CN112924530A - 使用离子迁移率进行物质鉴定的质谱成像 - Google Patents

Abstract

一种用于在组织学薄组织切片中鉴定和定位小分子种类的方法，该方法包括以下步骤：a)获取组织切片的质量/迁移率图像，并且对于图像的各个像素而生成目的小分子种类的质量/迁移率图；b)提供相同组织的第二样本并提取目的小分子，将目的小分子分离，并从分离出的小分子中获取质量和离子迁移率光谱；c)使用相应的参考数据库鉴定目的小分子；以及d)通过将经鉴定的种类的离子质量和迁移率与第二薄组织切片的离子质量和迁移率进行比较，将经鉴定的小分子分配到第一组织切片的质量/迁移率图的条目中。

Description

使用离子迁移率进行物质鉴定的质谱成像

技术领域

本申请涉及组织学上的薄组织切片的质谱成像，特别是涉及图像内小分子的鉴定。

背景技术

在本文中，通过质谱成像(MSI)获得的薄组织切片的术语“质谱图像”用于包括具有每个图像点(称为“像素”)的分子信息的质谱的图像。因此，“质谱图像”精确地对应于包括每个图像点的全色谱的“未减少的彩色图像”。

质谱分析法的趋势指向施用离子迁移率分离器。如果成像质谱仪配备有离子迁移率分离器，那么利用每个像素的精确质量和离子迁移率的图，能够进行“质量/迁移率成像”。对于“质量/迁移率成像”，没有简单的视觉对应。

通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)进行样本电离的质谱分析法已经多年成功用于确定精确的分子量，并且已经用于鉴定生物物质，特别是蛋白质和肽。这种类型的分析技术也可以用于复杂的混合物，并取得了一些成就。

在质谱成像中，迄今为止，仅在极少数情况下才可能从薄组织切片直接鉴定蛋白质、内源性肽、天然物质或药物的代谢物、聚糖和脂质；因此，它们的鉴定需要其他措施。在非成像质谱法中，这些措施通常需要蛋白质或它们的离子的碎片以增加信息量，通过酶消化使蛋白质分子碎片化或使所选择的母离子碎片化这两者中的一者或甚至是两者的组合来产生碎片离子。可在800原子质量单位至4,000原子质量单位测定的蛋白水解肽(有时称为“消化肽”)是由蛋白质链的酶促降解(例如，通过用蛋白酶胰蛋白酶消化)产生的肽。可以从碎片离子质谱中读取大部分氨基酸序列；这使得鉴定这些蛋白质成为可能。然而，用于获取碎片离子质谱的方法消耗了相当大量的物质；对于质谱成像，图像点(“像素”)的物质的量对于碎片离子谱获取而言几乎是不足的。此外，基质辅助激光解吸电离(MALDI)主要用于质谱成像，主要仅产生单电荷离子，这些单电荷离子的碎片化更困难、不敏感且不能传递很多信息。到目前为止，产生碎片离子光谱的尝试示出了可以从图像点的一个或有时为两个高强度肽中获得中等质量的子离子光谱，但是这决不足以用于更大规模的物质鉴定。

在美国专利No.10,197,576 B2(Suckau等人)中已经公开了通过质谱法鉴定薄组织切片中的蛋白质的先进方法，该专利通过引用并入本文。该方法使用两个相似的组织切片，并通过合适的酶消化两个切片中的蛋白质，同时基本上保留组织切片中的生物分子位置。一个切片用于获取消化肽的质量图像，其中各像素中的肽的精确质量生成了各像素的肽图。从另一切片中，提取整体组织切片的消化肽，并通过液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)进行分析，通过电喷雾电离，从而通过消化肽的碎片离子光谱产生蛋白质鉴定。特别是，通过以下对肽进行鉴定：(1)保留时间；(2)精确质量；和(3)离子碎片化模式。如果将属于特定蛋白质的肽的质量与像素的一者中的肽图的消化肽质量进行比较，并且该比较揭示了几种质量一致性，那么根据质量一致性的数量，认为或多或少可靠地鉴定了该蛋白质。

Suckau专利详细描述了薄组织切片的制备、消化步骤和鉴定方法。然而，该方法主要涉及组织切片中较大的蛋白质的鉴定和局部分布。仍然需要正确地鉴定聚糖、脂质、内源性肽、代谢物、药物或其他较小分子。仅通过精确质量在质谱图像中进行鉴定似乎不够可靠。

发明内容

现代质谱仪经常配备有离子迁移率分离装置，该离子迁移率分离装置可以测定离子迁移率并且根据它们的离子迁移率对离子进行分离。本申请利用这种光谱仪，并使用测定的离子迁移率来确定离子的碰撞截面(CCS)。对于大分子，碰撞截面给出了关于分子的折叠结构的信息，而对于小分子，碰撞截面构成了可与精确质量的测定结合使用的其他特征性质，从而鉴定特定的分子离子。在本申请的一个示例性实施方案中，碰撞截面(或简称为离子迁移率值)和精确质量的测定用于鉴定具有较低分子量的物质，并且用于研究具有较低分子量的物质在薄组织切片中的分布。

在根据本申请的方法中，在代表受试组织的第一样本的组织学薄组织切片中鉴定和定位小分子。受试组织的第二样本可为相似的薄组织切片，而在一个备选实施方案中，第二组织样本可以大于薄组织切片。由于小分子有待研究，因此不需要施加酶消化。第一样本组织切片用于测定质谱图像，使用基质辅助激光解吸电离并建立各像素中所有较小分子的精确质量的图。但与所引用的专利的方法不同，尽可能精确地测定所有离子类型的离子迁移率并使所有离子类型的离子迁移率包括在图中。

从组织的第二样本中提取所有可溶性物质，并通过诸如液相色谱法之类的分离方法来对溶液中的物质进行分离，所述组织的第二样本也可为薄组织切片或较大片的组织。然而，第二组织样本不限于单片组织；作为一个实例，约10个至20个薄组织切片可以用作较大的第二组织样本。经提取且经LC分离的物质的电喷雾电离产生多电荷离子。具有内置离子迁移率光谱仪的质谱仪测定了精确质量和离子迁移率，并且将这些测定值与合适的参考数据库进行比较以创建经鉴定的物质的列表。然后，将由组织的第二样本产生的具有精确质量和离子迁移率值的经鉴定的物质的列表用于鉴定薄组织切片的质谱图像的像素中的小分子。

可以通过与来自合适数据库的参考数据进行比较的在分离方法中离子的保留时间、离子的碰撞截面和离子的精确质量的组合来鉴定在100道尔顿至约4000道尔顿的范围内的离子。数据库可以从因特网获取，或者由用户建立或完成。然后，在薄组织切片的像素的质量图中，使用在第二组织样本中可靠地发现的小分子的列表，通过精确质量和碰撞截面来鉴定目的离子。

在本申请的另一实施方案中，将薄组织切片用作第一和第二组织样本这两者。如在其他实施方案中，组织切片首先用于测定具有每个像素的离子质量和离子迁移率图的质谱图像，但是留下足够的材料以在第二步骤中提取目的物质。以这种方式，组织切片也可用作第二组织样本，并且溶解剩余的基质材料产生了还包含所有小分子的溶液，然后可以如上所述对小分子进行分离和鉴定。

特别有利的实施方案基于使用液相色谱、离子迁移率光谱和串联质谱(LC-IMS-MS-MS)的测定来鉴定第二组织样本的小分子，即，可以另外产生碎片离子光谱，并且用于提供更精确的鉴定。通过电喷雾进行电离，从而产生非常适合于碎裂的多电荷离子。可以通过“捕获离子迁移率光谱”(TIMS)进行离子迁移率分离和测定。已知这种鉴定物质的方法名为“PASEF”(平行累积，连续碎裂)。目前，PASEF为用于组织中物质的最有效的鉴定方法。另一实施方案包括酶消化以在相同的测定运行中测定蛋白质，或从糖蛋白或蛋白聚糖中分裂聚糖。

该方法使用具有MALDI离子源和内置离子迁移率光谱仪的质谱仪从而测定第一薄组织切片的质谱图像。对于第二样本的LC-MS测定，应当使用电喷雾离子源，但是也能够将液相色谱与MALDI电离结合。市场上存在具有正交离子输入(OTOF)的飞行时间质谱仪，该飞行时间质谱仪配备有两种类型的离子源(MALDI和ESI)和离子迁移率光谱仪。通常，具有轴向离子输入的MALDI-TOF仪器不配备离子迁移率光谱仪。

为了鉴定和定位组织学薄组织切片的脂质、聚糖、内源性肽、代谢物或其他较小分子，本申请提供了包括以下步骤的第一方法：

a)用具有内置离子迁移率光谱仪的质谱仪获取薄组织切片的物质的质谱图像，并对于图像的各个像素而生成目的小分子的精确质量和离子迁移率值的图；

b)提供受试组织的第二样本并提取第二样本的可溶性分子，对所述可溶性分子进行分离并使用具有内置离子迁移率光谱仪的质谱仪分析所述可溶性分子，以获取由可溶性分子形成的小分子离子的精确质量和离子迁移率；

c)通过将分离方法的保留时间、离子的精确质量和离子迁移率值与参考数据进行比较，来鉴定第二组织样本中的小分子，并创建经鉴定的小分子的列表；以及

d)根据质量和离子迁移率，将列表中的经鉴定的小分子分配到步骤(a)中生成的质量/迁移率图中的条目中。

本申请提供了一种用于对组织学薄组织切片的脂质、内源性肽、代谢物、聚糖或其他较小分子的鉴定和定位的简洁方法。其他预制物适用于包含糖蛋白或蛋白脂质的样本，其中聚糖和脂质是目的物质。为了从蛋白质切割聚糖或脂质，在进行上述方法之前，可以直接对两个组织样本使用酶促或化学方法。

各种方法都有利地将包括电喷雾离子源、MALDI离子源和离子迁移率光谱仪的正交飞行时间质谱仪用于步骤(a)和(b)这两者。离子迁移率光谱仪可为TIMS(捕获离子迁移率光谱仪)，如果目标分子是预先已知的，那么能够与离子迁移率光谱仪一同使用时间缩放以提高迁移率光谱仪的分辨率。用这种方式，可以可靠地对具有非常相似的碰撞截面的异构体进行分离。

在施加基质物质层之后，可以在包括离子迁移率分离器的质谱仪中通过基质辅助激光解吸电离来进行步骤(a)中的质量/迁移率图像的获取。在步骤(b)中，液相色谱或毛细管电泳可以用作分离方法。通常，通过电喷雾对从液相色谱仪或电泳毛细管洗脱的物质进行电离，从而除了产生单电荷离子之外还产生多电荷离子。可以在合适的质谱仪中使这些离子碎裂，并且碎片离子光谱可以用于物质的鉴定，从而扩大鉴定的质量。

在本申请的一个版本中，通过液相色谱进行小分子种类的分离，其中在一个或多个MALDI样本支持板上，将分离出的洗脱液馏分与基质物质一起作为单个样本进行制备。在这种版本中，在配备有MALDI离子源和迁移率光谱仪的质谱仪中测定小分子种类的质量和迁移率光谱。

本申请的其他变型包括通过研究相对于目的小分子种类的均匀覆盖区域而言薄组织切片上的目的小分子种类的分布来过滤错误分配的鉴定，以及随后去除广泛孤立的种类。在分析相同组织的几个薄组织切片时，也能够只进行一次步骤(b)和(c)，并将在步骤(c)中获得的小分子列表用于分配所有薄组织切片的质量/迁移率图像的种类。最后，本申请的方法可以应用于具有或不具有化学稳定化的组织切片。

附图说明

图1为示意性地描述了可用于本申请的捕获离子迁移率光谱仪(TIMS)，其中相邻的电场示意图示出了离子所面对的电场强度如何沿TIMS的漂移管的长度变化的复合图。

图2示意性地描绘了可用于本申请的方法并且包括如图1所示的TIMS的飞行时间(TOF)质谱仪。

图3为表示本申请的方法的基本工作流程的流程图。

具体实施方式

使用配备有离子迁移率分离装置的质谱仪，根据本申请的方法涉及根据离子的离子迁移率对离子进行分离并测定相应的离子迁移率值。然后，根据这些值，计算碰撞截面(CCS)。如上所述，碰撞截面给出了关于分子的折叠结构的信息，在大多数情况下示出了具有不同折叠结构和不同碰撞截面的不同异构体。小分子通常仅存在具有一个单一碰撞截面的一个单一异构体，但是碰撞截面构成了可以与精确质量的测定结合用于分子离子的鉴定的其他特征性质。根据本申请，将碰撞截面的测定与精确质量一起使用，从而鉴定具有较低分子量的物质，并研究这些物质在薄组织切片的质谱图像中的分布。

本申请所用质谱仪使用离子迁移率光谱仪，在示例性实施方案中，如图1所示，该离子迁移率光谱仪为具有平行离子累积的捕获离子迁移率光谱仪(TIMS)。图中所示的TIMS包括分为离子累积器单元11a、随后为离子迁移率扫描单元11b的RF四极离子隧道。在该实施方案中，提供了两个离子源，电喷雾源电离(ESI)源和基质辅助激光解吸电离(MALDI)源。ESI源包括在喷雾流7中产生离子6的喷雾毛细管8。MALDI离子源包括样本支持板9，在样本支持板上用激光照射样本材料和能量吸收基质(如图2所示)，从而引起样本和基质材料的烧蚀和解吸。在本领域中这些类型的电离源是已知的，因此在本文中不进行更详细的讨论。

诸如电喷雾离子6之类的从离子源中的一者产生的离子经离子漏斗10进入TIMS，并通过四极RF场沿其轴对齐。TIMS包括两个DC电压供应单元和在系统的电极之间的电阻器链(未示出)，以用于在两个相应的隧道单元内产生在轴向方向上的两个可控制的电场势垒。气流14驱动离子朝向出口，但是在图1的电场示意图“D”中所示的初始累积期间，在累积器区11a中通过第一DC电场斜坡对抗离子的运动，第一DC电场斜坡具有朝向TIMS出口增加的电场强度E(z)。在累积期间，DC电场斜坡具有沿着累积器单元11a的长度从位置30处的最小值增加到位置31处的最大值的电场强度。如本领域已知的，选择DC电场斜坡的最小值和最大值，使得离子6在恒定气流14的力的作用下根据离子迁移率沿斜坡展开，从而引起离子通过离子迁移率而沿累积器单元11a的长度发生分离。

随后，如图1的电场示意图“E”所示，通过降低在累积器单元中的电场势垒，并使离子在气流14的力的作用下移动到扫描单元11b，从而将累积在累积器单元中的离子释放到扫描单元11b。在扫描单元11b中为第二DC电场势垒，也为斜坡的形式，如累积器单元11a中那样，离子根据离子迁移率沿着势垒的斜坡自身对齐。由于在累积器单元中先前的离子迁移率分离，因而相对快速地实现了该平衡，并且一旦离子已经转移到扫描单元11b，累积器单元中的电场势垒就再次升高，使得可以引入和分离新的离子组。在扫描单元11b中，通过逐渐降低电场势垒斜坡，将离子逐渐扫描出扫描单元11b。这导致离子在气流14的力的作用下离开扫描单元，释放的过程是从最低迁移率的离子到最高离子迁移率的离子。这些离子穿过输出离子漏斗12并进入下游的质谱仪。

图2示出了包括图1的TIMS的正交飞行时间(TOF)质谱仪。在该图中，示出了MALDI离子源的UV脉冲激光器3和激光束4照射可移动样本支持板9上的样本5，并且还示出了ESI离子源，但是本领域技术人员将理解，在任何给定时间，通常两个离子源中仅有一者是可操作的。在TIMS的下游是四极质量过滤器15，四极质量过滤器15可以用于通过质量过滤输入到质谱仪的离子，和/或作为碎裂室，其中较大的离子通过与碰撞气体的离子碰撞而碎片化。TOF质谱仪包括聚焦离子束16的离子的离子透镜系统17，以及用于正交地加速离子朝向离子反射器19的正交脉冲发生器18。如本领域已知的，正交加速的离子16通过离子反射器19反射，并且重新传入离子检测器20，将离子检测器20的输出用于产生质谱。

美国专利No.10,197,576B2提供了一种鉴定方法，该方法基于从相同的大蛋白产生的消化肽质量的多样性。与该方法相比而言，本申请涉及如聚糖、脂质、内源性肽、代谢物、药物或其他较小分子的较小分子的鉴定，这些较小分子不能通过单独的精确质量进行准确鉴定。除了从脂蛋白或糖蛋白中分离脂质或聚糖基团之外，不需要施加酶消化。如在所引用的专利中，使用MALDI电离并且创建在各像素中的所有小分子的精确质量的图，来测定薄组织切片的质谱图像。但是与所引用的专利的方法不同，使用具有离子迁移率分离器的质谱仪，并且测定所有离子类型的碰撞截面并使所有离子类型的碰撞截面包括在像素的质谱图中。

在本申请的示例性实施方案中，使用第二组织样本，提取所有可溶性物质，并在具有离子迁移率分离器的质谱仪(LC-IMS-MS)中通过液相色谱-质谱分析来研究溶液。然后，使用参考数据，通过(1)LC保留时间、(2)精确质量和(3)碰撞截面的组合，来鉴定在100道尔顿至约4000道尔顿的范围内的离子。生成存在于组织中的小分子的列表。然后，在质谱图像的像素的质量图中，可以使用精确质量和碰撞截面鉴定来自列表的离子，从而用于鉴定。以这种方式，可以研究聚糖、脂质、内源性肽、代谢物、药物或其他较小分子在质谱图像中的局部分布。

图3示出了本申请的一般步骤，其中该方法的不同实施方案涉及不同于基本工作流程的变化。如步骤40所示，该方法依赖于两个相似的组织样本，其中第一组织样本为薄组织切片。在本申请的不同实施方案中，第二组织样本可为第二薄组织切片、多个薄组织切片、较大片的相似组织，或者甚至是第一组织切片的重复利用。在步骤42中，获取第一样本(薄组织切片)的小分子的质量/迁移率图像，其中将质量和迁移率映射到图像的像素。在步骤44中，从第二组织样本中提取小分子，并使用诸如液相色谱法之类的分离方法进行分离。然后将与图2的质量/迁移率质谱仪相似的质量/迁移率质谱仪用于从小分子中获取质量/迁移率数据。

在步骤46中使用在步骤44中获取的数据，从而通过将分离过程的保留时间、离子迁移率和精确质量与来自已知小分子的参考数据库的数据进行比较来鉴定小分子。然后生成经鉴定的小分子的列表。使用该列表，在步骤48中通过离子迁移率和精确质量的比较，相对于它们的像素位置鉴定组织切片的小分子。

如上所述，根据具体应用和所涉及的环境，可以使用本申请的不同实施方案。在该方法的非常简单且经济的实施方案中，仅将单个薄组织切片用于提供两个组织样本。在第一步骤(图3的步骤42)中，从组织切片获取具有每像素的质量和离子迁移率图的质谱图像。然而，对于LC-IMS-MS测定，以留下足够的材料从而在第二步骤(步骤44)中提取的方式来进行质谱图像的测定。当使用MALDI电离进行第一步骤时，根据已知的解决方法在第二步骤中除去基质材料通常也提取包埋在基质材料中的目的小分子。然后通过液相色谱、电泳或其他用于溶解物质的分离方法来对基质材料和小分子的溶液进行分离。然后使用包括目的物质的分离保留时间、精确质量和碰撞截面的参考数据库进行小分子的鉴定(步骤46)。

在另一实施方案中，使用两个相似的薄组织切片以用于更高的灵敏度。第二组织样本应当为与第一样本组织切片尽可能相似的组织切片，其中所有组织类型的比例相同。例如，如果第二样本薄组织切片来自附近的切口，并且如果可能，甚至来自相邻的薄切片，那么是有利的。

又一实施方案包括酶消化或化学消化以从糖蛋白或蛋白聚糖中切割聚糖，或从脂蛋白中切割脂质。在以上引用的美国专利10,197,576B2中对消化的方法以及物质分子的位置的保存有一些详细描述。如果使用两个薄组织切片，那么必须在两个薄组织切片上进行切割，并且重要的是，对于两个薄组织切片，以相同的方式进行任何化学或酶消化。例如，非常有利的是，对并排的两个相邻的薄组织切片施加相同的喷雾和孵育方法，以实现尽可能相似的切割。

为了获取质谱图像，该方法使用如MALDI或解吸电喷雾电离(DESI)的解吸离子源和具有内置离子迁移率分离装置的质谱仪。对于第二组织样本的LC-MS测定，可以使用电喷雾离子源，但是也能够将液相色谱与MALDI电离结合。用于这些测定的特别简洁的方法使用液相色谱以对从第二组织样本中提取的小分子进行分离，并将分离出的洗脱液馏分与基质物质一起作为单个样本施加在一个或多个MALDI样本支持板上。通常以这种方式制作384个至1536个样本，并且可以将商业生产的移液机器人用于该任务，该移液机器人与液相色谱仪耦合并且自动地涂覆样本支撑板。然后，能够在配备有用于测定离子迁移率的相应控制程序的MALDI飞行时间质谱仪中自动测定来自样本支持板上的样本的小分子的质谱。然后在原则上，无限的时间(直到所有样本材料都用尽)可用于样本的测定，所述样本可以各自包含若干小分子种类。在美国专利No.7,070,949B2(D.Suckau等人)中对这种方法(没有离子迁移率光谱仪)进行了详细描述，并且已知缩写名为“LC-MALDI”。

在本申请中，使用LC-MALDI从而测定第二组织样本提供了两个组织样本的小分子通过相同的电离方法进行电离的优点。因此，如果离子迁移率或光谱的其他特性受到电离方法的影响，那么这种影响对于两个薄组织样本的样本而言是相同的。

如上所述，本申请的示例性实施方案使用具有内置离子迁移率光谱仪的质谱仪，内置离子迁移率光谱仪可为TIMS。TIMS的优点在于，对于不同的应用，可以容易地调节离子迁移率分辨率。例如，具有完全相同质量的不同小分子的离子迁移率有时非常相似。使用TIMS能够容易地调节扫描速度，这进而能够根据需要改变离子迁移率分辨率，从而区分具有非常相似的离子迁移率的小分子，例如具有相似碰撞截面的异构体。例如，在具有预先已知的非常相似的离子迁移率的小分子的针对性分析中，或者为了尽可能精确地测定碰撞截面，通过控制扫描速度从快到慢再回到快，TIMS能够围绕具有非常相似的离子迁移率的小分子对的离子迁移率对离子迁移率分辨率进行缩放。在单次扫描中，甚至多于一对的分子类型可以在单次扫描中进行缩放。

为了鉴定和定位组织学薄组织切片的脂质、内源性肽、代谢物、聚糖或其他较小分子，本申请提供了包括以下步骤的第一基本方法：

a)提供由薄组织切片组成的第一组织样本和来自与第一组织样本相同的整体组织材料的第二组织样本；

b)使用具有内置离子迁移率光谱仪的MALDI质谱仪，获取第一薄组织切片中的物质的质量/迁移率图像，从而确定并存储各像素中的一些或所有离子种类的精确质量和离子迁移率的图；

c)从第二组织样本中提取所有可溶性分子，通过色谱或电泳分离方法进行分离，并通过具有内置离子迁移率光谱仪的质谱仪进行研究，从而获取质量范围为200道尔顿至4000道尔顿的小分子的质量和离子迁移率；

d)通过将物质分离器的保留时间、第二组织样本的离子的精确质量和离子迁移率与合适数据库中的参考数据进行比较，鉴定第二组织样本的小分子，由此产生聚糖、脂质、内源性肽、代谢物、药物、代谢物或其他较小分子的列表；以及

e)基于分子的精确质量和分子的离子迁移率，将列表中一些或所有经鉴定的分子的身份分配到具有相同质量和离子迁移率的第一组织样本的薄组织切片的质谱图像的像素的质量/迁移率图中的条目中。作为结果，这些小分子在薄组织切片中的分布可以以图形表示并进行相应的研究。

为了鉴定和定位组织学薄组织切片的脂质、内源性肽、代谢物、聚糖或其他较小分子，本申请还提供了包括以下步骤的第二方法：

a)提供单个薄组织切片并准备该单个薄组织切片以使用MALDI基质材料进行成像；

b)使用具有内置离子迁移率光谱仪的MALDI质谱仪获取组织切片中的物质的质量/迁移率图像，确定并存储各像素中的一些或所有离子种类的精确质量和离子迁移率的图；

c)从同一组织切片中提取并溶解基质物质和目的小分子，通过色谱或电泳分离方法对目的小分子进行分离，并使用具有内置离子迁移率光谱仪的质谱仪来获得经提取并分离出的在质量范围为200道尔顿至4000道尔顿的小分子的质量和离子迁移率；

d)通过使用来自合适数据库的参考数据比较物质分离器的保留时间、小分子离子的精确质量和离子迁移率来鉴定小分子，从而创建聚糖、脂质、内源性肽、代谢物、药物、代谢物或其他较小分子的列表；以及

e)使用该列表，基于列表中的一些或所有经鉴定的分子的精确质量和它们的离子迁移率，将该列表中的一些或所有经鉴定的分子的身份分配到在步骤(b)中获得的质量/迁移率图像的像素的质量/迁移率图中的条目中。然后，这些小分子在薄组织切片中的分布可以以图形表示并进行相应的研究。

步骤(b)和(c)的两个质谱获取过程可能需要数小时甚至数天，这取决于薄组织切片的尺寸、扫描光栅的宽度、色谱分离的持续时间和色谱馏分的数量。在商业生产的质谱仪中，基本上自动进行这些步骤，并且在各种情况下都产生具有千兆字节至兆兆字节的量级的数据量。基本上通过与来源于包括分离保留时间、精确质量和碰撞截面的光谱文库的光谱进行比较，可以使用来自步骤(c)中的保留时间/质量/迁移率测定的数据来确定目的小分子。可以过滤数据库，使得仅考虑目的小分子。根据组织的差异，对于薄组织切片可以鉴定高达1,000种类型的小分子，但是通常只有少量分子形成研究的焦点。

使用具有平行离子累积的TIMS(图1和图2)，可收集由若干激光发射产生的离子。可以在至多10千赫兹的任何频率操作MALDI激光器3。通常，连续操作激光器是有利的，并且在这种情况下，平行累积是有利的。然而，在本申请的另一实施方案中，使用简单的TIMS代替具有离子的平行累积的TIMS。尽管简单的TIMS缺乏可以从若干次激光发射中摄取离子的累积单元的优点，但是可以用单一MALDI激光发射来操作简单的TIMS。在这种系统中，使用相应数量的激光发射，每秒可以进行20次至50次TIMS扫描。

避免分配不明确的重点在于用于图像中小分子的质量确定的测定精度。质量可以确定得越准确，对于薄组织切片的图像像素的质谱中的单一同位素质量而言，在测定误差范围内可能的备选小分子的数量将越少。无论是通过质谱仪的内部重新校准、通过在较低质量下实现较高质量分辨率的操作方法、还是通过诸如正交飞行时间质谱仪或甚至傅立叶变换质谱仪之类的具有可更精确地操作的分析器的质谱仪，在获取薄切片的质谱图像中的质量精度的每一次增加都是有利的。

尽管示例性实施方案使用低温冷冻的组织的薄切片，但是该方法也可以应用于化学稳定组织的薄切片。通过这种新的类型的分子成像分析，容易获得通过FFPE或相似方法稳定的来自临床档案的组织样本(包括非常老的样本)。

Claims (14)

1.一种用于在代表受试组织的第一样本的组织学薄组织切片中鉴定和定位小分子的方法，该方法包括：

a)用具有内置离子迁移率光谱仪的质谱仪获取所述薄组织切片的物质的质谱图像，并且对于所述图像的各个像素而生成小分子离子的精确质量和离子迁移率值的图；

b)提供所述受试组织的第二样本并提取所述第二样本的可溶性分子，对所述可溶性分子进行分离并使用具有内置离子迁移率光谱仪的质谱仪分析所述可溶性分子，以获取由所述可溶性分子形成的小分子离子的精确质量和离子迁移率；

c)通过将分离方法的保留时间、所述离子的精确质量和离子迁移率值与参考数据进行比较，来鉴定所述第二组织样本中的所述小分子，并创建经鉴定的小分子的列表；以及

d)根据质量和离子迁移率，将所述列表中的经鉴定的小分子分配到步骤(a)中生成的所述质量/迁移率图中的条目中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组织样本为所述受试组织的第二薄组织切片。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组织样本包括所述受试组织的多个薄组织切片。

4.根据权利要求1所述的方法，其中第二组织切片包括比所述薄组织切片大的一片所述受试组织。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在获取所述质谱图像之后，将所述薄组织切片用作所述第二组织样本。

6.根据权利要求1所述的方法，其中在质谱分析之前，使所述第二组织样本的经提取和分离的小分子的所述离子碎片化，并且步骤(c)中的所述小分子的所述鉴定是基于保留时间、精确质量、离子迁移率和碎片离子光谱。

7.根据权利要求1所述的方法，其中目标小分子种类为复合化合物中的聚糖或脂质基团，并且其中进行两种组织样本的糖复合物或脂质复合物的酶消化以从所述复合化合物上切割聚糖或脂质，以位置保存的方式对所述组织切片进行所述酶消化。

8.根据权利要求1所述的方法，其中使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)进行质谱图像的所述获取。

9.根据权利要求1所述的方法，其中使用液相色谱或毛细管电泳进行所述可溶性分子的所述分离。

10.根据权利要求1所述的方法，其中使用质谱仪分析所述可溶性分子包括通过电喷雾电离(ESI)进行电离。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，在对所述可溶性分子进行分离之后，在一个或多个基质辅助激光解吸电离(MALDI)样本支持板上，将分离出的馏分与基质物质一起作为单个样本进行制备，并且使用质谱仪对所述可溶性分子的所述分析包括用MALDI离子源进行电离。

12.根据权利要求1所述的方法，其中相对于目的小分子种类的均匀覆盖区域研究目的小分子种类在所述薄组织切片上的分布，并且其中，从所述质量/迁移率图中省略广泛孤立的种类。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中分析相同组织的多个薄组织切片，并且步骤(b)和(c)仅进行一次，在步骤(c)中获得的所述小分子列表用于在步骤(d)中将经鉴定的小分子分配到各个所述薄组织切片的所述质量/迁移率图的种类中。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织切片为化学稳定的组织切片。

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