JP2006517386A - Pnaダイマーおよびpnaオリゴマー合成に関する方法、組成物およびライブラリー - Google Patents
Pnaダイマーおよびpnaオリゴマー合成に関する方法、組成物およびライブラリー Download PDFInfo
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Abstract
Description
(I.本明細書で用いられる特定の略語のリスト)
Fmoc=9−フルオレニルメトキシカルボニル
Bhoc=ベンズヒドロキシカルボニル
Mmt=モノメトキシトリチル
TFA=トリフルオロ酢酸
bocまたはt−boc=ter−ブトキシカルボニル
PAL=5−(4’−アミノメチル−3’,5’−ジメトキシフェノキシ)吉草酸
MBHA=メトキシベンズヒドリルアミン
DHPP=4−(1’、1’−ジメチル−1’−ヒドロキシプロピル)−フェノキシアセチル−アラニル−アミノメチル樹脂
DNA=2’−デオキシリボ核酸
RNA=リボ核酸
PNA=ペプチド核酸
PEG=ポリエチレングリコール
DBU=1,8−ジアザビシクロ−[5.4.0]−ウンデク−7−エン
MeOH=メタノール
ACN=アセトニトリル
(II.定義)
本明細書を解釈する目的のために以下の定義が適用され、そして適切な場合はつねに、単数で用いられる用語は複数をも含み、そしてその逆も同じである。
(化学的アセンブリによるPNAオリゴマー合成)
PNAの化学的アセンブリのための方法は周知である(米国特許第5,539,082号、同第5,527,675号、同第5、623,049号、同第5、714,331号、同第5,718,262号,同第5、736,336号、同第5,773,571号、同第5,766,855号、同第5,786、461号、同第5,837,459号、同第5,891,625号、同第5,972,610号、第同5,986,053号、同第6,107,470号、同第6,201,103号、同第6,228,982号および同第6,357,163号を参照のこと;これらすべては本明細書中に参考として援用される(PerSeptive Biosystems Product Literatureもまた参照のこと))。PNA合成方法のための一般的参照としてはまた、Nielsenら、Peptide Nucleic Acids;Protocols and Applications、Horzon Scientific Press、Norfolk England(1999)を参照のこと。
連結/縮合反応で用いられるとき、選択された連結化学の性質が考慮されるべきである。単純さのために、本発明者らは、しばしば、連結/縮合反応で用いられるオリゴマーの1つを、末端オリゴマーまたは末端ブロックと、そしてその他を、縮合オリゴマーまたは縮合ブロックと称する。この区別は、一般に、異なるブロック間を、特にそれらが同じ核酸塩基配列を含む場合を区別することを除いて関係がない。しはしば、少なくとも連結で用いられる官能基の性質は、末端および縮合オリゴマーブロックについて異なる。なぜなら、それらは、異なる連結化学薬品を収容するように設計され得るからである。例えば、1つのオリゴマーブロックはC末端酸基を含み得、そしてその他はN末端アミン基を含み得、ここで、縮合/連結反応の産物は、細長いPNAオリゴマーまたはキメラを形成するアミド結合である。
PNAを標識するための非制限的な方法は、米国特許第6,110,676号、同第6,280,964号、同第6,355,421号、WO99/21881、米国特許第6,361,942号、WO/49293および米国特許第6,441,152号(これらすべては参考として本明細書中に援用される)、本明細書の実施例のセクション中に記載されているか、またはそうでなければ、PNA合成およびペプチド合成の技術分野で周知である。PNAを標識するための方法はまた、Nielsenら、Peptide Nucleic Acids;Protocols and Application、Horizon Scientific Press、Norfolk、England(1999)中で論議されている。PNAオリゴマーを標識するための非限定的な例は、以下で論議される。
PNAキメラは、核酸とペプチド核酸サブユニットの組み合わせである。これ故、PNAキメラの合成、標識および改変は、当業者に公知の方法、および上記で記載の方法を利用し得る。PNAキメラの合成、標識および改変のための適切な参照は、今や米国特許代6,063,569号として発行され、本明細書中に参考として援用されるWIPO公開特許出願番号WO96/40709号に見出され得る。さらに、PNA合成および標識のための上記に記載の方法は、PNAキメラのPNA部分を改変するためにしばしば用いられ得る。加えて、核酸の合成および標識のための周知の方法が、PNAキメラの核酸部分の改変のためにしばしば用いられ得る。例示の方法は、5,476、925、5,453,496、5,446,137、5,419,966、5,391,723、5,391,667、5,380,833、5,348,868、5,281,701、5,278,302,5,262,530、5,243,038、5,218,103、5,204,456、5,204,455、5,198,540、5,175,209、5,164,491、5,112,962、5,071,974、5,047,524、4,980,460、4,923,901,4,786,724、4,725,677、4,659,774、4,500,707、4,458,066、および4,415,732中に見出され得;そのすべては本明細書中に参考として援用される。
上記で論議されたように、PNAキメラおよびPNAオリゴマーは、レポーター成分で標識され得る。オリゴマーまたはオリゴマーブロックを直接標識するために適切なレポーター成分(標識)の非制限的な例は:量子ドット、マイナーグルーブバインダー、デキストラン結合体、分岐核酸検出システム、発色団、蛍光発色団、クエンチャー、スピンラベル、放射線同位元素、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物を含む。クエンチング成分もまた考慮された標識である。その他の適切な標識試薬および付着のための好ましい方法は、PNA、ペプチドまたは核酸合成の当業者によって認識され得る。非限定的な例は、上記に記載または参照されている。
一般に、スペーサーは、かさ高い標識試薬がプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション性質に対して有し得る悪影響を最小にするために用いられ得る。リンカーは、オリゴマーの2つ以上のオリゴマーブロックを連結するために用いられ得る。これらリンカーは、塩基ではない(abasic)。塩基ではないことは、本発明者らは、核酸塩基を含まないことを意味する。スペーサー/リンカー成分の非制限的な例は:1つ以上のアミノアルキルカルボン酸(例えば、アミノカプロン酸)、アミノ酸の側鎖(例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖)、1つ以上の天然のアミノ酸(例えば、グリシン)、アミノオキシアルキル酸(例えば、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタノン酸)、アルキル二酸(例えば、コハク酸)、アルキルオキシ二酸(例えば、ジグリコール酸)またはアルキルジアミン(例えば、1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサオクタン)である。スペーサー/リンカー成分はまた、偶発的に、または意図的に、オリゴマーの水可溶性を改善するために構築され得る(例えば、Gildeaら、Tett.Lett.39:7255〜7258(1998)).Guidance In Label Choice When Ligating/Condensing Oligomer Blocks:を参照のこと。
図8aおよび8bを参照して、適正に調製されたオリゴマーブロックは、水溶性カルボジイミドである1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ−プロピル)カルボジイミドヒドロクロライド(EDC)のようなカルボジイミドを用いて連結され得る。示されるように、代表的には、オリゴマーブロックの1つは、カルボン酸成分を含み、そして他方はアミノ基を含む。PNAオリゴマーは、それらが連結された天然アミノ酸成分を含むか否かにかかわらず、アミン末端およびカルボン酸末端を含み得るので、一般に、PNAオリゴマーブロックは:より代表的なC末端酸の代わりに、少なくとも1つのPNA C末端酸オリゴマーの調製を除いて、このタイプの連結化学を促進するための改変を要求しない。これらオリゴマーは、必要に応じて約75%までの有機改変剤(v/v)を含む水溶液中で連結され得る。pHは、6.5未満であり得る。トリアゾール化合物(例えば、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)または1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt))のような活性化試薬の添加は、縮合/連結反応の全体の収率を増加し得る。
米国公開出願2003−0077608およびPCT公開出願WO02/072865は、同時係属中であり、そして本出願とともに共通して所有されている。これらの公開された特許出願は、特に、オリゴマーブロックの連結を記載し、ここで、細長い(組み合わせ)オリゴマー中でブロックを分離する少なくとも3原子のリンカーが存在する。従って、これらの公開特許出願で記載される連結/縮合反応は、本明細書に記載のようなネイティブなオリゴマーを生成しない。それにもかかわらず、前記の特許出願は、本明細書に記載のPNA C末端酸オリゴマーに適用され得るオリゴマーブロックを縮合/連結するための種々の方法を記載している。PNA C末端酸オリゴマーの縮合/連結は、ネイティブPNAオリゴマーを生成するために用いられ得る。それらはネイティブオリゴマーであるので、それらは、例えば、自己指標PNAプローブを用いる多重SNP遺伝子型決定を含むPNAオリゴマーに共通して適用される任意の適用に用いられ得る。
a)序論
本発明は、PNAダイマーおよびPNAオリゴマー合成の分野に関する。これらPNAダイマーは、支持体に結合されているか否かにかかわらず、特に、PNA C末端酸オリゴマーの調製において用いられ得る。さらに、このPNA C末端酸オリゴマーは、それら自身、特に、連結/縮合を通じてより長いPNAオリゴマーおよび/またはキメラの調製で用いられ得、および特に、PNAオリゴマーおよび/またはキメラ調製で用いられるライブラリーの調製で用いられ得る。そのように生成されたPNAオリゴマーおよびPNAキメラは、それら自身、特に、制限されずに、自己指標アッセイ、多重アッセイおよび/または自己指標多重アッセイにおける使用によるを含む、目的の標的配列の決定において用いられ得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体組成物に関する。この固体支持体は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびPNAダイマーを含む。このPNAダイマーは、N末端の塩基不安定保護基を含み、そしてこの切断可能なリンカーを通じて固体支持体に切断可能に連結されている。さらに、この固体支持体上のPNAダイマーの積載は、1グラムあたり0.08mmol以上であり得る。このPNAダイマーは、Fmoc(Bhoc)モノマーから形成され得る。このPNAダイマーは、上記固体支持体の切断可能なリンカーにエステル結合により連結され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体のライブラリーに関する。このライブラリーは、少なくとも、2つの固体支持体を備え、ここで、この少なくとも2つの固体支持体の各々は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびPNAダイマーを含む。このPNAダイマーは、酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能であり得る。このPNAダイマーは、このライブラリーの上記少なくとも2つの固体支持体の任意の他方に結合しているPNAダイマーとは核酸塩基配列が異なり得る。このPNAダイマーは、エステル結合により固体支持体の切断可能なリンカーに連結され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法に関する。この方法は、第1のPNAモノマーを、立体的に妨害された立体的に妨害された固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このPNAモノマーは、N末端の塩基不安定アミン保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし好ましくは、上記固体支持体は洗浄され、過剰の第1のPNAモノマーを除去する。次いで、この固体支持体は、約1〜約2分の期間の間、この支持体に結合した第1のPNAモノマーから上記塩基不安定N末端アミン保護基を実質的に除去する脱保護試薬で処理される。この脱保護ステップは、迅速に実施されるべきである。なぜなら、非保護N末端アミンは、この酸を形成する切断可能なリンカーを攻撃し得、そしてそれによって、支持体から第1のPNAモノマーの環化および解離を引き起こすからである。迅速に実施されるとき、第1のPNAモノマーの50%より少ないの環化および解離を得ることが可能である。一旦、脱保護が実施されると、この固体支持体を洗浄し、脱保護試薬を除去し得る。ここで再び、この洗浄は、迅速に実施されるべきである。迅速にとは、本発明者らは、それが、可能な限りそれが合理的に実施され得るように実施されるべきであることを意味し;一般に、上記脱保護試薬が固体支持体に最初に付与される時間と、第2のPNAモノマーの結合が開始される時間との間で2〜10分を超えて経過しない。洗浄後、第2のPNAモノマーが、上記第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合することが可能な限り速く、そして好ましくは、上記脱保護試薬が上記固体支持体に最初に付与されるときの2〜10分以内に実施される。
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体結合PNAダイマーを形成するためのなお別の方法に関する。この方法は、第1のPNAモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このPNAモノマーは、酸不安定N末端保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし、好ましくは、この固体支持体を洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーは除去される。次いで、上記固体支持体は、上記酸不安定N末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理される。一旦、脱保護が実施されると、上記固体支持体は洗浄されて、上記脱保護試薬は除去される。洗浄後、第2のPNAモノマーが、上記第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合される。この方法によれば、上記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載は、1グラムあたり0.08mmol以上である。上記に記載の方法とは異なり、この脱保護ステップは迅速に実施されることは要求されない。なぜなら、N末端アミンはプロトン化され、そしてそれによって第1のPNAシントンの環化および脱離を引き起こし得ないからである。
なお別の実施形態では、本発明は、C末端PNAサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、PNA C末端酸オリゴマーに関する。例えば、この蛍光標識は、色素1または色素2であり得る。例えば、上記クエンチャー成分はダブシルであり得る。上記標識は、N末端アミンへを含む、PNAオリゴマーのN末端サブユニットに連結され得る。
なお別の実施形態では、本発明は、PNA C末端酸オリゴマーのライブラリーに関する。このライブラリーの各々のPNAオリゴマーは、核酸塩基配列、C末端PNAサブユニット(グリシンまたはリジンのようなアミノ酸ではない)および蛍光標識またはクエンチャー成分を含む。PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーは、制限されずに、N末端アミンへを含む、N末端サブユニットに連結され得る。このライブラリーの各PNAは、このライブラリーのその他のPNAオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる。このライブラリーのPNAオリゴマーの各々の核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択され得る。
本発明を、ここで、いかなる方法においても制限的であることは意図されない以下の実施例により説明する。
I.トリチル−Cl樹脂上の第1のPNAモノマーの積載
試薬:Fmoc(Bhoc)−PNAモノマー(Fmoc−A(Bhoc)−OH:P/N GEN063014、Fmoc−C(Bhoc)−OH:P/N GEN06315、Fmoc−G(Bhoc)−OH:P/N GEN06316、Fmoc−T(Bhoc)−OH:P/N GEN06317、1−メチル−2−ピロリドン(NMP):P/N400580、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF):P/N400143、N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU):P/N GEN063080はすべて、Applied Biosystems、Foster City、CAから得た。メタノール:P/N 015−4およびアセトニトリル:P/N 230−4は、Burdick&Jackson(Muskegon、Michigan)から得た。トリチル−Cl樹脂:P/N 01−64−0074は、Novabiochem(San Diego、CA)から5gバッチで得た。乾燥溶媒を、トリチルクロライド樹脂積載反応に用いた。無水ジクロロメタン(CH2Cl2):P/N 27,099−7、NMPは、4Åの分子篩上で一晩貯蔵した。溶媒(DMF、NMPおよびアセトニトリル)を樹脂洗浄のために用い、そしてその他の反応は、試薬グレードであった。
注記:PNAモノマー樹脂は合成の1または2日以内に用いられるか、使用まで4℃で貯蔵されるべきである。
上記の実験Iから得られた約0.5gの各乾燥樹脂を、NMPで少なくとも2〜3時間膨潤した。次いで、Fmoc基を、この樹脂を1分間、5mLのDMF中の20%(v/v)ピペラジンで処理することにより除去した。Fmoc脱保護が進行中であった間に、NMP中のPNAモノマーの溶液を、DIPEA(9当量)およびHAT(3.8当量)の添加により活性化した。最終のモノマー濃度は0.17Mであった。次いで、この樹脂を、さらに1分間以内にNMP(3×10〜15mL)で洗浄し、活性化PNA−モノママーを添加した。この結合は15分間行い、そして次に、樹脂を、減圧下の乾燥の前にNMPおよびアセトニトリルで洗浄した。次いで、樹脂積載能力をFmoc決定により算出した。すべての可能な16ダイマー−樹脂(4つの核酸塩基A、C、G&Tに基づく)を、上記のプロトコールを用いて合成した。PNAダイマー−樹脂の積載能力(表3)は、0.12〜0.35mmole/gの範囲であった。この積載は、しばしば、従来のFmoc−XAL−PEG−PS樹脂で用いられる。
注記:1)切断可能なリンカーがC末端酸を形成する;および2)N−α−アミンの脱保護が塩基性条件下で実施されるときはいつも、第2のPNAオリゴマーの結合反応は、N末端保護基の除去の後、可能な限りすばやく実施されるべきである。なぜなら、環化および脱離反応(図3を参照のこと)が生じ得、それによって、第1のモノマーの実質的部分が、固体支持体から除去され、それによって、樹脂の積載を効率的に低下するからである。
少なくとも4ヶ月の間一定のままであった。ダイマー−樹脂の安定性を試験するために、4ヶ月の間4℃で貯蔵された樹脂のサンプルを、DMFで洗浄し、そしてFmoc決定により(上記で提示された手順を参照のこと)積載能力をチェックする前に乾燥した。これらの洗浄は、任意のUV活性化合物はなく、それによって、それらは、これら条件下では、実質的に分解しないことを示した。
表4は、上記のように調製されたダイマー−樹脂を用いてアセンブルされるべき第1のPNAオリゴマーの中であった4つのPNAペンタマーのついての合成データを識別かつ提供する。合成は、Expedite PNA合成機上で実施された。色素1および色素2で標識されたPNAペンタマーは、ここでは、通常基準でダイマー−樹脂を用いてアセンブルされた。図1は、このような合成から得られたPNAオリゴマー、色素1−TGG−TC−OHの粗製サンプルの代表的な分析RP−HPLCプロフィールを示す。
(I.モノメトキシトリチル(Mmt)/Bhocモノマーの調製)
市販され、入手可能なFmoc(Bhoc)PNAモノマーを、Mmt/Bhocモノマーに、図2に示されるような反応を用いてN末端アミン保護基をシャッフルすることにより変換した。反応は単純で、そして4つすべての核酸塩基(A/T/G/C)に対する収率は満足すべきものであった(68〜96%)。
Mmt基は、樹脂上に第1のモノマーを係留した後、ジクロロメタン中の2%のジクロロ酢酸(DCA)の溶液で除去され得ることが理論付けられた。この脱保護戦略は、ケトピペラジンを形成する環化および脱離反応(図3)を行なわない、プロトン化アミン基を生成することが意図された。Bhoc基は、Mmt基除去条件下では不安定であることが知られているので、核酸塩基の遊離の環外アミンがMmt脱保護条件で生成された場合、分岐反応が生じる可能性があった。
この決定がなされた後、図4に示されるように、2,6−ジクロロ−ベンゾイルクロライドを用いて、Mmt/Bhoc−Gモノマーを、Wang樹脂に係留した。この樹脂を洗浄し、そして次のモノマー(T、T、GおよびA)を、標準的なHATUカップリング条件を用いて結合した。DCA洗浄中にPNAモノマーは検出されず(TLC:UVおよびニンヒドリン試験);これは、最初の残基がDCA処理に際して固体支持体から切断されないことを示した。
− 樹脂上のMmt/Bhocモノマー積載は高く(1.20〜0.27mmol/g)、そしてPNA C末端オリゴマーの調製のために用いられ得る。
− モノマー樹脂のMmt基の切断後、プロトン化アミンは、直後に結合される必要はない。
− キャッピング工程は、これらモノマーではなくされ、時間を減少する。
− 従来のPNA合成機の合成プロトコールを変更する必要はない。
モノマー樹脂(1〜5gスケール)の合成のための手順:
1)Fmoc/BhocPNAモノマー(1.46mmol、0.75当量)およびDIPEA(4.38mmol、2.25当量)を、NMP/DCM(10mL/5mL、すべて無水)中でモノマーが溶解するまで攪拌する*。モノマー濃度は0.1Mである。
2)樹脂**(1.5g、1.95mmol、1.00eq)をモノマー溶液に添加し;不活性雰囲気下で4時間攪拌する。
3)樹脂を濾過し、完全に混合しながら、3×15mLのNMPで洗浄する。
4)樹脂を、キャッピング溶液中(DCM/MeOH/DIPEA=17mL/2mL/1mL)で15分間攪拌する。
5)樹脂を濾過し、3×15mLのNMP、3×15mLのACNで各々完全に混合して洗浄する。
6)減圧下で樹脂を乾燥する。
1)モノマー樹脂(0.49mmol、1.0g、1.00当量)を、5.0mLのNMPに3時間の間浸す。
2)DeFMOC溶液:NMP(5.0mL)中2.0%DBUを調製する。
3)モノマー(0.98mmol、2.00当量)、HATU(0.93mmol、1.90当量)、およびDIPEA(1.96mmol、4.0当量)を、10mLのNMP中で5〜10分攪拌することによりカップリング溶液を調製する。モノマー濃度は0.1Mである。
4)NMP中のモノマー樹脂にDeFMOC溶液を直接添加する。DBUの最終濃度は1.0%である;4分攪拌する。
5)ビーズを濾過し;3×15mLのNMPで攪拌しながら洗浄する(約4分要する)。
6)樹脂にカップリング溶液を添加し、そして60分間攪拌する。
7)樹脂を濾過し、3×15mLのNMPで完全に攪拌して洗浄する。
8)15mLのPNAキャッピング溶液(Applied Biosystems、P/N GEN063102)を樹脂に添加し、30分間攪拌する。
9)樹脂を濾過し、3×15mLのNMP、3×15mLのACNで、各々完全に混合して洗浄する。
10)減圧下で樹脂を乾燥する。
Claims (74)
- 固体支持体組成物であって:
a)酸を形成する切断可能なリンカー;および
b)PNAダイマーであって、該切断可能なリンカーにより該固体支持体に切断可能に連結されたN末端の塩基不安定性保護基を含むPNAダイマーを含み、ここで、該固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、組成物。 - 前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、請求項1に記載の組成物。
- 前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項2に記載の組成物。
- 前記固体支持体が、PAL−PEG−PS(商標)、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記PNAダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記PNAダイマーが、Fmoc(Bhoc)モノマーから形成される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記固体支持体が、2つ以上の異なる支持体結合PNAダイマーを含むアレイである、請求項1または2に記載の組成物。
- 少なくとも2つの固体支持体を含むライブラリーであって、ここで、該少なくとも2つの固体支持体の各々が:
a)酸を形成する切断可能なリンカー;および
b)PNAダイマーであって:(i)該酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能に連結され;かつ(ii)該ライブラリーの少なくとも2つの固体支持体の任意のもう一方に連結されているPNAダイマーとは核酸塩基配列が異なるPNAダイマー
を含む、ライブラリー。 - 前記ライブラリーが、少なくとも16個の固体支持体を含み、各々の支持体が、少なくとも16個の可能なPNAダイマーのセットから選択されたPNAダイマーを含み、該セットの各々のPNAダイマーが、該セットの他のPNAダイマーすべてとは、少なくとも4つの異なる核酸塩基の少なくとも1つが異なる、請求項10に記載のライブラリー。
- 前記少なくとも4つの異なる核酸塩基の各々が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、請求項11に記載のライブラリー。
- 前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、請求項10に記載のライブラリー。
- 前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項13に記載のライブラリー。
- 前記固体支持体が、PAL−PEG−PS、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、請求項10に記載のライブラリー。
- 前記PNAダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、請求項10または13に記載のライブラリー。
- 前記PNAダイマーのC末端サブユニットが、前記切断可能なリンカーに連結される、請求項16に記載のライブラリー。
- 前記PNAダイマーが、Fmoc(Bhoc)保護PNAモノマーから形成される、請求項13に記載のライブラリー。
- 前記PNAダイマーが、t−boc/Z保護PNAモノマーから形成される、請求項10または13に記載のライブラリー。
- 前記PNAダイマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーから形成される、請求項10または13に記載のライブラリー。
- 前記PNAダイマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーおよびFmoc(Bhoc)保護PNAモノマーの両方から形成される、請求項10または13に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーの少なくとも1つの固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、請求項10または13に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーの固体支持体の少なくとも2分の1上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、請求項10または13に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーの固体支持体のすべての上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、請求項10または13に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーの各々の固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、請求項24に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーの各々の固体支持体上のPNAダイマーの積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、請求項24に記載のライブラリー。
- 前記支持体のライブラリーが、整列されてアレイを生成する、請求項10または13に記載のライブラリー。
- 支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法であって:
a)第1のPNAモノマーを、立体的に妨害された酸を形成する切断可能なリンカーを含む立体的に妨害された固体支持体に結合する工程であって、ここで、該PNAモノマーが、N末端の塩基不安定アミン保護基を含む工程;
b)該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーを除去する工程;
c)該固体支持体を、約1分間〜約2分間の間、該支持体に結合した第1のPNAモノマーから該塩基不安定N末端アミン保護基を実質的に除去するが、該支持体から第1のPNAモノマーの50%より多い環化および除去を許容しない脱保護試薬で処理する工程;
d)該固体支持体を洗浄する工程であって、該脱保護試薬を除去する工程;および
e)工程(c)および(d)を実施した後、実用的である限りすぐに、第2のPNAモノマーを、該第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合する工程、
を包含する、方法。 - 前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むFmoc(Bhoc)PNAモノマーである、請求項28に記載の方法。
- 前記第1および第2のPNAモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から独立に選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記N末端の塩基不安定保護基が、Fmocである、請求項28に記載の方法。
- 前記脱保護試薬が、有機溶媒中約15〜約25%のピペリジンを含む溶液である、請求項28に記載の方法。
- 前記脱保護試薬が、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%ピペリジンである、請求項32に記載の方法。
- 前記脱保護試薬が、NMP中に約0.2%〜約4%(v/v)DBUを含む溶液である、請求項28に記載の方法。
- 前記脱保護試薬が、NMP中の約2%DBUである、請求項34に記載の方法。
- 前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド(トリチル−Cl)樹脂である、請求項28に記載の方法。
- 前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、請求項28に記載の方法。
- 前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.1mmolから1グラムあたり約1mmolの範囲にある、請求項28に記載の方法。
- 前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.12mmolから1グラムあたり約0.35mmolの範囲にある、請求項28に記載の方法。
- 支持体に結合したPNAダイマーを形成する方法であって:
a)第1のPNAモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程であって、ここで、該PNAモノマーが、酸不安定N末端保護基を含む工程;
b)該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第1のPNAモノマーを除去する工程;
c)該固体支持体を、該酸不安定N末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理する工程;
d)該固体支持体を洗浄して該脱保護試薬を除去する工程;および
e)第2のPNAモノマーを、該第1のPNAモノマーのN末端アミンに結合する工程、を包含し、
ここで、該固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり0.08mmolより大きいか、またはそれに等しい、方法。 - 前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むt−boc/Z保護PNAモノマーである、請求項41に記載の方法。
- 前記第1および第2のPNAモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むMmt/Bhoc保護PNAモノマーである、請求項41に記載の方法。
- 前記第1のPNAモノマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーであり、そして前記第2のPNAモノマーが、Fmoc/Bhoc保護PNAモノマーである、請求項41に記載の方法。
- 前記第1および第2のPNAモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から独立に選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記第1のPNAモノマーが、Mmt/Bhoc保護PNAモノマーであり、そして前記脱保護試薬が、有機溶媒中の約1〜約5%(v/v)のジクロロ酢酸を含む溶液である、請求項41に記載の方法。
- 前記脱保護試薬が、ジクロロメタン(DCM)中の約2%のジクロロ酢酸である、請求項46に記載の方法。
- 前記固体支持体が、トリチルクロライド樹脂(トリチル−Cl)、2−クロロトリチルクロライド樹脂、DHPP、MBHA、4−メチルトリチルクロライド樹脂、4−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS、Rink酸樹脂およびNovaSyn TGTアルコール樹脂からなる群から選択される立体的に妨害された固体支持体である、請求項41に記載の方法。
- 前記固体支持体が、Fmoc−PAL−PEG−PS、NovaSyn TGAおよびWang樹脂からなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.1mmol〜1グラムあたり約1.2mmolの範囲内にある、請求項41に記載の方法。
- 前記固体支持体上のPNAダイマーの最終積載が、1グラムあたり約0.12mmol〜1グラムあたり約0.35mmolの範囲内にある、請求項41に記載の方法。
- C末端PNAサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、PNA C末端酸オリゴマー。
- 前記蛍光標識が、色素1または色素2である、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記クエンチャー成分が、ダブシルである、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記PNAオリゴマーは、長さが10 PNAサブユニット以下である、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記PNAオリゴマーは、長さが約3〜約8サブユニットである、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記PNAオリゴマーは、長さが約4〜約6サブユニットである、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記PNAオリゴマーは、長さが4サブユニットである、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記PNAオリゴマーは、長さが5サブユニットである、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記標識が、前記PNAオリゴマーのN末端サブユニットに連結される、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記標識が、前記PNAオリゴマーのN末端アミンに連結される、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- 前記オリゴマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、請求項52に記載のPNAオリゴマー。
- PNA C末端酸オリゴマーのライブラリーであって、該ライブラリーの各々のPNAオリゴマーが:
a)核酸塩基配列;
b)C末端PNAサブユニット;および
c)蛍光標識またはクエンチャー成分;
を含み、
ここで、PNAオリゴマーの各々が、該ライブラリーの他のPNAオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる、ライブラリー。 - 前記PNAオリゴマーの各々の核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、2−チオ−5−プロピニル−ウラシル、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2−チオウラシルおよび2−チオチミン、2−アミノプリン、N9−(2−アミノ−6−クロロプリン)、N9−(2,6−ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9−(7−デアザ−グアニン)、N9−(7−デアザ−8−アザ−グアニン)およびN8−(7−デアザ−8−アザ−アデニン)からなる群から選択される、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、N末端サブユニットに連結されている、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記PNAオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、N末端アミンに連結されている、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、同じ数のPNAサブユニットを含む、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーのPNAオリゴマーの少なくとも1つが、該ライブラリーの他の少なくとも1つのPNAオリゴマーと比較した場合に異なる数のPNAサブユニットを含む、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、約3〜約8個のPNAサブユニットを含む、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、約4〜約6個のPNAサブユニットを含む、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、4個のPNAサブユニットを含む、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーのPNAオリゴマーの各々が、5個のPNAサブユニットを含む、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーが、少なくとも2つのセットのPNA C末端酸オリゴマーを含み、ここで、該各セットのPNAオリゴマーが、主に、蛍光標識の性質において、他のセットのPNAオリゴマーと異なる、請求項63に記載のライブラリー。
- 前記第1のセットのPNA C末端酸オリゴマーが、色素1で標識され、そして前記第2のセットのPNA C末端酸オリゴマーが、色素2で標識される、請求項73に記載のライブラリー。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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