能なリンカーを有する固体支持体から離脱されるとき、形成されるC末端酸基を含むPNAオリゴマーである。例えば、PNAオリゴマーのこのC末端酸基は、C末端カルボン酸であり得るか、またはC末端スルホン酸であり得る。
n.本明細書で用いられるとき、用語「標識」、「レポーター部分」または「検出可能部分」は、交換可能であり、そしてオリゴマーまたはオリゴマーブロックに付着され得る部分をいい、またはそうでなければ、レポーターシステムで用いられ得、それによって、器具または方法によってオリゴマーを検出可能にする部分をいう。例えば、標識は、(i)検出可能なシグナルを提供する;(ii)第1または第2の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変するための第2の標識と相互作用する;または(iii)捕獲機能、すなわち、疎水性親和性、抗体/抗原、イオン的複合体化、を与える任意の部分であり得る。
o.本明細書で用いられるとき、「配列特異的」は、水素結合を通じた塩基対合によるハイブリダイゼーションを意味する。標準的な塩基対合の非制限的な例は、チミンまたはウラシルとのアデニン塩基対合、およびシトシンとのグアニン塩基対合を含む。塩基対合モチーフのその他の非制限的な例は、制限されずに:以下のいずれかとのアデニン塩基対合:5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、2−チオウラシルまたは2−チオチミン;以下のいずれかとのグアニン塩基対合:5−メチルシトシンまたはプソイドイソシトシン;以下のいずれかとのシトシン塩基対合:ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)またはN9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン);以下のいずれかとのチミンまたはウラシル塩基対合:2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)またはN9−(2,6−ジアミノプリン);およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)、汎用塩基である、例えば以下のいずれかのような任意のその他の核酸塩基との塩基対合:アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)またはN9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)(Seelaら、Nucl.Acids、Res.:28(17):3224〜3232(2000)を参照のこと)を含む。
p.本明細書で用いるとき、「縮合条件」または「連結条件」は、選択された縮合/連結化学に従って2つのPNAオリゴマーを縮合/連結するために適切な条件を意味する。
q.本明細書で用いるとき、「連結」および「縮合」は、交換可能であり、そして2つのオリゴマーブロックを共有結合し、それによって細長いPNAオリゴマーまたはキメラを形成するプロセスをいう。この連結/縮合化学は、これら方法の限定ではないことを理解すべきである。細長いPNAオリゴマーを形成するために適切な多くの縮合/連結化学の非限定的な例は、図8aおよび8bを参照して本明細書中に記載されている。
r.本明細書で用いられるとき、「クエンチング」は、その機構にかかわらず、クエンチャー部分にともなうエネルギー転移により引き起こされる蛍光レポーター部分の蛍光における減少を意味する。
s.本明細書で用いられるとき、「固体支持体」または「固体キャリア」は、その上で、PNAモノマー、PNAダイマー、PNAオリゴマーまたはPNAキメラが合成、付着、連結またはそうでなければ固定化される任意の固相材料を意味する。固体支持体は、「樹脂」、「合成支持体」、「固相」、「表面」および/または「支持体」のような用語を包含する。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトのような有機ポリマーから構成され得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御ポアガラス(CPG)、または逆相シリカのような無機物であり得る。固体支持体の形態は、ビーズ、スフェア、粒子、顆粒、ゲル、または表面の形状であり得る。表面は、平面状、実質的に平面状、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、そして膨潤性または非膨潤性特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、窪みまたはその他のコンテナ、ベッセルの形態、機能または位置に構成され得る。複数の固体支持体は、試薬のロボット送達のために、またはレーザー照射および共焦点または偏向光収集による走査を含む検出手段によりアドレス可能な、種々の位置にあるアレイにある形態であり得る。
t.本明細書で用いられるとき、「立体的に妨害された固体支持体」は、立体的に妨害された切断可能なリンカーまたは立体的に阻害された酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体を意味する。立体的に妨害されるとは、本発明者らは、リンカーが、固体支持体上でアセンブルされるリンカーとオリゴマーとの間で切断可能な共有結合を形成する二級または三級原子を含むことを意味する。立体的に妨害された固体支持体の非限定的な例は:トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl、Novabiochem、P/N 01−64−0074)、2−クロロトリチルクロライド樹脂(Novabiochem、P/N 01−64−0021)、DHPP(Bachem、P/N Q−1755)、MBHA(Applied Biosystems P/N 400377)、4−メチルトリチルクロライド樹脂(Novabiochem、P/N 01−64−0075)、4−メトキシトリチルクロライド樹脂(Novabiochem、P/N 01−64−0076)、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS(Novabiochem、P/N 01−64−0345)、Rink酸樹脂(Novabiochem P/Ns 01−64−0380、01−64−0202)、NovaSyn TGTアルコール樹脂(Novabiochem、P/N01−64−0074)を含む。
u.本明細書で用いられるとき、「支持体に結合」は、固体支持体上またはそれに固定化されることを意味する。
v.本明細書で用いられるとき、「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体支持体上に存在するか、またはベッセルの整列中にあるオリゴマーの所定の空間的整列を意味する。特定のアレイフォーマットは、「チップ」または「バイオチップ」と称される(M.Schena編、Microarray Biochip Technology、BioTechnique Books、Eaton Puslishing、Natick、MA(2000))。アレイは、例えば、2〜約12の低密度数、例えば、約100以上の位置の中密度、例えば、千以上の高密度数のアドレス可能な位置を含み得る。代表的には、このアレイフォーマットは、製作、取り扱い、配置、積み上げ、試薬導入、検出、および貯蔵を可能にする幾何学的に規則的な形状である。このアレイは、行およびカラムフォーマットの形態であり得、各位置の間は規則的な間隔である。あるいは、これらの位置は、束になり、混合されるか、または均等化処理またはサンプリングのために均一にブレンドされ得る。アレイは、各位置が、試薬の高スループット取り扱い、ロボット送達、マスキング、またはサンプリングのため、あるいはレーザー照射および共焦点または偏向光収集による走査を含む検出手段によって空間的にアドレス可能であるように構成される、複数のアドレス可能な位置を含み得る。
w.本明細書で用いられるとき、「ブロック」、「オリゴマーブロック」または「ブロックオリゴマー」は交換可能であり、そしてすべては、第2の適切に改変されたPNAオリゴマーまたはキメラに連結され、それによって細長いオリゴマーを調製するように設計され、かつ利用可能である、PNAオリゴマーまたはPNAキメラを意味する。連結/縮合されるオリゴマーまたはブロックは、非標識であり得るか、1つ以上のレポーター部分で標識され得るか、および/または1つ以上の保護または非保護官能基を含み得る。細長いオリゴマーに関し、ブロックはまた、この細長いオリゴマーを形成するために用いられたブロックから由来する細長いオリゴマーの一部をいうために用いられ得る。この細長いオリゴマーはまた、このオリゴマーをさらに伸長する連結/縮合反応におけるブロックとして用いられ得る。
x.本明細書で用いられるとき、ポリマーおよびオリゴマーは、長さが2つ以上のサブユニットのPNAオリゴマーまたはPNAキメラについていうとき、本質的に交換可能である。
y.本明細書で用いられるとき、「ネイティブオリゴマー」は、細長いオリゴマーの2つのオリゴマーブロックを分離するリンカーを含まないPNAオリゴマーまたはPNAキメラをいう。従って、ネイティブオリゴマーは、たとえキメラであっても、連結の点で改変されていないPNA骨格を含み、そしてそれ故、PNAモノマーのデノボの化学的アセンブリを用いて産生され得るものから区別不能である。
(III.一般)
(化学的アセンブリによるPNAオリゴマー合成)
PNAの化学的アセンブリのための方法は周知である(米国特許第5,539,082号、同第5,527,675号、同第5,623,049号、同第5,714,331号、同第5,718,262号,同第5,736,336号、同第5,773,571号、同第5,766,855号、同第5,786,461号、同第5,837,459号、同第5,891,625号、同第5,972,610号、第同5,986,053号、同第6,107,470号、同第6,201,103号、同第6,228,982号および同第6,357,163号を参照のこと;これらすべては本明細書中に参考として援用される(PerSeptive Biosystems Product Literatureもまた参照のこと))。PNA合成方法のための一般的参照としてはまた、Nielsenら、Peptide Nucleic Acids;Protocols and Applications、Horizon Scientific Press、Norfolk England(1999)を参照のこと。
(化学的アセンブリによるPNAオリゴマー合成)
PNAの化学的アセンブリのための方法は周知である(米国特許第5,539,082号、同第5,527,675号、同第5,623,049号、同第5,714,331号、同第5,718,262号,同第5,736,336号、同第5,773,571号、同第5,766,855号、同第5,786,461号、同第5,837,459号、同第5,891,625号、同第5,972,610号、第同5,986,053号、同第6,107,470号、同第6,201,103号、同第6,228,982号および同第6,357,163号を参照のこと;これらすべては本明細書中に参考として援用される(PerSeptive Biosystems Product Literatureもまた参照のこと))。PNA合成方法のための一般的参照としてはまた、Nielsenら、Peptide Nucleic Acids;Protocols and Applications、Horizon Scientific Press、Norfolk England(1999)を参照のこと。
ペプチド核酸の支持体に結合した自動化化学的アセンブリのための化学および器具は、今や、市販され入手可能である。標識PNAオリゴマーまたは非標識PNAオリゴマーの両方は、同様に、カスタムPNAオリゴマーの市販ベンダーから入手可能である。PNAの化学的アセンブリは、固相ペプチド合成に類似であり、ここで、アセンブリの各サイクルにおいて、このオリゴマーは、成長するポリマーに付加される次のシントンと縮合される反応性アルキルアミノ末端を所有している。
PNAは、マイクロモル以下からミリモルまたはそれ以上までの任意のスケールで合成され得る。PNAは、XALまたはPAL支持体を用いるExpedite Synthesizer(Applied Biosystems)上で、Fmoc(Bhoc)、tBoc/Z、またはMmT保護基モノマーを用いて、2μモルスケールで首尾よく合成され得る。あるいは、MBHA支持体とともにModel 433A Synthesizer(Applied Biosystems)が用いられ得る。さらに、多くのその他の自動化合成機および合成支持体が利用され得る。標準的なペプチド化学が利用されるので、天然および非天然アミノ酸が、慣用的にPNAオリゴマー中に取り込まれ得る。PNAは、ポリアミドであるので、それは、C末端(カルボキシル末端)およびN末端(アミノ末端)を有する。標的配列への逆平行結合(好ましい配向)のために適切なハイブリダイゼーションプローブの設計の目的のために、プローブするPNAプローブの核酸塩基配列のN末端は、相当するDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドの5’ヒドロキシル末端の等価物である。
(連結/縮合によるPNAオリゴマー合成)
連結/縮合反応で用いられるとき、選択された連結化学の性質が考慮されるべきである。単純さのために、本発明者らは、しばしば、連結/縮合反応で用いられるオリゴマーの1つを、末端オリゴマーまたは末端ブロックと、そしてその他を、縮合オリゴマーまたは縮合ブロックと称する。この区別は、一般に、異なるブロック間を、特にそれらが同じ核酸塩基配列を含む場合を区別することを除いて関係がない。しはしば、少なくとも連結で用いられる官能基の性質は、末端および縮合オリゴマーブロックについて異なる。なぜなら、それらは、異なる連結化学薬品を収容するように設計され得るからである。例えば、1つのオリゴマーブロックはC末端酸基を含み得、そしてその他はN末端アミン基を含み得、ここで、縮合/連結反応の産物は、細長いPNAオリゴマーまたはキメラを形成するアミド結合である。
連結/縮合反応で用いられるとき、選択された連結化学の性質が考慮されるべきである。単純さのために、本発明者らは、しばしば、連結/縮合反応で用いられるオリゴマーの1つを、末端オリゴマーまたは末端ブロックと、そしてその他を、縮合オリゴマーまたは縮合ブロックと称する。この区別は、一般に、異なるブロック間を、特にそれらが同じ核酸塩基配列を含む場合を区別することを除いて関係がない。しはしば、少なくとも連結で用いられる官能基の性質は、末端および縮合オリゴマーブロックについて異なる。なぜなら、それらは、異なる連結化学薬品を収容するように設計され得るからである。例えば、1つのオリゴマーブロックはC末端酸基を含み得、そしてその他はN末端アミン基を含み得、ここで、縮合/連結反応の産物は、細長いPNAオリゴマーまたはキメラを形成するアミド結合である。
しかし、オリゴマーが複数の連結によって伸長されるべきとき、本発明者らは、一般に、末端オリゴマーブロックを、第1の連結から、または直前に進行する連結ステップから産生されるオリゴマーブロックという。連結化学薬品のいくつかの非制限的な例は、図8aおよび8bに示されている。慣用的実験および本明細書中に含まれる説明を用い、当業者は、細長いPNAオリゴマーまたはPNAキメラを容易に調製し得る。
末端ブロックは、比較的非反応性であるC末端アミドを含み得る。対照的に、縮合ブロックは、連結反応に適切であるC末端を含み得る。しかし、縮合化学の性質に依存して、オリゴマーのこのC末端は、C末端酸を含み得る。オリゴマーの末端への連結/縮合される官能基は、縮合/連結化学の性質に依存して末端保護基の付加が必要であってもなくてもよい。オリゴマーブロックは、しばしば、それら自身がデノボ方法で調製されるので、そして適切な市販の試薬および器具が、C末端アミノ酸またはC末端アミドを含むPNAオリゴマーの産生のために利用可能であるために、当業者は、所望のC末端形態のオリゴマーブロックを容易に調製し得る。
N末端に関しては、ここで再び、正確な形態は、選択された連結化学の性質、およびオリゴマーが縮合オリゴマーブロックであるか、または末端オリゴマーブロックであるか否かに依存し得る。オリゴマーが末端ブロックである場合、このN末端は、反応性官能基(例えば、N末端アミン基)を含み得、その一方、オリゴマーが縮合オリゴマーブロックである場合、このN末端はキャップされ得る。キャッピングの非限定的な例は、N末端を標識でラベルすること、またはそうでなければ、それを、アセチルのような比較的非反応性である部分と反応することを含む。N末端が連結反応に含められる場合、それは、代表的には、遊離のアミンとして存在する。オリゴマーブロックは、しばしば、それら自身がデノボ方法で調製されるので、そして適切な市販の試薬および器具が、PNAオリゴマーの産生のために利用可能であるために、当業者は、所望のN末端形態のオリゴマーブロックを容易に調製し得る。
連結のための末端の改変に加え、このオリゴマーブロックは、改変および/または適正に保護され得、それによって、標識または表面への付着のための官能基を取り込む。このような官能基は、1)オリゴマー合成化学(例えば、標識を破壊し得るために必要な厳しい脱保護条件)、選択された縮合/連結化学(例えば、所望の標識の官能基が、縮合化学を妨害し得る)および官能基の意図された使用(例えば、それが、標識のため、または固体支持体への付着のために意図されているか否か)のような因子に依存して連結の前または後で利用され得る。
(PNA標識/改変)
PNAを標識するための非制限的な方法は、米国特許第6,110,676号、同第6,280,964号、同第6,355,421号、WO99/21881、米国特許第6,361,942号、WO99/49293および米国特許第6,441,152号(これらすべては参考として本明細書中に援用される)、本明細書の実施例のセクション中に記載されているか、またはそうでなければ、PNA合成およびペプチド合成の技術分野で周知である。PNAを標識するための方法はまた、Nielsenら、Peptide Nucleic Acids;Protocols and Application、Horizon Scientific Press、Norfolk、England(1999)中で論議されている。PNAオリゴマーを標識するための非限定的な方法は、以下で論議される。
PNAを標識するための非制限的な方法は、米国特許第6,110,676号、同第6,280,964号、同第6,355,421号、WO99/21881、米国特許第6,361,942号、WO99/49293および米国特許第6,441,152号(これらすべては参考として本明細書中に援用される)、本明細書の実施例のセクション中に記載されているか、またはそうでなければ、PNA合成およびペプチド合成の技術分野で周知である。PNAを標識するための方法はまた、Nielsenら、Peptide Nucleic Acids;Protocols and Application、Horizon Scientific Press、Norfolk、England(1999)中で論議されている。PNAオリゴマーを標識するための非限定的な方法は、以下で論議される。
アセンブリの合成化学は本質的に同じであるので、ペプチドを標識するために従来用いられている任意の方法が、しばしば、PNAオリゴマーを標識することを行うよう適合され得る。一般に、オリゴマーまたはポリマーのN末端は、カルボン酸基または活性化カルボン酸基を有する部分との反応により標識され得る。1つ以上のスペーサー部分が、必要に応じて、標識部分とオリゴマーの核酸塩基含有サブユニットとの間に導入され得る。一般に、このスペーサー部分は、標識反応を実施する前に導入され得る。所望であれば、このスペーサーは、標識内に埋包され得、そしてそれによって標識反応の間に取り込まれる。
代表的には、ポリマーのC末端は、標識部分または官能基部分を、その上にPNAオリゴマーがアセンブルされるべき支持体と最初に縮合することにより標識され得る。次いで、PNAオリゴマーのシントンを含む第1の核酸塩基が、標識部分または官能基部分と縮合され得る。あるいは、1つ以上のスペーサー部分(例えば、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸;「O−リンカー」)は、標識部分または官能基部分と、オリゴマーの第1の核酸塩基サブユニットとの間に導入され得る。一旦、調製されるべき分子が完全にアセンブル、標識および/または改変されると、それは、標準的な方法を用いて、支持体から切断され得、脱保護され得、そして精製され得る。
例えば、標識部分または官能基部分は、リジン誘導体であり得、ここで、ε−アミノ基は、保護されたまたは保護されない官能基であるか、またはそうでなければレポーター部分で改変される。レポーター部分は、5(6)−カルボキシフルオロセイン、色素1、色素2のような蛍光発色団または4−((4−ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸(ダブシル)のようなクエンチャー部分であり得る。リジン誘導体の固体支持体との縮合は、標準的な縮合(ペプチド)化学を用いて達成され得る。リジン誘導体のα−アミノ基は、次いで、脱保護され得、そして核酸塩基配列アセンブリが、最初のPNAシントンのリジンアミノ酸のα−アミノ基との縮合により開始され得る。上記で論議されたように、スペーサー部分が、必要に応じて、リジンアミノ酸と第1のPNAシントンとの間に、第1のPNAシントンの縮合前に、適切なスペーサー(例えば、Fmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸)をリジンアミノ酸と縮合することにより挿入され得る。
あるいは、アセンブルされ、または部分的にアセンブルされたポリマー上の官能基は、オリゴマーがなお支持体に結合したままで導入され得る。次いで、官能基は、任意の目的に利用可能であり、オリゴマーを支持体に付着されること、またはそうでなければレポーター部分と反応されることのいずれかに用いられることを含み、連結後反応されることを含む(連結後とは、本発明者らは、これらオリゴマーが1つ以上の縮合/連結反応の実施により完全に形成された後の点を意味する)。この方法は、しかし、適切に保護された官能基が、アセンブリの間に取り込まれ、その結果、アセンブリが終了した後、反応性官能性が生成され得ることを必要とする。従って、保護された官能基は、オリゴマー末端、オリゴマー内部を含む、オリゴマーまたはブロック内の任意の位置に付着され得る。
例えば、リジンのε−アミノ基は、4−メチル−トリフェニルメチル(Mtt)、4−メトキシ−トリフェニルメチル(MMT)または4、4’−ジメトキシトリフェニルメチル(DMT)保護基で保護され得る。このMtt、MMtまたはDMT基は、温和な酸性条件下の合成樹脂の処理によりオリゴマー(市販され利用可能なFmocPNAモノマーおよびPALリンカーを有するポリスチレン支持体を用いてアセンブルされた;PerSeptive Biosystems、Inc.、Framingham、MA)から除去され得る。結果として、ドナー部分、アクセプター部分またはその他のレポーター部分は、例えば、次いで、ポリマーがなお支持体に結合されている間に、リジンアミノ酸のε−アミノ基と縮合され得る。完全なアセンブリおよび標識の後、ポリマーは、次いで、周知の方法を用いて、支持体から切断され得、脱保護され得、そして精製され得る。
なお別の方法により、レポーター部分は、それが完全にアセンブルされた後、オリゴマーまたはオリゴマーブロックに付着され得、そして支持体から切断され得る。この方法は、標識が、オリゴマーを製造するために一般に用いられる切断、脱保護または精製処方と適合しない場合に好適である。この方法により、PNAオリゴマーは、ポリマー上の官能基と標識上の官能基との反応により溶液中で標識され得る。当業者は、結合溶液の組成が、例えば、ドナーまたはアクセプター部分のような、オリゴマーおよび標識の性質に依存することを認識する。この溶液は、有機溶媒、水またはその任意の組み合わせを含み得る。一般に、有機溶媒は、極性の非求核溶媒である。適切な有機溶媒の非限定的な例は、アセトニトリル(ACN)、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルスルホキシド、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)および1−メチルピロリドン(NMP)を含む。
標識されるべきポリマー上の官能基は、求核性であり得(例えば、アミノ基)、そして標識上の官能基は求電子性であり得る(例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸)。しかし、これは、ポリマー上の官能基が求電子性であり得(例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸)、そして標識上の官能基が求核性であり得る(例えば、アミノ酸基)ように、逆転され得ることが企図される。活性化カルボン酸官能基の非制限的な例は、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを含む。水溶液中では、PNAまたは標識のいずれかのカルボン酸基は、(選択された成分の性質に依存して)水溶性カルボジイミドで活性化され得る。試薬1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ−プロピル)カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)は、特に、水性アミド形成縮合反応のために販売されている市販の利用可能な試薬である。このような縮合反応はまた、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)または1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)がEDCと混合されるとき改善され得る。
水溶液のpHは、この縮合反応の間に緩衝液で調整され得る。例えば、縮合の間のpHは、4〜10の範囲内であり得る。一般に、非水性反応の塩基度は、非求核有機塩基の添加によって調整される。適切な塩基の非限定的な例は、N−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびN,N−ジイソプロピルエチルアミンを含む。あるいは、pHは、(N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N’−[2−エタンスルホン酸](HEPES)または4−モルホリンエタン−スルホン酸(MES)のような生物学的緩衝液または重炭酸ナトリウムのような無機緩衝液を用いて調整され得る。
(PNAキメラ合成および標識/改変)
PNAキメラは、核酸とペプチド核酸サブユニットの組み合わせである。これ故、PNAキメラの合成、標識および改変は、当業者に公知の方法、および上記で記載の方法を利用し得る。PNAキメラの合成、標識および改変のための適切な参照は、今や米国特許第6,063,569号として発行され、本明細書中に参考として援用されるWIPO公開特許出願番号WO96/40709号に見出され得る。さらに、PNA合成および標識のための上記に記載の方法は、PNAキメラのPNA部分を改変するためにしばしば用いられ得る。加えて、核酸の合成および標識のための周知の方法が、PNAキメラの核酸部分の改変のためにしばしば用いられ得る。例示の方法は、5,476,925、5,453,496、5,446,137、5,419,966、5,391,723、5,391,667、5,380,833、5,348,868、5,281,701、5,278,302,5,262,530、5,243,038、5,218,103、5,204,456、5,204,455、5,198,540、5,175,209、5,164,491、5,112,962、5,071,974、5,047,524、4,980,460、4,923,901,4,786,724、4,725,677、4,659,774、4,500,707、4,458,066、および4,415,732中に見出され得;そのすべては本明細書中に参考として援用される。
PNAキメラは、核酸とペプチド核酸サブユニットの組み合わせである。これ故、PNAキメラの合成、標識および改変は、当業者に公知の方法、および上記で記載の方法を利用し得る。PNAキメラの合成、標識および改変のための適切な参照は、今や米国特許第6,063,569号として発行され、本明細書中に参考として援用されるWIPO公開特許出願番号WO96/40709号に見出され得る。さらに、PNA合成および標識のための上記に記載の方法は、PNAキメラのPNA部分を改変するためにしばしば用いられ得る。加えて、核酸の合成および標識のための周知の方法が、PNAキメラの核酸部分の改変のためにしばしば用いられ得る。例示の方法は、5,476,925、5,453,496、5,446,137、5,419,966、5,391,723、5,391,667、5,380,833、5,348,868、5,281,701、5,278,302,5,262,530、5,243,038、5,218,103、5,204,456、5,204,455、5,198,540、5,175,209、5,164,491、5,112,962、5,071,974、5,047,524、4,980,460、4,923,901,4,786,724、4,725,677、4,659,774、4,500,707、4,458,066、および4,415,732中に見出され得;そのすべては本明細書中に参考として援用される。
(標識オリゴマーおよびオリゴマーブロック)
上記で論議されたように、PNAキメラおよびPNAオリゴマーは、レポーター部分で標識され得る。オリゴマーまたはオリゴマーブロックを直接標識するために適切なレポーター部分(標識)の非制限的な例は:量子ドット、マイナーグルーブバインダー、デキストラン結合体、分岐核酸検出システム、発色団、蛍光発色団、クエンチャー、スピンラベル、放射線同位元素、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物を含む。クエンチング部分もまた考慮された標識である。その他の適切な標識試薬および付着のための好ましい方法は、PNA、ペプチドまたは核酸合成の当業者によって認識される。非限定的な例は、上記に記載または参照されている。
上記で論議されたように、PNAキメラおよびPNAオリゴマーは、レポーター部分で標識され得る。オリゴマーまたはオリゴマーブロックを直接標識するために適切なレポーター部分(標識)の非制限的な例は:量子ドット、マイナーグルーブバインダー、デキストラン結合体、分岐核酸検出システム、発色団、蛍光発色団、クエンチャー、スピンラベル、放射線同位元素、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物を含む。クエンチング部分もまた考慮された標識である。その他の適切な標識試薬および付着のための好ましい方法は、PNA、ペプチドまたは核酸合成の当業者によって認識される。非限定的な例は、上記に記載または参照されている。
ハプテンの非限定的な例は、5(6)−カルボキシフルオレセイン、2,4−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンを含む。
蛍光色素(蛍光発色団)の非制限的な例は、5(6)−カルボキシフルオレセイン(Flu)、2’,4’,1,4,−テトラクロロフルオレセイン;および2’,4’,5’,7’,1,4−ヘキサクロロフルオレセイン、その他のフルオレセイン色素(本明細書中に参考として援用される米国特許第5,188,934号;同第6,008,379号;同第6,020,481号を参照のこと)、6−((7−アミノ−4−メチルクマリン−3−アセチル)アミノ)ヘキサン酸(Cou)、5(および6)−カルボキシ−X−ローダミン(Rox)、その他のローダミン色素(本明細書中に参考として援用される米国特許第5,366,860号;同第5,847,162号;同第5,936,087号;同第6,051,719号;同第6,191,278号;同第6,248,884号を参照のこと)、ベンゾフェノキサジン(本明細書中に参考として援用される米国特許第6,140,500号を参照のこと)、シアニン2(Cy2)色素、シアニン3(Cy3)色素、シアニン3.5(Cy3.5)色素、シアニン5(Cy5)色素、シアニン5.5(Cy5.5)色素、シアニン7(Cy7)色素、シアニン9(Cy9)色素(シアニン色素2、3、3.5、5および5.5は、Amersham、Arlington Heights、ILからNHSエステルとして入手可能である)、その他のシアニン色素(Kubista、WO97/45539)、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン(JOE)、5(6)−カルボキシ−テトラメチルローダミン(Tamara)、色素1(図7)、色素2(図7)またはAlexa色素シリーズ(Molecular Probes、Eugene、OR)を含む。
酵素の非制限的な例は、ポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ、Klenow PNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、シークエナーゼ、DNAポリメラーゼ1およびphi29ポリメラーゼ)、アルカリホスファターゼ(AP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、大豆ペルオキシダーゼ(SBP)、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼを含む。
クエンチング部分の非制限的な例は、例えば、ダブシル(dabcyl)およびダブシル(dabsyl)であるアリールジアゾ化合物のようなジアゾ含有部分、1つ以上のさらなるジアゾおよび/またはアリール基を含むホモログ;例えば、Fast Black(Nardone、米国特許第6,117,986号)、および置換化合物であって、ここでZが、Cl、F、Br、C1〜C6アルキル、C5〜C14アリール、ニトロ、シアノ、スルホネート、NR2、−OR、およびCO2Hのような置換基であり、ここで、各Rが、独立して、H、C1〜C6アルキルまたは以下の構造に従うC5〜C14アリールである
マイナーグルーブバインダーの非限定的な例は、以下の構造によって提示されるCDPI3である:
非放射活性標識方法、技法および試薬は、Non−Radioactive Labeling、A Practical Introduction、Garman、A.J.Academic Press、San Diego、CA(1997)中に総説がある。
(スペーサー/リンカー部分)
一般に、スペーサーは、かさ高い標識試薬がプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション性質に対して有し得る悪影響を最小にするために用いられ得る。リンカーは、オリゴマーの2つ以上のオリゴマーブロックを連結するために用いられ得る。これらリンカーは、無塩基性(abasic)であり得る。無塩基性とは、本発明者らは、核酸塩基を含まないことを意味する。スペーサー/リンカー部分の非制限的な例は:1つ以上のアミノアルキルカルボン酸(例えば、アミノカプロン酸)、アミノ酸の側鎖(例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖)、1つ以上の天然のアミノ酸(例えば、グリシン)、アミノオキシアルキル酸(例えば、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸)、アルキル二酸(例えば、コハク酸)、アルキルオキシ二酸(例えば、ジグリコール酸)またはアルキルジアミン(例えば、1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサオクタン)である。スペーサー/リンカー部分はまた、偶発的に、または意図的に、オリゴマーの水可溶性を改善するために構築され得る(例えば、Gildeaら、Tett.Lett.39:7255〜7258(1998)を参照のこと)。
一般に、スペーサーは、かさ高い標識試薬がプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション性質に対して有し得る悪影響を最小にするために用いられ得る。リンカーは、オリゴマーの2つ以上のオリゴマーブロックを連結するために用いられ得る。これらリンカーは、無塩基性(abasic)であり得る。無塩基性とは、本発明者らは、核酸塩基を含まないことを意味する。スペーサー/リンカー部分の非制限的な例は:1つ以上のアミノアルキルカルボン酸(例えば、アミノカプロン酸)、アミノ酸の側鎖(例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖)、1つ以上の天然のアミノ酸(例えば、グリシン)、アミノオキシアルキル酸(例えば、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸)、アルキル二酸(例えば、コハク酸)、アルキルオキシ二酸(例えば、ジグリコール酸)またはアルキルジアミン(例えば、1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサオクタン)である。スペーサー/リンカー部分はまた、偶発的に、または意図的に、オリゴマーの水可溶性を改善するために構築され得る(例えば、Gildeaら、Tett.Lett.39:7255〜7258(1998)を参照のこと)。
(オリゴマーブロックを連結/縮合する場合の標識の選択におけるガイダンス)
オリゴマーが縮合/連結され、それによって、細長いオリゴマーを生成すべきとき、コンポーネントオリゴマーブロックの潜在的に反応性の官能基の全体の性質は、可能な副または交差反応について考慮されるべきであることは当業者に明らかである。保護基はまた、適切な場合に用いられ得、副または交差反応の可能性を最小にするか、またはなくする。例えば、標識されたオリゴマーが連結されるべきとき、選択され得る種々の連結化学の性質を考慮して1つ以上の標識の官能基の反応性の可能性を考慮することが賢明である。あるいは、保護された標識が用いられ得る(例えば、図5を参照のこと)。
オリゴマーが縮合/連結され、それによって、細長いオリゴマーを生成すべきとき、コンポーネントオリゴマーブロックの潜在的に反応性の官能基の全体の性質は、可能な副または交差反応について考慮されるべきであることは当業者に明らかである。保護基はまた、適切な場合に用いられ得、副または交差反応の可能性を最小にするか、またはなくする。例えば、標識されたオリゴマーが連結されるべきとき、選択され得る種々の連結化学の性質を考慮して1つ以上の標識の官能基の反応性の可能性を考慮することが賢明である。あるいは、保護された標識が用いられ得る(例えば、図5を参照のこと)。
(連結/縮合化学の非制限的な例)
図8aおよび8bを参照して、適正に調製されたオリゴマーブロックは、水溶性カルボジイミドである1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ−プロピル)カルボジイミドヒドロクロライド(EDC)のようなカルボジイミドを用いて連結され得る。示されるように、代表的には、オリゴマーブロックの1つは、カルボン酸部分を含み、そして他方はアミノ基を含む。PNAオリゴマーは、それらが連結された天然アミノ酸部分を含むか否かにかかわらず、アミン末端およびカルボン酸末端を含み得るので、一般に、PNAオリゴマーブロックは:より代表的なC末端酸の代わりに、少なくとも1つのPNA C末端酸オリゴマーの調製を除いて、このタイプの連結化学を促進するための改変を要求しない。これらオリゴマーは、必要に応じて約75%までの有機改変剤(v/v)を含む水溶液中で連結され得る。pHは、6.5未満であり得る。トリアゾール化合物(例えば、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)または1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt))のような活性化試薬の添加は、縮合/連結反応の全体の収率を増加し得る。
図8aおよび8bを参照して、適正に調製されたオリゴマーブロックは、水溶性カルボジイミドである1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ−プロピル)カルボジイミドヒドロクロライド(EDC)のようなカルボジイミドを用いて連結され得る。示されるように、代表的には、オリゴマーブロックの1つは、カルボン酸部分を含み、そして他方はアミノ基を含む。PNAオリゴマーは、それらが連結された天然アミノ酸部分を含むか否かにかかわらず、アミン末端およびカルボン酸末端を含み得るので、一般に、PNAオリゴマーブロックは:より代表的なC末端酸の代わりに、少なくとも1つのPNA C末端酸オリゴマーの調製を除いて、このタイプの連結化学を促進するための改変を要求しない。これらオリゴマーは、必要に応じて約75%までの有機改変剤(v/v)を含む水溶液中で連結され得る。pHは、6.5未満であり得る。トリアゾール化合物(例えば、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)または1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt))のような活性化試薬の添加は、縮合/連結反応の全体の収率を増加し得る。
図8aおよび8bを参照して、連結/縮合の産物は、ドナーおよびアクセプター部分の両方を含むとして示されている。これは、しかし、例であって、そして限定ではない。連結されるべき1つまたは両方のオリゴマーは非標識であり得るからである。簡便には、この連結/縮合プロセスは、本明細書に記載のようなC末端PNAサブユニットを含むPNA C末端酸オリゴマーを用いてネイティブなオリゴマーを生成し得る。
1つの実施形態では、簡便には、これらネイティブなオリゴマーが、同時係属中でかつ共に所有されるUSSN09/179,162(参考として本明細書中に援用される)中により詳細に記載されるようなLinear Beaconとして標識される場合、多重SNP遺伝子型決定アッセイにおけることを含む、標的配列の分析のために用いられ得る。従って、本発明の組成物、方法およびライブラリーは、ライブラリーアプローチを通じて、多くの目的のために用いられ得るネイティブPNAオリゴマーの産生に用いられ得る。
(その他)
米国公開出願2003−0077608およびPCT公開出願WO02/072865は、同時係属中であり、そして本出願とともに共通して所有されている。これらの公開された特許出願は、特に、オリゴマーブロックの連結を記載し、ここで、細長い(組み合わせ)オリゴマー中でブロックを分離する少なくとも3原子のリンカーが存在する。従って、これらの公開特許出願で記載される連結/縮合反応は、本明細書に記載のようなネイティブなオリゴマーを生成しない。それにもかかわらず、前記の特許出願は、本明細書に記載のPNA C末端酸オリゴマーに適用され得るオリゴマーブロックを縮合/連結するための種々の方法を記載している。PNA C末端酸オリゴマーの縮合/連結は、ネイティブPNAオリゴマーを生成するために用いられ得る。それらはネイティブPNAオリゴマーであるので、それらは、例えば、自己指標PNAプローブを用いる多重SNP遺伝子型決定を含むPNAオリゴマーに共通して適用される任意の適用に用いられ得る。
米国公開出願2003−0077608およびPCT公開出願WO02/072865は、同時係属中であり、そして本出願とともに共通して所有されている。これらの公開された特許出願は、特に、オリゴマーブロックの連結を記載し、ここで、細長い(組み合わせ)オリゴマー中でブロックを分離する少なくとも3原子のリンカーが存在する。従って、これらの公開特許出願で記載される連結/縮合反応は、本明細書に記載のようなネイティブなオリゴマーを生成しない。それにもかかわらず、前記の特許出願は、本明細書に記載のPNA C末端酸オリゴマーに適用され得るオリゴマーブロックを縮合/連結するための種々の方法を記載している。PNA C末端酸オリゴマーの縮合/連結は、ネイティブPNAオリゴマーを生成するために用いられ得る。それらはネイティブPNAオリゴマーであるので、それらは、例えば、自己指標PNAプローブを用いる多重SNP遺伝子型決定を含むPNAオリゴマーに共通して適用される任意の適用に用いられ得る。
(IV.本発明の実施形態)
a)序論
本発明は、PNAダイマーおよびPNAオリゴマー合成の分野に関する。これらPNAダイマーは、ダイマーのライブラリーを含め、支持体に結合されているか否かにかかわらず、特に、PNA C末端酸オリゴマーの調製において用いられ得る。さらに、このPNA C末端酸オリゴマーは、それら自身、特に、連結/縮合を通じてより長いPNAオリゴマーおよび/またはキメラの調製で用いられ得、および特に、PNAオリゴマーおよび/またはキメラ調製で用いられるライブラリーの調製で用いられ得る。そのように生成されたPNAオリゴマーおよびPNAキメラは、それら自身、特に、制限されずに、自己指標アッセイ、多重アッセイおよび/または自己指標多重アッセイにおける使用によるを含む、目的の標的配列の決定において用いられ得る。
a)序論
本発明は、PNAダイマーおよびPNAオリゴマー合成の分野に関する。これらPNAダイマーは、ダイマーのライブラリーを含め、支持体に結合されているか否かにかかわらず、特に、PNA C末端酸オリゴマーの調製において用いられ得る。さらに、このPNA C末端酸オリゴマーは、それら自身、特に、連結/縮合を通じてより長いPNAオリゴマーおよび/またはキメラの調製で用いられ得、および特に、PNAオリゴマーおよび/またはキメラ調製で用いられるライブラリーの調製で用いられ得る。そのように生成されたPNAオリゴマーおよびPNAキメラは、それら自身、特に、制限されずに、自己指標アッセイ、多重アッセイおよび/または自己指標多重アッセイにおける使用によるを含む、目的の標的配列の決定において用いられ得る。
b)支持体結合PNAダイマー組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体組成物に関する。この固体支持体は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびPNAダイマーを含む。このPNAダイマーは、N末端の塩基不安定保護基を含み、そしてこの切断可能なリンカーを通じて固体支持体に切断可能に連結されている。さらに、この固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり0.08mmol以上であり得る。このPNAダイマーは、Fmoc(Bhoc)モノマーから形成され得る。このPNAダイマーは、上記固体支持体の切断可能なリンカーにエステル結合により連結され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体組成物に関する。この固体支持体は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびPNAダイマーを含む。このPNAダイマーは、N末端の塩基不安定保護基を含み、そしてこの切断可能なリンカーを通じて固体支持体に切断可能に連結されている。さらに、この固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり0.08mmol以上であり得る。このPNAダイマーは、Fmoc(Bhoc)モノマーから形成され得る。このPNAダイマーは、上記固体支持体の切断可能なリンカーにエステル結合により連結され得る。
この固体支持体は、立体的に妨害された固体支持体であり得る。この立体的に妨害された固体支持体の非限定的な例は、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂を含む。この固体支持体はまた、PAL−PEG−PS(登録商標)、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択され得る。
上記固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲であり得る。上記固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲であり得る。
上記支持体結合PNAダイマーは、2つ以上の異なる支持体結合PNAダイマーを含むアレイを生成するために上記支持体上に整列され得る。
上記支持体結合PNAダイマーは、種々の方法およびまたはPNAモノマータイプによって生成され得、制限されずに、以下のセクションIV(d)またはIV(e)に記載の方法を含む。
(c)支持体結合PNAダイマー固体支持体のライブラリー)
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体のライブラリーに関する。このライブラリーは、少なくとも、2つの固体支持体を備え、ここで、この少なくとも2つの固体支持体の各々は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびPNAダイマーを含む。このPNAダイマーは、酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能に連結され得る。このPNAダイマーは、このライブラリーの上記少なくとも2つの固体支持体の任意の他方に結合しているPNAダイマーとは核酸塩基配列が異なり得る。このPNAダイマーは、エステル結合により固体支持体の切断可能なリンカーに連結され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体のライブラリーに関する。このライブラリーは、少なくとも、2つの固体支持体を備え、ここで、この少なくとも2つの固体支持体の各々は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびPNAダイマーを含む。このPNAダイマーは、酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能に連結され得る。このPNAダイマーは、このライブラリーの上記少なくとも2つの固体支持体の任意の他方に結合しているPNAダイマーとは核酸塩基配列が異なり得る。このPNAダイマーは、エステル結合により固体支持体の切断可能なリンカーに連結され得る。
ライブラリーは、少なくとも16の固体支持体を含み得る。例えば、各支持体は、少なくとも16の可能なPNAダイマーのセットから選択されたPNAダイマーを含み得、ここで、このセットの各PNAダイマーは、このセットのその他のPNAダイマーのすべてとは、PNAダイマーのアセンブリで用いられたPNAサブユニットの少なくとも4つの異なる核酸塩基の少なくとも1つが異なっている。この少なくとも4つの異なる核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択され得る。例えば、実施例1に記載の16の固体支持体のライブラリーを参照のこと。
ライブラリーの固体支持体は、立体的に妨害された固体支持体であり得る。例えば、この立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択され得る。この固体支持体は、PAL−PEG−PS、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択され得る。
上記ライブラリーの固体支持体のPNAダイマーのC末端サブユニットは、上記切断可能なリンカーに連結され得る。このPNAダイマーは、Fmoc(Bhoc)保護モノマーから形成され得る。このPNAダイマーは、t−boc/Z保護モノマーから形成され得る。このPNAダイマーは、Mmt/Bhoc保護モノマーから形成され得る。このPNAダイマーは、その他のタイプのPNAモノマーまたは異なるタイプのPNAモノマーの組み合わせから形成され得る(以下の実施例3を参照のこと)。従って、PNAダイマー固体支持体のライブラリーが、制限されずに、以下のセクションV(d)またはV(e)に記載の方法を含む、種々の方法および/またはPNAモノマータイプによって生成され得ることは明瞭である。
ライブラリーの少なくとも1つの固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり約0.08mmol以上であり得る。上記ライブラリーの少なくとも2分の1の固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり約0.08mmol以上であり得る。上記ライブラリーの各固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり約0.08mmol以上であり得る。上記ライブラリーの各々の固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲であり得る。上記ライブラリーの各々の固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲であり得る(実施例1を参照のこと)。
支持体のライブラリーは整列されてアレイを生成し得る。
(d)PNAダイマー固体支持体を形成する方法)
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法に関する。この方法は、第1のPNAモノマーを、立体的に妨害された固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このPNAモノマーは、N末端の塩基不安定アミン保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし好ましくは、上記固体支持体は洗浄され、過剰の第1のPNAモノマーを除去する。次いで、この固体支持体は、約1〜約2分の期間の間、この支持体に結合した第1のPNAモノマーから上記塩基不安定N末端アミン保護基を実質的に除去する脱保護試薬で処理される。この脱保護ステップは、迅速に実施されるべきである。なぜなら、非保護N末端アミンは、この酸を形成する切断可能なリンカーを攻撃し得、そしてそれによって、第1のPNAモノマーの環化および支持体からの解離を引き起こすからである。迅速に実施されるとき、第1のPNAモノマーの50%より少ないの環化および解離を得ることが可能である。一旦、脱保護が実施されると、この固体支持体を洗浄し、脱保護試薬を除去し得る。ここで再び、この洗浄は、迅速に実施されるべきである。迅速にとは、本発明者らは、それが、可能な限り早くそれが合理的に実施され得るように実施されるべきであることを意味し;一般に、上記脱保護試薬が固体支持体に最初に付与される時間と、第2のPNAモノマーの結合が開始される時間との間で2〜10分を超えて経過しない。洗浄後、第2のPNAモノマーが、上記第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合することが可能な限り速く、そして好ましくは、上記脱保護試薬が上記固体支持体に最初に付与されるときの2〜10分以内に実施される。
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法に関する。この方法は、第1のPNAモノマーを、立体的に妨害された固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このPNAモノマーは、N末端の塩基不安定アミン保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし好ましくは、上記固体支持体は洗浄され、過剰の第1のPNAモノマーを除去する。次いで、この固体支持体は、約1〜約2分の期間の間、この支持体に結合した第1のPNAモノマーから上記塩基不安定N末端アミン保護基を実質的に除去する脱保護試薬で処理される。この脱保護ステップは、迅速に実施されるべきである。なぜなら、非保護N末端アミンは、この酸を形成する切断可能なリンカーを攻撃し得、そしてそれによって、第1のPNAモノマーの環化および支持体からの解離を引き起こすからである。迅速に実施されるとき、第1のPNAモノマーの50%より少ないの環化および解離を得ることが可能である。一旦、脱保護が実施されると、この固体支持体を洗浄し、脱保護試薬を除去し得る。ここで再び、この洗浄は、迅速に実施されるべきである。迅速にとは、本発明者らは、それが、可能な限り早くそれが合理的に実施され得るように実施されるべきであることを意味し;一般に、上記脱保護試薬が固体支持体に最初に付与される時間と、第2のPNAモノマーの結合が開始される時間との間で2〜10分を超えて経過しない。洗浄後、第2のPNAモノマーが、上記第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合することが可能な限り速く、そして好ましくは、上記脱保護試薬が上記固体支持体に最初に付与されるときの2〜10分以内に実施される。
この実施形態によれば、上記第1および第2のPNAモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むFmoc(Bhoc)PNAモノマーであり得る。上記第1および/または第2のPNAモノマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から独立に選択され得る。
上記第1または第2のPNAモノマーのN末端の塩基不安定保護基はFmocであり得る。上記脱保護試薬は、有機溶媒中約15〜約25(v/v)%のピペリジンを含む溶液であり得る。適切な有機溶媒の非制限的な例は、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)および1−メチル−2−ピロリドン(NMP)を含む。例えば、上記脱保護試薬は、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%(v/v)ピペリジンであり得る。
上記脱保護試薬は、有機溶媒中の約0.2%〜約4%のDBU(v/v)を含む溶液であり得る。例えば、上記脱保護試薬は、NMP(v/v)中の2%DBUであり得る。
この実施形態によれば、上記立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択され得る。好ましくは、上記立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド(トリチル−Cl)樹脂である。
(e)PNAダイマー固体支持体を形成するための別の方法)
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体結合PNAダイマーを形成するためのなお別の方法に関する。この方法は、第1のPNAモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このPNAモノマーは、酸不安定N末端保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし、好ましくは、この固体支持体を洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーは除去される。次いで、上記固体支持体は、上記酸不安定N末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理される。一旦、脱保護が実施されると、上記固体支持体は洗浄されて、上記脱保護試薬は除去される。洗浄後、第2のPNAモノマーが、上記第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合される。この方法によれば、上記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載は、1グラムあたり0.08mmol以上である。上記に記載の方法とは異なり、この脱保護ステップは迅速に実施されることは要求されない。なぜなら、N末端アミンはプロトン化され、そしてそれによって第1のPNAシントンの環化および脱離を引き起こし得ないからである。
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体結合PNAダイマーを形成するためのなお別の方法に関する。この方法は、第1のPNAモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このPNAモノマーは、酸不安定N末端保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし、好ましくは、この固体支持体を洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーは除去される。次いで、上記固体支持体は、上記酸不安定N末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理される。一旦、脱保護が実施されると、上記固体支持体は洗浄されて、上記脱保護試薬は除去される。洗浄後、第2のPNAモノマーが、上記第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合される。この方法によれば、上記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載は、1グラムあたり0.08mmol以上である。上記に記載の方法とは異なり、この脱保護ステップは迅速に実施されることは要求されない。なぜなら、N末端アミンはプロトン化され、そしてそれによって第1のPNAシントンの環化および脱離を引き起こし得ないからである。
上記第1および第2のPNAモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むt−boc/Z保護PNAモノマーであり得る。上記第1および第2のPNAモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むMmt/Bhoc保護PNAモノマーであり得る。上記第1のPNAモノマーはMmt/Bhoc保護PNAモノマーであり得、そして上記第2のPNAモノマーはFmoc/Bhoc保護PNAモノマーであり得る。
上記第1および第2のPNAモノマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から独立に選択され得る。
この方法によれば、上記第1のPNAモノマーがMmt/Bhoc保護PNAモノマーである場合、そして上記脱保護試薬は、有機溶媒中の約1〜約5%(v/v)のジクロロ酢酸を含む溶液であり得る。例えば、上記脱保護試薬は、ジクロロメタン(DCM)中の約2%のジクロロ酢酸(DCA)であり得る。
この方法によれば、上記固体支持体は、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される立体的に妨害された固体支持体であり得る。上記固体支持体はまた、Fmoc−PAL−PEG−PS、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択され得る。
この方法によれば、上記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載は、1グラムあたり約0.1mmol〜1グラムあたり約1.2mmolの範囲内であり得る。上記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載は、1グラムあたり約0.12mmol〜1グラムあたり約0.35mmolの範囲内であり得る。
(f)PNA C末端酸オリゴマー)
なお別の実施形態では、本発明は、C末端PNAサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、PNA C末端酸オリゴマーに関する。例えば、この蛍光標識は、色素1または色素2であり得る。例えば、上記クエンチャーはダブシルであり得る。上記標識は、N末端アミンへを含む、PNAオリゴマーのN末端サブユニットに連結され得る。
なお別の実施形態では、本発明は、C末端PNAサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、PNA C末端酸オリゴマーに関する。例えば、この蛍光標識は、色素1または色素2であり得る。例えば、上記クエンチャーはダブシルであり得る。上記標識は、N末端アミンへを含む、PNAオリゴマーのN末端サブユニットに連結され得る。
このPNAオリゴマーは、長さが10以下のPNAサブユニットであり得る。このような短いオリゴマーは、ライブラリーアプローチによる連結/縮合を用いて細長いPNAオリゴマーおよびPNAキメラの調製のために便利に用いられ得る。例えば、このPNAオリゴマーは、長さが約3〜約8のサブユニットであり得るか、または長さが約4〜約6のサブユニットであり得る。このPNAオリゴマーは、長さが4のサブユニットであり得る。このPNAオリゴマーは、長さが5のサブユニットであり得る。
このPNAオリゴマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択され得る。
(g)PNA C末端酸オリゴマーのライブラリー)
なお別の実施形態では、本発明は、PNA C末端酸オリゴマーのライブラリーに関する。このライブラリーの各々のPNA C末端酸オリゴマーは、核酸塩基配列、C末端PNAサブユニット(グリシンまたはリジンのようなアミノ酸ではない)および蛍光標識またはクエンチャー部分を含む。PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーは、制限されずに、N末端アミンへを含む、N末端サブユニットに連結され得る。このライブラリーの各PNAオリゴマーは、このライブラリーのその他のPNAオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる。このライブラリーのPNAオリゴマーの各々の核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択され得る。
なお別の実施形態では、本発明は、PNA C末端酸オリゴマーのライブラリーに関する。このライブラリーの各々のPNA C末端酸オリゴマーは、核酸塩基配列、C末端PNAサブユニット(グリシンまたはリジンのようなアミノ酸ではない)および蛍光標識またはクエンチャー部分を含む。PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーは、制限されずに、N末端アミンへを含む、N末端サブユニットに連結され得る。このライブラリーの各PNAオリゴマーは、このライブラリーのその他のPNAオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる。このライブラリーのPNAオリゴマーの各々の核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択され得る。
上記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々は、同じ数のPNAサブユニットを、しかし、これは限定ではないことを条件に含み得る。ライブラリーのPNAオリゴマーは、異なる数のPNAサブユニットを含み得る。例えば、上記ライブラリーは、ライブラリーの少なくとも1つのその他のPNAオリゴマーと比較したとき異なる数のPNAサブユニットを有する少なくとも1のPNAオリゴマーを含み得る。このライブラリーの各PNAオリゴマーは、約3〜約8のPNAサブユニットを含み得る。このライブラリーのPNAオリゴマーの各々は、約4〜約6のPNAサブユニットを含み得る。このライブラリーのPNAオリゴマーの各々は、5つのPNAサブユニットを含み得る。
PNA C末端酸オリゴマーのライブラリーは、それ自身がが、より大きなライブラリー内のセットであり得る。例えば、ライブラリーは、3つ以上のセットのオリゴマーブロックを含み得、ここで、少なくとも2つのセットは、2つ以上の異なる標識が各セットのオリゴマーブロックを独立に検出可能にするように、標識の性質を除いて実質的に同一であり得る。この2つ以上の独立して検出可能なオリゴマーブロックのセットは、末端オリゴマーブロックまたは縮合オリゴマーブロックのセットであり得、例えば、2セットのPNA C末端酸を含み、ここで、各セットは、異なる蛍光発色団(例えば、色素1および色素2)で標識される。本質的に同一であるが、付着した独立に検出可能な標識の性質が異なる2セットのオリゴマーブロックを生成することにより、独立に検出可能な細長いオリゴマーの対を調製することが可能であり、共通オリゴマーブロックとの連結/縮合を通じて、自己指標性の独立に検出可能なオリゴマーを含む。自己指標により、本発明者らは、プローブが、標的配列へのハイブリダイゼーションに際し、検出可能な性質を変化し、そしてそれによって過剰のプローブの除去の必要性を減少するか、またはなくすることを意味する。独立に検出可能とは、本発明者らは、1つの標識を独立に、そして必要に応じて、その他の標識の存在下で決定することが可能であることを意味する。
例えば、独立に検出可能な標識を含む少なくとも2つのオリゴマーブロックは、例えば、クエンチャー部分で標識される同じオリゴマーブロックに連結され得る。次いで、独立に検出可能な自己指標性の細長いオリゴマーの対は、米国公開出願2003−0077608およびPCT公開出願WO02/072865に記載のようなSNP遺伝子型決定アッセイを実施するためのプローブとして用いられ得る。但し、この反応によって生成されるPNAオリゴマーは、ネイティブPNAオリゴマーであり得る。
アクセプターまたはクエンチャー部分が、連結/縮合されるオリゴマーブロックの1つに存在しない場合、そのときは、細長いオリゴマーは、単一標識をもつオリゴマーであり得る。標識が、連結/縮合されるオリゴマーブロックのいずれかに存在しない場合、そのときは、この細長いオリゴマーは、例えば、ブロッキングプローブ(例えば、米国特許第6,110,676号を参照)として用いられ、または捕獲プローブとして用いられ得る非標識オリゴマーであり得る。
オリゴマーブロックの1つ以上のセットまたはサブセットはまた、必要に応じて、オリゴマーブロックの末端またはその内部の位置でオリゴマーブロックに連結された保護または非保護官能基を含み得る。これに関し、オリゴマーブロックは、実施者の望み、および利用可能な資源に依存して連結前または連結後いずれかに標識され得る。この官能基はまた、オリゴマーブロックまたは形成された細長いオリゴマーを表面に付着するために用いられ得る。
従って、別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも2つのセットのPNAオリゴマーを含むライブラリーに関し、ここで、各セットのPNAオリゴマーは、主に、蛍光標識の性質において、その他のセットのそれとは異なる。このようなPNA C末端オリゴマーは、米国公開出願2003−0077608およびPCT公開出願WO02/072865に記載のようなSNP遺伝子型決定アッセイのためのプローブまたはプローブのセットを生成するための連結/縮合反応で、但し、この反応で生成されるPNAオリゴマーはネイティブPNAオリゴマーであり得ることを条件に用いられ得る。
本願発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
固体支持体組成物であって:
a)酸を形成する切断可能なリンカー;および
b)PNAダイマーであって、該切断可能なリンカーにより該固体支持体に切断可能に連結されたN末端の塩基不安定性保護基を含むPNAダイマーを含み、ここで、該固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、組成物。
(項目2)
前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、項目2に記載の組成物。
(項目4)
前記固体支持体が、PAL−PEG−PS(商標)、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記PNAダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、項目1または2に記載の組成物。
(項目6)
前記PNAダイマーが、Fmoc(Bhoc)モノマーから形成される、項目1または2に記載の組成物。
(項目7)
前記固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、項目1または2に記載の組成物。
(項目8)
前記固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、項目1または2に記載の組成物。
(項目9)
前記固体支持体が、2つ以上の異なる支持体結合PNAダイマーを含むアレイである、項目1または2に記載の組成物。
(項目10)
少なくとも2つの固体支持体を含むライブラリーであって、ここで、該少なくとも2つの固体支持体の各々が:
a)酸を形成する切断可能なリンカー;および
b)PNAダイマーであって:(i)該酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能に連結され;かつ(ii)該ライブラリーの少なくとも2つの固体支持体の任意のもう一方に連結されているPNAダイマーとは核酸塩基配列が異なるPNAダイマー
を含む、ライブラリー。
(項目11)
前記ライブラリーが、少なくとも16個の固体支持体を含み、各々の支持体が、少なくとも16個の可能なPNAダイマーのセットから選択されたPNAダイマーを含み、該セットの各々のPNAダイマーが、該セットの他のPNAダイマーすべてとは、少なくとも4つの異なる核酸塩基の少なくとも1つが異なる、項目10に記載のライブラリー。
(項目12)
前記少なくとも4つの異なる核酸塩基の各々が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、項目11に記載のライブラリー。
(項目13)
前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、項目10に記載のライブラリー。
(項目14)
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、項目13に記載のライブラリー。
(項目15)
前記固体支持体が、PAL−PEG−PS、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、項目10に記載のライブラリー。
(項目16)
前記PNAダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目17)
前記PNAダイマーのC末端サブユニットが、前記切断可能なリンカーに連結される、項目16に記載のライブラリー。
(項目18)
前記PNAダイマーが、Fmoc(Bhoc)保護PNAモノマーから形成される、項目13に記載のライブラリー。
(項目19)
前記PNAダイマーが、t−boc/Z保護PNAモノマーから形成される、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目20)
前記PNAダイマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーから形成される、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目21)
前記PNAダイマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーおよびFmoc(Bhoc)保護PNAモノマーの両方から形成される、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目22)
前記ライブラリーの少なくとも1つの固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目23)
前記ライブラリーの固体支持体の少なくとも2分の1上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目24)
前記ライブラリーの固体支持体のすべての上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目25)
前記ライブラリーの各々の固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、項目24に記載のライブラリー。
(項目26)
前記ライブラリーの各々の固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、項目24に記載のライブラリー。
(項目27)
前記支持体のライブラリーが、整列されてアレイを生成する、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目28)
支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法であって:
a)第1のPNAモノマーを、立体的に妨害された酸を形成する切断可能なリンカーを含む立体的に妨害された固体支持体に結合する工程であって、ここで、該PNAモノマーが、N末端の塩基不安定アミン保護基を含む工程;
b)該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーを除去する工程;
c)該固体支持体を、約1分間〜約2分間の間、該支持体に結合した第1のPNAモノマーから該塩基不安定N末端アミン保護基を実質的に除去するが、該支持体から第1のPNAモノマーの50%より多い環化および除去を許容しない脱保護試薬で処理する工程;
d)該固体支持体を洗浄する工程であって、該脱保護試薬を除去する工程;および
e)工程(c)および(d)を実施した後、実用的である限りすぐに、第2のPNAモノマーを、該第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合する工程、
を包含する、方法。
(項目29)
前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むFmoc(Bhoc)PNAモノマーである、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記第1および第2のPNAモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から独立に選択される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記N末端の塩基不安定保護基が、Fmocである、項目28に記載の方法。
(項目32)
前記脱保護試薬が、有機溶媒中約15〜約25%のピペリジンを含む溶液である、項目28に記載の方法。
(項目33)
前記脱保護試薬が、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%ピペリジンである、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記脱保護試薬が、NMP中に約0.2%〜約4%(v/v)DBUを含む溶液である、項目28に記載の方法。
(項目35)
前記脱保護試薬が、NMP中の約2%DBUである、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、項目28に記載の方法。
(項目37)
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド(トリチル−Cl)樹脂である、項目28に記載の方法。
(項目38)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、項目28に記載の方法。
(項目39)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、項目28に記載の方法。
(項目40)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、項目28に記載の方法。
(項目41)
支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法であって:
a)第1のPNAモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程であって、ここで、該PNAモノマーが、酸不安定N末端保護基を含む工程;
b)該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーを除去する工程;
c)該固体支持体を、該酸不安定N末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理する工程;
d)該固体支持体を洗浄して該脱保護試薬を除去する工程;および
e)第2のPNAモノマーを、該第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合する工程、を包含し、
ここで、該固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、方法。
(項目42)
前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むt−boc/Z保護PNAモノマーである、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むMmt/Bhoc保護PNAモノマーである、項目41に記載の方法。
(項目44)
前記第1のPNAモノマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーであり、そして前記第2のPNAモノマーが、Fmoc/Bhoc保護PNAモノマーである、項目41に記載の方法。
(項目45)
前記第1および第2のPNAモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から独立に選択される、項目41に記載の方法。
(項目46)
前記第1のPNAモノマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーであり、そして前記脱保護試薬が、有機溶媒中の約1〜約5%(v/v)のジクロロ酢酸を含む溶液である、項目41に記載の方法。
(項目47)
前記脱保護試薬が、ジクロロメタン(DCM)中の約2%のジクロロ酢酸である、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される立体的に妨害された固体支持体である、項目41に記載の方法。
(項目49)
前記固体支持体が、Fmoc−PAL−PEG−PS、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、項目41に記載の方法。
(項目50)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.1mmol〜1グラムあたり約1.2mmolの範囲内にある、項目41に記載の方法。
(項目51)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.12mmol〜1グラムあたり約0.35mmolの範囲内にある、項目41に記載の方法。
(項目52)
C末端PNAサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、PNA C末端酸オリゴマー。
(項目53)
前記蛍光標識が、色素1または色素2である、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目54)
前記クエンチャー成分が、ダブシルである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目55)
前記PNAオリゴマーは、長さが10 PNAサブユニット以下である、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目56)
前記PNAオリゴマーは、長さが約3〜約8サブユニットである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目57)
前記PNAオリゴマーは、長さが約4〜約6サブユニットである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目58)
前記PNAオリゴマーは、長さが4サブユニットである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目59)
前記PNAオリゴマーは、長さが5サブユニットである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目60)
前記標識が、前記PNAオリゴマーのN末端サブユニットに連結される、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目61)
前記標識が、前記PNAオリゴマーのN末端アミンに連結される、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目62)
前記オリゴマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目63)
PNA C末端酸オリゴマーのライブラリーであって、該ライブラリーの各々のPNAオリゴマーが:
a)核酸塩基配列;
b)C末端PNAサブユニット;および
c)蛍光標識またはクエンチャー成分;
を含み、
ここで、PNAオリゴマーの各々が、該ライブラリーの他のPNAオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる、ライブラリー。
(項目64)
前記PNAオリゴマーの各々の核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、項目63に記載のライブラリー。
(項目65)
前記PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、N末端サブユニットに連結されている、項目63に記載のライブラリー。
(項目66)
前記PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、N末端アミンに連結されている、項目63に記載のライブラリー。
(項目67)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、同じ数のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目68)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの少なくとも1つが、該ライブラリーの他の少なくとも1つのPNAオリゴマーと比較した場合に異なる数のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目69)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、約3〜約8個のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目70)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、約4〜約6個のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目71)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、4個のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目72)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、5個のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目73)
前記ライブラリーが、少なくとも2つのセットのPNA C末端酸オリゴマーを含み、ここで、該各セットのPNAオリゴマーが、主に、蛍光標識の性質において、他のセットのPNAオリゴマーと異なる、項目63に記載のライブラリー。
(項目74)
前記第1のセットのPNA C末端酸オリゴマーが、色素1で標識され、そして前記第2のセットのPNA C末端酸オリゴマーが、色素2で標識される、項目73に記載のライブラリー。
本願発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
固体支持体組成物であって:
a)酸を形成する切断可能なリンカー;および
b)PNAダイマーであって、該切断可能なリンカーにより該固体支持体に切断可能に連結されたN末端の塩基不安定性保護基を含むPNAダイマーを含み、ここで、該固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、組成物。
(項目2)
前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、項目2に記載の組成物。
(項目4)
前記固体支持体が、PAL−PEG−PS(商標)、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記PNAダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、項目1または2に記載の組成物。
(項目6)
前記PNAダイマーが、Fmoc(Bhoc)モノマーから形成される、項目1または2に記載の組成物。
(項目7)
前記固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、項目1または2に記載の組成物。
(項目8)
前記固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、項目1または2に記載の組成物。
(項目9)
前記固体支持体が、2つ以上の異なる支持体結合PNAダイマーを含むアレイである、項目1または2に記載の組成物。
(項目10)
少なくとも2つの固体支持体を含むライブラリーであって、ここで、該少なくとも2つの固体支持体の各々が:
a)酸を形成する切断可能なリンカー;および
b)PNAダイマーであって:(i)該酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能に連結され;かつ(ii)該ライブラリーの少なくとも2つの固体支持体の任意のもう一方に連結されているPNAダイマーとは核酸塩基配列が異なるPNAダイマー
を含む、ライブラリー。
(項目11)
前記ライブラリーが、少なくとも16個の固体支持体を含み、各々の支持体が、少なくとも16個の可能なPNAダイマーのセットから選択されたPNAダイマーを含み、該セットの各々のPNAダイマーが、該セットの他のPNAダイマーすべてとは、少なくとも4つの異なる核酸塩基の少なくとも1つが異なる、項目10に記載のライブラリー。
(項目12)
前記少なくとも4つの異なる核酸塩基の各々が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、項目11に記載のライブラリー。
(項目13)
前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、項目10に記載のライブラリー。
(項目14)
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、項目13に記載のライブラリー。
(項目15)
前記固体支持体が、PAL−PEG−PS、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、項目10に記載のライブラリー。
(項目16)
前記PNAダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目17)
前記PNAダイマーのC末端サブユニットが、前記切断可能なリンカーに連結される、項目16に記載のライブラリー。
(項目18)
前記PNAダイマーが、Fmoc(Bhoc)保護PNAモノマーから形成される、項目13に記載のライブラリー。
(項目19)
前記PNAダイマーが、t−boc/Z保護PNAモノマーから形成される、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目20)
前記PNAダイマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーから形成される、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目21)
前記PNAダイマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーおよびFmoc(Bhoc)保護PNAモノマーの両方から形成される、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目22)
前記ライブラリーの少なくとも1つの固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目23)
前記ライブラリーの固体支持体の少なくとも2分の1上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目24)
前記ライブラリーの固体支持体のすべての上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目25)
前記ライブラリーの各々の固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、項目24に記載のライブラリー。
(項目26)
前記ライブラリーの各々の固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、項目24に記載のライブラリー。
(項目27)
前記支持体のライブラリーが、整列されてアレイを生成する、項目10または13に記載のライブラリー。
(項目28)
支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法であって:
a)第1のPNAモノマーを、立体的に妨害された酸を形成する切断可能なリンカーを含む立体的に妨害された固体支持体に結合する工程であって、ここで、該PNAモノマーが、N末端の塩基不安定アミン保護基を含む工程;
b)該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーを除去する工程;
c)該固体支持体を、約1分間〜約2分間の間、該支持体に結合した第1のPNAモノマーから該塩基不安定N末端アミン保護基を実質的に除去するが、該支持体から第1のPNAモノマーの50%より多い環化および除去を許容しない脱保護試薬で処理する工程;
d)該固体支持体を洗浄する工程であって、該脱保護試薬を除去する工程;および
e)工程(c)および(d)を実施した後、実用的である限りすぐに、第2のPNAモノマーを、該第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合する工程、
を包含する、方法。
(項目29)
前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むFmoc(Bhoc)PNAモノマーである、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記第1および第2のPNAモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から独立に選択される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記N末端の塩基不安定保護基が、Fmocである、項目28に記載の方法。
(項目32)
前記脱保護試薬が、有機溶媒中約15〜約25%のピペリジンを含む溶液である、項目28に記載の方法。
(項目33)
前記脱保護試薬が、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%ピペリジンである、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記脱保護試薬が、NMP中に約0.2%〜約4%(v/v)DBUを含む溶液である、項目28に記載の方法。
(項目35)
前記脱保護試薬が、NMP中の約2%DBUである、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、項目28に記載の方法。
(項目37)
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド(トリチル−Cl)樹脂である、項目28に記載の方法。
(項目38)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、項目28に記載の方法。
(項目39)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、項目28に記載の方法。
(項目40)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、項目28に記載の方法。
(項目41)
支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法であって:
a)第1のPNAモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程であって、ここで、該PNAモノマーが、酸不安定N末端保護基を含む工程;
b)該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーを除去する工程;
c)該固体支持体を、該酸不安定N末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理する工程;
d)該固体支持体を洗浄して該脱保護試薬を除去する工程;および
e)第2のPNAモノマーを、該第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合する工程、を包含し、
ここで、該固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、方法。
(項目42)
前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むt−boc/Z保護PNAモノマーである、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むMmt/Bhoc保護PNAモノマーである、項目41に記載の方法。
(項目44)
前記第1のPNAモノマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーであり、そして前記第2のPNAモノマーが、Fmoc/Bhoc保護PNAモノマーである、項目41に記載の方法。
(項目45)
前記第1および第2のPNAモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から独立に選択される、項目41に記載の方法。
(項目46)
前記第1のPNAモノマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーであり、そして前記脱保護試薬が、有機溶媒中の約1〜約5%(v/v)のジクロロ酢酸を含む溶液である、項目41に記載の方法。
(項目47)
前記脱保護試薬が、ジクロロメタン(DCM)中の約2%のジクロロ酢酸である、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される立体的に妨害された固体支持体である、項目41に記載の方法。
(項目49)
前記固体支持体が、Fmoc−PAL−PEG−PS、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、項目41に記載の方法。
(項目50)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.1mmol〜1グラムあたり約1.2mmolの範囲内にある、項目41に記載の方法。
(項目51)
前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.12mmol〜1グラムあたり約0.35mmolの範囲内にある、項目41に記載の方法。
(項目52)
C末端PNAサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、PNA C末端酸オリゴマー。
(項目53)
前記蛍光標識が、色素1または色素2である、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目54)
前記クエンチャー成分が、ダブシルである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目55)
前記PNAオリゴマーは、長さが10 PNAサブユニット以下である、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目56)
前記PNAオリゴマーは、長さが約3〜約8サブユニットである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目57)
前記PNAオリゴマーは、長さが約4〜約6サブユニットである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目58)
前記PNAオリゴマーは、長さが4サブユニットである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目59)
前記PNAオリゴマーは、長さが5サブユニットである、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目60)
前記標識が、前記PNAオリゴマーのN末端サブユニットに連結される、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目61)
前記標識が、前記PNAオリゴマーのN末端アミンに連結される、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目62)
前記オリゴマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、項目52に記載のPNAオリゴマー。
(項目63)
PNA C末端酸オリゴマーのライブラリーであって、該ライブラリーの各々のPNAオリゴマーが:
a)核酸塩基配列;
b)C末端PNAサブユニット;および
c)蛍光標識またはクエンチャー成分;
を含み、
ここで、PNAオリゴマーの各々が、該ライブラリーの他のPNAオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる、ライブラリー。
(項目64)
前記PNAオリゴマーの各々の核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、項目63に記載のライブラリー。
(項目65)
前記PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、N末端サブユニットに連結されている、項目63に記載のライブラリー。
(項目66)
前記PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、N末端アミンに連結されている、項目63に記載のライブラリー。
(項目67)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、同じ数のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目68)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの少なくとも1つが、該ライブラリーの他の少なくとも1つのPNAオリゴマーと比較した場合に異なる数のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目69)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、約3〜約8個のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目70)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、約4〜約6個のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目71)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、4個のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目72)
前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、5個のPNAサブユニットを含む、項目63に記載のライブラリー。
(項目73)
前記ライブラリーが、少なくとも2つのセットのPNA C末端酸オリゴマーを含み、ここで、該各セットのPNAオリゴマーが、主に、蛍光標識の性質において、他のセットのPNAオリゴマーと異なる、項目63に記載のライブラリー。
(項目74)
前記第1のセットのPNA C末端酸オリゴマーが、色素1で標識され、そして前記第2のセットのPNA C末端酸オリゴマーが、色素2で標識される、項目73に記載のライブラリー。
本発明の前述する実施形態を記載したが、以下の実施例は、例示であることが意図され、いかなる方法においても制限的であることは意図されない。
(本発明を実施するための様式)
本発明を、ここで、いかなる方法においても制限的であることは意図されない以下の実施例により説明する。
(本発明を実施するための様式)
本発明を、ここで、いかなる方法においても制限的であることは意図されない以下の実施例により説明する。
(実施例1;PNAダイマー−樹脂(固体支持体)のライブラリーの合成)
I.トリチル−Cl樹脂上の第1のPNAモノマーの積載
試薬:Fmoc(Bhoc)−PNAモノマー(Fmoc−A(Bhoc)−OH:P/N GEN063014、Fmoc−C(Bhoc)−OH:P/N GEN063015、Fmoc−G(Bhoc)−OH:P/N GEN063016、Fmoc−T−OH:P/N GEN063017、1−メチル−2−ピロリドン(NMP):P/N400580、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF):P/N400143、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA):P/N GEN0750000およびO−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU):P/N GEN063080はすべて、Applied Biosystems、Foster City、CAから得た。メタノール:P/N 015−4およびアセトニトリル:P/N 230−4は、Burdick&Jackson(Muskegon、Michigan)から得た。トリチル−Cl樹脂:P/N 01−64−0074は、Novabiochem(San Diego、CA)から5gバッチで得た。乾燥溶媒を、トリチルクロライド樹脂積載反応に用いた。無水ジクロロメタン(CH2Cl2):P/N 27,099−7、NMPは、4Åの分子篩上で一晩貯蔵した。溶媒(DMF、NMPおよびアセトニトリル)を樹脂洗浄のために用い、そしてその他の反応は、試薬グレードであった。
I.トリチル−Cl樹脂上の第1のPNAモノマーの積載
試薬:Fmoc(Bhoc)−PNAモノマー(Fmoc−A(Bhoc)−OH:P/N GEN063014、Fmoc−C(Bhoc)−OH:P/N GEN063015、Fmoc−G(Bhoc)−OH:P/N GEN063016、Fmoc−T−OH:P/N GEN063017、1−メチル−2−ピロリドン(NMP):P/N400580、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF):P/N400143、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA):P/N GEN0750000およびO−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU):P/N GEN063080はすべて、Applied Biosystems、Foster City、CAから得た。メタノール:P/N 015−4およびアセトニトリル:P/N 230−4は、Burdick&Jackson(Muskegon、Michigan)から得た。トリチル−Cl樹脂:P/N 01−64−0074は、Novabiochem(San Diego、CA)から5gバッチで得た。乾燥溶媒を、トリチルクロライド樹脂積載反応に用いた。無水ジクロロメタン(CH2Cl2):P/N 27,099−7、NMPは、4Åの分子篩上で一晩貯蔵した。溶媒(DMF、NMPおよびアセトニトリル)を樹脂洗浄のために用い、そしてその他の反応は、試薬グレードであった。
手順:Fmoc−A(Bhoc)−OH、Fmoc−G(Bhoc)−OHおよびFmoc−T−OHモノマー(それぞれ、3.62、3.69および2.53g、4.98mmol)および2.63mLのDIPEA(約3×4.98mmol)を、15mLの乾燥4:1CH2Cl2−NMP(0.332M)中に溶解した。Fmoc−C(Bhoc)−OHモノマー(3.49g、4.98mmol)および2.63mLのDIPEA(約3×4.98mmol)を、最初、12mLのNMP中に溶解し、そして次に、容量を、乾燥CH2Cl2の添加により15mLに調節した。
モノマー溶液を、次いで、50mLのプラスチックチューブ中の乾燥トリチル−Cl樹脂(3g/反応、1.66mmol/g)に添加し、キャップをし、そして室温で0.5時間振とうし、そのとき、樹脂が粘性のゲルとなった。この時点で、別の3mLの乾燥CH2Cl2を各反応混合物に添加し、そして反応をさらに2.5時間継続した。(最近の研究は、この反応は、本質的に45分以内に終了し、そして樹脂の積載能力は、反応時間を延長することによりもはや増加しないことを示した)。樹脂を、次いで濾過し、そしてNMPで2回洗浄し(各々約15ml)、次いで、15mLのCH2Cl2−MeOH−DIPEA(17:2:1、v/v)で迅速に洗浄し、もそしてNMPで2〜3回洗浄した。最終の洗浄をアセトニトリルを用いて行い、そして次に、樹脂を減圧で乾燥した。
樹脂積載は、Fmocカウント実験を行いながら、ピペリジン処理(1時間)の前に少なくとも2時間の間THFで樹脂を膨潤することにより算出した。代表的なFmocカウント実験では、3〜5mgのダイマー−樹脂を、キャップをした1mLの微量遠心分離チューブ中、100μLのTHFで2時間処理し、次いで、200μLのDMF中20%(v/v)ピペリジンを添加した。この反応混合物を、次いで、ボルテックスし、そして1時間静置した。この反応混合物の容量を、メタノールの添加により1mLに調節し、そして完全に混合した。上清液をメタノールで20倍希釈し、そしてUV吸光度を、301nmで記録した(バックグラウンド補正はメタノールで行った)。Fmoc切断に際し放出された発色団のモル吸光係数(301nmでε=7800M−1Cm−1)を、樹脂の積載能力を算出するために用いた。積載決定の結果は表2に見出される。
注記:PNAモノマー樹脂は合成の1または2日以内に用いられるべきであり、そして使用まで4℃で貯蔵されるべきである。
注記:PNAモノマー樹脂は合成の1または2日以内に用いられるべきであり、そして使用まで4℃で貯蔵されるべきである。
上記の実験Iから得られた約0.5gの各乾燥樹脂を、NMPで少なくとも2〜3時間膨潤した。次いで、Fmoc基を、この樹脂を1分間、5mLのDMF中の20%(v/v)ピペラジンで処理することにより除去した。Fmoc脱保護が進行中であった間に、NMP中のPNAモノマー(4当量)の溶液を、DIPEA(9当量)およびHATU(3.8当量)の添加により活性化した。最終のモノマー濃度は0.17Mであった。次いで、この樹脂を、さらに1分間以内にNMP(3×10〜15mL)で洗浄し、活性化PNA−モノママーを添加した。この結合は15分間行い、そして次に、樹脂を、減圧下の乾燥の前にNMPおよびアセトニトリルで洗浄した。次いで、樹脂積載能力をFmoc決定により算出した。すべての可能な16ダイマー−樹脂(4つの核酸塩基A、C、G&Tに基づく)を、上記のプロトコールを用いて合成した。PNAダイマー−樹脂の積載能力(表3)は、0.12〜0.35mmole/gの範囲であった。この積載は、しばしば、従来のFmoc−XAL−PEG−PS樹脂で用いられる。
注記:1)切断可能なリンカーがC末端酸を形成する;および2)N−α−アミンの脱保護が塩基性条件下で実施されるときはいつも、第2のPNAオリゴマーの結合反応は、N末端保護基の除去の後、可能な限りすばやく実施されるべきである。なぜなら、環化および脱離反応(図3を参照のこと)が生じ得、それによって、第1のモノマーの実質的部分が、固体支持体から除去され、それによって、樹脂の積載を効率的に低下するからである。
調製されたダイマー−樹脂は、任意のその他の従来のトリチル樹脂(4℃)のように貯蔵されるとき、安定であるようである。このような条件下で貯蔵された樹脂の積載能力は、少なくとも4ヶ月の間一定のままであった。ダイマー−樹脂の安定性を試験するために、4ヶ月の間4℃で貯蔵された樹脂のサンプルを、DMFで洗浄し、そしてFmoc決定により(上記で提示された手順を参照のこと)積載能力をチェックする前に乾燥した。これらの洗浄は、任意のUV活性化合物はなく、それによって、それらは、これら条件下では、実質的に分解しないことを示した。
表4は、上記のように調製されたダイマー−樹脂を用いてアセンブルされるべき第1のPNAオリゴマーの中であった4つのPNAペンタマーのついての合成データを識別かつ提供する。合成は、Expedite PNA合成機上で実施された。色素1および色素2で標識されたPNAペンタマーは、ここでは、通常基準でダイマー−樹脂を用いてアセンブルされた。図1は、このような合成から得られたPNAオリゴマー、色素1−TGG−TC−OHの粗製サンプルの代表的な分析RP−HPLCプロフィールを示す。
(I.モノメトキシトリチル(Mmt)/Bhocモノマーの調製)
市販され、入手可能なFmoc(Bhoc)PNAモノマーを、Mmt/Bhocモノマーに、図2に示されるような反応を用いてN末端アミン保護基をシャッフルすることにより変換した。反応は単純で、そして4つすべての核酸塩基(A/T/G/C)に対する収率は満足すべきものであった(68〜96%)。
N末端アミン保護基シャッフルを実施するために、以下のさらなる試薬を用いた(注記される場合を除き、先に識別された試薬が用いられた)。ヘキサン:P/N AH216−4は、Burdick & Jacksonから得た。ピペリジン:P/N 10,409−4、4−メトキシトリチルクロライド(Mmt−Cl):P/N 12920−8およびニンヒドリン:P/N 60−127は、Aldrich chemical companyから得た。酢酸エチル(EoOAc)は、Mallinckrodt(Paris、Kentucky)から得た。
一般に、このFmoc(Bhoc)−PNAモノマー(1.38mmol)を、42mLのDCM−DMF(1:1、v/v)中に溶解し、次いで、ピペリジンを添加した(818μL、8.28mmol)。8分後、トリエチルアミン(Et3N;2mL)およびMmt−Cl(1.276g、4.14mmol)をこの反応混合物に添加し、そして室温で18時間の間攪拌した。薄層クロマトグラフィー(TLC、シリカプレート、9:1 CH2Cl2−CH3OH+7滴のDIPEA/10mL)が、遊離の一級アミンの存在を示した場合(ニンヒドリンに活性、ベースラインスポット)、別のバッチのMmt−Cl(3g、9.73mmol)およびEt3N(2mL)を添加し、そしてさらに3時間攪拌した。一般に、次のTLCは、この一級アミンの完全な消費を示した。次いで、揮発性成分を、ロータリー−蒸発により除去し、そして黄色の泡を、最小量のCH2Cl2中に溶解した。このように得られた溶液を、次いで、シリカゲルのパッド(2(長さ)×5(直径)インチ、3:2 EtOAc−ヘキサン+0.2%のEt3Nでパック)上に載せ、そして最初に3:2 EtOAc−ヘキサン(900mL)で洗浄し、次いで、CH2Cl2中20%CH3OH+0.2%Et3N(600mL)で溶出した。溶媒の蒸発に際し、純粋な生成物が68〜96%の収率で得られた。
(II.副反応の分析)
Mmt基は、樹脂上に第1のモノマーを係留した後、ジクロロメタン中の2%のジクロロ酢酸(DCA)の溶液で除去され得ることが理論付けられた。この脱保護戦略は、ケトピペラジンを形成する環化および脱離反応(図3)を行なわない、プロトン化アミン基を生成することが意図された。Bhoc基は、Mmt基除去条件下では不安定であることが知られているので、核酸塩基の遊離の環外アミンがこれらのMmt脱保護条件で生成された場合、分岐反応が生じる可能性があった。
Mmt基は、樹脂上に第1のモノマーを係留した後、ジクロロメタン中の2%のジクロロ酢酸(DCA)の溶液で除去され得ることが理論付けられた。この脱保護戦略は、ケトピペラジンを形成する環化および脱離反応(図3)を行なわない、プロトン化アミン基を生成することが意図された。Bhoc基は、Mmt基除去条件下では不安定であることが知られているので、核酸塩基の遊離の環外アミンがこれらのMmt脱保護条件で生成された場合、分岐反応が生じる可能性があった。
この可能な副反応を試験するために、Fmoc(Bhoc)シトシンモノマーが、標準的なカップリング条件を用いてXAL−PEG−PS樹脂に係留され、そして次に、DCA溶液で3分間処理されるモデル実験を実施した。次いで、この樹脂を洗浄し、そして合成を、市販され入手可能なExpedite核酸合成機中で(市販され入手可能なFmoc(Bhoc)モノマーおよびプロトコールを用いて)継続し、配列GATCのPNAオリゴマーをアセンブルした。次いで、PNAを、標準的な手順を用いて樹脂から切断し、そして粗製オリゴマーを、MALDI−TOF MSにより分析した。
質量データは、生成物GATCおよびアセチル化生成物GATCAcの存在を示した。この結果は予想された。なぜなら、このBhoc脱保護シトシンは、次のキャッピングステップ(単数または複数)でアセチル化されたからである。しかし、質量分析では、分岐オリゴマーは検出されなかった。これは、シトシンの環外アミンは、代表的なHATUカップリング下ではPNAモノマーを用いてアシル化するに十分求核性ではないことを示唆する。次いで、テトラマーを、28%水性NH3での処理により非アセチル化オリゴマーに首尾よく変換した。これは、質量分析計中の質量分析によって確認された。これらの結果から、Mmt/Bhocモノマーは、オリゴマー分岐に悩むことなくC末端酸を含むPNAオリゴマーを合成するために用いられ得たと結論付けられた。
(III.Mmt/Bhocモノマーを用いるPNA C末端酸オリゴマーの調製)
この決定がなされた後、図4に示されるように、2,6−ジクロロ−ベンゾイルクロライドを用いて、Mmt/Bhoc−Gモノマーを、Wang樹脂に係留した。このMmt基をジクロロメタン中のDCAの2%溶液を用いて切断した。この樹脂を洗浄し、そして次のモノマー(T、T、GおよびA)を、標準的なHATUカップリング条件を用いて結合した。DCA洗浄中にPNAモノマーは検出されず(TLC:UVおよびニンヒドリン試験);これは、最初の残基がDCA処理に際して固体支持体から切断されないことを示した。
この決定がなされた後、図4に示されるように、2,6−ジクロロ−ベンゾイルクロライドを用いて、Mmt/Bhoc−Gモノマーを、Wang樹脂に係留した。このMmt基をジクロロメタン中のDCAの2%溶液を用いて切断した。この樹脂を洗浄し、そして次のモノマー(T、T、GおよびA)を、標準的なHATUカップリング条件を用いて結合した。DCA洗浄中にPNAモノマーは検出されず(TLC:UVおよびニンヒドリン試験);これは、最初の残基がDCA処理に際して固体支持体から切断されないことを示した。
積載は高く(0.31mmol/g;最初のTのFmocカウントから得た)、そしてその他のカップリングの間を通じて同じに維持された。合成を終了するために、Boc保護色素1(図5)を、標準的な標識条件を用いてPNAオリゴマーのN末端に結合した。この樹脂を切断し、そして粗製生成物を、MALDI−TOF MSおよびHPLCにより分析した。この分析は、この生成物の効率的な形成(96%)を示した。キャッピングステップは、すべてのカップリングから脱離され、そして生成物の質に影響するようではないことに注目することが重要である。このプロセスはまた、NovaSyn−TGA樹脂を用いてもまた成功し(図6)、ここで、樹脂は、Wang樹脂とは、主に、PEGリンカーの存在下であることが異なる。これらプロセスは、実施例1で上記に記載されたようなPNAダイマー樹脂(固体支持体)のライブラリーを生成するために用いられ得る。
(IV.結果の要約)
− 樹脂上のMmt/Bhocモノマー積載は高く(1.20〜0.27mmol/g)、そしてPNA C末端酸オリゴマーの調製のために用いられ得る。
− 樹脂上のMmt/Bhocモノマー積載は高く(1.20〜0.27mmol/g)、そしてPNA C末端酸オリゴマーの調製のために用いられ得る。
− モノマー樹脂のMmt基の切断後、プロトン化アミンは、直後に結合される必要はない。
− キャッピング工程は、これらモノマーではなくされ、時間を減少する。
− 従来のPNA合成機の合成プロトコールを変更する必要はない。
− キャッピング工程は、これらモノマーではなくされ、時間を減少する。
− 従来のPNA合成機の合成プロトコールを変更する必要はない。
非保護色素1および色素2の構造は、図7に見出され得る。
(実施例4:ダイマー樹脂生成のための別の一般的手順)
モノマー樹脂(1〜5gスケール)の合成のための手順:
1)Fmoc/BhocPNAモノマー(1.46mmol、0.75当量)およびDIPEA(4.38mmol、2.25当量)を、NMP/DCM(10mL/5mL、すべて無水)中でモノマーが溶解するまで攪拌する*。モノマー濃度は0.1Mである。
2)樹脂**(1.5g、1.95mmol、1.00eq)をモノマー溶液に添加し;不活性雰囲気下で4時間攪拌する。
3)樹脂を濾過し、完全に混合しながら、3×15mLのNMPで洗浄する。
4)樹脂を、キャッピング溶液中(DCM/MeOH/DIPEA=17mL/2mL/1mL)で15分間攪拌する。
5)樹脂を濾過し、3×15mLのNMP、3×15mLのACNで各々完全に混合して洗浄する。
6)減圧下で樹脂を乾燥する。
モノマー樹脂(1〜5gスケール)の合成のための手順:
1)Fmoc/BhocPNAモノマー(1.46mmol、0.75当量)およびDIPEA(4.38mmol、2.25当量)を、NMP/DCM(10mL/5mL、すべて無水)中でモノマーが溶解するまで攪拌する*。モノマー濃度は0.1Mである。
2)樹脂**(1.5g、1.95mmol、1.00eq)をモノマー溶液に添加し;不活性雰囲気下で4時間攪拌する。
3)樹脂を濾過し、完全に混合しながら、3×15mLのNMPで洗浄する。
4)樹脂を、キャッピング溶液中(DCM/MeOH/DIPEA=17mL/2mL/1mL)で15分間攪拌する。
5)樹脂を濾過し、3×15mLのNMP、3×15mLのACNで各々完全に混合して洗浄する。
6)減圧下で樹脂を乾燥する。
ダイマー(1〜5gスケール)合成のための手順:
1)モノマー樹脂(0.49mmol、1.0g、1.00当量)を、5.0mLのNMPに3時間の間浸す。
2)DeFMOC溶液:NMP(5.0mL)中2.0%DBUを調製する。
3)モノマー(0.98mmol、2.00当量)、HATU(0.93mmol、1.90当量)、およびDIPEA(1.96mmol、4.0当量)を、10mLのNMP中で5〜10分攪拌することによりカップリング溶液を調製する。モノマー濃度は0.1Mである。
4)NMP中のモノマー樹脂にDeFMOC溶液を直接添加する。DBUの最終濃度は1.0%である;4分攪拌する。
5)ビーズを濾過し;3×15mLのNMPで攪拌しながら洗浄する(約4分要する)。6)樹脂にカップリング溶液を添加し、そして60分間攪拌する。
7)樹脂を濾過し、3×15mLのNMPで完全に攪拌して洗浄する。
8)15mLのPNAキャッピング溶液(Applied Biosystems、P/N GEN063102)を樹脂に添加し、30分間攪拌する。
9)樹脂を濾過し、3×15mLのNMP、3×15mLのACNで、各々完全に混合して洗浄する。
10)減圧下で樹脂を乾燥する。
1)モノマー樹脂(0.49mmol、1.0g、1.00当量)を、5.0mLのNMPに3時間の間浸す。
2)DeFMOC溶液:NMP(5.0mL)中2.0%DBUを調製する。
3)モノマー(0.98mmol、2.00当量)、HATU(0.93mmol、1.90当量)、およびDIPEA(1.96mmol、4.0当量)を、10mLのNMP中で5〜10分攪拌することによりカップリング溶液を調製する。モノマー濃度は0.1Mである。
4)NMP中のモノマー樹脂にDeFMOC溶液を直接添加する。DBUの最終濃度は1.0%である;4分攪拌する。
5)ビーズを濾過し;3×15mLのNMPで攪拌しながら洗浄する(約4分要する)。6)樹脂にカップリング溶液を添加し、そして60分間攪拌する。
7)樹脂を濾過し、3×15mLのNMPで完全に攪拌して洗浄する。
8)15mLのPNAキャッピング溶液(Applied Biosystems、P/N GEN063102)を樹脂に添加し、30分間攪拌する。
9)樹脂を濾過し、3×15mLのNMP、3×15mLのACNで、各々完全に混合して洗浄する。
10)減圧下で樹脂を乾燥する。
本発明の好ましい実施形態を記載したが、今や、これら概念を取り込むその他の実施形態が用いられ得ることは当業者に明らかとなる。従って、これら実施形態は、開示の実施形態に制限されるべきではなく、むしろ本発明の思想および範囲によってのみ制限されるべきであると考えられる。
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- 明細書中に記載の発明。
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US5071974A (en) * | 1986-10-31 | 1991-12-10 | Amoco Corporation | Compositions and methods for the synthesis of oligonucleotides having 5'-phosphorylated termini |
US5243038A (en) * | 1986-11-04 | 1993-09-07 | Protein Polymer Technologies, Inc. | Construction of synthetic DNA and its use in large polypeptide synthesis |
US5175209A (en) * | 1987-01-06 | 1992-12-29 | Baylor College Of Medicine | Porous wafer for segmented synthesis of biopolymers |
US4923901A (en) * | 1987-09-04 | 1990-05-08 | Millipore Corporation | Membranes with bound oligonucleotides and peptides |
US5278302A (en) * | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5218103A (en) * | 1988-05-26 | 1993-06-08 | University Patents, Inc. | Nucleoside thiophosphoramidites |
US5047524A (en) * | 1988-12-21 | 1991-09-10 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
US5262530A (en) * | 1988-12-21 | 1993-11-16 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
US5112962A (en) * | 1989-04-19 | 1992-05-12 | Northwestern University | Labile anchors for solid phase polynucleotide synthesis |
US5391723A (en) * | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US5143854A (en) * | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5164491A (en) * | 1989-06-15 | 1992-11-17 | Gilead Sciences | Large scale synthesis of oligonucleotides and their associated analogs |
US5204455A (en) * | 1989-06-15 | 1993-04-20 | Froehler Brian C | Monomethoxytrityl protected oligonucleotides bound to a solid support |
US5366860A (en) | 1989-09-29 | 1994-11-22 | Applied Biosystems, Inc. | Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination |
US5188934A (en) | 1989-11-14 | 1993-02-23 | Applied Biosystems, Inc. | 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
DK51092D0 (da) | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
US6228982B1 (en) | 1992-05-22 | 2001-05-08 | Benget Norden | Double-stranded peptide nucleic acids |
US5766855A (en) | 1991-05-24 | 1998-06-16 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity |
US5641625A (en) | 1992-05-22 | 1997-06-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids |
US5419966A (en) * | 1991-06-10 | 1995-05-30 | Microprobe Corporation | Solid support for synthesis of 3'-tailed oligonucleotides |
US5281701A (en) * | 1991-07-12 | 1994-01-25 | Applied Biosystems, Inc. | Process and compounds for RNA synthesis |
US5348868A (en) * | 1992-04-24 | 1994-09-20 | Beckman Instruments, Inc. | Methods and reagents for cleaving and deprotecting oligonucleotides |
GB9211979D0 (en) | 1992-06-05 | 1992-07-15 | Buchard Ole | Uses of nucleic acid analogues |
US5476925A (en) * | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
US5391667A (en) * | 1993-03-04 | 1995-02-21 | Isis Pharmaceuticals | Copolymers of N-vinyl-lactams suitable for oligomer solid phase synthesis |
US5527675A (en) | 1993-08-20 | 1996-06-18 | Millipore Corporation | Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues |
DE4331012A1 (de) | 1993-09-13 | 1995-03-16 | Bayer Ag | Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik |
DE4331011A1 (de) * | 1993-09-13 | 1995-03-16 | Bayer Ag | Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit C-Verzweigung für Therapie und Diagnostik |
GB2284209A (en) | 1993-11-25 | 1995-05-31 | Ole Buchardt | Nucleic acid analogue-induced transcription of RNA from a double-stranded DNA template |
US5446137B1 (en) * | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
DE4408533A1 (de) * | 1994-03-14 | 1995-09-28 | Hoechst Ag | PNA-Synthese unter Verwendung einer basenlabilen Amino-Schutzgruppe |
US5705333A (en) | 1994-08-05 | 1998-01-06 | The Regents Of The University Of California | Peptide-based nucleic acid mimics(PENAMS) |
US6280964B1 (en) | 1995-04-14 | 2001-08-28 | The Regents Of The University Of California | Binding sites for phosphotyrosine binding domains |
JP2001518054A (ja) | 1995-06-07 | 2001-10-09 | パーセプティブ バイオシステムズ,インコーポレーテッド | Pna−dnaキメラと、このキメラ合成用のpnaシントン |
US6020481A (en) | 1996-04-01 | 2000-02-01 | The Perkin-Elmer Corporation | Asymmetric benzoxanthene dyes |
US5847162A (en) | 1996-06-27 | 1998-12-08 | The Perkin Elmer Corporation | 4, 7-Dichlororhodamine dyes |
SE506700C2 (sv) | 1996-05-31 | 1998-02-02 | Mikael Kubista | Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra |
US6110676A (en) | 1996-12-04 | 2000-08-29 | Boston Probes, Inc. | Methods for suppressing the binding of detectable probes to non-target sequences in hybridization assays |
CA2218439A1 (en) * | 1996-12-21 | 1998-06-21 | Henrik Orum | Method of identifying a nucleic acid using triple helix formation of adjacently annealed probes |
US6107470A (en) | 1997-05-29 | 2000-08-22 | Nielsen; Peter E. | Histidine-containing peptide nucleic acids |
US6008379A (en) | 1997-10-01 | 1999-12-28 | The Perkin-Elmer Corporation | Aromatic-substituted xanthene dyes |
US6485901B1 (en) | 1997-10-27 | 2002-11-26 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons |
AU1366299A (en) | 1997-10-27 | 1999-05-17 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons |
US5936087A (en) | 1997-11-25 | 1999-08-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Dibenzorhodamine dyes |
US6083682A (en) * | 1997-12-19 | 2000-07-04 | Glaxo Group Limited | System and method for solid-phase parallel synthesis of a combinatorial collection of compounds |
US6080868A (en) | 1998-01-23 | 2000-06-27 | The Perkin-Elmer Corporation | Nitro-substituted non-fluorescent asymmetric cyanine dye compounds |
DE19807463A1 (de) * | 1998-02-24 | 1999-08-26 | Mannesmann Vdo Ag | Ansaugvorrichtung für eine Brennkraftmaschine |
US6361942B1 (en) | 1998-03-24 | 2002-03-26 | Boston Probes, Inc. | Method, kits and compositions pertaining to detection complexes |
US6117986A (en) | 1998-06-10 | 2000-09-12 | Intergen Company, L.P. | Pyrimidines linked to a quencher |
DE69933770D1 (de) * | 1998-07-09 | 2006-12-07 | Biocept Inc | Verfahren zur verwendung einer universellen bibliothek von peptid-nukleinsäuren zur optimierung der dns-hybridisierung |
WO2000033084A2 (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Syntrix Biochip, Inc. | Arrays of organic compounds attached to surfaces |
US6441152B1 (en) | 1998-12-08 | 2002-08-27 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices |
DE69925635T2 (de) * | 1998-12-23 | 2006-05-04 | Genencor International, Inc., Palo Alto | Phenol oxidierende enzyme von pilzen |
DE19909373A1 (de) * | 1999-03-03 | 2000-10-05 | Ugichem | Neue PNA-Monomere, daraus resultierende PNA-Oligomere und deren Verwendung |
US6248884B1 (en) | 1999-06-03 | 2001-06-19 | The Perkin-Elmer Corporation | Extended rhodamine compounds useful as fluorescent labels |
US6140500A (en) | 1999-09-03 | 2000-10-31 | Pe Corporation | Red-emitting [8,9]benzophenoxazine nucleic acid dyes and methods for their use |
US6472153B1 (en) | 1999-10-26 | 2002-10-29 | Epoch Biosciences, Inc. | Hybridization-triggered fluorescent detection of nucleic acids |
US6191278B1 (en) | 1999-11-03 | 2001-02-20 | Pe Corporation | Water-soluble rhodamine dyes and conjugates thereof |
US6451588B1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-09-17 | Pe Corporation (Ny) | Multipartite high-affinity nucleic acid probes |
US7256275B2 (en) | 2001-03-09 | 2007-08-14 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to combination oligomers and libraries for their preparation |
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