JP2010261939A - 質量画像の形成方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】腫瘍組織などに発現しているタンパク質を、細胞レベルで網羅的に可視化する画像の形成方法で、詳しくは定量性の高い二次元画像の形成方法を提供することを目的とする。
【解決手段】細胞または組織を含む生体組織切片を対象とした質量分析法において、生体切片の測定範囲における各画素に対し、その領域に存在量が既知の生体分子を内部標準として用い、得られる測定スペクトルについて(対象分子の強度)/(内部標準物質の強度)値を算出して用いることにより、測定範囲における対象分子の分布像を得るものである。本発明により、検体における対象構成物の質量分析情報に基づく二次元分布画像を取得する際、測定範囲内での各画素間での感度差を補正でき、画像の定量性が向上する。これにより、特に組織切片上のタンパク質について、細胞レベルでの定量的可視化が可能となる。
【選択図】図1
Description
本発明は、生体組織切片の構成物の質量に関する情報に基づいて、前記構成物中の対象構成物の二次元分布画像を形成する画像形成方法であって、
前記構成物が属する領域を少なくとも細胞内部の領域、核の領域、細胞外部の領域に決定する工程、
前記工程で決定した領域ごとに、前記構成物の質量スペクトルにおける前記対象構成物に由来する質量信号の強度と前記構成物中の内部標準物質に由来する質量の信号強度から前記対象構成物に由来する質量の規格化された強度を算出する工程、
前記対象構成物に由来する質量の規格化された強度に基づいて前記対象構成物の二次元分布画像を形成する工程、
を有し
前記内部標準物は、(i) 細胞内部の領域ではアクチン、チューブリン、GAPDHのいずれかを用い、(ii)核の領域ではヒストン又は核酸を用い、(iii)細胞外部の領域ではアルブミン又はサイトカインを用いる
ことを特徴とする対象構成物の二次元分布画像を形成する画像形成方法に関する。
前記構成物が属する領域を少なくとも細胞内部の領域、核の領域、細胞外部の領域に決定する工程、
前記工程で決定した領域ごとに、前記構成物の質量スペクトルにおける前記対象構成物に由来する質量信号の強度と前記構成物中の内部標準物質に由来する質量の信号強度から前記対象構成物に由来する質量の規格化された強度を算出する工程、
前記対象構成物に由来する質量の規格化された強度に基づいて前記対象構成物の二次元分布画像を形成する工程、を有し
前記内部標準物は、(i)細胞内部の領域ではアクチン、チューブリン、GAPDHのいずれかを用い、(ii)核の領域ではヒストン又は核酸を用い、(iii)細胞外部の領域ではアルブミン又はサイトカインを用いる対象構成物の二次元分布画像を形成する画像形成方法に関する。
(1)検体の測定範囲を決定する工程
(2)前記測定範囲を画素に分割する工程、
(3)質量分析法により前記画素の質量スペクトルを得る工程、
(4)前記画素が属する領域を決定する工程
(5)前記画素の質量分析用内部標準物質を決定する工程、
(6)前記画素における質量スペクトルにおける対象構成物に由来する質量の信号強度と内部標準物質に由来する質量の信号強度から、前記対象構成物に由来する質量の規格化された強度を算出する工程、
(7)前記対象構成物に由来する質量の規格化された強度の測定範囲における二次元分布画像を構築する工程
(1)検体の測定範囲を決定する工程
測定範囲の決定は検体を観察して行う。観察の手段は特に限定されないが、質量分析装置に付属の顕微鏡、光学顕微鏡などが用いられる。また、蛍光染色処理の施された生体組織切片を対象とする場合には、蛍光顕微鏡を使用してもよい。
質量分析装置に付属の顕微鏡を用いる場合は、例えば、まず、低倍率で試料を観察しながら、試料ののったステージを移動し、観察すべき測定範囲をおおまかに決定し、さらに高倍率で観察し、対象となる細胞が測定範囲に含まれる様に微調整することができる。
なお、本発明においては、多くの場合、検体は生体組織切片であり、測定範囲は概ね細胞レベルである。「細胞レベル」とは、少なくとも一つ一つの細胞を識別できるレベルを意味する。細胞の径は概ね10μmから20μmの範囲にあり、神経細胞などの大きなものは約50μmである。したがって、本工程の観察は、空間分解能が10μm以下であることが必要であり、好ましくは5μm以下、さらに好ましくは2μm以下、より好ましくは1μm以下である。
測定範囲を画素に分割する際は、各画素のサイズが、一辺の長さが10μm以下とすることが必要であり、さらには各画素のサイズは、好ましくは5μm以下、さらに好ましくは2μm以下、より好ましくは1μm以下とすることが望ましい。
質量分析装置に付属の顕微鏡で観察する場合は、ソフトウェア上で、測定画素数を選択することにより画素への分割を行うことができる。画素数は例えば64×64、128×128、256×256、512×512ピクセルのなかから選択することができる。
なお、全工程を通じて、複数の二次元データを参照する場合があるが、それぞれのデータにおける画素を一致させるために、それぞれの二次元データにおいて、二次元座標を設定することができる。
質量分析装置で、検体の測定範囲について、二次元的に網羅的に質量分析を行い、画素に対応する質量スペクトルを得る。工程(1)及び(2)を質量分析装置に付属の顕微鏡及び付属のソフトウェアを用いて行う場合は、本工程では、自動的に画素ごとの質量スペクトルを得ることが可能である。一方、工程(1)、(2)を質量分析装置に付属の顕微鏡及びソフトウェア上で行わない場合や、その他必要な場合は、それぞれの二次元データにおいて、各画素を対応させる必要がある。画素あたり得られる質量スペクトルは1つであってもよいし、複数であってもよい。複数の場合はそれらのいずれかを用いてもよいし、複数のスペクトルの平均をとってもよい。
質量分析法をおこなう質量分析装置は一般的に、試料のイオン化をおこなう試料導入部と、イオン化した試料を分析する分析部とを有し、この分析部の方式によって様々な質量分析法に分類できる。
・一次イオンを用いる方法。
・FAB(Fast Atom Bombardment、高速原子衝突)法。
・MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization、マトリックス支援レーザー脱離イオン化)法。
ここで、FAB法とは、試料をマトリックスに混ぜ、ここに高速で中性原子を衝突させてイオン化する方法である。
また、MALDI法とは、試料をマトリックス中に混ぜて結晶を作り、これにレーザーを照射することでイオン化する方法である。
(a)四重極型。
(b)磁場偏向型。
(c)フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型。
(d)イオントラップ型。
(e)飛行時間型二次イオン質量分析(TOF−SIMS)型。
(f)タンデム型。
(b)磁場偏向型とは、イオンを磁場中に通し、その際に受けるローレンツ力による飛行経路の変化を利用する分析法である。
(c)フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型では、イオンを静電場と静磁場のかかったセルに導入し、イオン運動を励起するための高周波電圧を印加してイオンの周回周期を検出する。そして、サイクロトロン条件から質量を算出する分析法である。
(d)イオントラップ型とは、イオンを電極からなるトラップ室に保持し、この電位を変化させることで選択的にイオンを放出することで分離をおこなう分析法である。
また、(f)タンデム型は、上記の分析法を複数組み合わせる方法である。
本発明において検体は主に生体組織切片であり、画素が属する領域は、たとえば、細胞の内部、細胞内側における核の断面内部、および、細胞以外から選択することができる。さらには、領域として、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、ペルオキシソームなどの細胞内小器官、あるいは、骨組織、脂肪組織などを設定してもよい。
画素の内部標準は、その画素が属する領域の属性により決定することができる。なお、内部標準物質は、好ましくは次の二つの条件を満たすものを選択することが望ましい。
(1)細胞の断面内部、細胞内側における核の断面内部、または、細胞以外、の領域それぞれに安定して存在すること、
(2)存在量が3〜100個/1μm3のレベルであること、
具体的には、タンパク質類、ペプチド類、アミノ酸類、脂質類、リン酸類、糖鎖類、核酸が好ましく、より具体的には、領域が細胞内部に属する場合は、アクチン、チューブリン、GAPDHなど、核に属する場合はヒストンや核酸、細胞外部においてはアルブミンやサイトカイン、などのタンパク質分子を内部標準物質として適用するのが好ましい。
工程(3)で得た質量スペクトルに、工程(5)で決定された各画素に割り当てられた内部標準物質に基づき、各画素について「対象構成物の信号強度と割り当てられた内部標準物質の信号強度」により、対象構成物の信号強度を規格化し算出する。この時、割り当てられた内部標準物質の信号強度とは、内部標準物質の分子そのものの強度である必要はなく、内部標準物質を特定できるものの信号であればよい。例えば、工程(2)の際に前処理としてタンパク質の消化処理をおこなっていれば、内部標準物質の信号としてタンパク質が消化されることにより生成されるフラグメント分子の検出信号を用いることができる。
画像の再構築には、工程(4)で得た各画素の規格化された信号強度を、測定範囲中の各画素の位置に基づいて二次元分布画像として形成する。
また、上記のように画像を再構築する対象構成物は、複数であっても良い。
以下に、生体組織切片を検体とし、TOF−SIMS法により画像を取得する例を示す。
一次イオン:25kV Bi3 +、0.3pA(パルス電流値)、sawtoothスキャンモード
一次イオンのパルス周波数:2.5kHz(400μs/shot)
一次イオンパルス幅:約0.8ns
一次イオンビーム直径:約0.8μm
測定範囲:26μm×26μm
二次イオンの測定画素数:128×128
積算時間:128回スキャン(約500秒)
二次イオンの検出モード:正イオン
比較として、測定範囲全面の画素に全てに同一の内部標準物質(上記、タンパク質β−アクチンのフラグメント・イオン、または、脂質フラグメント・イオン)を用いた規格化による測定画像の再構成をおこなう場合の結果を図6(a)、(b)にそれぞれ示す。また、規格化の際、内部標準の信号強度がゼロによる除算エラーが生じる時は適当に小さな値(例えば1)を内部標準の信号に加えての補正をおこなう。
以下に、決められた測定範囲から得られた検体中の構成物の質量に関する情報を電子データとして保持し、その電子データに対して、コンピューターソフトウェアを用い、半自動的に前記対象構成物の二次元分布画像を形成する方法を例示する。
2 細胞
3 核
4 測定範囲(128×128の測定画素で構成)
5 測定画素
6 細胞の断面内部領域
7 細胞内側の核断面領域
8 細胞以外の領域
Claims (3)
- 生体組織切片の構成物の質量に関する情報に基づいて、前記構成物中の対象構成物の二次元分布画像を形成する画像形成方法であって、
前記構成物が属する領域を少なくとも細胞内部の領域、核の領域、細胞外部の領域に決定する工程、
前記工程で決定した領域ごとに、前記構成物の質量スペクトルにおける前記対象構成物に由来する質量信号の強度と前記構成物中の内部標準物質に由来する質量の信号強度から前記対象構成物に由来する質量の規格化された強度を算出する工程、
前記対象構成物に由来する質量の規格化された強度に基づいて前記対象構成物の二次元分布画像を形成する工程、
を有し
前記内部標準物は、(i) 細胞内部の領域ではアクチン、チューブリン、GAPDHのいずれかを用い、(ii)核の領域ではヒストン又は核酸を用い、(iii)細胞外部の領域ではアルブミン又はサイトカインを用いる
ことを特徴とする対象構成物の二次元分布画像を形成する画像形成方法。 - 前記構成物の質量スペクトルは、TOF−SIMS法によって測定されたことを特徴とする請求項1に記載の画像形成方法。
- 前記構成物の質量に関する情報は、一辺の長さが5μm以下の画素ごとの情報に基づくことを特徴とする請求項1又は2に記載の画像形成方法。
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