JP2010265301A - 血管新生を調整するための組成物及び方法 - Google Patents
血管新生を調整するための組成物及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010265301A JP2010265301A JP2010157554A JP2010157554A JP2010265301A JP 2010265301 A JP2010265301 A JP 2010265301A JP 2010157554 A JP2010157554 A JP 2010157554A JP 2010157554 A JP2010157554 A JP 2010157554A JP 2010265301 A JP2010265301 A JP 2010265301A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- epc
- mammal
- csf
- vascular
- growth factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
- A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【解決手段】一つの態様において、新たな血管を形成するのに十分な、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の有効量を哺乳動物に投与することを含む。さらに、好ましくはGM-CSFの有効量を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物において重度の血管損傷を予防または軽減する方法及び哺乳動物における新たな血管の形成を誘導するための薬学的製品及びキット。
【選択図】なし
Description
本出願は1998年3月9日に出願された米国特許仮出願第60/077,262号の継続出願であり、その開示は本明細書に参照として組み込まれる。
本発明の資金は一部、米国国立衛生局(National Institutes of Health)による助成金HL40518、HL02824及びHL57516により米国政府により提供された。従って、米国政府は本明細書で請求される発明内において、または本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は血管新生を調整するための、特に哺乳動物における方法に関する。一つの局面において、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)のような、血管新生調整剤の有効量を哺乳動物へ投与することを含む血管新生を調整する方法を提供する。さらに、哺乳類において損傷血管を治療または検出する方法を提供する。本発明は、哺乳動物において新たな血管の形成を誘導することを含む幅広い範囲の有用な適用性を有する。
血管は生組織への酸素及び栄養の供給に役立つ。血管はまた老廃物の除去を促進する。血管は「血管形成」と呼ばれる過程により新生される。一般的にはFolkman and Shing、J. Biol. Chem.、267 (16)、10931-10934 (1992): 非特許文献1を参照されたい。
a)哺乳動物から内皮前駆組織細胞(EPC)を単離する段階、
b)単離EPCを、EPCの増殖を誘導するに十分な少なくとも一つの因子の有効量と接触させる段階、
c)損傷血管を治療するのに十分な量の増殖EPCを哺乳動物へ投与する段階。
上記のように、本発明は、一つの態様では、GM-CSFの有効量、またはその有効な断片の患者への投与を含む、ヒトの患者での新生血管形成を誘発する方法を提供する。また、上記のように、該GM-CSFは、単独で、または少なくとも一つの血管新生調整剤、好ましくはこのような因子の一つ、少なくとも一つの脈管由来タンパク質、好ましくは一つの脈管由来タンパク質のうちの、一つまたは複数と組み合わせて(共投与)、ヒトの患者に投与できる。少なくとも一つの血管新生調整剤、好ましくは一つのこのような因子の有効量の投与を含む、EPCの可動化を促進する方法をもまた提供される。さらに、ヒトの患者内の損傷血管を治療または検出する方法も提供される。本発明は患者内の重度の血管損傷の予防または軽減を含む広い範囲の使用を有する。
a)目的の哺乳動物、好ましくは齧歯類とくにマウスからの末梢血液検体の獲得
b)血液検体からの低密度単核細胞の分離
c)分離された単核細胞と、特異的にSca-1+に結合でき、また単核細胞からSca-1+を分離できるビーズとの接触
d)例えば手でのSca-1+細胞数の測定によるSca-1+細胞の定量化
a)マウス末梢血液からのSca-1+及びSca-1-の単離、またはウサギ末梢血液からのTBM+及びTBM-の単離、及び、例えば本明細書で提供されるようなDi-Iによる、該細胞(Sca-1+及びTBM-)の検出可能な標識
b)数日間、通常は約4日間の適切なデッシュまたはプレート内の培地内での該細胞の培養
c)Di-I標識Sca-1+またはTBM-、またはDi-I非標識Sca-1-またはTBM+である、デッシュまたはプレート内の全ての付着した分散細胞のカウント
d)EPCであることを示す特異的な正の細胞の定量化
a)マウスの少なくとも片目に角膜ミクロポケットを作成する
b)許容できるポリマー及び少なくとも一つの脈間由来タンパク質を含むペレットを該ポケットへ加える
c)例えばスリット-ランプ生体顕微鏡検査方で、特徴的に段階b)の数日後、例えば5〜6日後、マウスの目の血管新生を調べる
d)例えばBS-1で、目のEC細胞に印をつける
e)目の血管新生、及びの任意にEC細胞の総数を定量化する。
a)ドナー哺乳類及び特徴的にはマウスからの検出可能な標識BM細胞の獲得
b)該マウスからの低密度BM単核細胞の単離。
c)例えば照射による、適切なレシピエントマウスからのBM細胞の除去。
d)該レシピエントマウスへの単離し検出可能に標識したBM細胞の投与。
e)例えば後肢虚血などの、マウスの血管損傷を促進する状態への該レシピエントマウスの暴露。
f)該レシピエントマウスへのGM-CSFの有効量の投与。
g)該レシピエントマウスからの少なくとも一つの角膜の獲得、及び
h)角膜内の標識BM細胞の検出及び定量化。
循環EPCは損傷に対し回復反応を構築する可能性がある。サイトカインの投与はEPCを可動化し、それにより治療的新生血管形成を増進するとする仮説は次のようにして研究された。
サイトカイン誘発EPC可動化が虚血組織の新生血管形成を促進するかどうかを決定するため、ウサギ後肢虚血モデルを使用した(Takeshitaら、J. Clin. Invest. 1994; 93: 662-670)。GM-CSFで前処理したウサギ(皮下、(s. c.)、rhGM-CSF; 50μg/日s. c.)では、EPCが豊富な細胞集団が増加し(対照動物に比べ189%)、また、手術0日目(即ち前)でEPC分化が促進された(対照動物に比べ421%)(図3)。毛細管密度の形態計測分析は、対照群(虚血、非GM-CSF)に比べ、GM-CSFでの前処理で誘発された大きな新生血管形成を示した(249対146/mm2、p<0.01)。GM-CSFでの前処理はまた虚血四肢/正常四肢の血圧比を非常に向上させた(0.71対0.49、p<0.01)(図3A〜3C)。
虚血組織中のEPCの動力学を調べるため、末梢血液からEPC単離及びEPC培養アッセイ法で、EPCの頻度と分化を調べた。EPCの豊富な画分を、マウスからはSca-1抗原-陽性(Sca-1+)細胞として、ウサギからは、抗原レパートリーCD5-/Igμ-/CD11b-と称されるT-リンパ細胞、B-リンパ細胞及び単球(TBM-)枯渇細胞集団として単離した。
虚血が重度の組織間のEPC動力学を、頻度及び分化について調べた。循環血液内のEPCが豊富な集団は、虚血開始後に増加し、手術7日目にピークを迎えた(7日目対0日目:マウスで17.5±2.4対3.8±0.6x105/ml [p<0.05]、ウサギで11.4±0.6対6.7±0.3x105/ml [p<0.05]、)(図5A、6A)。EPC培養アッセイ法は、虚血後のEPC分化の劇的な向上を示し、7日目にピークを迎えた(7日目対0日目:マウスで263±39対67±14/ mm2 [p<0.05]、ウサギで539±73対100±19 [p<0.05]、)(図5B、6B)。EPCが豊富な集団の頻度もEPC培養アッセイ法も、術後7日目の疑手術動物モデルのいずれに於いても有意なEPC動力学の増加を示さなかった。
虚血に誘発されるEPC可動化向上の新生血管形成への影響を調べるために、3日早く手術を施して後肢虚血を作出した動物に、マウス角膜ミクロポケットを適用した。スリット-ランプ(図5C及び6D)及び蛍光(図5E及び6F)顕微鏡写真は、非虚血擬手術の対照と比べ、後肢虚血動物で非血管マウス角膜の新生血管形成が向上したことを示す。血管長及び血管周の測定で、非虚血擬手術の対照と比べ、虚血動物内の新生血管形成へのEPC可動化の有意な効果が示された(長さ=0.67±0.04対0.53±0.04mm、p<0.05、円周=43.3±3.5対32.4±3.4%、p<0.05)(図5G及び5H)。
サイトカイン誘発EPC可動化が虚血組織の新生血管形成を促進させるかを決定するために、後肢虚血ウサギモデル(Takeshita,S.ら、J. Clin. Invest. 1994)を用いた。ECへの直接的な作用を避けながら、GM-CSF誘発EPC可動化を起させるために、後肢虚血の発達前の7日間、組換えヒトGM-CSFを毎日投与した。このようなGM-CSF前処理(50μg/日s. c.)はEPCが豊富な集団を増加させ(12.5±0.8対6.7±0.3x105 /ml、p<0.01)、0日目(手術前の前処理の7日目)でEPCの分化を促進させた(423±90対100±19 /mm2、p<0.01)。術後7日目までに、GM-CSF前処理群での循環EPCの頻度及びEPCの分化は対照値を上回った(それぞれ、20.9±1.0対11.3±2.5x105 /ml [p<0.05]、813±54対539±73 /mm2 [p<0.01])(図6A及び6B)。毛細管密度の分析は、GM-CSF前処理に誘発された大きな新生血管形成(249±18対非処理群の146±218 mm2 p<0.01)及び虚血/正常後肢血圧比の上昇を示す(0.71±0.03対0.49±0.03、p<0.01)(図6C)。
上記の結果は、マウス角膜ミクロポケットアッセイ法での新たな血管新生の測定により確証された。GM-CSF前処理マウス(rmGM-CSF、500ng/日、i. p. )では、対照マウスよりもより大きな角膜新生血管形成が発達した(長さ=0.65±0.05対0.53±0.04、p<0.05、mm; 円周=38.0±3.5対28.3±2.7%、p<0.05)(図6D〜6I)。
虚血及びGM-CSFへの反応における、BM由来EPCの角膜新生血管形成の病巣への取り込み促進の直接的な証拠を確立するため、ネズミBM移植モデル(BMT)を適用した。ミクロポケット移植の6日後に角膜を切除し、光学顕微鏡で調べたところ、擬手術群に比べ虚血四肢ではベータガラクトシダーゼ発現細胞の有意な増加が示された(3.5±0.6対10.5±1.7、p<0.01)。対照群と比べ、GM-CSFで処理したBMTレシピエントについても同様であった(3.2±0.3対12.4±1.7、p<0.01)(図7A、7B)。対照マウス(BMT後)の角膜では、ベータガラクトシダーゼ発現細胞は見られなかった。定量化学検出では、対照と比べ、GM-CSF投与マウスでのベータガラクトシダーゼ活性の統計学的に有意な増加が確認された(2.90±0.30対2.11±0.09X103、p<0.05)(図7C)。
マウスの末梢血検体を、屠殺直前の心臓から得、ヒストパーク-1083(Sigma、St. Louis、MO)密度勾配遠心を400gで20分間行い分離した。低密度単核細胞を収穫し、2mMのEDTA(DPBS-E)を補ったダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で二度洗浄し、目で数えた。個々の動物の血液単核細胞を、50μlのSca-1ミクロビーズ(Miltenyi Biotec、Auburn、CA)及び0.5%ウシ血清アルブミン(Sigma)を補った500μlのDPBS-Eバッファーに4℃で15分間懸濁した。バッファーで細胞を洗浄し、Sca-1抗原陽性(Sca-1+)細胞を、磁気ステンレススチールウールカラム(Miltenyi Biotec)で分離し、数を数えた。Sca-1の抗体に結合しなかった細胞は該カラムを通過し、一方Sca-1+細胞は残留した。該Sca-1+細胞をカラムから溶出し、両方の細胞画分を目で数えた。
ウサギの末梢血液検体を、20G灌流カテーテルで一方の耳静脈から得、ヒストパーク-1077(Sigma)密度勾配遠心を400gで20分間行い分離した。低密度単核細胞を収穫し、DPBS-Eで二度洗浄し、目で数えた。ウサギ造血幹/前駆細胞の適切な抗体が入手不可能なため、成熟HCsの喪失により未熟HCsを単離した。該細胞をマウス-ウサギCD5、抗-ウサギIgM(μチェイン)及びCD11の混合一次抗体とインキュベートし、成熟T及びBリンパ球及び単球をそれぞれ識別した。抗体を洗浄後、該細胞をニ次ラット-マウスIgGミクロビーズ(Miltenyi Biotec)とインキュベートし、磁気分離カラムに置いた(Miltenyi Biotec)。成熟T及びBリンパ球及び単球の抗体と結合しない、造血幹/前駆細胞に同一な細胞は、該カラムを通過し、一方抗体の混合液への陽性細胞は残留した。該陽性細胞(TBM+)、成熟HCsをカラムから溶出し、両方の細胞画分を目で数えた。
循環血液細胞からのEPC分化を評価するために、5%FBS(Clontecs、San Diego、CA)を補ったEBM-II培地のSca-1+またはTBM-をDi-I標識した後、個々のマウスの700μlの末梢血から単離したSca-1+及びSca-1-、及び個々のウサギの2mlの末梢血液から単離したTBM-及びTBM+を、ラット血漿ビトロネクチン(Sigma)でコーティングした24穴プレートの1つの穴で共培養した。培養4日後、細胞を培地でニ度洗浄し、Di-I標識Sca-1+またはTBM-細胞由来細胞、及び非標識Sca-1-またはTBM+細胞由来細胞の頻度に従い、付着した拡散細胞を数えた。
後肢虚血C57BL/6Jマウス(n=40)を手術後0(手術前)、3、7及び14日目に屠殺した(それぞれの時点で10匹ずつ)。擬手術マウスを同様に手術後7日目に屠殺した(n=4)。末梢血単核細胞をSca-1+細胞測定のために調整し、また、EPC濃厚画分を磁気ビーズ選抜(n=5)及びEPC培養アッセイ法(n=5)で調整した。
これらの実験はEPC動力学へのGM-CSFの効果、及びその後の新生血管形成への血管形成の貢献を示すことを意図する。
EC-特異的プロモーターのTie-2の転写制御下でLacZによりコードされるベータガラクトシダーゼの構築により発現する組換えマウスからの、BMTをFVB/Nマウスに実施した(Schlaeger,T. M.ら、Development、1995)。移植BMの再構築で、LacZの発現がTie-2発現BM由来細胞に限定され、他の体細胞ではLacZの発現が観察されない、Tie-2/LZ/BMTマウスを産出した。その後、虚血または擬手術の三日前、またはGM-CSFまたは対照媒介物での7日間の処理が完結した1日後に、Tie-2/LZ/BMTマウスに角膜アッセイ顕微鏡手術(Kenyon,B. M.ら、Invest Ophthalmol Vis Sci、1996及びAsahara,T.ら、Circ. Res. 1998)を行った。
ベータガラクトシダーゼ発現細胞を組織学的に検出するため、マウスの目全体を摘出し、4%パラフォルムアルデヒド中で4℃で2時間固定し、37℃で一晩X-gal溶液にインキュベートした。検体をその後、PBS内に置き、角膜半球(kemisphered cornea)を解剖顕微鏡化で切除し、組織学的プロセシングのために包埋した。組織検体は光学(light)ヘマトキシリン-及び-エオシンで対比染色し、光学顕微鏡で調べて、断面あたりのX-gal陽性細胞の数を目で数えた。それぞれの組織の3つの断面を調べ、X-gal染色細胞頻度の評価のために平均した。
同週齢(8週)のC57BL/6J雄マウス(Jackson Lab、Bar Harbor、ME)を用い、マウス後肢虚血モデルを作成した(Couffinhal,T.ら、Am. J. Pathol、1998)。全ての動物をその後の手術処置のために腹腔内ペントバルビタール注射(160 mg/kg)して痲酔した。大腿動脈上に横たわる左後肢の中央部で皮膚を切除した。その後大腿動脈を徐々に単離し、大腿動脈の基部を3-0絹結紮糸で結紮した。伏在動脈の末端部分を結紮し、他の動脈分枝び静脈を解剖して離し切除した。上に横たわる皮膚は二つの手術ホッチキスで閉じた。術後、37℃のヒーティングプレートにマウスをのせ、痲酔から完全に醒めるまで特別な注意を払って動物を監視した。
上記のウサギ後肢虚血モデルを用いた(Takeshita,S.ら、J. Clin. Invest. 1994)。ジラジンでの前投薬後、ケタミン(50 mg/kg)及びアセプロマジン(0.8 mg/kg)の混合物で全部で20匹のニュージーランド白ウサギ(3.8〜7.2kg)(Pine Acre Rabbitry、Norton、MA)を痲酔した。その後、鼡径靭帯から膝蓋とのちょうど隣接点まで下から縦切開を行った。手術時に手術者が無作為に切開を行った四肢を決定した。手術用ルーペを用いたこの切開で、全長の渡って大腿動脈を解剖して離し、下腹壁動脈、深大腿動脈、外側大腿回旋動脈、浅腹壁動脈を含む全ての大腿動脈分枝もまた解剖して離した。膝窩動脈及び伏在動脈を解剖して離した後、外腸骨動脈及び上記の全ての動脈を4.0絹結紮糸(Ethicon、Sommerville、NJ)で結紮した。最後に、大腿動脈を、外腸骨動脈の分枝としての基部の起点から、分岐して伏在及び外腸骨動脈を形成する末端の地点まで完全に切開した。大腿動脈の切開後、血栓の逆行性伝播により外腸骨動脈の咬合が引き起こされた。血流はその結果として外腸骨動脈から排出する側枝に依存性となった。
同週齢(8週)のC57BL/6J雄マウス(Jackson Lab)を用いて、マウス角膜新生血管形成を評価した。その後の手術処置のために、全ての動物を腹腔内ペントバルビタール注射(160 mg/kg)して痲酔した。改変バングレーフェ白内障刀でそれぞれのマウスの目に角膜ミクロポケットを作出した。それぞれのポケットに、150 ngの血管内皮増殖因子(VEGF)を含むヒドロンポリマータイプNCC(IFN Science、New Brunswick、NJ)でコーティングした0.34 x 0.34 mmのショ糖硫酸アルミニウム(Buck Meditec、Denmark)ぺレットを移植した。ぺレットは角膜の縁から1.0 mmに位置し、エリスロマイシン眼用軟膏(E. Foufera、Melville、NY)をそれぞれの手術した目に加えた。全てのマウスの角膜をペレット移植5日から6日後にかけてスリット-ランプ生体顕微鏡検査法で毎日調べた。新生血管形成の血管長及び血管周を術後6日目に測定し、全ての角膜を写真撮影した。これらの測定後、EC特異的マーカである、FITC(Vector Lab、Burlingame,CA)と接合した500 ngのBandeiraea Simplicifoliaレクチン(BS-1)を静脈内投与し、30分後に屠殺した。目を摘出し、1%パラフォルムアルデヒド溶液内で固定した。固定後、角膜をガラススライド上に乗せ、蛍光顕微鏡検査で調べた。
痲酔したウサギで、これらのインビボでの生体研究を行った。両後肢の血圧を測定した。それぞれに際して、後肢を剃り清浄して、後けい骨動脈の脈拍を、ドップラー消息子で同定し、それぞれの四肢の収縮血圧を標準的方法で測定した。血圧比は正常四肢の収縮血圧に対する虚血四肢の収縮血圧の比として、それぞれのウサギで決定した。
新生血管形成の範囲を、正常及び虚血後肢からとった光学顕微鏡的切片の毛細管の頻度を測定して調べた。組織標本は屠殺時に、両肢の筋肉からの横断面として得た。筋肉検体をO. C. T. 化合物(Miles、Elkhart、Ind.)内に包埋し、液体窒素で急凍結した。その後5μmの厚さの複数の凍結切片を、筋肉繊維が横方向になるようにそれぞれの標本から切り出した。組織切片をインドキシルテトラゾリウム法を用いて、塩基性フォスファターゼ染色し、上記のように毛細管ECsを検出し、またエオシンで対比染色した。毛細管を20倍の倍率で数え、毛細管密度を決定した(mm2あたりの平均毛細管数)。無作為に10の異なった領域を、毛細管算定のために選抜した。毛細管/筋肉繊維比を計算するために使用した算定方法は、他の点では毛細管の計算のために使用した方法と同一である。Prokop、D. J. (1997) Science、276:71; Perkins、S. and Fleischman、R. A. (1998) J. Clinical Invest. 81: 1072; Perkins、S. and Fleischman、R. A. (1990) Blood 75: 620を参照されたい。
全ての結果を平均±標準誤差として表わす。統計学的な有意差を、二つの平均の比較のための非対スチューデントT-検定で評価した。3群以上の多重比較はANOVAで行った。p<0.05の値は統計学的な有意差を示すものと解釈された。
Claims (49)
- 哺乳動物において新たな血管を形成するのに十分な血管新生調整剤の有効量を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物における新たな血管の形成を誘導する方法。
- 血管新生調整剤がGM-CSF、M-CSF、b-FGF、SCF、SDF-1、G-CSF、HGF、アンジオポエチン-1、アンジオポエチン-2、FTL-3リガンド、またはこれらの有効な断片である、請求項1記載の方法。
- 血管新生調整剤がGM-CSFであり、哺乳動物へのGM-CSFの投与量が哺乳動物において内皮前駆細胞(EPC)の頻度を増加させるのに十分である、請求項2記載の方法。
- 標準的EPC単離アッセイ法で測定してEPC頻度の増加が少なくとも約20%である、請求項3記載の方法。
- 哺乳動物に投与する血管新生調整剤の量が哺乳動物においてEPCの分化を増加させるに十分である、請求項1記載の方法。
- 標準的EPC培養アッセイ法で測定してEPC分化の増加が少なくとも約20%である、請求項5記載の方法。
- 哺乳動物への血管新生調整剤の投与量が哺乳動物において血管長を増加させるのに十分である、請求項1記載の方法。
- 標準的血管長アッセイ法で測定して血管長の増加が少なくとも約5%である、請求項7記載の方法。
- 哺乳動物に投与する血管新生調整剤の量がさらに、哺乳動物において血管径を増加させるのに十分である、請求項7記載の方法。
- 標準的血管径アッセイ法で測定して血管径の増加が少なくとも約5%である、請求項9記載の方法。
- 哺乳動物に投与する血管新生調整剤の量が組織虚血後にEPC分化を増加させるのに十分である、請求項1記載の方法。
- 標準的後肢虚血アッセイ法で測定してEPC分化の増加が少なくとも約20%である、請求項11記載の方法。
- 標準的角膜ミクロポケットアッセイ法で測定して、血管新生調整剤の投与量が新生血管形成を少なくとも約5%を増加させるのに十分である、請求項1記載の方法。
- 血管新生調整剤の投与量が病巣へのEPC骨髄由来EPCの取り込みを増加させるのに十分である、請求項1記載の方法。
- 標準的齧歯類骨髄(BM)移植モデルで測定して、EPC骨髄由来EPCの病巣への取り込みの増加が少なくとも約20%である、請求項14記載の方法。
- 哺乳動物が虚血組織を有する、有する疑いのある、または将来的に有すると考えられる、請求項1記載の方法。
- 虚血組織が虚血性脈管疾患と関係する、請求項16記載の方法。
- 虚血組織が四肢、移植片、または器官からの組織を含む、請求項16記載の方法。
- 前記組織が循環系または中枢神経系と関係する、請求項16記載の方法。
- 前記組織が心臓または脳組織である、請求項16記載の方法。
- 血管新生調整剤が少なくとも一つの脈管由来タンパク質と共投与される、請求項1記載の方法。
- 脈管由来タンパク質が内皮細胞分裂誘発物質である、請求項21記載の方法。
- 脈管由来タンパク質が、酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF-1)、表皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子α及びβ(TGF-α及びTGF-β)、血小板由来内皮増殖因子(PD-ECGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、肝細胞増殖因子(HGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、エリスロポエチン、コロニー刺激因子(CSF)、マクロファージ-CSF(M-CSF)、アンジオポエチン-1(Ang1)もしくはNOシンターゼ(NOS)、またはそれらの断片である、請求項21記載の方法。
- タンパク質がVEGF-B、VEGF-C、VEGF-2、VEGF-3、またはそれらの有効な断片である、請求項23記載の方法。
- 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の有効量を哺乳動物へ投与する段階、及び血管損傷を促進する状態に該哺乳動物を暴露する段階を含み、GM-CSFの量が哺乳動物において重度の血管損傷を予防または軽減するのに十分である、哺乳動物において重度の血管損傷を予防または軽減する方法。
- 血管損傷を促進する状態が侵襲性操作または虚血である、請求項25記載の方法。
- 侵襲性操作が手術である、請求項26記載の方法。
- 虚血が、感染、外傷、移植片拒絶、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、四肢虚血、虚血性心筋症または心筋虚血のうちの少なくとも一つに関係する、請求項26記載の方法。
- 血管損傷を促進する状態へ哺乳動物を暴露する少なくとも約12時間前に、GM-CSFを哺乳動物へ投与する、請求項25記載の方法。
- 血管損傷を促進する状態へ哺乳動物を暴露する約1日から10日前の間にGM-CSFを哺乳動物へ投与する、請求項29記載の方法。
- 血管損傷を促進する状態への暴露後、GM-CSFを哺乳動物へ投与することをさらに含む、請求項29記載の方法。
- 下記の段階を含む、治療が必要な哺乳動物において虚血組織を治療する方法:
a) 哺乳動物から内皮前駆細胞(EPC)を単離する段階、
b) 単離したEPCを、EPCの増殖を誘導するのに十分な量の脈管由来タンパク質と接触させる段階、及び
c) 虚血組織を治療するのに十分な量の増殖したEPCを哺乳動物へ投与する段階。 - EPCが次のマーカー、CD34+、flk-1+、またはtie-2+の少なくとも一つを有する、請求項32記載の方法。
- 虚血組織が損傷血管を有する、請求項32記載の方法。
- 血管が侵襲性操作により損傷を受ける、請求項34記載の方法。
- 侵襲性操作がバルーン血管形成、またはステントもしくはカテーテルの配置である、請求項35記載の方法。
- ステントが血管内ステントである、請求項36記載の方法。
- 少なくとも一つの脈管由来タンパク質の共投与をさらに含む、請求項32記載の方法。
- 脈管由来タンパク質が内皮細胞分裂誘発物質または内皮細胞分裂誘発物質をコードする核酸である、請求項38記載の方法。
- 脈管由来タンパク質が、酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF-1)、表皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子α及びβ(TGF-α及びTGF-β)、血小板由来内皮増殖因子(PD-ECGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、肝細胞増殖因子(HGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、エリスロポエチン、コロニー刺激因子(CSF)、マクロファージ-CSF(M-CSF)、アンジオポエチン-1(Ang1)もしくはNOシンターゼ(NOS)、またはそれらの断片である、請求項39記載の方法。
- タンパク質がVEGF-B、VEGF-C、VEGF-2、VEGF-3、またはそれらの有効な断片である、請求項40記載の方法。
- 内皮前駆細胞(EPC)の検出可能な標識を施された集団と哺乳動物を接触させる段階、及び哺乳動物の組織損傷部位でまたはその近傍で該標識細胞を検出する段階を含む、哺乳動物において組織損傷の存在を検出する方法。
- 組織損傷が虚血または虚血性脈管疾患である、請求項42記載の方法。
- 単離された内皮前駆細胞(EPC)を含み、哺乳動物に生理学的に許容されるよう調剤される、哺乳動物において新生血管形成を誘導するための薬学的製品。
- 滅菌されており、少なくとも一つの脈管由来タンパク質または該タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項44記載の薬学的製品。
- 単離されたEPC及び選択的に脈管由来タンパク質または該タンパク質をコ−ドする核酸の少なくとも一つを有し、選択的に、薬学的に許容される担体溶液、核酸または分裂誘発物質、EPCの運搬手段、及びキット使用のための説明書をさらに含む、単離された内皮前駆細胞(EPC)の全身性導入のためのキット。
- EPCの運搬手段がステント、カテーテル、またはシリンジである、請求項46記載のキット。
- 哺乳動物での内皮前駆細胞(EPC)可動化を促進するのに十分な、少なくとも一つの造血因子の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物においてEPC可動化を増強する方法。
- 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、少なくとも一つの脈管由来タンパク質、またはそれらの有効な断片のうちの一つまたは複数の有効量を哺乳動物へ共投与することをさらに含む、請求項48記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US7726298P | 1998-03-09 | 1998-03-09 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000535201A Division JP2002506008A (ja) | 1998-03-09 | 1999-03-09 | 血管新生を調整するための組成物及び方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010265301A true JP2010265301A (ja) | 2010-11-25 |
Family
ID=22137044
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000535201A Withdrawn JP2002506008A (ja) | 1998-03-09 | 1999-03-09 | 血管新生を調整するための組成物及び方法 |
JP2010157554A Pending JP2010265301A (ja) | 1998-03-09 | 2010-07-12 | 血管新生を調整するための組成物及び方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000535201A Withdrawn JP2002506008A (ja) | 1998-03-09 | 1999-03-09 | 血管新生を調整するための組成物及び方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1061800A4 (ja) |
JP (2) | JP2002506008A (ja) |
AU (1) | AU766238B2 (ja) |
CA (1) | CA2322559C (ja) |
WO (1) | WO1999045775A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012148200A2 (ko) * | 2011-04-26 | 2012-11-01 | 아주대학교 산학협력단 | 허혈성 혈관 질환 치료시술 보조용 조성물 |
KR101609690B1 (ko) * | 2011-04-26 | 2016-04-06 | 아주대학교산학협력단 | 허혈성 혈관 질환 치료시술 보조용 조성물 |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001094420A1 (en) | 2000-06-05 | 2001-12-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Identification and use of human bone marrow-derived endothelial progenitor cells to improve myocardial function after ischemic injury |
IL153115A0 (en) * | 2000-06-16 | 2003-06-24 | Curis Inc | Angiogenesis-modulating compositions and uses |
AU2001284695A1 (en) | 2000-07-31 | 2002-02-13 | New York Medical College | Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium |
US7547674B2 (en) * | 2001-06-06 | 2009-06-16 | New York Medical College | Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium |
US7862810B2 (en) | 2000-07-31 | 2011-01-04 | New York Medical College | Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium |
WO2002022163A1 (fr) | 2000-09-13 | 2002-03-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedes contre des maladies ischemiques |
AU2002227425B2 (en) * | 2000-10-30 | 2005-10-20 | Children's Medical Center Corporation | Tissue-engineered vascular structures |
CA2467557A1 (en) * | 2001-11-19 | 2003-05-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Agent which mobilizes multipotential stem cells from tissues to peripheral blood |
WO2003059375A1 (fr) * | 2002-01-17 | 2003-07-24 | Cardio Incorporated | Therapie complexe pour la regeneration des tissus |
KR100562824B1 (ko) | 2002-03-20 | 2006-03-23 | 주식회사 바이로메드 | 유전자 발현효율이 높으며 간세포 성장인자의 두 가지이형체를 동시에 발현하는 하이브리드 간세포 성장인자유전자 |
US20030199464A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-10-23 | Silviu Itescu | Regeneration of endogenous myocardial tissue by induction of neovascularization |
JP2005539031A (ja) * | 2002-08-16 | 2005-12-22 | シエーリング アクチエンゲゼルシャフト | 野生型または変異型eNOSによる重症肢虚血の遺伝子療法 |
AU2008200822A1 (en) * | 2002-08-22 | 2008-03-13 | The Cleveland Clinic Foundation | Stromal cell-derived factor-1 mediates stem cell homing and tissue regeneration in ischemic cardiomyopathy |
CN100366257C (zh) * | 2002-08-22 | 2008-02-06 | 克里夫兰诊所基金会 | 基质细胞衍生因子-1介导缺血性心肌病中干细胞归巢及组织再生 |
US20040037811A1 (en) * | 2002-08-22 | 2004-02-26 | The Cleveland Clinic Foundation | Stromal cell-derived factor-1 mediates stem cell homing and tissue regeneration in ischemic cardiomyopathy |
CN1738638A (zh) * | 2002-12-13 | 2006-02-22 | 藤原久义 | 治疗非缺血性心力衰竭的药物组合物 |
US7695723B2 (en) * | 2002-12-31 | 2010-04-13 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
WO2005107817A2 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-17 | Orbus Medical Technologies, Inc. | Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods of using same |
CA2584553A1 (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-23 | Cellgentech, Inc. | External agent for treatment of skin ulcer |
TW200637571A (en) * | 2005-01-11 | 2006-11-01 | Univ Nagoya Nat Univ Corp | CSF-containing remedy to be administered in low dose |
WO2006093172A1 (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-08 | Foundation For Biomedical Research And Innovation | 成体幹細胞の体外増幅方法 |
ES2520044T3 (es) | 2007-03-30 | 2014-11-11 | The Cleveland Clinic Foundation | SDF-1 para su uso en el tratamiento de trastornos vasculares periféricos isquémicos |
WO2009062143A2 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-14 | New York Medical College | Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium using cytokines and variants thereof |
WO2009073616A2 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-11 | New York Medical College | Compositions comprising vascular and myocyte progenitor cells and methods of their use |
WO2009073594A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-11 | New York Medical College | Methods of reducing transplant rejection and cardiac allograft vasculopathy by implanting autologous stem cells |
US8512696B2 (en) | 2007-11-30 | 2013-08-20 | Autologous, Llc | Methods of isolating non-senescent cardiac stem cells and uses thereof |
WO2009079451A2 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-25 | The Cleveland Clinic Foundation | Compositions and methods of promoting wound healing |
RU2470995C2 (ru) | 2008-04-09 | 2012-12-27 | Вайромед Ко., Лтд. | Лиофилизированные днк-составы для увеличенной экспрессии плазмидной днк |
JP5856059B2 (ja) | 2009-08-28 | 2016-02-09 | ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション | 虚血組織を治療するためのsdf−1送達 |
KR101336386B1 (ko) * | 2011-06-17 | 2013-12-04 | 전북대학교병원 | 림프관 생성 유도제 |
MX2016005006A (es) | 2013-10-22 | 2016-07-14 | Viromed Co Ltd | Composicion para prevenir a tratar la esclerosis lateral amiotrofica usando dos o mas isoformas del factor de crecimiento de hepatocito. |
EP3266459A4 (en) * | 2015-03-18 | 2018-04-18 | Foundation for Biomedical Research and Innovation | Medicine for treatment and/or prevention of ischemic diseases, method for improving angiogenesis-promoting activity of cells, or method for producing medicine |
KR20210027493A (ko) | 2018-07-19 | 2021-03-10 | 주식회사 헬릭스미스 | 네이키드 dna 유전자 요법을 위한 동결 건조된 약제학적 조성물 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4808042A (en) * | 1982-06-11 | 1989-02-28 | Electro-Plasma, Inc. | Powder feeder |
US4879282A (en) * | 1987-03-17 | 1989-11-07 | Saliba Jr Michael J | Medical application for heparin and related molecules |
US4808402A (en) * | 1987-05-29 | 1989-02-28 | Northwestern University | Method and compositions for modulating neovascularization |
US5980887A (en) * | 1996-11-08 | 1999-11-09 | St. Elizabeth's Medical Center Of Boston | Methods for enhancing angiogenesis with endothelial progenitor cells |
US5880090A (en) * | 1997-09-19 | 1999-03-09 | The Hope Heart Institute | Treatment of vascular graft implants with G-CSF |
-
1999
- 1999-03-09 AU AU30737/99A patent/AU766238B2/en not_active Ceased
- 1999-03-09 CA CA2322559A patent/CA2322559C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-09 JP JP2000535201A patent/JP2002506008A/ja not_active Withdrawn
- 1999-03-09 EP EP99912344A patent/EP1061800A4/en not_active Withdrawn
- 1999-03-09 WO PCT/US1999/005130 patent/WO1999045775A1/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-07-12 JP JP2010157554A patent/JP2010265301A/ja active Pending
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
JPN6012045016; J. Clin. Invest. Vol.87, 1991, p.986-995 * |
JPN6012045017; Circulation Vol.94, No.7, 1996, p.1496-1498 * |
JPN6012045018; American Journal of Pathology Vol.147, No.6, 1995, p.1649-1660 * |
JPN6012045019; 実験医学 Vol.15, No.12, 1997, p.1507-1510 * |
JPN6012045020; ASAHARA T. et al.: 'Blood cell derived endothelial cell precursor can participate in angiogenesis in vivo' Circulation Vol.94, No.8, 1996, p.I-237 * |
JPN6012045021; American Journal of Physiology Vol.271, No.3, 1996, p.F744-F753 * |
JPN6012045022; Asahara T. ae al.: Circulation Vol.96, No.8 SUPPL., 1997, p.l415-l416, 2321 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012148200A2 (ko) * | 2011-04-26 | 2012-11-01 | 아주대학교 산학협력단 | 허혈성 혈관 질환 치료시술 보조용 조성물 |
WO2012148200A3 (ko) * | 2011-04-26 | 2013-01-17 | 아주대학교 산학협력단 | 허혈성 혈관 질환 치료시술 보조용 조성물 |
KR101609690B1 (ko) * | 2011-04-26 | 2016-04-06 | 아주대학교산학협력단 | 허혈성 혈관 질환 치료시술 보조용 조성물 |
US9956265B2 (en) | 2011-04-26 | 2018-05-01 | Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation | Composition for aiding surgical procedures for treating ischemic vascular diseases |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1061800A4 (en) | 2004-10-06 |
JP2002506008A (ja) | 2002-02-26 |
WO1999045775A1 (en) | 1999-09-16 |
AU766238B2 (en) | 2003-10-09 |
CA2322559C (en) | 2012-07-17 |
CA2322559A1 (en) | 1999-09-16 |
EP1061800A1 (en) | 2000-12-27 |
AU3073799A (en) | 1999-09-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6676937B1 (en) | Compositions and methods for modulating vascularization | |
AU766238B2 (en) | Compositions and methods for modulating vascularization | |
Miller-Kasprzak et al. | Endothelial progenitor cells as a new agent contributing to vascular repair | |
Ohki et al. | Granulocyte colony‐stimulating factor promotes neovascularization by releasing vascular endothelial growth factor from neutrophils | |
Tepper et al. | Adult vasculogenesis occurs through in situ recruitment, proliferation, and tubulization of circulating bone marrow–derived cells | |
Ballard et al. | Vascular tenascin‐C regulates cardiac endothelial phenotype and neovascularization | |
Nishida et al. | Absence of angiotensin II type 1 receptor in bone marrow–derived cells is detrimental in the evolution of renal fibrosis | |
EP0941125B1 (en) | Methods for regulating angiogenesis | |
US8119398B2 (en) | Adipose-derived stem cells for tissue regeneration and wound healing | |
US9095580B2 (en) | Compositions and methods for regulating angiogenesis | |
Khouri et al. | The effect of basic fibroblast growth factor on the neovascularisation process: skin flap survival and staged flap transfers | |
US20060003932A1 (en) | Method for promoting neovascularization | |
JP2005007196A (ja) | ヒト・骨形態形成蛋白を用いる神経再生 | |
CZ2004852A3 (cs) | Materiály z buněk stromatu kostní dřeně pro použití při tvorbě cév a výrobě angiogenních a trofických faktorů | |
WO2008107422A1 (en) | Osteopontin for the prediction and treatment of cardiovascular diseases | |
BRPI0620523A2 (pt) | método de aumentar o potencial de implante e de atração celular, método de preparar células para transplante em um sujeito, população de células e composição farmacêutica | |
CA2650638A1 (en) | Methods for treating diabetes | |
Herbrig et al. | Endothelial progenitor cells in chronic renal insufficiency | |
US20040228834A1 (en) | Compositions and methods for modulating vascularization | |
Padilla et al. | Bone marrow mononuclear cells stimulate angiogenesis when transplanted into surgically induced fibrocollagenous tunnels: results from a canine ischemic hindlimb model | |
Jones et al. | Venous endothelial changes in therapeutic arteriovenous fistulae | |
JP2010037292A (ja) | 脂肪由来幹細胞と塩基性線維芽細胞増殖因子を組み合わせた線維性病変の治療法 | |
US20230034582A1 (en) | Cell population and method of obtaining the same | |
JP6706836B2 (ja) | 単核球培養用無血清培地 | |
Ferns et al. | Atherosclerosis and platelet derived growth factors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120829 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20121128 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20121203 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130603 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131216 |