CN101058801B - 促进人皮下脂肪干细胞分化成熟的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞及基因工程技术领域。虽然胚胎干细胞具有多向分化潜能，但对其的研究和应用存在诸多伦理问题，所以对同样具有多向分化潜能的成体干细胞的研究受到关注，其中脂肪干细胞(ADSC)由于其来源丰富，提取方便，更被研究者所重视。另外FGF10是一种只表达于白色脂肪组织的成纤维细胞生长因子，对脂肪组织的分化成熟起着至关重要的作用。本发明通过体外培养建立了脂肪干细胞系，并且构建了一种可以表达人成纤维细胞生长因子10(FGF10)的重组载体，通过体外及体内实验均证实外源表达的FGF10能促进ADSC的分化成熟。这种促进人皮下脂肪干细胞分化成熟的方法在皮肤创伤治疗和整形美容领域有很大的应用前景。

Description

促进人皮下脂肪干细胞分化成熟的方法及其应用

技术领域

本发明涉及干细胞及基因工程技术领域，具体涉及一种利用重组人成纤维细胞生长因子10(FGF10)表达载体作用于人皮下脂肪干细胞，使其分化成熟的方法，及其在皮肤创伤治疗和整形美容中的应用。

背景技术

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hES)是从着床前的内细胞团(inner cell mass，ICM)获得的具有多向分化潜能性，可以发育成为各种细胞的一类细胞系。因其具有多潜能性，而成为组织工程、器官移植等各项研究的重要材料来源。然而胚胎干细胞的研究和应用存在伦理问题，所以近年来对于成体干细胞的研究日益受到关注，其中脂肪组织因为来源丰富，提取方便，所以从中提取干细胞逐渐被研究者所重视。该研究大都集中于脂肪含量较多的动物，尤其对兔皮下脂肪的分离培养及诱导鉴定做了大量卓有成效的工作。近来由于吸脂手术越来越多，很多人开始从废弃的脂肪中进行提取人脂肪干细胞的研究。Patricia A.Zuk等人2002年在抽脂术组织中成功分离培养脂肪干细胞，并诱导分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞等三个胚层来源的细胞(Patricia A.Zuk，et al.Human adipose tissue is a source of multipotentstem cells.Mol bio of the cell，2002；13：4279～95)，最近更有人将其定向诱导成为心肌细胞(Lenka，et al.Obesity Research，2003)。所以可以将之称为抽脂术细胞(processed lipoaspirate，PLAs)或脂肪来源的间充质干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)。然而吸脂术对皮下脂肪有加热液化的操作过程，对细胞的存活和培养带来不利。

人成纤维细胞生长因子(FGFs)是由数量众多的成员组成的一个超家族，目前被鉴定的FGFs已有23种，其中FGF10是四肢、肺、牙齿、下颌腺以及白色脂肪组织等器官组织形成中重要的信号调节分子。基因敲除(gene knockout，KO)技术是研究该基因功能的主要手段，近年通过制备FGF10的KO小鼠，发现FGF10广泛参与胚胎器官组织的形成发生。在人的成体组织中，FGF10是表达于白色脂肪组织的唯一的FGF，而在白色脂肪组织中只有ADSC能在一定条件下分泌FGF10(Itoh N，et al.FGFs as multifunctional signaling molecules：divesity of structure andfunction.Seikagaku，2001；73(7)：525～35)，并且FGF10在体内发挥作用时间短暂，半衰期仅为10小时左右(A.A.Thomson，et al.Prostatic growthand development are regulated by FGF10.Development，1999；126：3693～701)。

脂肪组织的生长不仅包括脂肪细胞体积的增大，也包含了新脂肪细胞的生成，而新脂肪细胞即为白色脂肪组织中的脂肪干细胞分化而来。调控这一分化过程的转录调节因子和细胞因子有很多，主要有CAAT增强子结合蛋白家族(C/EBPs)中的C/EBPα、C/EBPβ和过氧化物酶体增殖物激活受体家族(PPARs)中的PPARγ等。这些转录调节因子共同控制着脂肪细胞的分化，其中尤以C/EBPs和PPARs的协同作用最为重要，两者能相互激活转录，而在转录过程中这些因子作用也有先后顺序，C/EBPβ在分化过程中首先得以表达，随即能激活C/EBPα和PPARγ的表达，而C/EBPα也能诱导PPARγ的表达(Evan D.Rosen，et al.Transcriptional regulation of adipogenesis.Gene & Development，2000；14：1293～307)。

干细胞在体内不同部位分化为不同组织细胞，组织微环境在调控分化方向上起了重要的作用，为多种临床医疗拓展了新的途径和思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进人皮下脂肪干细胞分化成熟的方法，及其在皮肤创伤治疗和整形美容中的应用。

本发明根据人成纤维细胞生长因子10(FGF10)是特异性表达于白色脂肪组织唯一的FGF、人白色脂肪组织中存在的脂肪干细胞可以在一定诱导条件下分化为成熟脂肪细胞以及干细胞在体内微环境作用下分化成不同细胞等事实，构建了含FGF10基因的重组载体，将其转染至人胚源性间充质干细胞(human mesenchymal stem cell，MSC)，利用MSC表达的外源性FGF10促进ADSC向成熟脂肪细胞分化。

另外由于吸脂术对皮下脂肪有加热液化的操作过程，对细胞的存活和培养带来不利。本发明从外科开腹手术术中取得皮下脂肪组织，分离培养建立了脂肪干细胞系(ADSC)，并进行了细胞系的定向诱导分化和鉴定。

本发明的方法主要包括以下步骤：

I、脂肪干细胞的分离培养和扩增；

II、构建了含人成纤维细胞生长因子10(FGF10)基因的重组载体，将其转染至人胚源性间充质干细胞(MSC)；

III、利用MSC表达的外源性FGF10促进ADSC向成熟脂肪细胞分化。

上述的含FGF10基因的重组载体是pcDNA3.0-FGF10。

本发明通过体外共培养的方法以及裸鼠背部皮下注射细胞的体内实验发现，FGF10可以促进脂肪干细胞向成熟脂肪细胞的分化，利用脂肪细胞特异油红O染色、实时定量PCR检测分化过程中的各种转录因子以及裸鼠皮肤石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色等方法直接或间接地证明了FGF10的作用。因而证实了本发明在皮肤创伤治疗和整形美容中的应用，特别是本发明对临床以增脂为主要方法的整形美容提供了新的途径和思路。

附图说明

图1构建pCDNA3.0-FGF10重组表达载体流程图

具体实施方式

现结合实施例及附图，对本发明作进一步的描述。

实施例1：

一、脂肪干细胞分离培养和扩增

1、脂肪干细胞原代培养方法如下：成人皮下脂肪组织来自长海医院妇科手术，用无菌50ml离心管于手术室取术中剪取皮下脂肪约15ml左右，保持37℃，于30分钟内送抵细胞实验室，超净工作台上用眼科剪将脂肪组织剪成0.3×0.3cm大小颗粒，并尽量清除微血管、结缔组织及电凝疤痕，用0.1mM磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗剪碎组织3次后移入青霉素小瓶中，0.1％胶原酶I消化，同时用眼科剪反复剪碎至糊状，将糊状组织移入50ml离心管，置37℃摇床，170rpm，继续消化30min后1000rpm离心10min，去除上清，将沉淀重悬于0.075mM氯化钾中以去除红细胞，静置10min后1000rpm离心10min，去上清，沉淀重悬于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，根据组织量多少移入相应大小的培养皿中，48小时后观察细胞贴壁情况(培养用液均购自美国GIBCO公司)。

发现48小时后有大量梭型细胞贴壁，隔天更换培养液，经过10天左右细胞数量达到90％培养皿底面积，并且细胞生长呈现明显的螺旋状排列。达到对数生长期后，用0.25％胰酶(美国GIBCO公司)37℃消化3min，按照1∶3的比例进行传代，传代3次左右即可获得纯度很高的脂肪干细胞。

2、免疫荧光检测ADSC相对特异性分子：ADSC生长至90％培养皿底面积后，以无水乙醇固定，按免疫组化技术进行免疫荧光分析。一抗为羊抗人OCT-4、S-100以及小鼠抗人CD44、CD49d、E-cadherin(北京中山生物技术有限公司)，二抗为FITC标记的驴抗羊及羊抗小鼠IgG(华美生物工程有限公司)。

结果显示经传代培养第5代ADSC细胞核表达OCT-4，细胞核及细胞质表达S-100和CD44，细胞膜表达E-cadherin，另外经过与人胚胎来源间充质干细胞(MSC)的免疫荧光对比显示，ADSC细胞质表达CD49d，而MSC则不表达。

3、经传代至第3代、第5代、第7代ADSC分别接种于2个6孔板中，进行细胞计数。每24小时消化一孔进行细胞计数，共计12天。每次计数重复3次，取平均值，绘制细胞生长曲线。

结果显示ADSC随传代增加，增殖速度没有明显变化。增殖均缓慢，平均10天左右到达对数生长期。

4、ADSC多能分化能力：

ADSC各方向诱导培养基及鉴定方法

分化方向	培养基	附加条件	鉴定方法
				脂肪	10％FBSDMEM	1mmol/L地塞米松，10μmol/L胰岛素，0.5mmol/L IBMX	油红O染色
骨	10％FBSDMEM	0.1μmol/L地塞米松，50μmol/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-磷酸甘油	I型胶原的免疫组化

分化方向	培养基	附加条件	鉴定方法
				软骨	10％FBSDMEM	6.25μg/ml胰岛素，50μmol/L抗坏血酸，10ng/ml TGF	II型胶原的免疫组化
神经	DMEM	10μmol/Lβ-巯基乙醇	神经元特异烯醇化酶(NSE)的免疫组化

第3代及第5代ADSC分别利用以上培养基诱导培养，3～5天更换一次培养基，7～10天左右各诱导方向细胞均出现较明显的形态改变，其中成脂肪诱导ADSC胞质中出现大量脂滴，数量随诱导天数增加而减少，脂滴体积随诱导天数增加而增加。成骨诱导ADSC细胞形态出现疏松结构，胞质中出现结节结构。成软骨诱导细胞形态由梭型转变为卵圆型。成神经诱导ADSC胞膜则出现较为明显的细长突起。各经过诱导的ADSC均用常规免疫组化对特异性分子进行鉴定，成脂诱导利用油红O染色，具体方法为：细胞爬片PBS洗涤，2％多聚甲醛固定10min，PBS洗涤后加入0.3％油红O染色20min，PBS洗涤3次，每次5min，光镜观察结果。另外利用RT-PCR检测各分化方向特异性基因的表达情况(各特异性表达产物基因及引物见下表)。

ADSC各诱导分化方向的特异性表达产物及其引物

分化方向	特异性产物及分子大小	引物
			脂肪	ap2364bp	正向：5’ACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAA3’反向：5’GTCAGCTTCAAATTGTCATGAGCTG3’
骨	Osteopontin411bp	正向：5’GCCGAGGTGATAGTGTGGTT3’反向：5’TGAAATTCATGGCTGTGGAA3’
			软骨	Collagen type II654bp	正向：5’GGGAGTAATGCAAGGACCAA3’反向：5’ACCATCATCACCAGGCTTTC3’
神经	Neurofilament801bp	正向：5’GTGCTACCAAATACATCACTA3’反向：5’GTTTCCAATATGACCTTTATT3’

二、重组FGF10人问充质干细胞株的建立

1、制备人肺脏组织总RNA

肺脏组织来自长海医院胸心外科手术，液氮中凿碎组织，用中科英达生物工程有限公司总RNA抽提试剂盒，按常规异硫氰酸胍法提取获得总RNA。

2、合成引物

根据已知的人类FGF10cDNA序列(Genbank NM004465)，利用primerpremiere5.0设计引物，由上海英骏生物技术有限公司合成引物。

正向引物：5’GGGAA TTCCATATGATGTGGAAATGGATACTG3’，其5’端引入Nde I酶切位点(下划线)和保护碱基(斜体)

反向引物：5’CGCGGATCCATGAGTGTACCACCATTG3’，其5’端引入BamH I酶切位点(下划线)和保护碱基(斜体)

3、RT-PCR扩增获得人FGF10cDNA片段

以上述人肺脏总RNA为模板，用上述引物通过RT-PCR扩增FGF10cDNA，其全长为628bp。所用的RNA PCR Kit(M-MLV)购自美国Promega生物公司。PCR反应在PE9600型扩增仪上进行，条件为94℃45s、55℃45s、72℃45s，35个循环。PCR产物按常规经纯化、测序，获得正确序列的人FGF10cDNA。

4、构建pcDNA3.0-FGF10重组质粒

将基因人FGF10cDNA片段，插入载体pcDNA3.0(购自Biolab公司)中，转化DH5α感受态大肠杆菌，构建成pcDNA3.0-FGF10重组真核表达载体。具体方法为：按常规方法用Nde I和BamH I内切酶(购自大连TaKaRa宝生物工程有限公司)分别酶切基因片段FGF10及载体pcDNA3.0，然后以基因片段与载体片段摩尔数约为3∶1的比例进行连接反应。反应体系(10μl)包括T4连接酶缓冲液1μl、基因片段20ng、载体片段60ng、T4连接酶1μl，反应混合物置17℃12～16小时，然后取连接产物加入100μl DH5α感受态大肠杆菌中，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴2min，加入900μl LB培养基，37℃摇床1hr，5000rpm离心5min，去除上清，将剩余菌液均匀涂布于含氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂糖培养基平板上，37℃倒置培养12hr。从平板上挑取若干个菌落接种于3ml含相应抗性的LB培养基中，37℃摇床培养12hr，用质粒小量抽提试剂盒(购自中科英达生物公司)进行质粒抽提，抽得质粒用常规得限制性内切酶酶切进行鉴定，最终获得pcDNA3.0-FGF10真核重组表达载体。

5、建立pcDNA3.0-FGF10重组人间充质干细胞株并筛选阳性表达细胞克隆

按美国Sigma公司生产的脂质体转染试剂盒说明书操作，将重组质粒载体pcDNA3.0-FGF10转染对数生长期的人胚源间充质干细胞(MSC)。具体方法如下：在Eppendorf管中分别将重组质粒载体和脂质体用Sigma ESCORT V transfection buffer稀释，质粒载体1μg加入100μlbuffer中，脂质体3μl加入97μl buffer中，静置10min后，将稀释后的质粒载体和脂质体轻轻混匀，再静置30min。将混合后的复合物缓缓加入6孔板中已生长至70％～80％的MSC中，轻轻摇匀，24hr后加入G418(美国GIBCO公司)600μg/ml进行筛选，隔天加入G418600μg/ml，7天后挑选阳性单克隆分皿培养，2周后得到转染pcDNA3.0-FGF10的人MSC细胞株。

细胞株用免疫荧光、RT-PCR、ELISA、Western-blotting等方法鉴定FGF10的转染效果。结果均显示成功转染FGF10目的基因，并开始表达目的蛋白。

三、体外、体内实验证明FGF10的促成脂作用

1、体外实验

将pcDNA3.0-FGF10-MSC和ADSC分别种植在半透膜细胞共培养池(cell culture inserts)(美国Falcon公司)多孔膜的外侧和内侧，因两种细胞可能经膜上的孔形成细胞与细胞间的接触，同时pcDNA3.0-FGF10-MSC分泌的细胞因子也可以通过此孔作用于ADSC，诱导其分化。实验共设3组：共培养实验组，阳性对照组(条件培养基诱导组)以及阴性对照组(自由分化组)。共培养实验组的具体操作方法如下：6孔板中加入10％FBS DMEM，放入cell culture inserts，CO₂预孵育30min。将cell culture inserts膜向上倒置于6孔板盖上，均匀种植pcDNA3.0-FGF 10-MSC于膜外面，CO₂孵育6hr。翻转cell culture inserts，将ADSC种植于cell culture inserts的膜内面，CO₂中培养，观察细胞生长及分化情况。

膜内面ADSC共培养3天后出现形态改变，胞质内出现大小不等脂滴。10天后分化速度减缓，用油红O染色观察，胞质内出现大量染为红色的脂滴。另外利用real-time PCR和western-blotting检测脂肪细胞分化过程中重要的转录因子C/EBPα、C/EBPβ以及PPARγ的表达情况，real-time PCR结果显示共培养初期第2天开始C/EBPβ表达量增加，第5天C/EBPα及PPARγ的表达量开始增加，而C/EBPβ减少，符合脂肪细胞分化成熟过程中转录因子的表达规律。

2、动物体内实验以证明在体状态下FGF10对ADSC的分化诱导作用。

实验所用裸鼠为BALB/C Nu品系，SPF级，体重约为15～25g，3～4周龄，购自上海实验动物中心。注射入裸鼠背部皮肤下的pcDNA3.0-FGF10-MSC和ADSC细胞数量级为1×10⁵，以1∶1的比例注射，另外设诱导培养后的ADSC注射的阳性对照组和注射生理盐水的阴性对照组。SPF级条件下喂养，2周后取材。常规H-E染色后发现，实验组注射部位皮下脂肪较阴性对照组明显增厚，局部出现幼稚毛囊结构，提示为局部微环境导致细胞向毛囊分化。另外行人HLA及PPARγ常规免疫组化，进一步证明细胞的来源及分化的进程。

上述所有实验内容均证明了重组人成纤维细胞生长因子10表达载体能够促进人皮下脂肪干细胞的分化成熟。

Claims (2)

1.一种促进人皮下脂肪干细胞分化成熟的方法，其特征在于该方法主要包括以下步骤：

I、脂肪干细胞的分离培养和扩增；

II、构建了含FGF10基因的重组载体，将其转染至人胚源性间充质干细胞；

III、利用人胚源性间充质干细胞表达的外源性FGF10促进脂肪干细胞向成熟脂肪细胞分化。

2.根据权利要求1所述的一种促进人皮下脂肪干细胞分化成熟的方法，其特征在于其中所述的含FGF10基因的重组载体是pcDNA3.0-FGF10。

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