JP2010215636A - 分化調節薬剤およびその使用法 - Google Patents

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Abstract

【課題】肥満症、脂肪腫、脂肪腫症、悪液質、もしくは脂肪異栄養症を含むがそれらに限定されない脂肪症関連状態、または外傷もしくは萎縮性状態における脂肪組織の消失を治療もしくは防止するための方法における、前脂肪細胞の分化能力および／または増殖を調節するための方法および薬剤の提供。
【解決手段】線維芽細胞増殖因子（FGF）シグナル経路、特にFGF-1もしくはFGF-2シグナル経路を調節するための方法および調節する薬剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般に前脂肪細胞（preadipocyte）の分化能力および/または増殖を調節するための方法および薬剤に関する。より詳細には、本発明は、前脂肪細胞の増殖を引き起こし、かつ前脂肪細胞が脂肪細胞へ分化するのを増強する線維芽細胞増殖因子（FGF）シグナリング、特にFGF-1およびFGF-2シグナリングに関する。さらにより詳細には、本発明は、FgfもしくはFgfrポリヌクレオチドまたはそれらの発現産物に対して特異的なアンタゴニスト分子を含むFGFシグナリングを減少させる、損傷させる、または阻止する分子に、ならびに前脂肪細胞の分化能力および/または増殖をダウンレギュレートすることを含む脂質生成の負の調節のためのこれらの分子の使用に関する。本発明は、前脂肪細胞の分化能力および/または増殖を増加させるための、FgfポリヌクレオチドおよびFGFポリペプチドを含むFGFもしくはFGFRアゴニスト分子、ならびにそれらの生物活性フラグメント、変異体および誘導体の使用にも及ぶ。さらに本発明は、Fgf遺伝子もしくはFgfr遺伝子、またはFgf遺伝子もしくはFgfr遺伝子と同一の生合成もしくは調節経路に属する遺伝子から選択された遺伝子の発現を調節する段階を含む、FGFシグナリングをアゴナイズ（agonise）する、もしくはFGFシグナリングをアンタゴナイズ（antagonise）するために、またはその遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を調節するために有用である薬剤をスクリーニングする方法にも及ぶ。その上、本発明は肥満症、脂肪腫、脂肪腫症、悪液質もしくは脂肪異栄養症を含むがそれらに限定されない脂肪症関連状態、または外傷もしくは萎縮性状態における脂肪組織の消失を治療もしくは防止する方法におけるそのような調節薬剤の使用に関する。
肥満症
肥満症はもはや従来の「西洋化された」地域社会に限定されない全世界的に重大な健康上の問題となっているが、それは民族特有の伝統的な生活様式に優先して伝統的な「西洋」諸国の高脂肪食および定住性生活様式が取り入れられてきたためである（Dollら、Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.26（1）:48-57,2002：非特許文献１）（Fall.Br.Med.Bull.60:33-50,2001：非特許文献２）。肥満症、および特に小児における肥満症の発生率は、ほぼすべての他の医学的状態より速い速度で増大しつつある。世界中でおよそ2千2百万人の5歳未満の小児が過体重であり（Deckelbaumら、Obes.Res.,9,Suppl.4:239S-243S,2001：非特許文献３）、世界中で7％を超える成人が肥満症であり、さらに成人の21％が過体重であると分類されている（Seidell.Acta.Paediatr.,Suppl.88（428）:46-50,1999：非特許文献４）。世界保健機関は、世界的な成人における肥満症の高発生率を「世界的な汎流行病」と表現している。
肥満症と心血管疾患やII型糖尿病（Fall,2001、前記：非特許文献２）等の重篤な共存症（co-morbidity）との関連は、肥満症が重篤な医学的状態として分類される原因である（Jamesら、Obes.Res.9.Suppl.4:228S-233S,2001：非特許文献５）。肥満症は結果として医療予算に重大な経済的影響を及ぼすために、肥満症の管理および防止は健康促進戦略にとって最優先課題になっている。そのような戦略の目的はカロリー制限や運動を増やすことによる体重の減少であるが、そのような目標の前提は病的に肥満している個人においてさえ体重の減少が肥満症関連病理の緩和もしくは改善をもたらせるという証拠に基づいている（Melissasら、Obest.Surg.11（4）:475-81,2001：非特許文献６）。
残念なことに、そのような戦略はこれまである程度の成果しか得られていない。世界中で肥満症率が継続的に増加していることにより、これらの肥満症の管理および防止戦略の焦点は代謝性および遺伝性治療介入への転換を余儀なくされてきた。そのような介入が成功するには、脂肪沈着の細胞機序に関する詳細な理解が必要とされる。
ヒト脂肪組織は、生涯を通して細胞内に蓄積されるトリグリセリドおよび脂肪細胞両方の普段の流動を伴う動的器官である。新規脂肪細胞は、脂質生成として知られるプロセスである前脂肪細胞の増殖および分化によって形成される。前脂肪細胞は脂肪組織の間質-血管区画内で見いだされる線維芽細胞様細胞である。脂質生成を阻害する治療的介入は、重度の過体重患者の管理において重要な臨床的用途を有するであろう。
これまでに実施された研究では、脂肪細胞のサイズおよび数における変化の基礎にある細胞性事象および分子性事象の数種のタンパク質、神経ペプチドおよび転写調節因子が発見されている。これらの薬剤の作用は、脂肪細胞の数およびサイズが細胞-細胞様式または細胞-マトリックス様式で機能する分子を介して下流シグナリングを誘発するホルモンや栄養によるきっかけ（cue）を含む、複雑な相互作用において変化することを示唆している（Gregoire Exp.Biol.Med.（Maywood）226（11）:997-1002,2001：非特許文献７）。これらの分子の全範囲、ならびにそれらが相互作用して脂肪細胞へ作用を発揮する方法についてはいまだ確証されていない。
脂質生成については、動物およびヒト前脂肪細胞の単離、ならびにインビトロの複製および分化を可能にする技術の開発を通して多くのことが突き止められてきた。さらに、インビトロで脂肪細胞様細胞へ分化するマウス前脂肪細胞系（例、3T3-L1）についての試験により詳細な洞察が獲得されてきた。
ヒト組織については、前脂肪細胞はコラゲナーゼ消化を使用して脂肪組織から単離され、血清含有培地中でプレーティングされる。コンフルエンスに達すると（事前に継代培養を行って、または行わずに）、細胞は血清無含有の化学修飾およびホルモン修飾培地中で分化する。このプロセスは、時間がかかる、および成熟脂肪細胞の表現型を獲得する細胞の比率が低いというどちらにおいても比較的非効率である。
複製期はマイトジェンおよびインスリンにより強化され、血清を必要とする。分化期は、血清によって完全に阻害され、インスリン、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、および成長ホルモンによって強化される。近年、チアゾリジンジオン（TZD）クラスの薬物が、脂質生成にとって重要なリガンド依存性転写因子であるPPARγへの結合を介して分化を刺激することが証明された。
本発明につながった研究では、血管細胞と脂肪細胞の間で相互作用が発生するという仮説に取り組んだ。脂質生成には微細血管網の確立が先行することが知られており（Hutleyら、Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.281（5）:E1037-44,2001：非特許文献８）、前脂肪細胞と微小血管構造の内皮細胞との間でパラクリン相互作用が発生すると提案されてきた（Hutleyら、前記：非特許文献８）（Varzanehら、Metabolism.43（7）:906-12,1994：非特許文献９）。候補パラクリン化合物の単離を試みて、本発明者らはヒト前駆脂肪細胞と微小血管内皮細胞（MVEC）とを共培養し、その結果としてFGF-1としても知られる酸性線維芽細胞増殖因子（aFGF）が培地中に存在することを見いだした。初期の試験は予想外にも、この増殖因子の起源が主としてMVECであること、そして以前の試験とは反対に、前脂肪細胞とFGF-1との共培養がそれらの増殖および複製を顕著に促進し、さらに成熟脂肪細胞への細胞の分化に有意なプラスの作用を及ぼすことを示唆した。FGFファミリーの様々なメンバー間には潜在的な機能的重複性があるために、一つまたは複数の他のFGFもまた脂質生成を直接的または間接的に調節することに関連する可能性があると考えられる。実際に、初期の研究は、FGF-1によって示された作用に類似する塩基性FGF（FGF-2としても知られる）について前脂質生成性（pro-adipogenic）作用を示唆している。
FGF
構造的に関連するポリペプチド増殖因子の線維芽細胞増殖因子ファミリーは、多様な認識された作用を備える20種を超えるメンバーを含む。ファミリー間には限定された直接的コード配列相同性が存在する。この名称は増殖の刺激がファミリーメンバー間で普遍的ではないので誤解を招きやすいが、FGFは1ファミリーとして、増殖および発生、細胞複製および血管形成、細胞生存およびアポトーシス、ならびに腫瘍発生および形態形成において極めて重要な役割を果たす。FGFは、一部はFGFと類似もしくは相補的作用を備える極めて多数の増殖因子を含むより規模の大きなヘパリン結合性増殖因子ファミリーに属している。
FGFは多数の様々な遺伝子によってコードされ、図1〜6における3つのコード領域とともに、類似のイントロン-エキソン構成を有する。120アミノ酸の重要な中心核領域は高度に保存されているが（70〜100％同一性）、他の領域は顕著な配列多様性を示す。FGFは、シグナルペプチドもしくは局在化配列の存在下およびグリコシル化部位ならびに翻訳後の修飾において変化する。FGFの多くは、選択的プロモーターの使用（例、FGF-1）、選択的スプライシング（例、FGF-1およびFGF-2）ならびに選択的ポリアデニル化部位の使用（例、FGF-1およびFGF-2）を含む多様性を示す。作用の特異性を提供する1つの機序は、組織特異的プロモーターの使用（例、FGF-1）である。
すべてのFGFは細胞から遊離できるが、一部は産生細胞および標的細胞の核もしくは細胞質中に蓄積することもある。さらに、分泌されたFGFは細胞外マトリックス内に貯蔵され、それ以降のそれらの遊離はプロテアーゼ制御下にある。FGFは、2つの機序のどちらかによって細胞外マトリックスから「遊離」される。第1の機序では、プロテアーゼまたはヘパリナーゼによる細胞外マトリックス成分の酵素的開裂がFGFの遊離を生じさせる。第2の機序では、FGFが担体タンパク質（FGF-BP）へ結合し、これが順にFGFをその受容体へ送達することができる。ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンが効率的なFGFシグナリングのために必須であることは容認されている。一部のFGFの発現については、組織特異性および/または分化段階特異性が報告されている。
FGFファミリーと細胞外マトリックスの成分との関連は、a）循環プロテアーゼ分解からのFGFの保護、およびb）増殖因子の局所的レザバーの製造の2つの目的に役立つと考えられる:。後者の機能はFGFシグナリングの厳密な空間的調節を可能にするが、それは細胞外マトリックスと接触している細胞しかFGFシグナルを受信できないためである。
FGF受容体
リガンドと同様に、FGF受容体（FGFR）は（少なくとも）5つの構造的に関連するタンパク質をコードする遺伝子ファミリーを含んでいる。それらはチロシンキナーゼクラスの受容体のメンバーであり、広範囲に発現する。5つの受容体のアミノ酸配列は、シグナル伝達に関係する最高に保存された領域を含む60〜95％である。FGFは受容体への結合において相違する特異性を有しており、そしてこれは、受容体およびそれらのスプライス変異体の細胞特異的発現とともに、シグナルオプションにおけるさらなる多様性を提供する。原形質膜内の局在化に加えて、FGFRは核エンベロープおよびマトリックス内でもまた発現する。FGFに反応したシグナル伝達は、受容体の二量体化およびヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）との複合体形成を通して発生する。その後のFGFRの細胞内ドメイン上の複数部位でのリン酸化は、複数の下流シグナル伝達分子および経路の動員および/またはリン酸化を開始させる。3つまでの特徴的なIg様細胞外ドメインがあり、それらはFGFRをIG受容体スーパーファミリー（PDGFRおよびIL-1Rも含有する）内に配置する。
FGFシグナリングの多様性は、受容体の細胞特異的発現の組み合わせ、受容体アイソフォームの細胞特異的発現の組み合わせ、様々なヘテロダイマーの組み合わせ、および様々な範囲のFGFによって提供される。
HSPG
HSPGは、コアタンパク質へ共有結合している硫酸化グリコサミノグリカンであり、FGF-FGFR相互作用を促進するように機能する。これは、FGFおよびFGFRにおける構造変化を誘導して各々が二量体化かつ結合することを許容するHSPG、またはFGFおよびFGFRとの活性なシグナリング複合体の一部を形成するHSPGのいずれかに起因する可能性がある。両方のモデルを支持する実験的証拠が存在しており、両方の機序が存在することは高度に想定できる。一部のFGFの初期の反応はHSPGの非存在下で引き出される可能性があるが、持続的なシグナリングのためにはHSPGが不可欠であると思われる。HSPGは細胞外マトリックス内での分解からFGFを保護するためにも機能する。これまでにFGFシグナリングに関連付けられているHSPGには、シンデカン（細胞関連性膜貫通プロテオグリカン）、グリピカン（グリコシルホスファチジルイノシトール基によって原形質膜へ固定されたプロテオグリカン）およびパールカン（細胞外基底板プロテオグリカン）が含まれる。HSPGがFGFシグナリングの調節に関係しているという証拠は、インビトロ試験および公知のHSPG突然変異を有する個体についての試験から得られている。これらの試験は、例えばグリピカンがFGF-2誘導性有糸分裂誘発を促進できるが、FGF-7反応を阻害することを示している。
システインに富むFGFR
システインに富むFGFR（CFR）は、ヘパラン硫酸鎖が欠如した、FGFを結合する内在性膜シアロ糖タンパク質である。CFRおよびFGFRへのFGFの結合は相互に排他的である。CFRは、細胞内部位へのFGFターゲティングおよび細胞内FGF濃度の調節において役割を果たすと思われる。
FGFシグナル経路
1.FGFR-依存性細胞内シグナリング
上記に述べたように、そして図1に示したFGFシグナル経路の略図を参照すると、リガンド結合は受容体の二量体化および自己リン酸化を誘導する。突然変異分析は、シグナル伝達のためには二量体化単独で十分であることを示唆している。FGFRは多数の細胞内リン酸化部位（FGFR-1の場合には7つ）を有しており、リン酸化部位を突然変異させ、キナーゼを死滅させると、受容体はFGFの多数の生物学的シグナルを伝達することができない。しかし、一部の作用は維持されており、これは非受容体媒介性シグナル経路が重要な検討課題であることを示唆している。
FGF/FGFRによって利用されることが公知であるシグナル経路は、（1）SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK経路、および（2）PLCγ、PKC、Ca2＋経路である。
a）SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK経路
受容体のリン酸化に引き続いてsrcホモロジー（SH-2）ドメイン含有およびホスホチロシン結合（PTB）ドメインタンパク質は特定の細胞内FGFRホスホチロシンへ結合する。これらのタンパク質には、PLCγ、SHC、およびFRS2（FGFR基質2）が含まれ、これらの分子の一部はFGFRに特異的であり（例、FRS2）、その他はより乱交雑である（例、SHC）。リン酸化すると、これらのドッキングタンパク質はRASへのアダプターとして機能するGRB2-SOS複合体へ直接的に結合する。膜関連性RASは次にMAPK伝達経路を動員して活性化する。
MAPK経路における複数のキナーゼ各々がFGF（および他の）受容体の下流にある他のシグナル分子によって調節され、この「相互干渉（cross-talk）」が多くの反応特異性を許容することは注目に値する。
b）PLCγ、PKC、Ca＋＋経路
PLCγはSH-2ドメインタンパク質であり、FGFR内の特定のホスホチロシン（FGFR-1中のY766）へ結合し、引き続きホスホイノシトールをイノシトール1,4,5三リン酸（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）へ加水分解する。IP3は細胞内貯蔵からのCa2＋遊離を誘導するが、他方DAGはセリン/トレオニン特異的キナーゼであるPKCを活性化する。
概して、FGF刺激の生物学的結果は、他のシグナル分子および経路からの調節に加えて、細胞内で見いだされるFGF、FGFR、HSPGおよびシグナル中間体の量、組み合わせおよび細胞内局在に左右される。
2.FGFターゲット遺伝子
FGF処理は、多数の遺伝子の発現を変化させ、かつ非FGFR媒介性機序を介して変化させることができる。これは直接作用であると推定され、かつ多数のFGFは核ターゲティングモチーフを有しており、核内および核小体内で、ならびにクロマチンと関連して見いだされる。FGFが遺伝子転写に及ぼす作用は細胞型特異的である。さらに、FGFは初期誘導が他の因子に左右される遺伝子の発現を維持することが証明されている。転写調節に加えて、FGFはmRNAの安定性ならびにタンパク質の翻訳および翻訳後修飾にも影響を及ぼす。
3.他の増殖因子シグナル経路との相互作用
FGFは多数の他の増殖因子をアンタゴナイズできる、またはそれらと相乗作用することができる。FGFとトランスフォーミング増殖因子（TGF）、インスリン様増殖因子-1（IGF-1）、およびWNTシグナリングとの協同性は一般的である。
上記から、本発明に従ってFGFシグナル経路、特にFGF-1もしくはFGF-2シグナル経路の分子の使用によって、特に脂肪症関連状態における脂質生成を促進または阻害する薬物標的および調節因子の両方を提供でき、かつ下記で説明するように肥満の素因についての診断マーカーも提供できることが提案される。
Dollら、Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.26（1）:48-57,2002 Fall.Br.Med.Bull.60:33-50,2001 Deckelbaumら、Obes.Res.,9,Suppl.4:239S-243S,2001 Seidell.Acta.Paediatr.,Suppl.88（428）:46-50,1999 Jamesら、Obes.Res.9.Suppl.4:228S-233S,2001 Melissasら、Obest.Surg.11（4）:475-81,2001 Gregoire Exp.Biol.Med.（Maywood）226（11）:997-1002,2001 Hutleyら、Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.281（5）:E1037-44,2001 Varzanehら、Metabolism.43（7）:906-12,1994
そこで1つの局面では、本発明は特に脂肪症関連状態の治療もしくは予防において有用な脂質生成を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般にFGFシグナル経路を調節するために十分な時間および条件下で細胞をある薬剤と接触させる段階を含む。いくつかの態様では、FGFシグナル経路はFGF-1シグナル経路およびFGF-2シグナル経路から選択される。これらの経路の代表的メンバーには、FGFR、HSPG、SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK経路のメンバー、PLCγ-PKC-Ca2＋経路のメンバー、FGF-1核移行経路のメンバー、ならびにP34およびFIF（FGF-相互作用因子）等の細胞内結合パートナーが含まれるが、それらに限定されない。適切な薬剤の非限定的例には、本明細書で詳細に説明するように、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質、もしくは他の有機分子（炭素を含有する）または無機分子等の小分子が含まれる。
いくつかの態様では、細胞は遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性を調節する薬剤と接触させられ、このとき遺伝子はFgf遺伝子（例、Ffg-1またはFgf-2）およびFgf遺伝子と同一の調節経路または生合成経路に属する遺伝子（例、P34およびFIF）から選択される。これらの態様では、細胞は適切には微小血管内皮細胞またはその前駆体である。
他の態様では、細胞は遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を調節する薬剤と接触させられ、このとき遺伝子はFgfr遺伝子（例、Fgfr-1、Fgfr-2、Fgfr-3、Fgfr-4、Fgfr-5、特にFgfr-1、Fgfr-2、Fgfr-3、Fgfr-4）、Fgfr遺伝子と同一の調節経路もしくは生合成経路に属する遺伝子（例、Ras-Raf-MAPキナーゼ経路および/またはホスホリパーゼC経路を介するシグナリングに関係する遺伝子）、その発現がFgf遺伝子の発現産物によって直接的もしくは間接的に調節される遺伝子（例、PPARγ、IGFBP-3、IGFBP-6、IGF-2、IRS-2、PI3キナーゼ、PKCθ）、またはそれとFGFが相互作用するFGFRの機能をアゴナイズするもしくはそれらの機能をアンタゴナイズする遺伝子（例、FGF-1もしくはFGF-2）から選択される。これらの態様では、細胞は適切には前脂肪細胞またはその前駆体である。
いくつかの態様では、薬剤は遺伝子（例、Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、Igfbp-6）の発現またはその遺伝子の発現産物（例、FGFR-1、FGFR-2、PPARγ、C/EBPα、PLCγ2、IGFBP-3、IGFBP-6）のレベルもしくは機能活性を減少させる。他の態様では、薬剤は遺伝子（例、Fgf-1、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、Pkcθ）の発現、またはその遺伝子の発現産物（例、FGF-1、FGF-3、IGF-2、IRS-2、PI3キナーゼ、PKCθ）のレベルもしくは機能活性を増加させる。さらに他の態様では、薬剤はFGFRとFGFとの相互作用を減少させる、または阻止することを含めて、FGFRの機能をアンタゴナイズする。これらの態様では、その薬剤はFGFシグナル経路をアンタゴナイズし、このために前脂肪細胞の分化能力および/または増殖を直接的もしくは間接的に減少させる、または阻止するために有用である。
いくつかの態様では、薬剤は遺伝子（例、Fgf-l、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、Pkcθ）の発現またはその遺伝子の発現産物（例、FGF-1、IGF-2、IRS-2、PI3キナーゼ、PKCθ）のレベルもしくは機能活性を減少させる。他の態様では、薬剤は遺伝子（例、Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、Igfbp-6）の発現または遺伝子の発現産物（例、FGFR-1、FGFR-2、PPARγ、C/EBPα、PLCγ2、IGFBP-3、IGFBP-6）のレベルもしくは機能活性を増加させる。さらに他の態様では、薬剤はFGFRとFGFとの相互作用を強化する、促進する、さもなければ可能にすることを含めて、FGFRの機能をアゴナイズする。これらの態様では、薬剤はFGFシグナル経路をアゴナイズするので、このため前脂肪細胞の分化能力および/または増殖を直接的もしくは間接的に増加させるために有用である。
適切には、薬剤は遺伝子の発現またはその遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性をその薬剤の非存在下における発現、レベルもしくは機能活性と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％増加または減少させる。
さらにまた別の局面では、本発明はFGFシグナル経路を調節する薬剤を同定する方法を提供する。これらの方法は、典型的には調製物を試験薬剤と接触させる段階を含み、このとき調製物は、（i）FGFシグナル経路のポリペプチド成分の少なくとも生物活性フラグメント、またはその変異体もしくは誘導体に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または（ii）レポーター遺伝子に機能的に連結している成分を調節する遺伝子配列の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドを含む。試験薬剤の非存在下で正常もしくは基準のレベルおよび/または機能活性と比較して、レポーター遺伝子のポリペプチド成分、または発現産物のレベルおよび/または機能活性において検出された変化は、その薬剤がFGFシグナル経路を調節することを示唆する。
本発明のさらにまた別の局面は、FGFシグナル経路を調節する薬剤を同定する方法を提供する。これらの方法は、一般にFGFRを発現する細胞の第1サンプルとFGFとを接触させてマーカーを測定する段階；FGFRを発現する細胞の第2サンプルと薬剤およびFGFとを接触させてマーカーを測定する段階；および細胞の第1サンプルのマーカーと細胞の第2サンプルのマーカーとを比較する段階を含む。様々な態様では、これらの方法は様々なマーカー（例、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ；G3PDH、およびFGF経路の細胞内成分）、または前脂肪細胞の増殖および/または分化と関連するマーカーの組み合わせのレベルを測定する。
本発明によると、上記で広範に記載した薬剤は脂肪症関連状態における脂質生成を調節するために有用である。脂肪症関連状態には、肥満症、脂肪腫、脂肪腫症、悪液質、もしくは脂肪異栄養症、または外傷もしくは萎縮性状態における脂肪組織の消失が含まれるが、それらに限定されない。そこで、本発明の他の局面は、脂質生成を阻害する、もしくは減少させるため、または肥満症もしくは脂質生成における局所性で異常に上昇している脂質生成を制御するために、任意で薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含めて調製される薬剤の使用を企図しているが、このときその薬剤は上記で広範に記載したFGFシグナル経路をアンタゴナイズする。
さらにまた別の局面では、本発明は悪液質の治療もしくは予防または脂肪症における局所性欠乏症（localised deficiency）の状態において脂質生成を刺激するために任意で薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含めて調製される薬剤の使用に関するが、このときその薬剤は上記で広範に記載したFGFシグナル経路をアゴナイズする。
上記の方法で使用する薬剤は、上記で広範に記載した遺伝子の発現産物の少なくとも一部分、またはその発現産物の変異体もしくは誘導体、またはその遺伝子の発現を調節する遺伝子配列を含む調製物と薬剤とを接触させる段階；および遺伝子配列の発現産物、変異体、もしくは誘導体、またはその遺伝子配列から発現した産物の少なくとも一部分のレベルもしくは機能活性の変化を検出する段階によって決定されるように、上記で広範に記載した遺伝子の発現産物、または遺伝子の発現を調節する遺伝子配列（例、転写エレメント）に結合することを特徴とする。
いくつかの態様では、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤は、FGFもしくはFGFRポリペプチド、またはその生物活性フラグメント、またはこれらの変異体もしくは誘導体、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列を含む調製物を接触させる段階；およびFGFもしくはFGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、変異体もしくは誘導体、または遺伝子配列から発現した産物のレベルもしくは機能活性の減少を検出する段階によって決定されるように、FGFもしくはFGFRに、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列（例、転写エレメント）に結合する。
他の態様では、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤は、FGFRおよびFGFとその薬剤とを接触させてFGFRとFGFとの結合を測定する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする。これらの態様では、薬剤はFGFまたはFGFRへ結合することができ、それらがFGFRとFGFとの結合を減少させた、または阻止した場合に試験結果は陽性となる。薬剤は、FGFもしくはFGFRに特異的な小分子または抗原結合分子であってよい。
他の態様では、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤は、FGFRおよびHSPGと薬剤とを接触させてFGFRとHSPGとの結合を測定する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする。これらの態様では、薬剤はFGFまたはHSPGへ結合することができ、それらがHSPGとFGFRとの結合を減少させた、または阻止した場合の試験結果は陽性である。それらの化合物は、FGFRまたはHSPGに特異的な小分子または抗原結合分子であってよい。
他の態様では、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤は、FGFおよびCFRと薬剤とを接触させてFGFとCFRとの結合を測定する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする。これらの態様では、薬剤はFGFまたはCFRへ結合することができ、それらがFGFとCFRとの結合を減少させた、または阻止した場合に試験結果は陽性となる。それらの化合物は、FGFまたはCFRに特異的な小分子または抗原結合分子であってよい。
さらに他の態様では、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤は、前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択された細胞の第1サンプルとFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階；前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択された細胞の第2サンプルとFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階；ならびに細胞の第1サンプルの分化および/または増殖と細胞の第2サンプルの分化および/または増殖とを比較する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする。これらの態様では、薬剤はFGFとFGFRとの結合を妨害すること、FGFRのリン酸化を妨害すること、FGF/FGFR相互作用の上流もしくは下流のシグナル経路の成分を妨害すること、FGFRとHSPGとの結合を妨害すること、FGFとCFRとの結合を妨害すること、またはFGFRの二量体化を妨害することにより、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする。いくつかの態様では、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする薬剤はTGF、IGF-1、およびWNTシグナル経路から選択されたシグナル経路を妨害する。
また別の態様では、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤は、動物モデルまたはヒトにシグナル経路をアンタゴナイズする薬剤を投与する段階、およびその薬剤への動物の応答性を測定する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする。これらの態様では、上記に記載した薬剤を用いてその方法を実施することができ、動物を肥満症または局所性の異常な脂質生成の増加状態における脂質生成の阻害もしくは減少について試験できる。
さらに別の態様では、脂質生成を刺激する薬剤は、FGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、またはこれらの変異体もしくは誘導体、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列を含む調製物を接触させる段階；およびFGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、変異体もしくは誘導体、または遺伝子配列から発現した産物のレベルもしくは機能活性の増加を検出する段階によって決定されるように、FGFRまたはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列（例、転写エレメント）に結合する。
他の態様では、脂質生成を刺激する薬剤は、FGFRおよびFGFと薬剤とを接触させてFGFRとFGFとの結合を測定する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアゴナイズする。これらの態様では、薬剤はFGFまたはFGFRへ結合することができ、それらがFGFRとFGFとの相互作用を刺激した場合に試験結果は陽性となる。薬剤は、FGFまたはFGFRに対して特異的な小分子または抗原結合分子であってよい。
他の態様では、脂質生成を刺激する薬剤は、FGFRおよびHSPGとその薬剤とを接触させてFGFRとHSPGとの結合を測定する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアゴナイズする。これらの態様では、薬剤はFGFまたはHSPGへ結合することができ、それらがHSPGとFGFRとの相互作用を刺激した場合に試験結果は陽性となる。化合物は、FGFまたはHSPGに対して特異的な小分子または抗原結合分子であってよい。
他の態様では、脂質生成を刺激する薬剤は、FGFおよびCFRと薬剤とを接触させてFGFとCFRとの結合を測定する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアゴナイズする。これらの態様では、薬剤はFGFまたはCFRへ結合することができ、それらがCFRとFGFとの相互作用を刺激した場合に試験結果は陽性となる。化合物は、FGFまたはCFRに対して特異的な小分子または抗原結合分子であってよい。
さらに他の態様では、脂質生成を強化する薬剤は、前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択された細胞の第1サンプルとFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階；前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択された細胞の第2サンプルと薬剤とFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階；ならびに細胞の第1サンプルの分化および/または増殖と細胞の第2サンプルの分化および/または増殖とを比較する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアゴナイズする。これらの態様では、化合物はFGFとFGFRとの結合を刺激すること、FGFRのリン酸化を刺激すること、FGFRとHSPGとの結合を刺激すること、FGFとCFRとの結合を刺激すること、FGFRの二量体化を刺激すること、またはFGF/FGFR相互作用の上流もしくは下流のシグナル経路を刺激することにより、FGFシグナル経路をアゴナイズする。
さらに他の態様では、脂質生成を刺激する薬剤は、動物モデルまたはヒトにシグナル経路を作動させる薬剤を投与して、その薬剤への動物の応答性を測定する段階によって決定されるように、FGFシグナル経路をアゴナイズする。これらの態様では、上記に記載した薬剤を用いてその方法を実施することができ、動物を悪液質の治療もしくは予防、または脂肪症における局所性欠乏症の状態における脂質生成の刺激について試験できる。
本発明のさらにまた別の態様では、脂肪症関連状態における脂質生成を調節するための薬剤を製造する方法を提供する。これらの方法は一般に、上記で広範に記載したFGFシグナル経路を調節することが疑われる薬剤を試験する段階；および調節についての試験結果が陽性であることに基づいてその薬剤を合成する段階を含む。適切には本方法は、肥満症関連状態を治療もしくは予防するための薬剤の有効性を改善するために、その薬剤を誘導体化する段階、および任意で薬学的に許容される担体および/または希釈剤を用いて誘導体化薬剤を製剤する段階をさらに含む。
また別の局面によると、本発明は患者における脂肪症関連状態の存在を検出する方法、またはそのリスクを診断する方法を提供する。これらの方法は一般に、患者から入手した生物学的サンプル中のFGFシグナル経路に関係する異常な遺伝子、またはFGFシグナル経路に関係する遺伝子の異常な発現産物の存在を決定する段階を含み、このとき異常な遺伝子もしくは異常な発現産物は脂肪症関連状態の存在もしくはリスクと相関している。
いくつかの態様では、異常な遺伝子は異常なFgf遺伝子および異常なFgfr遺伝子から選択される。他の態様では、異常な発現産物は異常なFgf発現産物および異常なFgfr発現産物から選択される。
さらにまた別の局面によると、本発明は患者における異常に増加した脂肪症に関連する状態の存在を検出する方法、またはそのリスクを診断する方法を含む。これらの方法は一般に、患者から入手した生物学的サンプル中のFGFシグナル経路に関係する異常な遺伝子、またはFGFシグナル経路に関係する遺伝子の異常な発現産物の存在を決定する段階を含み、このとき異常な遺伝子もしくは異常な発現産物はその状態の存在もしくはリスクと相関している。異常に増加した脂肪症と関連する状態には、肥満症、または脂肪腫および脂肪腫症等の脂質生成における局所性で異常に増加した状態が含まれるが、それらに限定されない。
本発明のまた別の局面は、患者における異常に増加した脂肪症に関連する状態の存在を検出する方法、またはそのリスクを診断する方法を提供する。これらの方法は一般に、発現産物の正常な（例、非肥満性の）基準のレベルまたは機能活性とは相違するFGFシグナル経路に関係する遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性を細胞中で決定する段階を含む。いくつかの態様では、本方法はFgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、およびIgfbp-6から選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の増加または上昇を決定する段階を含む。他の態様では、本方法はFgf-1、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、およびPkcθから選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の減少を決定する段階を含む。これらの態様では、細胞は前脂肪細胞またはその前駆体である。
他の態様では、本方法はFgf-1およびFgf-2から選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性における増加または上昇を決定する段階を含む。これらの態様では、細胞は微小血管内皮細胞である。
本発明のまた別の局面は、肥満症または脂質生成における局所性で異常に増加した状態における脂質生成を阻害する、または減少させる方法を企図している。これらの方法は一般に、そのような治療を必要とする患者に脂質生成の阻害に有効な量の、上記で広範に記載したFGFシグナル経路を損傷させる、または妨害する薬剤、および任意で薬学的に許容される担体または希釈剤を投与する段階を含む。
本発明のまた別の局面は、悪液質または脂肪症における局所性欠乏症の状態を治療または予防する方法を企図している。これらの方法は一般に、そのような治療を必要とする患者に脂質生成の阻害に有効な量の、上記で広範に記載したFGFシグナル経路を刺激する薬剤、および任意で薬学的に許容される担体または希釈剤を投与する段階を含む。
本発明のさらにまた別の局面は、脂肪症関連状態を治療または予防する薬物の調製における上記で広範に記載した薬剤の使用を提供する。
FGFシグナル経路の概略図である。 微小血管内皮細胞（MVEC）および前脂肪細胞（PA）をヒト脂肪組織から単離および分離する方法の概略図である。DPBS:脱イオンリン酸緩衝食塩液；RT:室温；HBSS:ハンクス塩類溶液；FCS:ウシ胎児血清；EC:内皮細胞；PECAM-1:血小板-内皮細胞接着分子1。 脂肪組織由来MVECの形態を示す写真である。A:ヒト脂肪組織から単離されたMVECの位相差顕微鏡写真。典型的な敷石状形態および中央に所在する顕著な核に注目。B:フォン・ウィルブランド因子（vWF）についての免疫細胞化学染色は顕著な核周囲細胞質の染色を示す。C:PECAM-1についての免疫細胞化学染色は、原形質膜発現に一致する接合部染色を示す。BおよびCでは、核をヨウ化プロピジウムにより対比染色した（バー＝10μm；原倍率×200）。 脂肪由来MVECおよび3T3-L1脂肪細胞中でのFGF-1の強力な発現を示すウェスタンブロット分析の写真表示（3T3-L1線維芽細胞においても発現が示された）。FGF-1タンパク質は、ヒト前脂肪細胞（FGF-1への曝露＋／−）および脂肪細胞のどちらにおいても検出できなかった。RT-PCR分析によりこれらの発現パターンが確証された。 FGF-1およびFGF-2の両方に応答したヒト前脂肪細胞（PA）の増殖における顕著な増加を示しているグラフ表示である（FGF-1は増殖に対してFGF-2より大きな作用を及ぼす）。 FGF-1およびFGF-2の両方に応答したヒト前脂肪細胞（PA）の分化における顕著な増加を示すグラフ表示である（FGF-1は分化に対してFGF-2より大きな作用を及ぼす）。 FGF-1およびFGF-2の併用処理の作用を示しているグラフ表示である。この結果は、FGF-1およびFGF-2の両方が複製中もしくは分化中のどちらかに存在すると脂質生成性であること、かつ複製中および分化中のFGF-1の脂質生成作用は独立的で付加的であることを示す。BRL＝ロシグリタゾン；括弧は複製処理であることを意味する。 血清含有培地（SCM）を利用する3T3-L1分化プロトコール（＋インスリンおよび初期3日間はデキサメタゾンおよびロシグリタゾン）を使用したヒト前脂肪細胞（PA）の分化を示す写真表示である。パネル（A）は、分化前の増殖中にFGF-1へ曝露されていないPAを示す。パネル（B）および（C）は、それぞれFGF-1の存在下で6週間にわたり増殖させ、引き続いてSCM中で分化させた皮下および大綱PAを示す。これは血清の存在下で分化すヒトPAについての最初の報告である（バー＝10μm）。 FGF-1の存在下および非存在下で血清含有培地中でコンフルエンスまで増殖させたヒトPA中での遺伝子発現を比較した別個の2回の遺伝子アレイ実験の結果を示す表である。遺伝子発現は、発現が一貫して（CV＜5％）少なくとも50％増加または減少した場合にFGF-1によって影響を受けたと見なされた。 PLCγ2がFGFRシグナル伝達において重要な細胞内分子であることを示す写真表示である。ウェスタンブロット分析および免疫蛍光法の両方によって、この分子の発現がこの増殖因子に曝露されていなかったFGF-1 cf.細胞の存在下でコンフルエンスまで増殖させたヒトPA中で増加することが確証された。免疫蛍光のデータはさらに、PLCγ2発現が、分化誘導が発生する段階であるコンフルエンス状態では高度にアンレギュレートされることも示す（バー＝10μm）。 PLCγ2の阻害が前脂肪細胞のFGF-1誘導性分化を顕著に減少させることを示すグラフ表示である。 抗FGF-1抗体の中和がFGF-1誘導性ヒト前脂肪細胞の複製を排除することを示すグラフ表示である。 後FGFRシグナル伝達経路の阻害がFGF-1媒介性ヒト脂質生成に顕著な作用を及ぼすことを示すグラフ表示である。
発明の詳細な説明
1.用語の定義
他に定義していない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載した方法および材料に類似する、または等価の任意の方法および材料を使用できるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明のために、以下の用語を下記に定義する。
冠詞「1つの（a, an）」とは、本明細書では1つもしくは1つより多く（すなわち、少なくとも1つまで）のその冠詞の文法上の目的語について言及するために使用する。例えば、「1つのエレメント」とは、1つのエレメントまたは1つより多くのエレメントを意味する。
「同一の調節経路または生合成経路に属する遺伝子」とは、その発現産物がFGFもしくはFGFRタンパク質レベルおよび/またはFgfもしくはFgfr転写レベルを調節する、さもなければそれらに影響を及ぼす遺伝子を意味する。例えば、Fgfと同一の調節経路に属する遺伝子は、Fgf/FGFの代わりにFgf/FGFの上流調節因子、またはFgf/FGFの下流調節標的をコードすることができる。あるいは、Fgfr遺伝子と同一の調節経路または生合成経路に属する遺伝子には、Fgfr遺伝子の発現を直接的または間接的に調節する遺伝子、ならびにFGFR活性化のためのシグナル伝達物質として機能する遺伝子が含まれる。そのようなシグナル分子はFGFR活性化の作用を伝達および/または媒介することに関係しており、一般に当技術分野において公知である。それらには特に、ホスホリパーゼC（PLC）-γ、Crk、SNT-1/FRS2、および/またはSrcシグナル経路に関係する分子が含まれる。
本明細書で使用する「異常なポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって「正常な」基準ポリヌクレオチドから区別され、かつ非肥満症性の基準値と比較して上昇した脂質生成速度を含む脂質生成欠陥の存在またはリスクと相関しているポリヌクレオチドを意味する。
「異常なポリペプチド」という用語は、少なくとも1つのアミノ酸残基の置換、欠失、または付加によって「正常な」基準ポリペプチドから区別され、かつ非肥満症性の基準値と比較して上昇した脂質生成速度を含む脂質生成欠陥の存在またはリスクと相関しているポリペプチドを意味する。
「増幅産物」とは、核酸増幅法によって生成された核酸産物を意味する。
「抗原結合分子」とは、標的抗原に対する結合親和性を有する分子を意味する。この用語は抗原結合活性を示す免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントおよび非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークにも及ぶことが理解されるであろう。
「抗原性または免疫原性活性」とは、本発明によるポリペプチド、フラグメント、変異体、または誘導体が、それを投与された動物、適切には哺乳動物における抗原反応または免疫原性反応を産生する能力を意味し、このときその反応にはそのポリペプチドまたはフラグメントに特異的に結合するエレメントの産生が含まれる。
「生物活性フラグメント」とは、親ポリペプチドの活性を維持している全長親ポリペプチドのフラグメントを意味する。本明細書で使用する「生物活性フラグメント」という用語には、親ポリペプチドの活性を含む例えば少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50連続アミノ酸残基の欠失変異体および小ペプチドが含まれる。この種のペプチドは、標準的な核酸組換え法の適用を通して入手できる、または従来の液相もしくは固相合成法を使用して合成できる。例えば、Blackwell Scientific Publicationsにより発行されたNicholson編集による「Synthetic Vaccines」と題する出版物に含まれているAthertonおよびShephardによる「Peptide Synthesis」と題する第9章に記載された液相合成法（solution synthesis）または固相合成法(solid phase synthesis)を参照できる。あるいは、ペプチドはendoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C、およびブドウ球菌V8-プロテアーゼ等のプロテイナーゼを用いた本発明のポリペプチドの消化によって生成できる。消化されたフラグメントは、例えば高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）法によって精製できる。
本明細書で使用する「生物学的サンプル」という用語は、患者から抽出された、処理されていない、処理された、希釈された、または濃縮されたサンプルを意味する。適切には、生物学的サンプルは組織生検材料、より好ましくは皮下もしくは大網組織生検材料である。
「悪液質」とは、栄養不良または一般的疾病状態が付随する場合も付随しない場合もあり、かつ一つまたは複数の他の病理に対する続発性の場合がある正常より低い脂肪症の臨床状態を意味する。「悪液質」という用語は次の状態に及ぶが、それらに限定されない、癌性悪液質、フッ素性悪液質、下垂体性（hypophysial）悪液質、下垂体除去性悪液質（cachexia hypophysiopriva）、マラリア性悪液質、水銀性悪液質(cachexia mercurialis)、下垂体性(pituitary)悪液質、鉛性悪液質、副腎性（suprarenalis）悪液質、および尿毒症性(uraemic)悪液質、または脂肪症における局所性欠乏症の状態。
本明細書の全体を通して、状況が他の意味を必要としない限り、「含む（comprise, comprises, comprising）」という用語は、上記の段階もしくは要素または段階もしくは要素の群を含むと理解されるが、いずれか他の段階もしくは要素、または段階もしくは要素の群の除外とは理解されない。
本明細書に使用した「脂質生成における局所性で異常に増加した状態」という表現には、脂肪組織の制限された沈着につながる解剖学的に局所性の調節不全の脂質生成を特徴とする、および/またはそれと関連する病理が含まれる。そのような状態には脂肪腫および脂肪腫症が含まれるが、それらに限定されない。
「脂肪症における局所性欠乏症の状態」とは、特に皮下脂肪組織の消失を生じさせる外傷による身体障害、熱傷または化学的火傷、脂肪異栄養症または萎縮性状態によって惹起される、脂肪組織における解剖学的に限定された機能不全を意味する。本明細書で使用する「脂肪異栄養症」という用語は、先天性、後天性、および部分的もしくは完全であってよい皮下脂肪の不在を生じさせる脂肪代謝の障害と関連する、またはそれを特徴とする任意の病理学的状態を意味する。そのような状態には、特に先天性全身性脂肪異栄養症、先天性進行性脂肪異栄養症、全身性脂肪異栄養症、ウイップル病、限局性脂肪異栄養症（partial lipodystrophy）、進行性脂肪異栄養症、および完全脂肪異栄養症（total lipodystrophy）が含まれる。本明細書で使用する「萎縮性状態」という用語は、解剖学的に限局性であっても限局性でなくてもよい脂肪組織を含む身体組織の減少または消耗に関連する、および/またはそれを特徴とする状態を意味するが、その原因には特に中枢神経系および/または末梢神経系の損傷、不活性および/または不能力を含むことができる。そのような萎縮性状態には、漿液性萎縮症、脊髄筋萎縮症、関節性萎縮症、圧迫性萎縮症、神経障害性萎縮症、非活動性萎縮症、内分泌性萎縮症および老年性萎縮症が含まれるが、それらに限定されない。
「〜に対応する」もしくは「〜に対応している」とは、（a）基準ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部分と実質的に同一もしくは相補的である、またはペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または（b）基準ペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはポリペプチド、に関する。
「誘導体」とは、例えば他の化学成分との結合もしくは複合体形成、または当技術分野において理解されているような翻訳後修飾法によるような修飾によって塩基性配列から得られたポリペプチドを意味する。「誘導体」という用語の範囲内には、機能的に同等の分子を提供する、付加もしくは欠失を含む親配列に加えられた変化も含まれる。
本明細書で使用する「分化能力」という用語は、前脂肪細胞が脂肪細胞への機能的成熟を促進するシグナルに応答する能力、またはその応答の大きさを意味する。「分化能力の増加」とは試験分子によって付与されると見なすことができ、このとき前脂肪細胞と試験分子との十分な時間および適切な条件下での共培養は、例えば前脂肪細胞の分化誘導薬剤への応答の増加を生じさせ、これは特に分化を経験した前脂肪細胞の数の増加または前脂肪細胞が分化を経験する速度の増加として観察することができる。
ある活性を調節する、またはある状態を治療もしくは予防する状況における「有効量」とは、そのような調節、治療、もしくは予防を必要とする個体への、その作用を調節するために、またはその状態の治療、予防、もしくは改善のために有効である単回投与もしくは反復投与の一部のいずれかでの、有効成分の投与量を意味する。脂質生成における局所性で異常に増加した状態を患っている個体のそのような改善の非限定的例には、脂肪沈着の低下、痩せの増加、体重減少、ならびに心血管疾患および糖尿病に関連する症状の改善が含まれる。悪液質を患っている個体および脂肪症における局所性の欠乏症の状態についての改善の非限定的例には、脂肪沈着の強化、体重増加、および萎縮性状態に関連する症状の改善が含まれる。有効量は、治療される個体の健康状態および身体状態、治療される個体の分類群、組成物の処方、医療状態の評価、および他の関連要素に依存して変動するであろう。その量は、慣例的試験を通して決定できる相当に広い範囲内に含まれると予想される。
本明細書で使用する「機能」という用語は、生物学的、酵素的、または治療的機能を意味する。
「機能的Fgfポリヌクレオチド」または「機能的FGFポリペプチド」とは、構造的または機能的欠陥を有さない、かつ脂質生成の上昇または傷害を含む脂質生成欠陥の存在またはリスクと相関しない、FgfポリヌクレオチドまたはFGFポリペプチドを意味する。
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、細胞ゲノムのあらゆる別個のコーディング領域ならびに関連するノンコーディング領域および調節領域を意味する。その遺伝子は、発現の調節に関係する特定のポリペプチド、イントロン、および隣接する5’および3’ノンコーディングヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームを意味することがさらに意図されている。これに関連して、遺伝子は所与の遺伝子と自然に結び付いているプロモーター、エンハンサー、終止および/またはポリアデニル化シグナル等の制御シグナル、または異種制御シグナルをさらに含んでいてよい。DNA配列は、cDNAもしくはゲノムDNA、またはそれらのフラグメントであってよい。遺伝子は染色体外での維持のために、または宿主内へ組み込むために、適切なベクター内へ導入されてよい。
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」という用語は、DNA-DNAハイブリッドまたはDNA-RNAハイブリッドを産生する相補的ヌクレオチド配列の対合を意味する。相補的塩基配列は、塩基対形成の法則によって関連付けられる配列である。DNAでは、AはTと対合し、CはGと対合する。RNAでは、UはAと対合し、CはGと対合する。これに関連して、本明細書で使用する「マッチ」および「ミスマッチ」という用語は、相補的核酸鎖内の対合するヌクレオチドのハイブリダイゼーション能力を意味する。上記に記載の古典的A-TおよびG-C塩基対等のマッチしたヌクレオチドは、効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしない他のヌクレオチドの組み合わせである。
本明細書での「免疫相互作用」の言及には、特に分子の一方が免疫系の成分である、またはそれを模倣する場合の分子間の任意の相互作用、反応、または他の関連形態についての言及が含まれる。
「単離された」とは、通常はその天然状態で付随する構成要素から実質的もしくは本質的に離れている物質を意味する。
「調節する」とは、標的分子のレベルまたは機能活性を直接的または間接的に増加または減少させることを意味する。例えば、ある薬剤は標的分子以外の分子と相互作用することによって、レベル/活性を間接的に調節することができる。これに関連して、標的ポリペプチドをコードする遺伝子の間接的調節はその範囲内に第1の核酸分子の発現の調節を含み、このとき第1の核酸分子の発現産物は標的ポリペプチドをコードする核酸分子の発現を調節する。
本明細書で使用する「肥満症」という用語には、身体内の脂肪組織の過剰な蓄積の結果として身体的必要量を超える体脂肪の増加が存在する状態が含まれる。「肥満症」という用語には次の状態:成人期発症肥満症；食事性肥満症；内因性もしくは代謝性肥満症；内分泌性（endocrine）肥満症；家族性肥満症；過インシュリン性肥満症；過形成-肥厚性（hyperplastic-hypertrophic）肥満症；性機能低下性肥満症；甲状腺機能低下性肥満症；終生(lifelong)肥満症；病的肥満症および外因性肥満症が含まれるが、それらに限定されない。
「肥満症の治療」という用語は、心血管疾患、アテローム硬化症、高血圧、ピックウィック症候群（Pickwickian syndrome）および糖尿病を含むがそれらに限定されない肥満症に続発する状態の治療を含む。
「〜から入手した」とは、例えばポリヌクレオチド抽出物もしくはポリペプチド抽出物等のサンプルが宿主の特定起源から単離された、または得られたことを意味する。例えば、抽出物は宿主から直接的に単離された組織または生物学的液体から入手できる。
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合（または関連する構造変異体もしくはそれらの合成アナログ）を介して連結された複数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの関連する構造変異体もしくは合成アナログ）から構成されるポリマーを意味する。そこで、「オリゴヌクレオチド」という用語は典型的にはヌクレオチド残基を意味しており、それらの間の結合は自然に発生するヌクレオチドポリマーであるが、この用語にはその範囲内にペプチド核酸（PNA）、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、2-O-メチルリボ核酸等の様々なアナログが含まれることが理解されるであろう。この分子の正確なサイズは、特定の適用に依存して変動する可能性がある。オリゴヌクレオチドは、典型的には長さが比較的短く、一般には約10から30ヌクレオチド残基であり、この用語はあらゆる長さの分子を意味することができるが、「ポリヌクレオチド」もしくは「核酸」という用語は典型的には大きなオリゴヌクレオチドに対して使用される。
「機能的に連結した」とは、転写および翻訳調節ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドが転写されてポリペプチドが翻訳されるような方法でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連して配置されていることを意味する。
「患者」という用語は、ヒトもしくは他の動物起源の患者を意味し、本発明の方法を使用して試験もしくは治療することが望ましい任意の個体を含む。しかし、「患者」には症状が存在することを意味しないことは理解されるであろう。本発明の範囲内に含まれる適切な動物には、霊長類、家畜動物（例、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、実験動物（例、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、コンパニオン動物（例、ネコ、イヌ）、および捕獲野生動物（例、キツネ、シカ、ディンゴ、鳥類、爬虫類）が含まれるが、それらに限定されない。
「薬学的に許容される担体」とは、哺乳動物への局所的または全身性投与において安全に使用できる固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化剤を意味する。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、mRNA、RNA、cRNA、cDNA、またはDNAを示す。この用語は、典型的には長さが30ヌクレオチド残基より長いオリゴヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、基準ポリヌクレオチド配列または当技術分野において知られているストリンジェントな条件下で基準配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドと実質的配列同一性を示すポリヌクレオチドを意味する（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,1989を参照）。これらの用語は、一つまたは複数のヌクレオチドが付加、欠失、または相違するヌクレオチドと置換されているポリヌクレオチドをさらに含む。これに関連して、当技術分野では突然変異、付加、欠失および置換を含む一定の変化を基準ポリヌクレオチドに加えることができ、それによって変化したポリヌクレオチドが基準ポリヌクレオチドの生物学的機能もしくは活性を維持することが十分に理解されている。「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語には、自然に存在する対立遺伝子変異体も含まれる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では互換的にアミノ酸残基のポリマーならびにその変異体および合成アナログを意味するために使用される。そこでこれらの用語は、一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然型アミノ酸の化学アナログ等の合成の非天然型アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、および天然型アミノ酸ポリマーに適合する。
「ポリペプチド変異体」という用語は、一つまたは複数のアミノ酸が相違するアミノ酸と置換されているポリペプチドを意味する。当技術分野においては、一部のアミノ酸は、以下で記載するようにそのポリペプチドの活性の性質を変化させずに広範囲に類似の特性を備える他のアミノ酸と取り換えられてよいこと（保存的置換）が明確に理解されている。これらの用語は、一つまたは複数のアミノ酸が付加、欠失、または相違するアミノ酸と置換されているポリペプチドをさらに含む。
「プライマー」とは、DNAの1本の鎖と対合した場合に、適切な重合因子の存在下でプライマー伸長産物の合成を開始することのできるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、好ましくは増幅において最高効率を得るためには一本鎖であるが、任意で二本鎖であってもよい。プライマーは、重合因子の存在下で伸長産物の合成を開始するために十分に長くなければならない。プライマーの長さは、用途、使用される温度、鋳型反応条件、その他の試薬、およびプライマーの起源を含む多数の要素に左右される。例えば、標的配列の複雑性に依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には15から35以上のヌクレオチド残基を含有しているが、より小数のヌクレオチド残基を含有していてもよい。プライマーは、約200ヌクレオチド残基から数キロベース以上までのような大きなポリヌクレオチドであってよい。プライマーは、ハイブリダイズして合成を開始するための部位として機能するように設計されている鋳型上の配列に「実質的に相補的」となるように選択することができる。「実質的に相補的」とは、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするために十分に相補的であることを意味する。好ましくは、プライマーはそれにハイブリダイズするように設計されている鋳型とのミスマッチを含有していないが、それは必須ではない。例えば、非相補的ヌクレオチド残基はプライマーの5’末端に結合することができ、プライマー配列の残りは鋳型に対して相補的である。あるいは、プライマー配列がそれとハイブリダイズし、それによりプライマーの伸長産物を合成するための鋳型を形成するために、鋳型配列との十分な相補性を有していることを前提に、非相補的ヌクレオチド残基または非相補的ヌクレオチド残基の伸長部をプライマー内に点在させることができる。
「プローブ」とは、特異的配列もしくは部分配列または別の分子の他の部分へ結合する分子を意味する。他に指示しない限り、「プローブ」という用語は、典型的には、相補的な塩基対形成を介してしばしば「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれる他のポリヌクレオチドへ結合するポリヌクレオチドプローブを意味する。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブとの完全配列相補性を欠如する標的ポリヌクレオチドに結合することができる。プローブは、直接的もしくは間接的に標識化できる。
本明細書で使用する「組換えポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドの自然には通常見いだされない形状への操作により、インビトロで形成されたポリヌクレオチドを意味する。例えば、組換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形状であってよい。一般に、そのような発現ベクターにはポリヌクレオチドへ機能的に連結した転写および翻訳調節ポリヌクレオチドが含まれる。
「組換えポリペプチド」とは、組換え技術を使用して、すなわち組換えまたは合成ポリヌクレオチドの発現を通して作製されたポリペプチドを意味する。
本明細書で使用する「レポーター分子」とは、抗原結合分子およびその標的抗原を含む複合体の検出を許容するシグナルを提供する、その化学的性質によって分析法により同定可能な分子を意味する。「レポーター分子」という用語は、ラテックスビーズ上の赤血球等の細胞凝集または凝集の阻害の使用にもさらに及ぶ。
「ベクター」とは、ポリヌクレオチド分子、好ましくは、例えばその中にポリヌクレオチドを挿入またはクローン化できるプラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルス由来のDNA分子を意味する。ベクターは、好ましくは一つまたは複数の独自の制限部位を含有しており、標的細胞もしくは標的組織、またはそれらの前駆細胞もしくは前駆組織を含む、定義された宿主細胞内で自律複製することができる、あるいはクローン化配列が複製可能であるように定義された宿主のゲノム内に統合することができる。したがってベクターは、自律複製ベクター、すなわちその複製が染色体複製から独立している、例えば直鎖状または閉環状プラスミド、染色体外エレメント、微小染色体、または人工染色体等の染色体外実体として存在するベクターであってよい。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含有してよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されるとゲノム内に統合され、統合された染色体と一緒に複製されるベクターであってよい。ベクター系は、単一ベクターもしくはプラスミド、宿主細胞のゲノム内に導入される全DNAを一緒に含有している2つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含んでいてよい。ベクターの選択は、典型的にはそのベクターとその中にベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存するであろう。今回の場合には、ベクターは好ましくは、動物および好ましくは哺乳動物細胞中で操作可能に機能的であるウイルスまたはウイルス由来ベクターである。そのようなベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルス、または酵母から得ることができる。ベクターは、適切な形質転換株を選択するために使用できる抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーをさらに含んでいてよい。そのような耐性遺伝子の例は当業者には知られており、抗生物質のカナマイシンおよびG418（Geneticin（登録商標））に耐性を付与するnptII遺伝子、ならびに抗生物質ヒグロマイシンBに耐性を付与するhph遺伝子が含まれる。
「野生型」および「正常」という用語は、天然由来の種のメンバーの大多数に特徴的な表現型とは対照的な、例えば突然変異体の表現型を言うために互換的に使用される。
本明細書で使用する下線を付した、またはイタリック体で表示した遺伝子の名称は、下線を付してもイタリック体で表示されてもいない遺伝子の名称によって表示されるそのタンパク質産物とは対照的な遺伝子を表示している。例えば、「Fgf-1」とはFgf-1遺伝子を意味するが、他方「FGF-1」とは「Fgf-1」遺伝子の転写および翻訳および選択的スプライシングから産生したタンパク質産物を意味する。
2.脂質生成の調節方法
本発明は、部分的に、前脂肪細胞の脂肪細胞へのインビトロ分化（脂質生成）は前脂肪細胞の複製期を通じて培地中のMVECの存在によって強化でき、かつこの作用は培地へのFGF-1またはFGF-2の添加によってMVECの非存在下でも複製できるという発見に基づいている。何らかの特定の理論あるいは作動形態に結び付けることを望んではいないが、本発明者らは、MVEC（または、もしかすると他の細胞型）によるFGF-1およびその他のFGFスーパーファミリーのメンバーのインビボ産生が隣接する前脂肪細胞上のFGF受容体を活性化し、それらが脂肪細胞へ分化するのを直接的もしくは間接的に促進すると考えている。さらに、本発明者らはFGF-1がヒト前脂肪細胞の複製を促進すること（IGF-1、FGF-2、または血清単独より強力に）、かつ複製期中のヒト前脂肪細胞のFGF-1処理が引き続いて分化する能力を劇的に増加させること（すなわち、「初回刺激（priming）」作用）を見いだした。さらに、本発明者らはこのFGF-1の「プライミング」作用が分化中のTZD処理により劇的に増加することを証明したが、これはFGF-1がPPARgリガンドではないことを示唆している。ヒト前脂肪細胞はFGFを産生しないこと、かつFGF-1の増殖前の作用がFGFに対する中和抗体によって阻止されることも見いだされた。このため、FGFシグナル経路、特にFGF-1またはFGF-2シグナル経路の調節因子は特に肥満症、脂質生成における局所性で異常に増加した状態、悪液質、および脂肪症における局所性欠乏症の状態を含む脂肪症関連状態の治療または予防、ならびに過剰な脂質生成および不十分な脂質生成に関する研究のために有用であることを提案する。
したがって、本発明は、細胞をFGFシグナル経路、特にFGF-1またはFGF-2シグナル経路を調節するために十分な時間および条件下である薬剤と接触させる段階を含む、脂質生成を調節する方法を提供する。FGF経路の代表的メンバーには、FGF（特に、FGF-1およびFGF-2）、FGFR（例、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、およびFGFR-5、特にFGFR-1、FGFR-2、FGFR-3およびFGFR-4）、HSPG（例、シンデカン-1、シンデカン-2、シンデカン-3、シンデカン-4、グリピカン-1、グリピカン-2、グリピカン-3、グリピカン-4、グリピカン-5、グリピカン-6、パールカン、およびβグリカン）、CFR、SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK経路のメンバー（例、SHC、Crk、FRS2（SNT-1としても知られるFGFR基質2）、Src、FAK、Nck、Shb、SHP2、GRB-2、SOS、80K-H、pp66、Gab1、P38 MAPK（ERK）、PI3K、AKT、PKB、RAS、RAF、ERK1,2、MAPKKK（RAF-1）、MAPKK（MEK）、MAPK、Jun、Fos、FPPS（ファルネシルピロリン酸シンターゼ））、PLCγ-PKC-Ca2＋経路のメンバー（例、PLCγ（ホスホリパーゼCγ）、Fes、PIP2、DAG（ジアシルグリセロール）、アラキドン酸、Ca2＋チャンネル、Ca2＋、IP3（イノシトール1,4,5三リン酸）、CaMキナーゼ（Ca2＋/カルモジュリン依存性キナーゼ）、PKC（プロテインキナーゼC）、PKA（プロテインキナーゼA）、cAMP、CREB、CBP（CREB結合タンパク質）、FGF-1核移行経路のメンバー（例、STAT-1およびSTAT-3）、P34およびFIF（FGF-相互作用因子）等であるがそれらに限定されないFGFの細胞内結合パートナー、およびSTN-2等のFGFRの細胞内結合パートナー、ならびにスプライス変異体を含むそれらの変異体が含まれる。
本発明によると、ある薬剤はFGF（特にFGF-1および/またはFGF-2）を産生する細胞またはFGFシグナリングの標的である細胞を標的とすることができる。そこで、いくつかの態様では細胞はMVECまたはMVEC前駆体であるが、他の態様では細胞は前脂肪細胞または前脂肪細胞前駆体である。
FGF産生細胞がその薬剤の対象である態様では、その薬剤はFgf遺伝子（例、Fgf-l、Fgf-2）またはその発現の上流調節因子の発現、あるいはそのような遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を適切に調節する。これらの態様では、脂質生成はFgf遺伝子の発現またはその発現産物のレベルもしくは機能活性を強化することによって、またはFgf遺伝子、その発現産物の抑制因子もしくは活性化因子のどちらであるかに依存して、調節遺伝子の発現またはその発現産物のレベルもしくは機能活性を強化する、もしくは減少させることによって刺激される。これとは反対に、脂質生成はFgf遺伝子の発現またはその発現産物のレベルもしくは機能活性を減少させる、もしくは阻止することによって、またはFgf遺伝子、その発現産物の抑制因子もしくは活性化因子のどちらであるかに依存して、調節遺伝子の発現またはその発現産物のレベルもしくは機能活性を各々強化する、もしくは減少させることによって減少する、もしくは阻止される。
FGFを標的とする細胞がその薬剤の対象である態様では、その薬剤はFgfr遺伝子（例、Fgfr-1、Fgfr-2、Fgfr-3、Fgfr-4、Fgfr-5、特にFgfr-1、Fgfr-3、Fgfr-4）、またはFgfr遺伝子と同一の調節経路もしくは生合成経路に属する遺伝子（例、上記のようにFGFシグナル経路に属する遺伝子）、または発現がFgf遺伝子の発現産物によって直接的もしくは間接的に調節される遺伝子（例、PPARγ、IGFBP-3、IGFBP-6、IGF-2、IRS-2、PI3キナーゼ、PKCθ）の発現を調節する、またはFGF（例、FGF-1もしくはFGF-2）が相互作用するFGFRもしくはCFRの機能をアゴナイズ、もしくは刺激する。これらの態様では、脂質生成はFgfr遺伝子の発現またはその発現産物のレベルもしくは機能活性を強化すること、FGFシグナル経路の成分の発現を強化すること、FGFRとFGFとの相互作用またはCFRとFGFとの相互作用を強化する、促進する、さもなければ可能にすることにより、またはFGFRの二量体化および/またはリン酸化を刺激することにより刺激される。対照的に、脂質生成はFGFRとFGFとの、またはCFRとFGFとの相互作用を阻害もしくは阻止することを含めて、FGFRもしくはCFRの機能をアンタゴナイズすること、またはHSPGとFGFRとの相互作用を阻害もしくは阻止すること、FGFRのリン酸化を妨害することり、FGF/FGFRもしくはFGF/CFRの相互作用の上流もしくは下流のシグナル経路の成分を妨害すること、またはFGFRの二量体化を妨害することにより減少する、もしくは阻害される。
したがって、脂質生成の減少が必要とされる場合は、その薬剤は例えば肥満症または脂質生成における局所性で異常に増加した状態の治療において脂肪細胞の形成を減少もしくは損傷させることを含めて、前脂肪細胞の脂質生成能力を減少もしくは損傷させるために使用される。そのような治療レジメンに予想される状態には、アテローム硬化症、高血圧、糖尿病および内分泌性またはその他の代謝性の疾患または状態等に関連する、またはそれらに続発性である病理的状態が含まれる。脂質生成における局所性で異常に増加した状態には、脂肪過多腫瘍（脂肪腫および脂肪肉腫）および脂肪腫症が含まれてよい。あるいは、脂質生成の増加が必要な場合は、薬剤は例えば悪液質に関連する状態または脂肪症における局所性欠乏症の状態における脂肪沈着を改善することを含む、脂質生成を強化するために使用される。
遺伝子発現を減少させる、または阻止するために適切な薬剤には、例えばFGFまたはFGFRをコードするmRNAの翻訳を阻害するように機能するアンチセンスRNAおよびDNA分子、ならびにリボザイムを含むオリゴリボヌクレオチド配列が含まれるが、それらに限定されない。アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mRNAに結合してタンパク質翻訳を防止することによりmRNAの翻訳を直接的に阻害する。アンチセンスDNAに関しては、例えば、-10から＋10領域の翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、RNAの特異的開裂を触媒することのできる酵素的RNA分子である。リボザイムの作用機序は、リボザイム分子と相補的標的RNAとの配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くヌクレオチド鎖の開裂を伴う。標的配列のヌクレオチド鎖開裂を特異的かつ効率的に触媒する改変ハンマーヘッド型モチーフのリボザイム分子は、本発明の範囲内に含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム開裂部位はGUA、GUU、およびGUCの配列を含むリボザイム開裂部位について標的分子を走査することによって初めて同定される。同定されると、標的遺伝子の開裂部位を含有する領域に相当する15から20リボヌクレオチドの短いRNA配列は、そのオリゴヌクレオチド配列を不適切にする可能性がある二次構造等の予想される構造的特徴について評価することができる。候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする可能性について試験することによってさらに評価することができる。
アンチセンスRNAおよびDNA分子ならびにリボザイムは、RNA分子を合成するための当技術分野において知られている任意の方法によって調製できる。これらには、例えば固相ホスホラアミダイト化学合成法等の当技術分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、RNA分子はアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成することもできる。そのようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーター等の適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込んだ極めて広範囲のベクター内に組み込むことができる。あるいは、使用されるプロモーターに依存して、アンチセンスRNAを構成的もしくは誘導的に合成するアンチセンスcDNA構築物を細胞系内に安定的に導入することもできる。
細胞内安定性および半減期を増加させる手段として、DNA分子への様々な修飾を導入することができる。考えられる修飾には、分子の5’もしくは3’末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドバックボーン内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートもしくは2’O-メチルの使用が含まれるが、それらに限定されない。
または標的遺伝子もしくは遺伝子転写体のRNA干渉を媒介するRNA分子（RNAi）を使用し、遺伝子発現を減少させる、または阻止することができる。RNAiは、標的遺伝子の転写体と相同である一本鎖、および典型的には二本鎖RNA（dsRNA）を導入することによる標的遺伝子産物の干渉または破壊を意味する。そこで、いくつかの態様では、dsRNA自体および特に標的遺伝子の少なくとも一部分に対応するdsRNAを産生する構築物を使用してその発現を減少させる、または阻止することができる。遺伝子発現のRNAi媒介性阻害は、例えばステムループもしくはヘアピンRNA構造をコードする核酸構築物を標的細胞のゲノム内にトランスフェクトすること、収束プロモーター間から標的遺伝子に対するホモロジーを有するトランスフェクトされた核酸構築物を発現させること、または単一プロモーターの後ろから頭-頭もしくは尾-尾複製としての当技術分野において報告されている任意の技術を使用して遂行されてよい。任意の類似の構築物は、それが自らの上で折り返し、dsRNAを産生する能力を有する一本鎖RNAを産生できる限り、または2つの別個のRNA転写体を産生してそれが次にアニールして標的遺伝子に対するホモロジーを有するdsRNAを形成できる限り使用できる。
RNAiに対して絶対のホモロジーは必要とされず、約200塩基対のdsRNAに対して約85％の、より低い閾値のホモロジーが記載されている（PlasterkおよびKetting,2000,Current Opinion in Genetics and Dev.10:562-67）。このため、dsRNAの長さに依存して、RNAiをコードする核酸はそれらが標的遺伝子転写体に向けて含有するホモロジーのレベルが、すなわち標的遺伝子と少なくとも約85％のホモロジーを有する100から200塩基対のdsRNA、およびより長い、すなわち標的遺伝子と少なくとも約75％のホモロジーを有する300から100塩基対のdsRNAまで変動する可能性がある。別個に発現したRNAへアニーリングするように設計された一本鎖RNA転写体を発現するRNAをコードする構築物、または収束プロモーターから別個の転写体を発現する単一構築体は、好ましくは長さが少なくとも約100ヌクレオチドである。内部折り畳みを介してdsRNAを形成するように設計された一本鎖RNAを発現するRNAをコードする構築体は、好ましくは長さが少なくとも約200ヌクレオチドである。
dsRNAを形成する構築体を発現するために使用されるプロモーターは、結果として生じるdsRNAが破壊を目標とする細胞系統における遺伝子産物に対して特異的であれば、あらゆる種類のプロモーターであってよい。あるいは、プロモーターはそれが特定の発生系統の細胞中でのみ発現するという点において系統特異的であってよい。これは、標的とされない細胞系統中でも発現している遺伝子においてホモロジーのいくつかが重複する場合に有益な可能性がある。このプロモーターは、外部から制御される因子、または細胞内環境因子によって誘導可能であってもよい。
他の態様では、約21から約23ヌクレオチドのRNA分子を利用し、例えばTuschlらによって米国特許出願第20020086356号において記載されているように、それらが対応する特異的mRNAの開裂を指示するRNAiを媒介することができる。そのような21〜23nt RNA分子は、3’ヒドロキシル基を含んでもよく、一本鎖もしくは二本鎖（2つの21〜23nt RNAとして）であってよいが、このときdsRNA分子の末端は平滑末端、または突出末端を含んでもよい（例、5’、3’）。
本発明によると、FGFシグナル経路の様々な時期に脂質生成の調節をターゲティングすることができる。いくつかの態様では、FGFのレベルまたは濃度がターゲティングの対象である。適切には、FGF、特に細胞外FGFのレベルもしくは機能活性は、例えばR ＆ D Systems社（ミネソタ州ミネアポリス）によって市販されているR ＆ D systems AF232、またはCancer Res.1988.48:4266に開示されているような抗FGF抗原結合分子（例、中和抗体）の使用により減少する。
他の態様では、FGF-FGFRの結合または活性化がターゲティングの対象である。例えば、FGFRシグナリングの刺激はFGFRの過剰発現によって、またはリガンドの非存在下でFGFR二量体化/オリゴマー化を促進する突然変異および引き続いての構成的活性化を通して達成できる。あるいは、受容体の二量体化を誘導する非リガンド分子を使用して、類似の作用を作り出すことができる。受容体の突然変異は生物学的作用の崩壊も誘導することができ、かつFGF-応答を「特別仕立て」するために利用できるであろう。
他の態様では、FGFRシグナリングの阻害もしくは阻止は、FGFR発現の減少、FGFR突然変異（特に、しかし非排他的にリン酸化部位の）、受容体凝集の防止、または活性結合部位もしくは重要な関連モチーフの遮断を介して、リガンド-受容体相互作用を妨害するアプローチを通して達成される。そのような戦略には、受容体への抗体および小分子結合阻害剤を遮断することが含まれる。受容体のリン酸化を損傷させる薬理学的戦略もまた有効である可能性がある。代表的なFGFRアンタゴニストには、例えばOncogene 1991,6:1195およびFASEB J.1992.6:3362に開示されているような可溶性組換えFGFR-l（IIIc）/Fcキメラ、可溶性組換えFGFR-2/Fcキメラおよび可溶性組換えFGFR-3/Fcキメラを含むがそれらに限定されないFGFRの可溶性型が含まれる。本発明は、さらに例えばCancer Res.1988.48:4266に開示されているような様々な遮断能力を備えるFGFR拮抗性抗原結合分子の使用も想定している。他の態様では、例えばJ.Biol.Chem.1992.267:11307に開示されているように金属キレート剤（例、EDTAまたはEGTA）を使用してFGFRの二量体化を遮断でき、かつFGFR結合ペプチドを使用してCell Growth and Diff.2001に開示されたFGFR（例、FGFR730（p）Y）、およびIUBMB Life 2002.54:67に開示された合成ペプチドのAc-ValTyrMetSerProPhe-NH2の活性または活性化をアンタゴナイズできる。本発明はさらに、TMPP（Cardiovascular Res.2002.53:232）等のFGF-2阻害剤、PD161570（Life Sciences 1998.62:143）等のFGFR1チロシンキナーゼ阻害剤の使用を想定している。
他の態様では、ターゲティングの対象はHSPGである。これに関連してHPSGの発現もしくはタイプの修飾がFGFシグナリングを達成すること、およびHPSG突然変異（天然もしくは人工）がFGFシグナリングの調節と結び付いていることは公知である。例えば、シンプソン・ゴラビ・ベーメル（Simpson-Golabi-Behmel）症候群において見られるグリピカン-3の突然変異には、アップレギュレートされたFGF-1シグナリングと関連する。HPSG発現は、FGFシグナリングの変化を導く多数の非特異的および特異的方法により薬理学的に減少させることができる。そのような戦略は、血管形成および腫瘍発生を減少させる試みにおいて開発されてきた。HSPGと同種の方法で機能する（すなわち、リガンド-受容体複合体もしくはその活性を調節する）他の分子は、さらにFGFシグナリングも調節できる。例示的なHSPGアンタゴニストには、スクロースオクタスルフェート（sucroseoctasulfate）（Mol.Cell.Biol,2002,22:7184）、スラミン（J.Mol.Biol,1998,281:899）、スラジスタ(suradista)（J.Mol.Biol.1998,281:899）、TNP-470（PNAS,2002,99:10730）、アンギオスタチン（PNAS,2002,99:10730）、エンドスタチン（PNAS,2001,98:12509およびHuman Gene Therapy,2001,12:347）、硫酸ホスホマンノペンタオース(phosphomannopentaose sulfate)等のヘパラナーゼ阻害剤（PI-88）（Cancer Research,1999,59:3433）、硫酸マルトヘキサオース（Cancer Research,1999,59:3433）、ヘパリナーゼ（J.Biol.Chem,1997,272:12415およびJ.Biol.Chem,1994,269:32279）、ヘパラチナーゼ（J.Biol.Chem,1994,269:32279）および塩素酸ナトリウム（J.Biol.Chem,1994,269:32279）が含まれるが、それらに限定されない。
さらにまた別の態様では、ターゲティングの主題は受容体以降のFGFシグナル伝達の成分である。FGFR以降のシグナリングの調節は、FGFの特異的な生物学的作用を増加または減少させることができる。そのような戦略は、細胞特異的もしくは組織特異的作用を入手する能力をさらに有する。上記で説明したように、FGFRによって利用されるシグナル伝達経路はしばしばリガンドもしくは受容体にとって唯一ではないが、シグナル経路の調節を通してのFGFシグナリングの調節については十分に証明されている。SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK経路の代表的アンタゴニストには、カルフォスチンC（Cal C）（J.Biol.Chem.,1999,274:18243）等のPKC阻害剤、PD 98059（PD）（Diabetes,2003,52:43およびJBC,1998,273:32111）等のMEK阻害剤、Ly 294002（LY）（Cellular Signalling,2001,13:363およびJ.Neurochem,2002,81:365）等のPI3-K阻害剤、SB 202474（SB 474）（JBC,1998,273:32111）、SB203580（Diabetes,2003,52:43およびJBC,1998,273:32111）、SB 202190（JBC,1998,273:32111）、12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセテート（TPA）（Oncogene,2002,21:1978）およびPD 98059等のSB190に対する制御化合物が含まれるが、それらに限定されない。あるいは、PLCγ-PI3K-PKC-Ca2＋経路を標的とすることができ、これに関連して非常に多くの研究があらゆるレベルでのこの経路の阻害がFGFを含む増殖因子シグナリングを妨害できるという仮説を支持している。本発明の実践において使用するために想定される代表的阻害剤には、U-73122（Calbiochem社）等のホスホリパーゼC阻害剤が含まれるが、それらに限定されない。
さらに他の態様では、ターゲティングの対象はCFRである。これらの態様では、CFRの過剰発現はFGF-1およびFGF-2の細胞内蓄積の低下をもたらすであろう。そのような戦略を使用すると、特に推定される直接的転写作用を調節することによってFGF作用を調節できるだろう。
本発明は、上記の方法における例えば下記のセクション3に記載した方法によって同定される遺伝子または発現産物阻害剤の使用をさらに想定している。
標的ポリペプチドの活性を強化するために使用できる薬剤には、例えば下記のセクション3に開示した標準プロトコールによって、または非ヒト動物モデルを使用して同定もしくは生成できるあらゆる適切な誘導因子もしくは安定化/活性化薬剤が含まれる。今回の場合には、この薬剤は全長標的ポリペプチドまたはその生物活性フラグメントをコードする標的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも1種の生物活性フラグメントを含んでいてよい。この種類の例示的な薬剤には、FGFRもしくはFGF作動性抗原結合分子、FgfポリヌクレオチドもしくはFGFポリペプチド、またはその発現産物がFGFとFGFRとの相互作用を強化する、促進する、さもなければ可能にするポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドのポリペプチド発現産物が含まれる。FgfポリヌクレオチドおよびFGFポリペプチドを産生するための配列情報は、GenBankおよびEMBL等の公に入手できるデータベースで入手可能である。そのような分子は、当業者が標準技法を使用して容易に製造することができる。
本発明の調節薬剤は、適切に脂質生成に影響を及ぼす、または脂質生成を調節するであろう。したがって試験対象である細胞は、好ましくはFGFの起源であるMVECもしくはその前駆体、またはFGFによって活性化されるFGF受容体を発現できる前脂肪細胞である。前脂肪細胞は、脂質生成を介する分化が新規脂肪細胞を作製するような細胞型である。後者の細胞型の蓄積は肥満症に先行する脂肪症の増加を導く、かつそれとは逆に、脂質生成非存在下での脂肪細胞の過剰な消失は悪液質または脂肪症における局所性欠乏症の状態において発生するような過剰に低い脂肪症を導く。MVECに調節薬剤が及ぼす作用を試験するための適切なアッセイには、推定されるFGF調節薬剤またはFGFR調節薬剤の存在下での前脂肪細胞との共培養が含まれるが、それには限定されない。前脂肪細胞の分化能力を阻害もしくは刺激する調節薬剤の能力は、培養前脂肪細胞を使用して、または適切な動物モデルへ本発明の分子を投与してインビボで測定できる。本発明の発明者らは、選択的腹部手術を受けた個体から大網および皮下脂肪組織の生検材料を入手し、細胞培養のためにそのような生検標本材料から前脂肪細胞およびMVECを使用するための系を確立した。増殖および分化能力を測定するためのアッセイは、当技術分野において周知である。皮下および大網前脂肪細胞をプレーティングし、次に推定されるFGFまたはFGFR調節薬剤の存在下または非存在下でMVEC馴化増殖培地へ曝露させた。前脂肪細胞の増殖および分化を測定するためのアッセイも、当技術分野において周知である。例えば、増殖を測定するアッセイには、増殖培地への曝露に引き続いてホルマザンの比色アッセイ法（Promega社）を使用して前脂肪細胞数を評価するアッセイが含まれる。前脂肪細胞分化能力は、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）酵素活性およびトリアシルグリセロール蓄積の測定によって評価される。
当業者に周知のインビボ評価用ツールを利用して、脂肪細胞内への前脂肪細胞の分化能力に関して本明細書で記載したFGFシグナル経路調節薬剤の作用を評価することができる。そのような分化は脂肪組織の蓄積を生じさせる。そして患者におけるそのような組織の量を測定するためのアッセイ手段には、脂肪計を使用した皮下脂肪厚の測定が含まれる。このアッセイには、体脂肪率値を入手するために適した領域（例、三頭筋、二頭筋、肩甲下、および腸骨上（suprailiac）領域）からの皮下脂肪厚の積分法が含まれる。その他のインビボアッセイには、水中での体重測定、生体電気インピーダンス法、2エネルギーX線吸光光度法、および放射線イメージング法（例、コンピュータ化された断層撮影法もしくは磁気共鳴イメージング法）が含まれる。
本明細書に記載したFGFシグナル経路調節薬剤は、本明細書では概して「悪液質および悪液質関連状態」という用語で呼ぶ脂肪沈着の重度の欠失が発生する条件下で脂質生成を強化する用途を有することができる。他の用途には、脂質生成における局所性欠乏症が存在する状態の臨床管理が含まれる。そのような状態には、脂肪異栄養症および身体傷害、熱傷もしくは萎縮性疾患からの脂肪組織の限局性消失が含まれる。そのような状態は、特に癌、心疾患、マラリア、および進行性腎不全の結果として生じることがある。本発明の方法は、そのような病理的状態に関連する脂肪組織の消耗を予防する、または遅延させることができる。
3.標的分子調節因子の同定
本発明は、遺伝子の発現またはその遺伝子の発現産物のレベルおよび/または機能活性を調節する段階を含むFGFシグナル経路を調節する薬剤をスクリーニングする方法もさらに特徴とし、このときその遺伝子はFgf遺伝子、Fgfr遺伝子、Fgf遺伝子もしくはFgf遺伝子と同一の調節もしくは生合成経路に関連する遺伝子、FGFR遺伝子と同一の調節もしくは生合成経路に関連する遺伝子、またはその発現産物がFGFとFGFRとの相互作用を調節する（例、促進する、強化する、もしくは可能にする；または阻害する、もしくは損傷させる）遺伝子、またはその発現がFgf遺伝子の発現産物によって直接的もしくは間接的に調節される、あるいはFGFが相互作用するFGFRの機能をアゴナイズする、もしくはその機能をアンタゴナイズする遺伝子から選択される。
いくつかの態様では、本方法は:（1）ある調製物を試験薬剤と接触させる段階であって、このときその調製物が（i）FGFシグナル経路のポリペプチド成分の少なくとも生物活性フラグメント、またはその変異体もしくは誘導体に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または（ii）レポーター遺伝子へ機能的に連結した成分を調節する少なくとも一部分の遺伝子配列を含むポリヌクレオチドを含有する段階；および（2）試験薬剤の非存在下で正常もしくは基準のレベルおよび/または機能活性と比較して、その薬剤がFGFシグナル経路を調節することを示唆するポリペプチド成分、またはレポーター遺伝子の発現産物のレベルおよび/または機能活性における変化を検出する段階を含む。
脂質生成の調節を検出する、測定する、さもなければ決定するために適切な任意のアッセイ法（例えば、前脂肪細胞の増殖および分化能力を検出することによってなど）は、本発明によって想定されている。適切な種類のアッセイは当業者には公知であり、これらの例は前記のセクション2に記載した。
本発明の範囲に含まれる調節因子には、例えばセクション2に記載したように、拮抗性の抗原結合分子、および阻害剤であるペプチドフラグメント、アンチセンス分子、リボザイム、RNAi分子および共抑制分子、ホスホリパーゼC阻害剤およびキナーゼ阻害剤を含むFGFシグナル経路のアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。アゴニストには、作動性の抗原結合分子、FGFシグナル経路の成分またはそれらの生物活性フラグメント、変異体および誘導体、プロモーター活性を増加させる、または負の調節機序を妨害する分子、ならびに任意の負の調節機序に打ち勝つ分子が含まれる。
候補薬剤は極めて多数の化学クラスを含むが、典型的にはそれらは有機分子、好ましくは50より多く約2,500ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの化学官能基が含まれる。候補薬剤は、しばしば環状炭素もしくは複素環構造、または一つまたは複数の上記の官能基と置換された芳香族もしくは多環芳香族構造を含んでいる。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログ、またはそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない生体分子中で見いだされる。
FGFポリペプチドまたはFGFRポリペプチドの小さな（非ペプチド）分子調節因子が特に好ましい。これに関連して、そのような分子は経口投与後により容易に吸収され、有する潜在的抗原決定因子がより小数であるために、または大きなタンパク質に基づく医薬品より細胞膜を超える可能性が高いために、小分子が特に好ましい。小有機分子は、適切な細胞中へ進入して遺伝子の発現にも影響を及ぼす（例えば、遺伝子発現に関係する調節領域または転写因子と相互作用することによって）、またはアクセサリー分子の結合を阻害もしくは強化することによって遺伝子の活性に影響を及ぼす能力を有する可能性がある。
あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーを利用できる、または容易に産生できる。さらに、天然もしくは合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は従来の化学的、物理的および生化学的手段を通して容易に修飾して、コンビナトリアルライブラリーを生成するために使用できる。構造的アナログを生成するために、公知の薬物にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の指向性もしくはランダム化学修飾を受けさせることができる。
スクリーニングは、公知の薬理学的に活性な化合物およびその化学アナログに対してもまた向けることができる。
本発明による調節薬剤のスクリーニングは、任意の適切な方法によって達成できる。例えば、本方法はFgf遺伝子もしくはFgfr遺伝子、またはFgfもしくはFgfr遺伝子と同一の調節もしくは生合成経路に属する遺伝子に対応するポリヌクレオチドを発現する細胞と、調節活性を有することが疑われる薬剤とを接触させ、そのポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質のレベルもしくは機能活性の調節、またはタンパク質もしくは転写体（以後標的分子と呼ぶ）の下流細胞標的の活性もしくは発現の調節についてスクリーニングする段階を含むことができる。そのような調節を検出する段階は、ELISA法、セルベース（cell-based）ELISA法、阻害ELISA法、ウェスタンブロット法、免役沈降法、スロットもしくはドットブロットアッセイ法、免役染色法、RIA法、シンチレーション近接アッセイ法、抗原結合分子コンジュゲートまたはフルオレセインもしくはローダミン等の蛍光薬剤の抗原コンジュゲートを使用する蛍光免疫アッセイ法、オクタロニー二重免疫拡散分析法、アビジン-ビオチンもしくはストレプトアビジン-ビオチン検出系を使用する免疫アッセイ法、および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を含む核酸検出アッセイ法を含むがそれらに限定されない方法を使用して達成できる。
関心対象の標的分子が調節もしくは発現されるポリヌクレオチドは試験対象である細胞中で自然に発生することがある、または試験の目的で宿主細胞内へ導入されていることがあることは理解されるであろう。さらに、自然に発生する、または導入されたポリヌクレオチドは構成的に発現させることができ、それによりコードされた配列産物の発現をダウンレギュレートする薬剤についてスクリーニングする際に有用なモデルを提供する。このとき、ダウンレギュレーションは核酸もしくは発現産物レベルでありうる、または活性化を必要とすることがあり、それによりコードされた配列産物の発現をアップレギュレートする薬剤についてスクリーニングする際に有用なモデルを提供する。さらに、ポリヌクレオチドが細胞内に導入される程度まで、そのポリヌクレオチドは標的タンパク質をコードする全コード配列を含んでいてよい、またはそのポリヌクレオチドはそのコード配列の一部分（例、FGFRのFGF結合ドメイン、もしくはFgfのFGFR結合ドメイン、もしくはFGFRのHSPG結合ドメイン）またはそのポリヌクレオチドによりコードされる産物の発現を調節する一部分（例、プロモーター）を含んでいてよい。例えば、天然でそのポリヌクレオチドと結びついているプロモーターが、試験の対象である細胞内に導入されてよい。これに関連して、プロモーターだけが利用される場合は、プロモーター活性の調節を検出する段階は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、およびカテコールアミンアセチルトランスフェラーゼ（CAT）を含むがそれらに限定されない適切なレポーターポリヌクレオチドとそのプロモーターとを機能的に連結させることによって達成できる。発現の調節は、そのレポーターポリヌクレオチドと結び付いている活性を測定することによって決定できる。
別の例では、検出の対象は標的分子自体ではなく標的分子の下流調節標的、または発現が標的タンパク質によって調節される産物をコードする遺伝子のプロモーターへ機能的に連結したレポーター分子であってよい。
これらの方法は、合成、コンビナトリアル、化学、および天然ライブラリーを含むタンパク質性もしくは非タンパク質性薬剤等の推定される調節薬剤の高スループットスクリーニングを実施するための機序を提供する。これらの方法は、標的分子をコードするポリヌクレオチドに結合する薬剤、または上流分子の発現を調節し、引き続いて標的分子をコードするポリヌクレオチドの発現を調節する薬剤のいずれかの検出をさらに促進するであろう。したがって、これらの方法は本発明により標的分子の発現または活性を直接的または間接的のいずれかで調節する薬剤を検出する機序を提供する。
一連の態様では、本発明は本発明により標的分子のレベルおよび/または機能活性を誘導または阻害することのできる小分子またはその他の化合物（すなわち、調節薬剤）を同定するためのアッセイ法を提供する。これらのアッセイは、非形質転換細胞、不死化細胞株、または組換え細胞株を使用してインビトロで実施できる。さらにこれらのアッセイは、増加もしくは減少したmRNA発現（例えば、本明細書に開示した核酸プローブを使用して）、増加もしくは減少したタンパク質産物のレベル（例えば、本明細書に開示した抗原結合分子を使用して）、または組換え構築体中の標的分子に関連する遺伝子調節領域に機能的に連結したレポーター遺伝子（例、GFP、βガラクトシダーゼ、もしくはルシフェラーゼ）の増加もしくは減少した発現レベルに基づいて、増加もしくは減少した遺伝子の発現もしくはタンパク質の産生の存在を検出できる。
そこで例えば、特定の標的分子を産生する細胞を培養し、そして培地に一つまたは複数の試験化合物を添加することができる。化合物に標的分子のレベルもしくは機能活性を十分な時間（例、6〜72時間）にわたり誘導もしくは阻害させた後に、上記に記載した、かつ当技術分野において周知の任意の方法を使用して確定されたベースラインからのレベルの変化を検出できる。特に好ましい態様では、細胞は前脂肪細胞または微小血管内皮細胞（MVEC）である。適切な核酸プローブもしくは抗原結合分子を使用して、標的分子のレベルおよび/または機能活性の変化を検出し、かつ標的分子のアゴニストもしくはアンタゴニストとしての化合物を同定するために必要なのは慣例的実験だけである。
いくつかの態様では、例えばGFP、βガラクトシダーゼ、またはルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子が標的分子に関連する遺伝子の5’調節領域へ機能的に連結されている組換えアッセイ法が使用される。そのような調節領域は、当業者であれば容易に単離かつクローン化することができる。レポーター遺伝子および調節領域はフレーム単位で（あるいは、3つの潜在的なリーディングフレーム各々で）結合され、レポーター遺伝子の転写および翻訳は標的分子に関連する遺伝子の調節エレメントの制御下で進行する可能性がある。組換え構築体は任意の適切な細胞型内に導入できるが、哺乳動物細胞が好ましく、かつヒト細胞が最も好ましい。形質転換細胞を培地中で増殖させ、かつレポーター遺伝子の発現のベースラインレベルを確定した後、試験化合物を培地に添加することができる。レポーター遺伝子の発現を検出する容易さは、本発明の標的分子のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための迅速な高スループットアッセイ法を提供する。
この方法によって同定された化合物は、標的分子に関連する遺伝子の発現をインビボで修飾することに強力な有用性を有するであろう。これらの化合物は、最も強力なインビボ作用を有する化合物を同定するために動物モデル中でさらに詳細に試験できる。さらに、標的ポリペプチド結合活性を有する小分子に関連して上記で記載したように、これらの分子は例えばこれらの化合物を連続修飾、分子モデリング、およびその他の合理的な薬物デザインで使用される慣例的技法に供することによって、医薬品開発のための「主要化合物」として機能することができる。
他の態様では、FGFタンパク質の精製調製物が、FGFが活性である条件下において候補薬剤の存在下および非存在下でインキュベートされ、FGF活性のレベルが適切なアッセイによって測定される、FGF活性を阻害する薬剤を同定する方法が提供される。例えば、FGF阻害剤は、候補薬剤が細胞（例、MVECおよび前脂肪細胞）中のFGF活性を減少させる能力を測定することによって同定できる。この方法の1つの態様では、Fgfを発現できるMVECが前脂肪細胞と共培養され、培地中の細胞が細胞中でFGFが活性である条件下で候補薬剤に暴露されるか、候補薬剤の存在下および非存在下で培養され、前脂肪細胞の分化能力の強化等の脂質生成に関連する活性が検出される。薬剤がこの活性を阻害すれば、試験結果は陽性となる。
さらに他の態様では、FGFタンパク質の精製調製物が、FGFが活性である条件下において候補薬剤の存在下および非存在下でインキュベートされ、FGF活性のレベルが適切なアッセイによって測定される、FGF活性を増加する薬剤を同定する方法が提供される。例えば、FGF刺激因子または活性化因子は、候補薬剤が細胞（例、MVECおよび前脂肪細胞）中のFGF活性または活性化を増加させる能力を測定することによって同定できる。この方法の1つの態様では、Fgfを発現できるMVECが前脂肪細胞と共培養され、培地中の細胞が、細胞中でFGFが活性である条件下で候補薬剤に暴露されるか、候補薬剤の存在下および非存在下で培養され、前脂肪細胞の分化能力の強化等の脂質生成に関連する活性が検出される。薬剤がこの活性を上昇させれば、試験結果は陽性となる。
さらに他の態様では、FGFRタンパク質の精製調製物が、FGFRがFGFリガンドへ結合できる条件下において候補薬剤の存在下および非存在下でインキュベートされ、FGFR活性化のレベルが適切なアッセイによって測定される、FGFR活性化を阻害もしくは防止する薬剤を同定する方法が提供される。例えば、FGFRアンタゴニストは、受容体リガンドの存在下で候補薬剤が細胞（例、前脂肪細胞）中のFGFR活性化をベースライン時値から減少させる能力を測定することによって同定できる。この方法の1つの態様では、Fgfrを発現できる前脂肪細胞がMVECと共培養され、培地中の細胞が細胞中でFGFが活性である条件下で候補薬剤に暴露されるか、候補薬剤の存在下および非存在下で培養され、前脂肪細胞の分化能力の強化等の脂質生成に関連する活性が検出される。薬剤がこの活性を阻害すれば、試験結果は陽性となる。
他の態様では、FGFRタンパク質の精製調製物が、FGFRがFGFリガンドへ結合できる条件下において候補薬剤の存在下および非存在下でインキュベートされ、FGFR活性化のレベルが適切なアッセイによって測定される、FGFR活性化を強化する薬剤を同定する方法が提供される。例えば、FGFRアゴニストは、受容体リガンドの存在下で候補薬剤がベースライン値から細胞（例、前脂肪細胞）中の基底FGFR活性化を強化する能力を測定することによって同定できる。この方法の1つの態様では、Fgfrを発現できる前脂肪細胞がMVECと共培養され、培地中の細胞が細胞中でFGFが活性である条件下で候補薬剤に暴露されるか、候補薬剤の存在下および非存在下で培養され、前脂肪細胞の分化能力の強化等の脂質生成に関連する活性が検出される。薬剤がこの活性を強化または促進すれば、試験結果は陽性となる。
さらに他の態様では、固相支持体へ付着したあらゆる考えられるアミノ酸の組み合わせからなるランダムペプチドライブラリーを使用して、標的分子またはその機能的ドメインへ結合できるペプチドを同定することができる。標的分子へ結合できる分子の同定は、組換え可溶性標的分子を用いてペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって遂行できる。標的分子は、任意の適切な方法によって精製、組換え的に発現、または合成することができる。そのような分子は、当業者であれば例えばSambrookら（1989、前記）の特に第16および17節；Ausubelら（「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley ＆ Sons Inc,1994-1998）の特に第10および16章；およびColiganら（「Current Protocols in Immunology」,（John Wiley ＆ Sons,Inc,1995-1997）の特に第1、5および6章に記載された標準プロトコールを使用して便利に調製できる。あるいは、本発明による標的ポリペプチドは、例えばAthertonおよびShephard（前記）の第9章およびRobergeら（1995,Science 269:202）に記載された液相合成法または固相合成法を使用して合成できる。
相互作用して標的分子、適切には標的ポリペプチドとの複合体を形成するペプチド/固相支持体を同定および単離するためには、標的ポリペプチドを標識もしくは「タグ付け」する必要が生じることがある。標的ポリペプチドは、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素ならびにフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコエリトリン（PE）、およびローダミン等の蛍光レポーター分子を含む任意の適切なレポーター分子へ共役結合することができる。任意の所与のレポーター分子と標的ポリペプチドとの共役結合は、当技術分野において慣例的である方法を使用して実施できる。あるいは、標的ポリペプチド発現ベクターは、それに対して市販で入手できる抗原結合分子が存在するエピトープを含有するキメラ標的ポリペプチドを発現するように、工学技術により作製できる。エピトープ特異的抗原結合分子は、酵素、蛍光色素、または着色ビーズもしくは磁気ビーズを用いての標識化を含む当技術分野において周知の方法を使用してタグ付けできる。
例えば、「タグ付き」標的ポリペプチドコンジュゲートは、標的ポリペプチドとライブラリー内のペプチド種との間で複合体形成を許容するように、30分間から1時間にわたり22℃でランダムペプチドライブラリーと一緒にインキュベートされる。ライブラリーは、次に未結合の標的ポリペプチドを除去するために洗浄される。標的ポリペプチドがアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼと共役結合している場合は、全ライブラリーが例えば各々5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルリン酸（BCIP）または3,3’,4,4’’-ジアミノベンジジン（DAB）のようなアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのいずれかについての基質を含有するペトリ皿内へ注入される。数分間インキュベートした後にペプチド/固相標的ポリペプチド複合体は変色し、マイクロマニピュレーターを用いて解剖顕微鏡下で物理的に容易に同定かつ単離することができる。蛍光的にタグ付けされた標的ポリペプチドが使用された場合は、蛍光活性化ソーティング法により複合体を単離できる。異種エピトープを有するキメラ標的ポリペプチドが使用された場合、ペプチド/標的ポリペプチド複合体の検出は、標識化エピトープ特異的抗原結合分子を使用して遂行できる。いったん単離されると、固相支持体へ付着したペプチドの同一性はペプチドシーケンシングによって決定することができる。
4.FGFシグナル経路に関係する遺伝子発現の検出方法
FGFシグナル経路の遺伝子（例、Fgf遺伝子およびFgfr遺伝子）は脂質生成、そして特に前脂肪細胞の分化をプライミングすることに関連していると考察されるので、そのような遺伝子の発現における異常が肥満症、または家族性肥満症、アテローム硬化症、高血圧、および糖尿病を含むがそれらに限定されない肥満症関連状態の素因とつながっている可能性のある、脂質生成の上昇を含む機能不全の脂質生成の基礎となっている、もしくは原因である可能性がある。したがって、本発明は、患者から入手した生物学的サンプル中でのFGFシグナル経路に関係する異常な遺伝子（例、異常なFgf遺伝子もしくはFgfr遺伝子）またはその遺伝子の異常な発現産物の存在を決定する段階を含む、患者における肥満症の存在を検出する、または肥満症のリスクを診断する方法を想定している。このとき、異常な遺伝子または異常な発現産物は肥満症または肥満症関連状態を発生する素因の存在と相関している。
いくつかの態様では、本方法は、その発現産物の正常な基準レベルおよび/または機能活性とは相違する遺伝子の発現産物のレベルおよび/または機能活性を検出する段階を含む。例えば、肥満症の存在、または予想される肥満症に関連する苦痛の存在は、Fgf遺伝子産物またはFgfr遺伝子産物が正常な非肥満症患者もしくは影響を受けていない患者において発現するレベルと比較して検出可能に高いレベルで発現した場合に診断される。あるいは肥満症は、その遺伝子の正常な非肥満症性基準レベルまたは機能活性と比較して増加または上昇しているFgf遺伝子またはFgfr遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性を検出することによって診断される。
そこで、FGFシグナル経路の成分のタンパク質レベルまたは転写レベルを定性的または定量的に決定することが望ましいであろう。あるいは、または追加して、FGFシグナル経路の異常な構造遺伝子およびそれらの調節領域について探索することが望ましいであろう。
生物学的サンプルは、任意の適切な組織（例、皮下結合組織または大網組織の生検材料）または液体であってよい。
4.1 遺伝子診断法
本発明の1つの態様は、FGFシグナル経路に関係する遺伝子発現の増加を検出する方法を含む。例えば、細胞（例、MVEC）中のFgf遺伝子の転写体、または細胞（例、前脂肪細胞）中のFgfr遺伝子の転写体を定性的もしくは定量的に決定することにより、Fgf遺伝子もしくはFgfr遺伝子の発現を検出できる。本発明のまた別の態様は、細胞（例、MVEC）の遺伝子および転写体を試験することによってFGFシグナル経路に関係する遺伝子（例、Fgf遺伝子またはFgfr遺伝子）の発現または機能の増加を検出する方法を含んでいる。これらの態様では、核酸は標準的方法（Sambrookら、「Molecular Cloning.A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbor Press,1989；Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley ＆ Sons Inc,1994-1998）によって生物学的サンプルに含有される細胞から単離できる。核酸は、ゲノムDNAまたは断片化もしくは全細胞RNAであってよい。RNAが使用される場合、RNAを相補的DNAへ転換させるのが望ましいことがある。1つの態様では、RNAは全細胞RNAであり、また別の態様では、RNAはポリ-A RNAである。1つの態様では、核酸は核酸増幅法によって増幅させられる。適切な核酸増幅法は当業者には周知であり、例えばAusubelら（前記）に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；例えば米国特許第5,422,252号に記載されたストランド置換増幅法（strand displacement amplification：SDA）；例えばLiuら（1996）（国際出願国際公開公報第92/01813号）およびLizardiら（国際出願国際公開公報第97/19193号）に記載のローリングサークル型複製法（rolling circle replication：RCR）；例えばSooknananら（1994,Biotechniques 17:1077-1080）に記載された核酸配列に基づく増幅法（nucleic acid sequence-based amplification：NASBA）；ならびに例えばTyagiら（1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5395-5400）に記載されたQ-βレプリカーゼ増幅法が含まれる。
フォーマットに依存して、関心対象の特定の核酸は、増幅法を使用して直接的に、または増幅後に第2の公知の核酸を用いてサンプル中で同定される。次に、同定された産物が検出される。一定の用途では、検出は視覚的手段（例、ゲルの臭化エチジウム染色）によって実施できる。あるいは、検出は化学ルミネセンス、放射性標識もしくは蛍光標識の放射線シンチグラフィー、または電気インパルスもしくは熱インパルス信号を使用するシステムを通じて産物の間接的同定を伴うことがある（Affymax Technology；Bellus,1994,J.Macromol.Sci.Pure,Appl.Chem.,A31（1）:1355-1376）。
検出後には、所与の患者において所見された結果とコントロール反応または統計的に有意な正常被験者の基準群とを比較することができる。この方法によって、検出された発現産物の量と肥満症の進行または重症度とを関連付けることができる。
転写体のレベルを決定することに加えて、この方法は様々なタイプの欠陥を調査するためにも有用なことも証明できる。これらの欠陥には、欠失、挿入、点突然変異、および重複が含まれてもよい。点突然変異は、停止コドン、フレームシフト突然変異、またはアミノ酸置換を生じさせる。体細胞突然変異は、非生殖細胞系組織中で発生する突然変異である。生殖細胞系組織は、あらゆる組織中で発生することができ、遺伝する。コーディング領域内外での突然変異もまた、遺伝子の転写を変化させることによって、あるいは転写体（mRNA）もしくはタンパク質いずれかのプロセッシングを安定化させる、さもなければ変化させる、またはその両方によって、産生するFGFシグナル経路成分の量に影響を及ぼすことがある。
これに関連して、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法（FISH）、直接DNAシーケンシング法、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）分析法、サザンブロッティング法またはノーザンブロッティング法、一本鎖構造分析法（single-stranded conformation analysis：SSCA）、RNase保護アッセイ法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（ASO）、ドットブロット分析法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、RFLP法、およびPCR-SSCP法を含むがそれらに限定されない様々なアッセイ法が企図されている。本発明によってさらに企図されているのは、Haciaら（1996,Nature Genetics 14:441-447）およびShoemakerら（1996,Nature Genetics 14:450-456）によって記載されているようなチップベースDNAテクノロジーである。手短には、これらの方法には極めて多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析する定量的方法が含まれる。オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子をタグ付けすることにより、または固定プローブアレイを使用することによって、チップテクノロジーを使用して高密度アレイとして標的分子を分離し、ハイブリダイゼーションに基づいてこれらの分子をスクリーニングすることができる。Peaseら（1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:5022-5026）；Fodorら（1991,Science 251:767-773）も参照されたい。
4.2 タンパク質に基づく診断
4.2.1 抗原結合分子
本発明の標的分子と免疫相互作用性である抗原結合分子を使用して、FGFシグナル経路遺伝子発現の増加または減少を測定することができる。そこで本発明は、FGFシグナル経路に関係する遺伝子（例、FGFもしくはFGFRポリペプチド、または一つまたは複数のFGFポリペプチドもしくはFGFRポリペプチドのレベルおよび/または機能活性を調節する、さもなければ影響を及ぼすタンパク質）の発現産物に特異的に結合する抗原結合分子もまた企図している。例えば、抗原結合分子は完全ポリクローナル抗体を含んでいてよい。そのような抗体は、ポリクローナル抗血清を入手するために、例えば本発明の標的分子をマウスもしくはウサギが含まれてよい生産種内に注射することによって調製できる。ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者には周知である。使用できる例示的プロトコールは、例えばColiganら、「Current Protocols In Immunology」（John Wiley ＆ Sons,Inc.1991）およびAusubelら（1994-1998、前記）の特に第11章第III節に記載されている。
生産種において入手されるポリクローナル抗体の代わりに、例えばKohlerおよびMilstein（1975,Nature 256,495-497）によって記載されている標準技法を使用して、または例えばColiganら（1991、前記）によって記載されている方法の近年の変法によって、本発明の標的分子が接種された生産種由来の脾臓もしくは他の抗体産生細胞を不死化することによって、モノクローナル抗体を産生することもできる。
本発明は、抗原結合分子としてさらにFv、Fab、Fab’およびF（ab’）2免疫グロブリンフラグメントを企図している。あるいは、抗原結合分子は合成安定化Fvフラグメント、単一の可変領域ドメイン（dAbsとしても知られる）、「ミニボディ（minibody）」、および当技術分野において知られているもの等の形状であってよい。
さらに、抗原結合分子としてヒト化抗体もまた企図されている。ヒト化抗体は、相補的決定領域を非ヒト（例、齧歯類、好ましくはマウス）免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖からヒト可変ドメイン内へ転移させることによって作製される。次にヒト抗体の典型的残留物は、非ヒト対応物のフレームワーク領域内で置換される。ヒト化抗体由来の抗体成分の使用は、非ヒト定常領域の免疫原性と関連する可能性のある問題を未然に防ぐ。非ヒト、特にマウスの免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な方法は、例えばOrlandiら（1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3833）によって記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を産生するための方法は、例えばJonesら（1986,Nature 321:522）、Carterら（1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285）、Sandhu（1992,Crit.Rev.Biotech.12:437）、Singerら（1993,J.Immun.150:2844）、Sudhir（編集、Antibody Engineering Protocols,Humana Press Inc.1995）、Protein Engineering:Principles and Practice、Clelandら（編集）の中のKelley,「Engineering Therapeutic Antibodies」,第399〜434頁（John Wiley ＆ Sons,Inc.1996）、およびQueenらの米国特許第5,693,762号（1997）に記載されている。
4.2.2 免疫診断学的アッセイ
上記の抗原結合分子は、ELISA法およびウェスタンブロッティング法等の方法を通して、健康および疾患状態におけるFGFシグナル経路遺伝子発現の調節を直接的または間接的に測定することに有用性がある。本発明の標的ポリペプチドを検出するために使用できる代表的なアッセイ戦略には、サンプル中の標的ポリペプチド（例、FGFポリペプチド）と抗原結合分子とを結合させて抗原結合分子および標的ポリペプチドを含む複合体の検出を含有する免疫アッセイ法が含まれるが、それらに限定されない。例示的免疫アッセイは、本発明の標的分子のレベルもしくは機能活性を測定できる免疫アッセイである。典型的には、本発明の標的ポリペプチドと免疫相互作用性である抗原結合分子と、標的ポリペプチドを含有することが疑われる生物学的サンプルとが接触させられる。抗原結合分子および標的ポリペプチドを含む複合体の濃度が測定され、測定された複合体濃度が次にサンプル中の標的ポリペプチドの濃度と関連付けられる。本発明と一致して、標的ポリペプチドの異常な濃度、特に上昇した濃度の存在は、肥満症を含む脂質生成機能不全の存在、または脂質生成機能不全と関連する可能性がある苦痛の指標である。
抗原結合分子-標的抗原複合体の形成を決定する任意の適切な方法が使用されてよい。例えば、関連するレポーター分子を有する本発明による抗原結合分子は免疫アッセイ法において利用できる。そのような免疫アッセイ法には、当業者には周知のラジオ免疫アッセイ法（RIA）、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、および免疫クロマトグラフ法（ICT）、ウェスタンブロッティング法が含まれるが、それらに限定されない。例えば、本発明によって使用できる様々な免疫アッセイ法を開示しているColiganら（1994、前記）を参照することができる。免疫アッセイ法には、当技術分野において理解されている、あるいは例えば下記に記載するような競合的アッセイ法を含むことができる。本発明が定性的および定量的免疫アッセイ法を含むことは理解されるであろう。
適切な免疫アッセイ法は、例えば米国特許第4,016,043号、第4,424,279号および第4,018,653号に記載されている。これらは、非競合的タイプの1部位（single-site）および2部位(two-site)アッセイ法ならびに慣例的競合結合アッセイ法を含んでいる。これらのアッセイ法は、標的抗原への標識化抗原結合分子の直接結合をさらに含んでいる。
本発明に使用するためには、2部位アッセイ法が特に好ましい。これらのアッセイ法には多数の変法が存在し、それらはすべて本発明に含まれることが意図されている。手短には、典型的フォワードアッセイ法（forward assay）では、非標識抗体等の非標識抗原結合分子が固相基質上で固定化され、試験されるサンプルが結合した分子と接触させられる。抗体-抗原複合体の形成を許容するために十分な時間にわたる適切なインキュベーション期間後、検出可能なシグナルを産生できるレポーター分子を用いて標識された別の抗原結合分子、適切には抗原に特異的な第2抗体が次に添加され、そしてまた別の抗体-抗原-標識抗体の複合体の形成を許容するに十分な時間にわたりインキュベートされる。任意の未反応薬剤は洗浄して除去され、レポーター分子によって産生されたシグナルの観察によって、抗原の存在が決定される。結果は、目に見えるシグナルの単純な観察による定性的結果、あるいは既知量の抗原を含有するコントロールサンプルと比較することによる定量的結果のどちらかである。フォワードアッセイ法に関する変法には、サンプルおよび標識抗体の両方が結合抗体に同時に添加される同時アッセイ法が含まれる。容易に明白になるであろう小さな変法を含むこれらの方法は、当業者には周知である。本発明によると、サンプルは上記に記載したように組織もしくは液体を含む抗原を含有している可能性のあるサンプルである。
典型的フォワードアッセイ法では、抗原もしくはその抗原性部分に対して特異性を有する第1抗体が固相表面に共有的もしくは受動的のいずれかで結合させられる。固相表面は、典型的にはガラスもしくはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンである。固相支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、もしくはマイクロプレートの形状、または免疫アッセイ法を実施するために適切な他の任意の表面であってよい。結合プロセスは当技術分野において周知であり、一般には固相支持体へのポリマー-抗体複合体の架橋結合、共有結合、または物理的吸着から構成されるが、これは次に試験サンプルの調製において洗い流される。試験されるサンプルのアリコートが次に固相複合体へ添加され、存在する任意の抗原と抗体との結合を許容するために十分な時間にわたり適切な条件下でインキュベートされる。インキュベーション期間後、抗原-抗体複合体が洗浄され、乾燥され、そしてその抗原の一部分に対して特異的な第2抗体と共にインキュベートされる。第2抗体は一般にそれと結び付いているレポーター分子を有しており、レポーター分子は第2抗体と抗原との結合を指示するために使用される。結び付いているレポーター分子によって決定される結合した標識抗体の量は、固定された第1抗体へ結合した抗原の量に比例している。
また別の方法は、生物学的サンプル中の抗原を固定化し、次に固定化抗原をレポーター分子により標識化されていてもいなくてもよい特異的抗体への曝露を伴う。標的の量およびレポーター分子シグナル強度に依存して、結合した抗原は抗体を用いた直接標識化によって検出することができる。あるいは、第1抗体に特異的な第2標識抗体が、第3標的-第1抗体-第2抗体複合体を形成するために標的-第1抗体複合体へ曝露される。この複合体は、レポーター分子が放出するシグナルによって検出される。
上記から、抗原結合分子と結び付いているレポーター分子が下記の:（a）抗原結合分子とレポーター分子との直接結合；（b）抗原結合分子とレポーター分子との間接結合；すなわち、引き続いて抗原結合分子へ結合する他のアッセイ試薬へのレポーター分子の結合；および（c）引き続いての抗原結合分子と反応産物との結合、を含む可能性があることは理解されるであろう。
レポーター分子は、色素原、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、ユーロピウム（Eu34）等のランタニドイオン、放射性同位元素、および直接的可視標識（direct visual label）を含む群から選択されてよい。
直接的可視標識の場合には、コロイド状金属粒子もしくは非金属粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはその他のシグナル産生物質などを含有する小胞を利用することができる。
レポーター分子として使用するのに適切な極めて多数の酵素は、米国特許明細書第4,366,241号、第4,843,000号、および第4,849,338号に開示されている。本発明において有用である適切な酵素には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が含まれる。これらの酵素は、単独で、あるいは溶液中に含まれる第2酵素と組み合わせて使用できる。
適切な蛍光色素には、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、R-フィコエリトリン（RPE）、およびテキサスレッドが含まれるが、それらに限定されない。その他の例示的な蛍光色素には、Dowerら（国際出願国際公開公報第93/06121号）で考察された蛍光色素が含まれる。さらにまた、米国特許第5,573,909号（Singerら）、第5,326,692号（Brinkleyら）に記載された蛍光色素も参照することができる。あるいは、米国特許第5,227,487号、第5,274,113号、第5,405,975号、第5,433,896号、第5,442,045号、第5,451,663号、第5,453,517号、第5,459,276号、第5,516,864号、第5,648,270号、および第5,723,218号に記載された蛍光色素も参照することができる。
酵素免疫アッセイの場合には、酵素が一般にはグルタルアルデヒドもしくは過ヨウ素酸塩によって第2抗体へ共役結合される。しかし容易に認識されるように、当業者であれば容易に利用できる極めて多種多様な共役結合法が存在する。特定の酵素と一緒に使用する基質は、一般には対応する酵素による加水分解で検出可能な変色を産生させるように選択される。適切な酵素の例には、前記に記載した酵素が含まれる。上記に記載の色素原基質ではなく蛍光性産物を産生する蛍光原基質を使用することもまた可能である。すべての場合で、酵素標識抗体が第1抗体-抗原複合体へ添加される。それは次に結合させられ、過剰な試薬は洗い流される。次に、適切な基質を含有する溶液が抗体-抗原-抗体の複合体へ添加される。基質は第2抗体に結合した酵素と反応し、定性的な可視シグナルを産生するが、これは通常は分光光度計によりさらに定量され、サンプル中に存在した抗原量の指標を提供する。
あるいは、フルオレセイン、ローダミン、およびランタニド、ユーロピウム（EU）等の蛍光化合物は、それらの結合能力を変化させずに抗体へ化学的に結合することができる。特定波長の光線を用いた照明により活性化すると、蛍光色素標識抗体は光線エネルギーを吸着し、分子内で興奮性の状態を誘発することを含み、次に光学顕微鏡を用いて視覚的に検出できる特徴的な色の光線を放出する。蛍光標識抗体と第1抗体-抗原複合体とを結合させる。未結合試薬を洗い流した後、残留している第3複合体を次に適切な波長の光線へ曝露させる。観察された蛍光は、対象となる抗原の存在を指示する。免疫蛍光アッセイ（IFMA）は、当技術分野において十分に確立されている。しかし放射性同位元素、化学発光分子、または生物発光分子等の他のレポーター分子もまた使用できる。
例えばFGFRへのFGF結合活性の変化したレベルについて試験する方法、または抗FGFもしくは抗FGFR抗原結合分子を使用する組織、細胞、もしくは液体中のFGFもしくはFGFRタンパク質レベルのウェスタンブロッティング分析、またはサンプルに結合していない他のFGFもしくはFGFR結合パートナーの抗原結合分子量をアッセイし、添加された抗原結合分子もしくは結合パートナーの総量から減じる方法を含む、標的ポリペプチド（例、FGFもしくはFGFR）を試験する他の手段を利用できることは明確に理解されるであろう。
5.治療的使用および予防的使用
本発明によると、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする薬剤が肥満症、肥満症関連状態、脂肪腫、および脂肪腫症を含む過剰な脂質生成の治療または予防のための活性薬剤として有用であることが提案されている。FGFシグナル経路をアゴナイズする薬剤が、例えば悪液質および悪液質関連状態において脂質生成を強化するために有用であることもさらに提案されている。そのような薬物は、それら自体で、またはそれらが適切な薬学的に許容される担体と混合されている薬学的組成物中のいずれかで患者に投与することができる。
本発明の脂質生成調節薬剤は、それらの活性を特定の細胞型に限定することができる生物学的標的薬剤と共役結合させることができる。そのような生物学的標的薬剤には、細胞特異的表面抗原と免疫相互作用性である薬剤が含まれる。例えば、FGFRの活性を調節する薬剤と、脂肪細胞分化関連タンパク質（ADRP）等の前脂肪細胞特異的タンパク質と免疫相互作用性である薬剤とを共役結合させることができる。免疫相互作用性コンジュゲートの存在は、FGFR調節薬剤の作用に前脂肪細胞特異性を付与する。
治療される特定の状態に依存して、薬物は全身性または局所的に処方かつ投与することができる。処方および投与の方法は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」,Mack Publishing Co.（ペンシルベニア州イーストン）の最新版に見いだすことができる。適切な投与経路には、例えば経口、経直腸、経粘膜、または経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびにクモ膜下、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む非経口送達が含まれる。注射するためには、本発明の薬物は水溶液中、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理的緩衝食塩液等の生理的に適合する緩衝液中で処方することができる。経粘膜投与のためには、障壁を通過するために適切な浸透剤が調製物中に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において一般に知られている。筋肉内および皮下注射は、例えば免疫原性組成物、ワクチン、およびDNAワクチンを投与するために適切である。
本薬物は、当技術分野において周知の薬学的に許容される担体を使用して経口投与するために適切な用量へ容易に製剤することができる。そのような担体は、本発明の化合物を錠剤、ピル剤、カプセル剤、液剤、ジェル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等の治療される患者が経口摂取するための剤形に製剤することを可能にする。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩液、および発熱物質を含有しない水から選択できる。
本発明に使用するために適切な薬学的組成物には、有効成分が所定の目的を達成するために十分な量で含有されている組成物が含まれる。患者に投与される薬物の用量は、脂質生成の強化または減少等の患者における有益な反応を経時的に発生させるために十分でなければならない。投与される薬物の量は、年齢、性別、体重、および一般にその健康状態を含めて治療される対象に依存してよい。これに関連して、投与する薬物の正確な量は開業医の判断に依存するであろう。脂質生成の調節において投与される薬物の有効量を決定する際には、医師はFGFシグナル経路の成分の組織中レベル、および脂肪症の程度を評価することができる。いずれにせよ、当業者であれば本発明の薬物の適切な用量を容易に決定できる。
非経口投与のための薬学的調製物には、水溶形にある活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液は適切な注射用油性懸濁剤として調製できる。適切な親油性溶媒もしくは溶剤には、ゴマ油等の脂肪油、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。注射用水性懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の懸濁剤の粘度を増加させる薬剤を含んでいてよい。任意で、懸濁剤はさらに高濃縮液の調製を可能にするために適切な安定剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤をさらに含有していてよい。
経口使用するための薬学的調製物は、活性化合物と固形賦形剤を組み合わせることによって、任意で生じた混合物を粉末化し、かつ所望であれば、錠剤もしくは糖衣錠の核を入手するために適切な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工することによって入手できる。適切な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；例えばコーンスターチ、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、またはポリビニルピロリドン（PVP）等のセルロース調製物等の充填剤である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウム等の塩のような崩壊剤が添加されてよい。そのような組成物は任意の調剤方法によって調製できるが、すべての方法は上記に記載した一つまたは複数の薬物と一つまたは複数の必要な成分を含む担体とを結合させる段階を含む。一般に、本発明の薬学的組成物は、例えば従来型の混合、溶解、顆粒形成、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル形成、封入、または凍結乾燥プロセスの手段によるそれ自体は公知の方法で製造できる。
糖衣錠の核には適切なコーティングが用意される。この目的には、任意でアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、または二酸化チタン、ラッカー液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有していてよい濃縮糖溶液を使用できる。活性化合物用量の様々な組み合わせを識別するため、または特徴付けるために、錠剤もしくは糖衣錠コーティング剤に色素もしくは顔料を添加することができる。
経口使用できる医薬品には、ゼラチンから製造された押し込み型のカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤から製造された軟質の密封カプセルが含まれる。押し込み型のカプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、および任意で安定剤との混合物中に有効成分を含有することができる。軟質カプセルでは、活性化合物は脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコール等の適切な液体中に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定剤を添加することができる。
本発明の薬物の剤形には、このために特別に設計された注入式もしくは埋め込み式制御放出用装置、またはこの方法で追加して機能するように修飾されたインプラントの他の形態をさらに含むことができる。本発明の薬剤の制御された放出は、例えばアクリル樹脂、ワックス、脂肪族多価アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロース等の一定のセルロース誘導体を含む疎水性ポリマーを用いて本発明の薬剤をコーティングすることによって実行できる。さらに、制御された放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム、またはマイクロスフィアを使用して実行することができる。
本発明の薬物は、薬学的に適合する対イオンを備える塩として提供することができる。薬学的に適合する塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含むがそれらに限定されない多数の酸を用いて形成できる。塩は、対応する遊離塩基形である水性または他のプロトン性溶媒中により可溶性である傾向を示す。
本発明の方法に使用される任意の化合物について、治療有効量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、動物モデルにおいて細胞培養で決定されるIC50（例、FGFまたはFGFRポリペプチドの活性の最大半減の阻害もしくは強化を達成する試験薬剤の濃度）を含む循環中濃度範囲を達成する用量を処方できる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定できる。
そのような薬物の毒性および治療有効性は、例えばLD50（集団の50％が致死する用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効である用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的製薬手法によって決定できる。毒性作用と治療作用との用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から入手されたデータは、ヒトにおいて使用するための用量範囲を処方するために使用できる。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性をほとんど、または全く有さないED50を含む循環中濃度の範囲内にある。用量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動してよい。正確な調製物、投与経路および用量は、患者の状態に照らして個々の医師が選択することができる（例えば、Finglら、1975による「The Pharmacological Basis of Therapeutics」の第1章第1頁を参照）。
投与量および投与間隔は、FGFまたはFGFRの阻害または強化作用を維持するために十分である活性薬剤の血漿中レベルを提供するために個々に調整できる。全身性投与するための通常の患者用量の範囲は、1〜2,000mg/日、一般には1〜250mg/日、そして典型的には10〜150mg/日である。患者の体重に関して記載した通常の用量範囲は、0.02〜25mg/kg/日、一般には0.02〜3mg/kg/日、そして典型的には0.2〜1.5mg/kg/日である。患者の体表面積に関して記載した通常の用量範囲は、0.5〜1,200mg/m2/日、一般には0.5〜150mg/m2/日、典型的には5〜100mg/m2/日である。
あるいは、例えば好ましくは皮下または大網組織である組織中への化合物の直接注射によっての全身性の方法ではなく局所的方法で、しばしばデポー剤または持続性放出製剤で化合物を投与することもできる。
その上に、例えば組織特異的抗体を用いてコーティングされたリポソーム中で、標的薬物送達系中の薬物を投与することができる。リポソームは、組織を標的とし、組織によって選択的に取り込まれるであろう。
局所投与もしくは選択的取り込みの場合、この薬剤の有効な局所濃度が血漿濃度とは関連していない可能性がある。
本発明は、哺乳動物の遺伝子療法の方法もまた企図している。そのような方法は、FGFシグナル経路の成分、またはその生物活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法構築体を利用するが、このときポリヌクレオチドは哺乳動物におけるポリヌクレオチドの発現を指示する一つまたは複数の調節配列を提供する遺伝子療法ベクター内にライゲートされる。典型的には、遺伝子療法ベクターはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびレトロウイルス等のウイルスDNA配列から得られる。当業者が現在利用できる適切な遺伝子療法ベクターは、例えばRobbinsら、1998の中に見いだすことができる。「アンチセンス」療法が企図される場合（例、Fgf）、Fgfポリヌクレオチドの一つまたは複数の選択された部分が遺伝子療法ベクター内で3’→5’へ方向付けることができる。
哺乳動物、適切にはヒトへの遺伝子療法構築体の投与は、直接経口摂取、全身性注射、または選択された組織もしくは細胞への送達、または哺乳動物もしくは適合するドナーから単離された細胞への間接的送達を含むことができる。後者のアプローチの例は、増殖および分化能力を有する単離幹細胞がFgfポリヌクレオチドを含むベクターを用いてトランスフェクトされる幹細胞療法であろう。幹細胞は、ある期間に渡り培養され、次に治療される哺乳動物へ移される。
哺乳動物または適合するドナーの細胞もしくは組織への遺伝子療法構築体の送達は、例えば微粒子銃法、リポソーム媒介性トランスフェクション（例、リポフェクチンもしくはリポフェクタミン）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムもしくはDEAE-デキストラン媒介性トランスフェクションによって促進できる。適切な送達方法についての考察は、Ausubelら（1994-1998、前記）の第9章の中に見いだすことができる。
例えば、FGF-1をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入して、その細胞が脂質生成を促進する能力を強化することができる。これとは逆に、3’→5’オリゴヌクレオチド等のFgf-1アンチセンス配列を導入して、その細胞の脂肪細胞への分化を減少もしくは損傷させることができる。
また別の態様では、本発明の調節薬剤をコードするポリヌクレオチドは当技術分野において知られているような「裸の（naked）DNA」組成物の形状にある治療用または予防用組成物として使用できる。例えば、調節ポリヌクレオチドと機能的に連結したポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー等）は動物、好ましくは哺乳動物に導入することができ、そこでインビボ、好ましくは前脂肪細胞組織中での調節薬剤の産生を惹起する。
発現ベクターを標的細胞または組織内へ導入する段階は、意図された使用および種に依存して相違するであろう。そして例えばMulligan,R.C.（1993）に記載されているような一つまたは複数の非ウイルスベクターおよびウイルスベクター、カチオン性リポソーム、レトロウイルス、ならびにアデノウイルスを含むことができる。そのような方法には、例えば下記を含むことができる:
A.注射（Wolffら、1990）、外科的埋め込み、点滴注入、または任意の他の手段による発現ベクターの局所適用
この方法は、その治療法の有効性を増加させるために、さらに発現ベクターによってコードされるタンパク質に反応性である細胞の注射、外科的埋め込み、点滴注入、または任意の他の手段による局所適用と併用できる。この方法は、タンパク質の活性のために必要な他の因子の注射、外科的埋め込み、点滴注入、または任意の他の手段による局所適用とも併用できる。
B.単独、またはリポソーム（Zhuら、1993）、ウイルスカプシドもしくはナノ粒子（Bertlingら、1991）、または他の送達媒介因子と組み合わせたDNA（Calabrettaら、1993）もしくはRNAの注射による全身性送達
ターゲティングの向上は、ポリヌクレオチド/発現ベクターと標的分子とを連結することによって（例えば、抗原結合分子を使用するいわゆる「魔法の弾丸（magic bullet）」アプローチ）、または発現ベクターによってコードされるタンパク質、またはそのタンパク質に反応性である細胞の活性のために必要な他の因子の注射、外科的埋め込み,
もしくは任意の他の手段による局所適用によって達成されてよい。例えば、アンチセンスFgfポリヌクレオチドを含有するリポソームの場合には、免疫相互作用性物質をMVEC表面抗原に特異的であるリポソームコーティング剤に組み込むことによってMVECを標的とすることができる。MVEC特異的細胞表面抗原の例はPECAM-1である。
C.エキソビボでのトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム（Chenら、1987）、またはカチオン性脂質およびポリアミン（Roseら、1991）の存在下で）、感染、注射、エレクトロポレーション（Shigekawaら、1988）、またはそれらの細胞中でのポリヌクレオチドの発現を増加できる任意の他の方法によって修飾されている細胞の任意の手段による注射または埋め込みもしくは送達
その修飾は、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルスベクター（アデノウイルスベクターもしくはレトロウイルスベクター等；Mulligan,1993；Miller,1992；Salmonsら、1993）もしくはその他のベクター、リポソーム（Zhuら、1993）、ウイルスカプシド、もしくはナノ粒子（Bertlingら、1991）、または任意のその他の修飾メディエーターもしくはその他のベクター、または任意その他の修飾メディエーター等の修飾物質によって媒介される可能性がある。遺伝子または遺伝子産物の送達溶剤としての細胞の使用は、Barrら、1991およびDhawanら、1991によって記載されている。処理された細胞は、治療される対象においてそれらの生存を促進するいずれかの栄養素、増殖因子、マトリックス、または他の物質と組み合わせて送達することができる。
以下では、本発明を容易に理解して実際的に実行するために、特定の好ましい態様を下記の非限定的例によって記載する。
実施例１ ヒト前脂肪細胞およびMVECの生検、単離、および培養
材料および方法
抗PECAM-1抗体でコーティングされた磁気ビーズの生成
共有結合したヒツジ抗マウスIgG1（Dynal社）を備えるDynabeads M-450を製造業者の取扱説明書にしたがってPECAM-1（CD31）に対する精製マウス抗ヒトモノクローナル抗体（PharMingen社）でコーティングした。抗PECAM-1抗体でコーティングしたDynabeadsは濃度30mg/mLの脱イオン化リン酸緩衝食塩液（DPBS）＋0.1％ BSA中に再懸濁させ、4℃で無菌保存した。調製されたビーズは少なくとも4ヵ月間は活性のままであった。
対象
対の大網（O）および腹部皮下（S）脂肪組織生検材料を、選択的開腹外科手術（婦人科手術または血管手術）を受けた4例の男性患者（平均年齢69歳、範囲66〜70歳；平均BMI:27、範囲26〜29）および5例の女性患者（平均年齢55歳、範囲39〜67歳；平均BMI:27、範囲20〜32）から入手した。糖尿病または重度の全身性疾患を有している患者は含まれず、脂肪組織質量または代謝に影響を及ぼすことが知られている薬物を摂取している患者もいなかった。本試験プロトコールは、プリンセス・アレクサンドラ病院およびクイーンズランド工科大学の治験審査委員会によって承認された。全患者から文書によるインフォームド・コンセントを入手した。
間質血管（stromovascular）細胞の単離
図2を参照すると、生検材料は研究室のリンガー液中へ運ばれた（輸送時間15分間）。前脂肪細胞および微小血管内皮細胞は同一生検材料から単離した。（1）目に見える神経、血管、および線維組織の除去後、脂肪を細かく細分化し、3mg/mLのII型コラゲナーゼおよび1.5％ウシ血清アルブミンを含有する37℃の消化液（25mM HEPES、5mM グルコース、120mM 塩化ナトリウム、50mM 塩化カリウム、および1mM 塩化カルシウム）中で1時間インキュベートした。消化液 対 脂肪組織の比率は4:1であった。結果として生じた消化物を250μmメッシュ（Sigma社）に通して濾過し、脂肪細胞および遊離油を間質-血管成分から4℃での5分間にわたる250gでの遠心により分離した。（2）間質-血管ペレットをDPBS＋10％ BSA中に再懸濁させ、洗浄し、遠心した（600g、5分間、4℃）。これを繰り返し、次にDPBS単独の中で最終洗浄した。（3）結果として生じたペレットを室温で15分間にわたり、1mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（CSL社、ブリスベン）を含有する0.25％トリプシン中で時折撹拌しながらインキュベートした。5％ウシ胎児血清（ICN社）を含有するハンクス平衡食塩液（HBSS）の添加によりトリプシンを中和した。（4）結合組織の大きなフラグメントは100μmメッシュ（Sigma社）を通しての濾過により除去した。（5）濾液を遠心し（600g、5分間、4℃）、1％ゼラチンをコーティングしたペレットを25cm2培養フラスコ（Corning社）内に再懸濁させて10％FBS；100IU ペニシリン；100μg/mL ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン（全部がICN Biomedical Australasia社）；90μg/μL ヘパリン；30ng/mLのβ-内皮細胞増殖因子（β-ECGF）；0.014M HEPES；0.15％ NaHCO3を含有する内皮細胞（EC）増殖培地（M-199；ICN社）中でプレーティングした。この混合細胞集団を37℃、5％ CO2中で3〜5日間にわたり培養した。
抗PECAM-1 Dynabeadsを用いての微小血管内皮細胞の選択
さらになお図2を参照すると:（6）短い培養期間（およそ3日間）の後、細胞を0.25％トリプシン/1mM EDTAと一緒に4〜5分間にわたりインキュベートし、次にハンクス緩衝食塩液（HBSS）＋5％ FBSを用いてトリプシンを中和し、遠心した。（7）ペレット化細胞を1mLのHBSS＋5％ FBS中に再懸濁させ、50μLの抗PECAM-1でコーティングしたDynabeads（15分間、4℃）と一緒にインキュベートした。（8）HBSS＋5％ FBSを用いて細胞/ビーズ懸濁液の総量を10mLとし、室温で3分間にわたり磁気粒子濃縮機を使用して内皮細胞を選択した。マグネット内に配置したままのチューブを用いて、洗浄液中の選択されなかった細胞（前脂肪細胞）を新鮮なチューブへ移した。次にさらに10mLのHBSS＋5％ FBSを用いて内皮細胞を洗浄し、磁気粒子濃縮機（3分間）を使用して再選択した。この洗浄/選択の過程を5回繰り返した。（9a）選択された細胞（内皮細胞）を次に1％ゼラチンをコーティングした培養フラスコ内のEC増殖培地中でプレーティングした（上記のとおりに）。（9b）非選択細胞（前脂肪細胞-PA）を遠心し、100IU ペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、および10％ FBS（PA増殖培地）を含有するDMEM/Ham’s F12 1:1（ICN Biomedical Australasia社）中に再懸濁させた。
内皮細胞培養の精製
さらになお図2を参照すると:（10）混入している線維芽細胞からの内皮細胞の分離は、0.25％トリプシン/1mM EDTA（T/V）を用いて培養を30〜40秒間処理し、HBSS＋5％ FCSを用いてT/Vを中和し、EC増殖培地を含む1％ゼラチンでコーティングしたフラスコへ非付着性内皮細胞を移すことによって達成した。このトリプシン化および移動方法を均質な内皮細胞培養が入手されるまで培養の初期2週間にわたって1回もしくは2回繰り返した。
細胞培養
細胞は37℃、5％ CO2中で維持した。培地を2〜3日毎に取り換え、トリプシン/EDTAを用いて細胞を慣例的に継代培養した。内皮細胞はゼラチンをコーティングしたフラスコ内のEC増殖培地中で維持し、前脂肪細胞はコーティングしていない培養フラスコ内のPA増殖培地中で維持した。内皮細胞数が増加するにつれて、EC増殖培地中のβ-ECGFの濃度は30ng/mLから10ng/mLへと低下した。継代培養2〜4の実験作業では、内皮細胞および前脂肪細胞の両方を使用した。
その他の細胞型の培養
ヒト皮膚微小血管内皮細胞系CADMEC（Cell Applications社、サンディエゴ）（脂肪由来初代内皮細胞と同一条件下で培養した）、およびヒト皮膚線維芽細胞（パンチ生検によって入手し、ヒト前脂肪細胞と同一条件下で培養した）を内皮細胞試験のための各々陽性および陰性コントロールとして使用した。
内皮細胞の特性付け
脂肪症組織生検材料から入手した微小血管内皮細胞（MVEC）を多数の方法で特性付けした。
形態
培養を倒立位相差顕微鏡により内皮細胞の特徴的な敷石状形態について試験した（図3A）。
免疫蛍光法
細胞はフォン・ウィルブランド因子（vWF）（クローンF8/86、DAKO社）および血小板内皮細胞接着分子-1（PECAM-1；CD31）（クローンJC/70A、DAKO社）の発現について特定のモノクローナル抗体を使用する免疫蛍光法によって評価した。細胞を24ウェルプレート（1％ゼラチンをコーティングした）の個々のウェル内でコンフルエンスまで増殖させた。コントロール細胞（ヒト皮膚微小血管内皮細胞-CADMEC）、ヒト前脂肪細胞およびヒト皮膚線維芽細胞の初代培養を平行して処理した。培地を除去した後、細胞を2％パラホルムアルデヒド（BDH Laboratory Supplies社、英国）中で2分間、室温（RT）で固定した。次に細胞を、0.1％トリトンX 100（Ajax Chemicals社、オーストラリア）を用いて30秒間、RTで易透化処理した。固定かつ易透化処理した細胞をPBS中の1％ BSAを用いて洗浄かつブロッキングし（3回）、その後PBS＋1％ BSA中で希釈した後に添加した一次抗体（全抗体を1:100の希釈率で使用した）と一緒に4℃で4時間インキュベートした。二次抗体の非特異的結合により産生する擬陽性を排除するために、すべての細胞型をさらに初代抗体に置換して緩衝液または非免疫抗体（アイソタイプコントロール）のいずれかを用いて類似の方法で処理した。細胞をPBSにより洗浄し（3回）、次にPBS＋1％ BSA中の1:50の希釈率でフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-標識二次抗体（ウサギ抗マウスIgG FITC；DAKO社）と一緒に室温で30分間インキュベートした。細胞をPBSにより洗浄し（2回）、次に核を4℃で5分間かけてヨウ化プロピジウム（ストック液:100mLの0.1Mクエン酸3ナトリウム中の5mgのヨウ化プロピジウム；使用液:1部のストック液対3部の0.1M PBS）により対比染色した。細胞をPBSによりさらに2回洗浄し、その後Nikon TE-FM Epi-Fluorescenceアタッチメントを装備したNikon Eclipse TE300倒立顕微鏡を使用して試験し、そしてKodak MAX 400 ASAフィルムを装填したNikon F70カメラで撮影した。上記のようにモノクローナル抗体（クローンBBIG-E4,R ＆ D Systems社）および免疫蛍光法を使用して、10ng/mLの腫瘍壊死因子（TNF）α（Biosource International社、米国）を含有する増殖培地中で4時間にわたり前処理した細胞中でのE-セレクチン（CD62E）の発現についてさらに調査した。結果は図3に示した。
遺伝子発現
MVECおよびCADMECをNOS3遺伝子による内皮細胞一酸化窒素シンターゼ（eNOS）の発現について試験した。全RNAは細胞から製造業者の指示にしたがってTri-reagent（Sigma社）を使用して抽出した。2μgのRNAを標準的方法によりExpand Reverse Transcriptase（Roche社）を使用してcDNAへ転換させた。PCRは、1×のPCRバッファー、1μLのcDNA、12.5pmolの各プライマー、1.5mMのMgCl2、および0.625UのTaq DNAポリメラーゼを含有する総量25μLの反応液中で実施した。プライマー配列および熱サイクル条件は以前に記載されたとおりであった（Rockettら、In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.,31:473-481,1998）。PCR産物は、1×のTBEバッファー中に1mL当たり1μgの臭化エチジウムを含有する1.2％アガロースゲル上で分離し、紫外光線下で視認かつ写真撮影した。ФX174マーカーを使用した。
前脂肪細胞の特性付け
前脂肪細胞は形態（位相差顕微鏡および細胞計数）ならびに分化能力に基づいて特性付けした。後者はG3PDH酵素活性およびトリアシルグリセロール蓄積によって評価した。
G3PDH活性
活性は、以前に記載されたように評価した（Adamsら、J.Clin.Invest.100:3149-53,1998）（Primary Mesenchymal Cells,第1版,Kluwer Academic 5:173-87,2001中のHutleyら）。
トリアシルグリセロールの蓄積
細胞計数およびNile Redアッセイを使用して脂質の蓄積を評価した。
細胞計数
分化培地中での14日間の処理後、1mm2マイクロメーターグリッドを使用する倍率100倍の位相差顕微鏡（西独、ノイバウエル）下で各処理において細胞を含有する脂質の数を推定した。各処理について相違する10ヵ所の領域を試験し、細胞総数および脂質含有細胞の割合の両方を評価した（データは示していない）。
Nile Redアッセイ
以前に記載されたように（Hutleyら、2001、前記）、6ウェルプレート内で培養した前脂肪細胞をリン酸緩衝食塩液（PBS）（pH 7.4）中で3回洗浄し、各ウェルに150μLのトリプシン-バーゼン液を添加した。細胞が培養プレートから離れるまで、細胞を37℃で10分間インキュベートした。Nile Redを含有するPBSを各ウェルに最終濃度1μg/mLとなるように添加し、細胞をさらに室温で5〜7分間インキュベートした。488nm（励起時）/540nm（発光時）で分光蛍光計（Aminco Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer）を使用して室温で蛍光を測定した。結果は表面積で標準化した。各処理は3回ずつ実施した。
実施例2 MVECが前脂肪細胞の増殖および分化に及ぼす作用
血管内皮細胞由来因子が脂質生成に及ぼす役割を調査するために、本発明者らは、微小血管内皮細胞由来因子を含有する増殖培地の存在下で前脂肪細胞をインビトロ培養した場合の作用について試験した。
材料および方法
前脂肪細胞およびMVECの生検材料を入手して単離かつ培養する方法は、実施例1と同様であった。
馴化培地の調製
すべてが1％ゼラチンをコーティングした培養上でコンフルエンス状態にあるヒト脂肪由来微小血管内皮細胞（MVEC）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（CADMEC）、およびヒト皮膚線維芽細胞（HSF）の個別培養の各々を、10ng/mLのβ-ECGFを含有するEC増殖培地（上記参照）へ37℃、5％ CO2中で48時間にわたり曝露させた。この培地を次に収集し、0.22μ低タンパク質結合フィルターを使用して濾過し、その後の使用時まで-20℃で貯蔵した。EC増殖培地＋10ng/mLのβ-ECGFもまた上記のとおりに処理したが、培養フラスコに細胞は含めなかった（ブランクコントロール）。使用直前に、各培地を解凍し、各々へ5％FCSをさらに添加した。
前脂肪細胞増殖アッセイ
皮下および大網前脂肪細胞ならびにヒト皮膚線維芽細胞を、96ウェルプレート内のDMEM/Ham’s F12（1:1）＋10％ FCS（PA増殖培地）中で約1×103cells/ウェル（サブコンフルエント）の密度で個別にプレーティングし、37℃、5％ CO2大気中で16〜20時間に渡り接着させた。この培地を次にEC増殖培地と取り換え、コンフルエントな皮下もしくは大網MVEC、ヒト皮膚線維芽細胞（HSF）、または細胞を含有しないウェル（ブランクコントロール）のいずれかへ曝露させること（各処理は4回ずつ実施した）により馴化させた（上記参照）。個別実験において皮下および大網PAを上記のとおりにプレーティングし、引き続いてS MVEC、O MVEC、ヒト皮膚EC（CADMEC）馴化培地、新鮮なEC増殖培地、またはブランクコントロールのいずれかを用いて処理した。48時間後、前脂肪細胞の細胞数をホルマザンの比色アッセイ（Promega社）により評価した。水溶性テトラゾリウム塩である3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム（MTS）を200μg/mLの濃度で各ウェルに添加した。37℃で4時間に渡りインキュベーションした後、Bio-Rad 3550マイクロプレートリーダーを使用して490nmの吸光度で測定した。このアッセイの妥当性を二通りの方法で試験した；1）前脂肪細胞を1ウェル当たりの細胞250個；500個；1,000個；2,000個；4,000個でプレーティングし（4回ずつ）、そして490nmで吸光度を測定した；2）A490nmで測定した後、細胞を引き続きヨウ化プロピジウムにより染色し、蛍光顕微鏡を使用して直接細胞計数を実施した。1ウェル当たり計4領域について計数し、これらの結果を490nmでのホルマザンの吸光度により入手した細胞数と比較した。
統計学的検定
細胞数と光学密度との相関関係は、ピアソンの相関係数によって推定した。増殖に関するデータは、反復測定値についての一方向性の分散分析によって評価した。条件内作用についての事後比較はα＝0.05で対応のあるt-検定（paired-t test）を用いて処理した。
結果
MVEC馴化培地がPA増殖に及ぼす作用
前脂肪細胞の増殖に作用を及ぼす可溶性因子がMVECによって分泌されるかどうかを決定するために、ヒト前脂肪細胞をMVEC馴化培地による48時間の処理へ曝露させた。これらの結果は、コントロールと比較して、前脂肪細胞（皮下および大網の両方）の増殖率における統計的有意な増加を証明した（p＝＜0.001）。この結果は、皮下（S）および大網（O）脂肪組織部位由来のMVEC馴化培地を用いて処理した前脂肪細胞についての結果と類似であったが、「S」MVECを用いて処理した前脂肪細胞は「O」MVECを用いて処理した増殖率より増殖率がわずかに高い傾向を示した。脂肪由来MVECによって産生した因子が前脂肪細胞に及ぼす有糸分裂促進性作用は、ヒト皮膚MVEC（CADMEC）によって誘導された増殖が脂肪由来MVECによって誘導された増殖ほど高くなかったので（p＝0.001）、ある程度の特異性を示した。ヒト皮膚線維芽細胞由来馴化培地は、ブランクコントロールに比較して前脂肪細胞への増加した増殖作用を有していなかった。これらの試験における増殖アッセイの妥当性を公知の数の前脂肪細胞を使用して確認したところ、結果は細胞数と490nmでの吸光度との直線関係を証明した（r2＝0.9）。限られた数の実験において、直接細胞計数を使用してさらに結果の妥当性を確認したところ、試験アッセイおよび実験アッセイのどちらにおいても490nmでのホルマザンの吸光度との陽性相関関係（ピアソン相関係数＝0.97）が示された。
実施例3 前脂肪細胞、脂肪細胞、およびMVECにおけるFGF-I発現の分析
MVECがFGF-1を産生するという観察に基づいて、調査者らは前脂肪細胞のインビトロでの複製および分化における特異的増殖因子FGF-1が果たす役割を調査する実験を実施した。結果（データは示していない）により、単離時点から精製FGF-1の存在下で増殖した前脂肪細胞が、FGF-1またはその他のMVEC由来因子の非存在下で培養した前脂肪細胞と比較して、類似の、だが付加的ではない分化能力の増加を示した。調査者らは、次にFGF-1産生細胞の同一性を確証し、そして同定された細胞中でのFGF-1 mRNA産生を定量するための実験をデザインした。
材料および方法
大網および皮下組織の生検および前脂肪細胞の単離は、実施例1に記載した方法にしたがって実施した。
細胞内FGF-1の免疫蛍光標識化
特異的抗FGF-1抗体（Sigma社、F5421）を使用して細胞内FGF-1を検出した。標識化細胞内FGF-1の視認は、共焦点顕微鏡を使用して実施した。
前脂肪細胞、脂肪細胞、およびMVECにおけるFGF-I mRNA発現の評価
FGF-1 mRNA発現は、リアルタイムRT-PCRを使用して評価した。標準プロトコール（TRI-reagent）を使用して各細胞型から全RNAを抽出し、そしてSuperscript preamplification system（Life Technologies社）を使用してcDNAを生成した。次にABI Prism 7700 Sequence Detector（Perkin Elmer社/Applied Biosystems社）を使用する蛍光に基づくリアルタイムPCR法であるTaqMan（商標）アッセイ法を使用してFGF-1の発現を決定した。
FGF-1タンパク質発現の定量化
次にサンプル細胞型各々の全細胞溶解液中でのFGF-1タンパク質発現を評価するためにウェスタンブロッティング法を実施した。
結果
初期データは、FGF-1 mRNAおよびタンパク質が成熟ヒト脂肪細胞中では極めて低レベルで発現するが、前脂肪細胞中ではmRNAもタンパク質も検出できないことを示した。以前の試験結果に一致して、FGF-1 mRNAおよびタンパク質は、どちらもMVECによって高レベルで発現した。
実施例4 遺伝子発現におけるFGF-l誘導性の変化についての特性付け
材料および方法
ヒト大網前脂肪細胞は、選択的開腹外科手術（婦人科手術または血管手術のいずれか）を受けた患者から組織生検により入手した。糖尿病または重症な全身性疾患を有する患者は1例もあるべきではなく、脂肪組織質量または代謝に影響を及ぼすことが知られている薬物を摂取している患者もいるべきではなかった。以下のプロトコールは、プリンセス・アレクサンドラ病院およびクイーンズランド工科大学の治験審査委員会によって承認された。実施例1に記載した方法によって前脂肪細胞を単離かつプレーティングした。
前脂肪細胞を48時間にわたりヒトFGF-1接種血清の存在下（＋）または非存在下（-）で増殖させた。次に、マイクロアレイチップを製造業者の指示にしたがって使用して遺伝子発現を比較した。マイクロアレイの走査画像上でImaGene 4.1（BioDiscovery社）ソフトウェアプラットホームを使用してスポットを同定した。データ解釈には、GeneSpring 4.1ソフトウエア（Silicon Genetics社）を使用した。
ホスホリパーゼCγ2（PLCγ2）タンパク質の発現は、モノクローナル抗PLCγ2抗体（Santa Cruz社、sc-5283）を使用して免疫蛍光標識化法を用いるウェスタンブロッティング法を使用して分析した。
実施例5 脂肪生成組織へのPLCγ2調節因子のターゲティング
PLCγ2は身体の全組織における極めて多数のシグナル経路に関与しているので、前脂肪生成もしくは抗脂肪生成を目的としてその活性を調節する薬剤を使用するためには、前脂肪細胞への調節因子の選択的ターゲティングを必要とする。
材料および方法
免疫学的ターゲティングプロトコール
標準プロトコールを使用して、前脂肪細胞特異的タンパク質、脂肪細胞分化関連タンパク質（ADRP）に対するモノクローナル抗体を作製した。手短には、タンパク質からペプチド配列を合成し、次にこれを使用して12週間に渡り週2回、5匹のウサギ（同系交配シロウサギ系統）に接種した。この期間中に血清に基づくインビトロ免疫細胞化学的アッセイ法を使用して、ウサギ由来の血清をADRPとの反応性について試験することにより、導入されたペプチドに対する免疫学的反応を監視した。12週間後にウサギを屠殺し、抗ADRP抗体の変異体を単離および試験するために単離脾臓細胞を培養した。U-73122上の遊離カルボキシル基を抗ADRP抗体上のN-末端残基へ架橋結合させるカルボジイミドアミド化段階を使用して、U-73122との共役結合のために最も高い親和性定数を有する抗ADRP IgG抗体を選択した。
脂肪親和性ターゲティングプロトコール
脂肪親和性ベンゾジアゼピンアンタゴニストであるフルマゼニルを脂肪組織中でのこのホスホリパーゼ阻害剤の蓄積を促進するためにU-73122と共役結合させた。共役結合は、各化合物上での選択した炭素原子間の共有結合を形成する単純な架橋結合反応を使用して実施した。
各共役結合U-73122化合物の抗脂肪生成能力を試験するために、各調製物の3つの用量を生後10〜40日のSTZ自然発症糖尿病性肥満症ラット系統において試験した。筋肉内注射により1日2回用量を投与した。試験動物の肥満指数（BMI）値を毎日試験し、処置期間を通してラットを有害薬物反応について監視した。フルマゼニルコンジュゲート処置群を中枢神経系有害作用について緊密に監視した。
実施例6 ヒト脂肪組織、ヒト脂肪組織由来微小血管内皮細胞およびマウス3T3-LI細胞中でのFGF-1の発現
全細胞の溶解産物は、単離時点（1週間超）からのFGF-1ならびに大網および皮下単離ヒト脂肪細胞の存在下および非存在下で、分化した3T3-L1脂肪細胞、脂肪組織MVEC、大網および皮下のヒト前脂肪細胞から調製した。BCAを使用したタンパク質の定量後に、総タンパク質の20μgをレーン毎に装填し、SDS/PAGEによりタンパク質を分解し、ニトロセルロース膜へ移した。関心対象のタンパク質は、抗FGF-1抗体および関連する二次抗体のパネルを使用して検出した。結合した抗体は、強化された化学発光を使用して検出した。
図4に示すように、FGF-1タンパク質は3T3-L1細胞および内皮細胞中では検出されたが、任意の実験条件下のヒト前脂肪細胞または脂肪細胞中では検出されなかった。結果は、FGF-1 mRNAについての定量的RT-PCR分析により試験かつ確証された全ての抗体と一致していた（データは示していない）。
実施例7 FGF-1、FGF-2、およびIGF-Iが大網および皮下前脂肪細胞の複製および分化に及ぼす作用
複製
前脂肪細胞を96ウェルプレート内の血清含有培地中で細胞500個/ウェル（サブコンフルエント）の密度で12〜18時間にわたりプレーティングして接着させた。細胞をその後、1ng/mLのSCM＋増殖因子中で48時間に渡りインキュベートし、そしてMTS増殖アッセイ（Promega社）を実施した。SCMコントロールと比較して表示した図5に示す結果は、FGF-1およびFGF-2の両方に反応した増殖の顕著な増加を証明した。
分化
分化実験のために、前脂肪細胞を単離して、内皮細胞馴化培地（EC-DMEM）中で、または増殖因子の存在下で2ヵ月間まで継代培養し、その後6ウェルプレート内でコンフルエンスに到達させた。細胞を次に、0.1μMロシグリタゾンを含有する血清無含有の化学修飾された分化培地中で分化させた。分化は、標準G3PDHアッセイを使用して第21日に評価した。
図5に示す結果は、増殖因子または脂肪組織MVEC馴化培地への前脂肪細胞の曝露が、引き続いて標準条件下での分化を促進することを示した。複製に及ぼす作用と同様に、FGF-1はFGF-2より顕著な作用を有しており、FGF-2の作用は順にIGF-1を用いて所見された作用より大きかった。
FGF-1およびFGF-2併用処理の作用
ヒト大網および皮下前脂肪細胞を単離し、FGF-1またはFGF-2の存在下および非存在下でSCM中で継代培養した。コンフルエンスに達すると、細胞はFGF-1またはFGF-2の存在下および非存在下での標準的な化学修飾されたSFM＋ロシグリタゾン中で分化した。分化はG3PDH活性によって評価した。図6に示す結果は、FGF-1およびFGF-2のどちらも、複製中または分化中のどちらかに存在した場合、脂質生成性であることを示した。両方の過程を通しての存在は付加的であった。FGF-1はFGF-2より大きな脂質生成性作用を有していた。これらのデータは、複製および分化中のFGF-1の脂質生成性作用が独立的かつ付加的であることを示唆している。
実施例8 FGF-1の血清の存在下におけるヒト前脂肪細胞のインビトロでの分化の許容
インビトロでのヒト前脂肪細胞分化の標準的要件は、血清の強制的除去である。これは、SCM中で高い分化能力を有するマウス脂肪細胞型（例、3T3-L1）とは対照的である。ヒト細胞のために開発された培養系は分化のために必要な因子のダウンレギュレーションを誘導する、または抗分化因子の発現を促進する（あるいはその両方）と推定されている。これらの実験において、ヒト大網および皮下前脂肪細胞を単離し、FGF-1の存在下で継代培養した。次にSCM＋インスリンならびに（第1〜3日）デキサメタゾンおよびロシグリタゾン中で細胞を分化させた。
図8に表示す結果は、SCM中で継代培養した前脂肪細胞中での分化の完全な不在（原形質中の脂質の蓄積によって証明されるように）（A）ならびにSCM＋FGF-1中で継代培養した皮下（B）および大網（C）前脂肪細胞中での有意な分化を示した。
これは血清存在下でのヒト前脂肪細胞のインビトロ分化の初めての証明であり、ヒト脂質生成におけるFGF-1が果たす中心的役割についての説得力のある証拠である。
実施例9 FGF-lによるヒト前脂肪細胞遺伝子発現のマイクロアレイ分析
全RNAは、SCM（コントロール）またはSCM＋FGF-1のいずれかの中で単離および増殖させたコンフルエントなヒト皮下前脂肪細胞から単離した。cRNAを調製し、チップへハイブリダイズさせ、引き続いてAffymetrix（登録商標）システムを使用して分析した。各処理を2例ずつのサンプルによって表示し、2回の独立実験を実施した。遺伝子発現は、発現が一貫して（CV＜5％）少なくとも50％増加または減少した場合にFGF-1によって影響を受けたと見なした。100を超える遺伝子を各カテゴリーに分類し、現在調査中の遺伝子を図9に示した。
FGFR-1およびFGFR-2のアップレギュレーション、ならびにFGFR-3のダウンレギュレーションは、ヒト前脂肪細胞中でのFGF-1の作用がFGFR-1またはFGFR-2によって媒介される可能性があることを示唆した。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）およびCCAAT/強化因子結合タンパク質α（C/EBPα）のアップレギュレーションは、これらの重要な脂質生成転写調節因子がFGF-1の脂肪生成性作用を媒介することを指示している。FGF-1はSCM中でのそれらの発現を促進する、または消失を防止すること（またはその両方）ができるであろう。PLCγ2の増加した発現は、これが重要な後FGFRシグナリング分子であるため関連がある。
実施例10 ヒト前脂肪細胞PLCγの発現のFGF-1による増加
ヒト前脂肪細胞を24ウェルプレート内のSCM＋/-FGF-1中で培養した。PLCγ発現を間接免疫蛍光法によって試験した。非免疫一次および二次抗体だけを含むコントロールは染色を示さなかった。図10に示す結果は、この分子の発現がSCM単独中での細胞と比較して、FGF-1の存在下でコンフルエンスまで増殖させたヒトＰＡ中で増加することを証明した。これらの結果は、PLCγ2発現が、分化誘導が発生する段階であるコンフルエンス状態では大きくアップレギュレートされることも示した。
実施例11 PLCγの阻害によるFGF-1誘導性ヒト脂質生成の損傷
ヒト皮下前脂肪細胞を単離し、PLC阻害剤であるU-73122（Calbiochem社）を含めて、および含めずにFGF-1の存在下および非存在下のSCM中で継代培養した。細胞を次にコンフルエンスへ到達させ、U-73122を含めて、および含めずにFGF-1の存在下および非存在下でロシグリタゾンを含有する標準的な化学修飾されたSFMを使用して分化させた。分化はG3PDH活性によって評価した。図11に示す結果は、U-73122が複製期または分化期中にFGF-1誘導性分化を有意に損傷させたこと、およびどちらのプロセス中にも付加的な作用を及ぼしたことを示している。
実施例12 中和抗FGF-1抗体によるFGF-1誘導性ヒト前脂肪細胞複製の排除
ヒト前脂肪細胞を単離し、FGF-1＋/-抗FGF-1抗体を含むSCM中で培養した。複製を上記に記載したとおりに評価した。図12に示す結果は、抗体を用いた複製の用量依存的な減少を示している。これらのデータは、細胞外FGF-1減少戦略の有効性を支持している。
実施例13 後FGFRシグナリングの阻害が前脂肪細胞分化に及ぼす作用
ヒト前脂肪細胞を単離し、SCM＋FGF-1中で継代培養した。分化の1週間前を通して、チロシンキナーゼ阻害剤を培地に添加した。次に細胞を初期3日間に渡りSFM＋ロシグリタゾン＋FGF-1＋/-阻害剤中で分化させた。第15日に細胞を採取し、G3PDH活性により分化を評価した。
これらの実験のために使用した化合物は次のとおりであった:（1）カルフォスチンC（Cal C）-PKC阻害剤；（2）PD 98059（PD）-MEK阻害剤；（3）Ly 294002（LY）PI3-K阻害剤；（4）SB 202190（SB 190）-p38キナーゼ阻害剤；および（5）SB 202474（SB 474）-SB 190に対するコントロール化合物。
図13に示す結果は、後FGFRシグナル伝達後経路の阻害がFGF-1媒介性ヒト脂質生成に顕著な作用を及ぼすことを証明している。PKC、PI3K、およびPLCγ（上記に示した）の阻害は、すべてが分化を有意に減少させた。前脂肪細胞複製期中のMEKおよびp38キナーゼの阻害は、単独で引き続いての分化を有意に減少させた。
本明細書で言及した各特許、特許出願、および出版物の開示は、これによりその全体が参照して本明細書に組み込まれる。
本明細書での参考文献についての言及は、そのような参考文献が本出願にとって「先行技術」として利用可能であるという是認であると解釈すべきではない。
本明細書を通して、その目的は本発明をいずれか1つの態様または特定の特徴の集まりに限定することなく、本発明の好ましい態様を記載することであった。このため当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく実行される特定態様を様々に修飾および変更できることを理解するであろう。すべてのそのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (62)

  1. FGFシグナル経路を調節するために十分な時間および条件下で細胞と薬剤とを接触させる段階を含む、脂質生成を調節する方法。
  2. FGFシグナル経路がFGF-1シグナル経路およびFGF-2シグナル経路から選択される、請求項1記載の方法。
  3. 薬剤が遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を調節し、遺伝子がFgf遺伝子、Fgfr遺伝子、Hspg遺伝子、SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK経路に属する遺伝子、PLCγ-PKC-Ca2＋経路に属する遺伝子、FGF-1核移行経路に属する遺伝子、およびFGFの細胞内結合パートナーをコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  4. 細胞と、遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を調節する薬剤とを接触させ、遺伝子がFgf遺伝子およびFgf遺伝子と同一の調節経路もしくは生合成経路に属する遺伝子から選択される、請求項1記載の方法。
  5. 細胞が微小血管内皮細胞またはその前駆体である、請求項4記載の方法。
  6. Fgf遺伝子がFgf-1およびFgf-2から選択される、請求項4記載の方法。
  7. Fgf遺伝子と同一の調節経路または生合成経路に属する遺伝子がP34およびFIFから選択される、請求項4記載の方法。
  8. 細胞と、遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を調節する薬剤とを接触させ、遺伝子がFgfr遺伝子、Fgfr遺伝子と同一の調節経路もしくは生合成経路に属する遺伝子、その発現がFgf遺伝子の発現産物によって直接的もしくは間接的に調節される遺伝子、またはFGFが相互作用するFGFRの機能をアゴナイズ（agonise）もしくはアンタゴナイズ（antagonise）する遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  9. Fgfr遺伝子がFgfr-1、Fgfr-3、およびFgfr-4からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
  10. Fgfr遺伝子と同一の調節経路もしくは生合成経路に属する遺伝子が、シンデカン-1、シンデカン-2、シンデカン-3、シンデカン-4、グリピカン-1、グリピカン-2、グリピカン-3、グリピカン-4、グリピカン-5、グリピカン-6、パールカン、βグリカン、CFR、SHC、Crk、FRS2、Src、FAK、Nck、Shb、SHP2、GRB-2、SOS、80K-H、pp66、Gab1、P38 MAPK、PI3K、AKT、PKB、RAS、RAF、ERK1,2、MAPKKK、MAPKK、MAPK、Jun、Fos、FPPS、PLC、Fes、PIP2、DAG、Ca2＋チャンネル、IP3、CaMキナーゼ、PKC、PKA、cAMP、CREB、およびCBPからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項8記載の方法。
  11. その発現がFgf遺伝子の発現産物によって直接的または間接的に調節される遺伝子が、Pparγ、Igfbp-3、Igfbp-6、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、およびPkcθからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
  12. FGFRと相互作用するFGFがFGF-1またはFGF-1である、請求項8記載の方法。
  13. 細胞が前脂肪細胞（preadipocyte）またはその前駆体である、請求項8記載の方法。
  14. 薬剤が前脂肪細胞の分化能力および/または増殖を減少させるためにFGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項1記載の方法。
  15. 薬剤が遺伝子の発現またはその遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を減少させ、遺伝子がFgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、およびIgfbp-6からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
  16. 薬剤が遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を増加させ、遺伝子がFgf-l、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、およびPkcθからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
  17. 薬剤がFGFRの機能をアンタゴナイズする、またはFGFRとFGFとの相互作用を妨害する、請求項14記載の方法。
  18. 薬剤が前脂肪細胞の分化能力および/または増殖を増加させるためにFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項1記載の方法。
  19. 薬剤が遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を減少させ、遺伝子がFgf-l、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、およびPkcθからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
  20. 薬剤が遺伝子の発現または遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を増加させ、遺伝子がFgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、およびIgfbp-6からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
  21. 薬剤がFGFRの機能をアゴナイズする、またはFGFRとFGFとの相互作用を強化する、促進する、さもなければ可能にする、請求項18記載の方法。
  22. 薬剤が遺伝子の発現およびその遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性を、その薬剤の非存在下における発現、レベル、または機能活性と比較して少なくとも10％増加または減少させる、請求項1記載の方法。
  23. （i）FGFシグナル経路のポリペプチド成分の少なくとも生物活性フラグメント、もしくはその変異体もしくは誘導体に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または（ii）レポーター遺伝子に機能的に連結している成分を調節する遺伝子配列の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドを含む調製物と、試験薬剤とを接触させる段階；ならびに試験薬剤の非存在下における正常もしくは基準のレベルおよび/または機能活性と比較した、薬剤がFGFシグナル経路を調節することを示唆するポリペプチド成分またはレポーター遺伝子の発現産物のレベルおよび/または機能活性における変化を検出する段階を含む、FGFシグナル経路を調節する薬剤を同定する方法。
  24. FGFRを発現する細胞の第1サンプルとFGFとを接触させて少なくとも1つのマーカーを測定する段階；FGFRを発現する細胞の第2サンプルと薬剤およびFGFとを接触させてマーカーを測定する段階；ならびに細胞の第1サンプルのマーカーと細胞の第2サンプルのマーカーとを比較する段階を含む、FGFシグナル経路を調節する薬剤を同定する方法。
  25. マーカーが、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、FGF経路の細胞内成分、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
  26. 脂質生成を阻害するもしくは減少させる、または肥満症もしくは脂質生成が局所性で異常に増加した状態において脂質生成を制御するための薬物の製造における薬剤の使用であって、薬剤がFGFシグナル経路をアンタゴナイズする使用。
  27. FGFもしくはFGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、またはこれらの変異体もしくは誘導体、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列を含む調製物を接触させる段階；およびFGFもしくはFGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、または変異体もしくは誘導体、またはその遺伝子配列から発現した産物のレベルもしくは機能活性の減少を検出する段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFもしくはFGFRに、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列に結合する、請求項26記載の使用。
  28. FGFRおよびFGFと薬剤とを接触させてFGFRとFGFとの結合を測定する段階であって、FGFRとFGFとの結合を減少させた、または排除した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
  29. 薬剤がFGFまたはFGFRに特異的な拮抗性の抗原結合分子である、請求項28記載の使用。
  30. FGFRおよびHSPGと薬剤とを接触させてFGFRとHSPGとの結合を測定する段階であって、FGFRとHSPGとの結合を減少させたまたは排除した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
  31. 薬剤がHSPGまたはFGFRに特異的な拮抗性の抗原結合分子である、請求項30記載の使用。
  32. FGFおよびCFRと薬剤とを接触させてFGFとCFRとの結合を測定する段階であって、FGFとCFRとの結合を減少させたまたは阻止した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
  33. 薬剤がFGFまたはCFRに特異的な拮抗性の抗原結合分子である、請求項30記載の使用。
  34. 前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択される細胞の第1サンプルとFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階；前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択される細胞の第2サンプルと薬剤およびFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階；細胞の第1サンプルの分化および/または増殖と細胞の第2サンプルの分化および/または増殖とを比較する段階であって、細胞の分化および/または増殖を増加させた場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
  35. FGFとFGFRとの結合を妨害すること、FGFRのリン酸化を妨害すること、FGF/FGFR相互作用の上流もしくは下流のシグナル経路の成分を妨害すること、FGFRとHSPGとの結合を妨害すること、FGFとCFRとの結合を妨害すること、またはFGFRの二量体化を妨害することにより、薬剤がFGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。いくつかの態様では、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする薬剤はTGF、IGF-1、およびWNTシグナル経路から選択されるシグナル経路を妨害する。
  36. 動物モデルまたはヒトにシグナル経路をアンタゴナイズする薬剤を投与して薬剤に対する動物の応答性を測定する段階であって、動物における脂質生成を阻害したもしくは減少させた場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を阻害する、さもなければ減少させる薬剤が、FGFシグナル経路をアンタゴナイズする、請求項26記載の使用。
  37. 悪液質の治療もしくは予防、または脂肪症における局所性欠乏症（localised deficiency）の状態において脂質生成を刺激するための薬物の製造における薬剤の使用であって、薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする使用。
  38. FGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、またはこれらの変異体もしくは誘導体、またはFgfもしくはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列を含む調製物を接触させる段階；およびFGFRポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、または変異体もしくは誘導体、または遺伝子配列から発現した産物のレベルもしくは機能活性の増加を検出する段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFRまたはFgfr遺伝子の発現を調節する遺伝子配列に結合する、請求項37記載の使用。
  39. FGFRおよびFGFと薬剤とを接触させてFGFRとFGFとの結合を測定する段階であって、FGFRとFGFとの相互作用を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
  40. 薬剤がFGFまたはFGFRに特異的なアゴニストの抗原結合分子である、請求項39記載の使用。
  41. FGFRおよびHSPGと薬剤とを接触させてFGFRとHSPGとの結合を測定する段階であって、FGFRとHSPGとの相互作用を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
  42. 薬剤がHSPGまたはFGFRに特異的なアゴニストの抗原結合分子である、請求項41記載の使用。
  43. FGFおよびCFRと薬剤とを接触させてFGFとCFRとの結合を測定する段階であって、CFRとFGFとの相互作用を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
  44. 薬剤がFGFまたはCFRに特異的なアゴニストの抗原結合分子である、請求項43記載の使用。
  45. 前脂肪細胞またはそれらの前駆体から選択される細胞の第1サンプルとFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階；前脂肪細胞もしくはそれらの前駆体から選択される細胞の第2サンプルと薬剤およびFGFとを接触させて細胞の分化および/または増殖を測定する段階；細胞の第1サンプルの分化および/または増殖と細胞の第2サンプルの分化および/または増殖とを比較する段階であって、細胞の分化および/または増殖を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を強化する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
  46. FGFとFGFRとの結合を刺激すること、FGFRのリン酸化を刺激すること、FGFRとHSPGとの結合を刺激すること、FGFとCFRとの結合を刺激すること、FGFRの二量体化を刺激すること、またはFGF/FGFR相互作用の上流もしくは下流のシグナル経路を刺激することにより、薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項45記載の使用。
  47. 動物モデルまたはヒトにシグナル経路をアゴナイズする薬剤を投与してその薬剤に対する動物の応答性を測定する段階であって、動物における脂質生成を刺激した場合に薬剤の試験結果が陽性となる段階によって決定されるように、脂質生成を刺激する薬剤がFGFシグナル経路をアゴナイズする、請求項37記載の使用。
  48. FGFシグナル経路を調節することが疑われる薬剤を試験する段階；および調節についての試験結果が陽性であることに基づいて薬剤を合成する段階を含む、脂肪症関連状態における脂質生成を調節する薬剤を製造する方法。
  49. 薬剤を誘導体化する段階、ならびに任意で薬学的に許容される担体および/または希釈剤を用いて誘導体化薬剤を製剤する段階をさらに含む、請求項48記載の方法。
  50. 患者から得た生物学的サンプル中のFGFシグナル経路に関係する異常な遺伝子、またはFGFシグナル経路に関係する遺伝子の異常な発現産物の存在を決定する段階を含む、患者における脂肪症関連状態の存在を検出する、またはそのリスクを診断するための方法であって、異常な遺伝子または異常な発現産物が脂肪症関連状態の存在またはリスクと相関している方法。
  51. 異常な遺伝子が、異常なFgf遺伝子および異常なFgfr遺伝子から選択される、請求項50記載の方法。
  52. 異常な発現産物が、異常なFgf発現産物および異常なFgfr発現産物から選択される、請求項50記載の方法。
  53. 患者から得た生物学的サンプル中のFGFシグナル経路に関係する異常な遺伝子、またはFGFシグナル経路に関係する遺伝子の異常な発現産物の存在を決定する段階を含む、患者における異常に増加した脂肪症関連状態の存在を検出する、またはそのリスクを診断するための方法であって、異常な遺伝子または異常な発現産物が脂肪症関連状態の存在またはリスクと相関している方法。
  54. 状態が、肥満症および脂質生成における局所性で異常に増加した状態からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
  55. 脂質生成における局所性で異常に増加した状態が、脂肪腫および脂肪腫症からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
  56. 発現産物の正常な基準レベルまたは機能活性とは相違するFGFシグナル経路に関係する遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性を細胞中で決定する段階を含む、患者における異常に増加した脂肪症関連状態の存在を検出する、またはそのリスクを診断するための方法。
  57. Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3およびIgfbp-6からなる群より選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の増加または上昇を決定する段階を含む方法であって、細胞が前脂肪細胞またはその前駆体である、請求項56記載の方法。
  58. Fgf-l、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3キナーゼ、Pkcθからなる群より選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の減少を決定する段階を含む方法であって、細胞が前脂肪細胞またはその前駆体である、請求項56記載の方法。
  59. Fgf-1およびFgf-2から選択される遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の増加または上昇を決定する段階を含む方法であって、細胞が微小血管内皮細胞である、請求項56記載の方法。
  60. 治療を必要とする患者にFGFシグナル経路を損傷、または妨害する脂質生成の阻害に有効な量の薬剤、および任意で薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を投与する段階を含む、肥満症または脂質生成の局所性で異常に増加した状態における脂質生成を阻害する、または減少させる方法。
  61. 治療を必要とする患者にFGFシグナル経路を刺激する脂質生成の強化に有効な量の薬剤、および任意で薬学的に許容される担体もしくは希釈剤とを投与する段階を含む、悪液質または脂肪症における局所性欠乏症の状態を治療または予防する方法。
  62. 脂肪症関連状態を治療または予防するための薬物の調製における、FGFシグナル経路を調節する薬剤の使用。
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