JP2010110232A

JP2010110232A - 光学活性化合物の製造方法

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Publication number: JP2010110232A
Application number: JP2008283385A
Authority: JP
Inventors: Masakatsu Nishihachijo; 正克西八條; Shigeru Kawano; 茂川野; Yoshihiko Yasohara; 良彦八十原
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2008-11-04
Filing date: 2008-11-04
Publication date: 2010-05-20

Abstract

【課題】二重結合もしくはニトロ基を有する化合物から不純物の少ない光学活性化合物の製造方法を提供する。
【解決手段】ニトロレダクターゼがエノン化合物の二重結合を還元するので、ニトロレダクターゼ活性が低減又は消失した微生物に還元酵素遺伝子を導入して作製した組換え微生物を用いて、二重結合もしくはニトロ基を有する化合物を還元することにより、不純物含量の少ない光学活性化合物を得る。
【選択図】なし

Description

本発明はニトロレダクターゼ活性を低減した微生物を宿主として作製した組換え微生物を触媒として用いることを特徴とする光学活性な化合物の製造方法に関する。

光学活性化合物である３−ブテン−２−オールの製造方法としては、次のものが知られている。
（１）加水分解酵素の作用によってラセミ体を光学分割する方法（特許文献１、特許文献２）、
（２）光学活性な２，３−エポキシアルコールを経由する方法（非特許文献１）や光学活性な乳酸を利用する方法（特許文献３）、
がある。（１）の方法では、光学分割反応であるためその収率は５０％を越えることはなく経済的な方法と言い難い。（２）の方法では、高価な試薬を用いた多段階の反応であり、実用的とはいえない。また、
（３）安価なメチルビニルケトンを微生物や酵素によって立体選択的に還元する方法（特許文献４）、
が知られている。この方法は、光学純度の高い３−ブテン−２−オールを効率的に製造する方法であるが、メチルエチルケトンと２−ブタノールが副生成し、その除去が困難であることを本発明者らは明らかにした。
また、光学活性化合物であるニトロフェニルアルコール誘導体の製造方法としては、
（４）ラセミ体の２−ブロモ−１−（４−ニトロフェニル）エタノールにカルボン酸無水物存在下、微生物由来のリパーゼを作用させ、光学分割する方法（特許文献５）がある。（４）の方法では、光学分割反応であるためその収率は５０％を越えることはなく経済的な方法と言い難い。また、
（５）ニトロアセトフェノンから微生物や酵素によって立体選択的に還元する方法（非特許文献２、特許文献６）がある。これらの方法は収率や生成物の蓄積濃度、光学純度が低いため、工業的に効率的な方法とは言い難い。
また、光学活性化合物である、２−置換プロパナール誘導体の製造方法として、以下の様な方法が知られている。
（６）プロリン誘導体を不斉補助基として用い、プロパナールを不斉アルキル化することにより、光学純度９４％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−メチルペンタナールを合成する方法（非特許文献３）。
（７）ベアウベリア・スルフレセンス（ＢｅａｕｖｅｒｉａＳｕｌｆｕｒｅｓｃｅｎｓ）を用いて２−メチル−２−ペンテナールを微生物還元して光学活性２−メチル−１−ペンタノールを取得し、これを酸化して光学活性２−メチルペンタナールを合成する方法（非特許文献４）。
（８）サッカロマイセス・セルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＯｌｄＹｅｌｌｏｗＥｎｚｙｍｅ２（ＯＹＥ２）のような炭素-炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、安価に入手可能な２−ブチルアクロレインを立体選択的に還元することにより、（Ｒ）−２−メチル−ペンタールを簡便に製造する方法。

しかしながら、（６）の方法では、不斉アルキル化反応に高価な不斉補助基が必要である。（７）の方法では、副生物である２−メチル−１−ペンテノールが多量に生成する。このようにいずれも工業的製法としては大きな課題を有している。また、（８）の方法で得られる（Ｒ）−２−メチル−ペンタールの光学純度は９４．５％ｅ．ｅ．であり、不純物（光学異性体）を多く含んでいる。
特開平１−１３２３９９公報特開平５−３１７０９０公報ＤＥ４２１９５１０公報特開２００６−２４６７７２特許第３８１４７６６号特開２００３−９６０２９Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ１，３９９（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，１３０５９−１３０７２（１９９８）ＮｅｗＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，９７３−９７５（２０００）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３７，３８２５−３８２９（１９８１）

本発明の課題は、エノン化合物から医薬品の中間体として有用な光学活性化合物を製造する方法において、不純物もしくは光学異性体の少ない光学活性化合物の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、微生物を触媒としてメチルビニルケトンから光学活性な３−ブテン−２−オールを製造する方法において、不純物であるメチルエチルケトンと２−ブタノールの低減を目的に、これらの不純物の生成原因を調べた。その結果、微生物が有するニトロレダクターゼによりメチルビニルケトンの二重結合が還元されてメチルエチルケトンが生成すること、さらに、メチルビニルケトンのカルボニル基を還元する酵素によりメチルエチルケトンのカルボニル基が還元され２−ブタノールが生成することを発見した。本発明者らはニトロレダクターゼ遺伝子を破壊した微生物を取得し、この株を用いればメチルビニルケトンからメチルエチルケトン及び２−ブタノールの含量が少ない光学活性な３−ブテン−２−オールの製造が可能であることを見出した。

また、ニトロレダクターゼはニトロアセトフェノンをアミノアセトフェノンに還元することから、ニトロレダクターゼ遺伝子を破壊した微生物を用いることにより、アミン体を副生成することなく、効率的に光学活性ニトロフェニルアルコール誘導体が製造できることを明らかにした。

さらに、ニトロレダクターゼは２−ブチルアクロレインをラセミ体の２−メチル−ペンタールに還元することから、ニトロレダクターゼ遺伝子を破壊した微生物を用いることにより、光学純度の高い２−置換プロパナール誘導体を製造できることを明らかにした。

本発明によって、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な３−ブテン−２−オールやニトロフェニルアルコール誘導体、２−置換プロパナール誘導体などの光学活性化合物をつくる還元反応において、ニトロレダクターゼ活性が低い宿主を用いることによって、不純物もしくは光学異性体の含量を低減した製造方法が提供された。

以下、本発明を実施形態で詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。

本発明はニトロレダクターゼ活性が低い宿主微生物に、前記ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素のＤＮＡを含むベクターを導入することにより作製した組換え微生物を用いて、カルボニル基もしくは炭素−炭素二重結合を還元することを特徴とする、光学活性化合物の製造方法である。

本発明の「ニトロレダクターゼ」は、ニトロ基を還元し、アミノ基もしくはヒドロキシアミン基を生成する活性（以下、ニトロレダクターゼ活性と略記する）を有し、かつエノン化合物の炭素−炭素二重結合を還元する活性を有するポリペプチドである。好ましくはＥＣ番号１．５．１．３４のジヒドロプテリジンレダクターゼに分類される酵素であり、さらに好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌由来のものである。最も好ましくはニトロレダクターゼＮｆｓＢである。ＮｆｓＢは配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、上記ニトロレダクターゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。なお、ニトロレダクターゼ活性の検出方法としては、例えばＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，７３６−７４４（１９９６）に記載の方法がある。

配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９８９））等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、ニトロレダクターゼ活性を有する限り上記ポリペプチドに包含される。

配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素ついて、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、前述した他の微生物由来のアミノ基転移酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。

置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。

また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ, Ａｌａ, Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ

置換、挿入、欠失及び／または付加されるアミノ酸の数としては、改変後のポリペプチドがアミノ基転移酵素（Ａ）の活性を有する限り、特に制限されないが、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、配列同一性が８５％以上であることが好ましい。配列同一性９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９９％以上が最も好ましい。配列同一性は、前記の高度保存領域の確認と同様にして、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と改変されたアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除し、さらに１００を乗じた値で表される。

ニトロレダクターゼ活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、ニトロレダクターゼ活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。

本発明における「ニトロレダクターゼ活性が低い宿主微生物」とは、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，７３６−７４４（１９９６）に記載の方法でニトロレダクターゼ活性を測定した場合、その比活性が０．５Ｕ／ｍg以下、好ましくは０．１Ｕ／ｍｇ以下である微生物、もしくは、野生型の宿主微生物よりもニトロレダクターゼ活性が低減・消失した変異型の宿主微生物である。この変異型の宿主微生物を取得する方法としては特に限定はなく変異処理法もしくは、遺伝子工学的手法でも良い。

変異処理法としては微生物に公知の変異誘導法、例えば、変異誘発の物理的手段としては、紫外線照射、放射線照射等があり、化学的手段としては、エチルメタンスルホン酸、Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロソグアニジン等の変異剤を接触させる方法を適宜用いることにより行えばよい。

遺伝子工学的手法としては、例えば、相同組換えにより破壊型遺伝子を、宿主染色体上の正常遺伝子と置換する方法が挙げられる。破壊型遺伝子は配列表の配列番号２のＤＮＡにおいて１個以上のヌクレオチドが置換、挿入、欠失及び／または付加されており、かつ、そのＤＮＡにコードされているポリペプチドが正常型遺伝子のコードするポリペプチドに比べニトロレダクターゼ活性が低減しているＤＮＡである。例えば、配列表の配列番号２のＤＮＡの任意の場所に、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が挿入されたＤＮＡが好ましい。相同組換えにより破壊型遺伝子を、宿主染色体上の正常遺伝子と効率良く置換する方法としては、例えば、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｕｔａｇｅｎ．Ｒｅｓ．２５，８７−９２（２００３）に記載の（１）ＬｉｎｅａｒＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、（２）Ｐｒｅｌｉｇａｔｉｏｎ法、（３）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄなどがある。

また、アンチセンスＤＮＡ法によりニトロレダクターゼ活性を低減することもできる。例えば、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，３４，（２００６）に記載の方法でニトロレダクターゼをコードするＤＮＡのアンチセンスＤＮＡを導入することにより得られたニトロレダクターゼ活性を低減した宿主微生物の利用も本発明に含まれる。

変異型宿主微生物のニトロレダクターゼ活性が低減・消失していることを確認する方法としては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，７３６−７４４（１９９６）に記載の方法で野生型及び変異型宿主微生物のニトロレダクターゼ活性を測定し、変異型宿主微生物のニトロレダクターゼ活性が消失しているか、もしくは、野生型の微生物よりも低下していればよい。例えば、野生型宿主微生物のニトロレダクターゼ活性を１００％としたときに、変異型宿主微生物の活性が９５％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下であればよい。また、本発明においては、ニトロレダクターゼの活性測定の変わりに実施例に示すエノン化合物の炭素−炭素二重結合の還元酵素活性を測定することでも確認できる。

本発明に用いる宿主生物は、ニトロレダクターゼ活性が当初から低いか、野生型よりも低減されており、ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素を発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)属、バチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)属、シュードモナス(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)属、セラチア(Ｓｅｒｒａｔｉａ)属、ブレビバクテリウム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、コリネバクテリイウム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、ストレプトコッカス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)属、及びラクトバチルス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ)属及びストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、クライベロマイセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)属、シゾサッカロマイセス(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、チゴサッカロマイセス(Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、ヤロウイア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属、トリコスポロン(Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ)属、ロドスポリジウム(Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ)属、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)属、及びキャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ)属、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属、セファロスポリウム(Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ)属、及びトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。

遺伝子工学的手法で得られるニトロレダクターゼ活性を低減させた宿主微生物の例としては、奈良先端科学技術大学院大学（日本国奈良県生駒市高山町８９１６番地５）が保有する大腸菌一遺伝子破壊株ＫｅｉｏコレクションのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＷＫ０５６７株が挙げられる（参考文献（ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，６６４０−６６４５（２０００）、参考文献（ｂ）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙ２Ａｒｔｉｃｌｅｎｕｍｂｅｒ：２００６．０００８ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ４１０００５０Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎｌｉｎｅ（２００６））。

本発明で製造される光学活性化合物の原料はエノン合物、もしくはニトロ基を有するカルボニル化合物である。前記還元酵素がカルボニル基を還元する酵素を用いる場合の原料としては、一般式（１）；

（式中、Ｒ¹は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。）で表される化合物が好ましく、この場合、得られる光学活性化合物は一般式（２）；

（式中、Ｒ¹は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、＊は不斉炭素をそれぞれ表す。）である。より好ましくは、前記Ｒ¹が直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基である。さらに好ましくは直鎖の炭素数１〜５の低級アルキル基である。最も好ましくは前記Ｒ¹がメチル基である。

また、前記還元酵素がカルボニル基を還元する酵素を用いる場合の原料としては、
一般式（３）；

（式中、ｎは０以上の整数、Ｒ²はハロゲン原子、水酸基、置換されていても良いアルコキシ基、置換されていても良いアルキル基またはアミノ基を表し、Ｒ³、Ｒ⁴は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換されていても良いアルコキシ基、置換されていても良いアルキル基、またはアミノを示し、それぞれ同一でも異なっていてもよい、また、ニトロ基はパラ位もしくはメタ位に置換されていること表す）であり、得られる光学活性化合物が一般式（４）；

（式中、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴は前記と同じ＊は不斉炭素をそれぞれ表す。）であってもよい。

好ましくはｎが０〜１０の整数、Ｒ²がハロゲン原子あるいは直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、Ｒ³及びＲ⁴が水素原子である。より好ましくはｎが０〜５の整数Ｒ²がハロゲン原子もしくは炭素数１〜５の低級アルキル基、Ｒ³及びＲ⁴が水素原子である。最も好ましくはｎが０、Ｒ²がメチル基、Ｒ³及びＲ⁴が水素原子、ニトロ基がメタ位に置換されている化合物である。

また、前記の炭素−炭素二重結合を還元する酵素を用いる場合の原料としては、一般式（３）；

（式中、Ｒ²は直鎖または分岐鎖状のアルキル基、もしくはアラルキル基を表す。）で表される化合物が好ましく、この場合、得られる光学活性化合物は、一般式（４）；

（式中、Ｒ²は直鎖または分岐鎖状のアルキル基、もしくはアラルキル基を、＊は不斉炭素を表す。）である。より好ましくは、前記Ｒ²が直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、もしくは炭素数６〜１５のアラルキル基である。さらに好ましくは直鎖の炭素数１〜５の低級アルキル基もしくは炭素数６〜１０のアラルキル基である。最も好ましくは前記Ｒ²がブチル基もしくはフェニル基である。

「ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素」としてはニトロレダクターゼ活性を検出できない酵素もしくは、ＥＣ番号１．５．１．３４以外のＥＣ番号１に分類される酵素であればよい。好ましくは、カルボニル基を還元する酵素又は炭素−炭素二重結合を還元する酵素である。なお、ニトロレダクターゼ活性の検出方法としては、例えばＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，７３６−７４４（１９９６）に記載の方法がある。

光学活性化合物の原料がエノン化合物である場合に利用するカルボニル基を還元する酵素としては、特に特開２０６６−２４６７７２に記載のものが好ましく、具体的にはアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロードスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである。さらに好ましくは、アクロモバクター・デニトリフィカンズ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、セルロモナス・エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）、セルロモナス・ウダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｕｄａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、シュードモナス・ツトゼリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ツカムレラ・パウロメタボラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ）、キャンディダ・インコンスピシア（Ｃａｎｄｉｄａｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ディポダスカス・テトラスペルマ（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）、ピキア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａｍｉｎｕｔａｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・ヘンリッキ（Ｐｉｃｈｉａｈｅｎｒｉｃｉｉ）、ロードスポリディウム・ディオボバタム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｄｉｏｂｏｖａｔｕｍ）、ロードスポリジウム・スファエロカプム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｍ）、ロードスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、およびロドトルラ・グルチニス・バー・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からなる群より選ばれた微生物由来のものである。

光学活性化合物の原料がニトロ基を有するカルボニル化合物である場合に利用するカルボニル基を還元する酵素としては、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものが好ましく、さらに好ましくはキャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）からなる群より選ばれた微生物由来のものである。

光学活性化合物の原料がエノン化合物である場合に利用する炭素−炭素二重結合を還元する酵素としては、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシディフィリウム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、スポリディオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、およびチゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである。さらに好ましくはアクロモバクター・キシロキダンスサブスピーシーズデニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アシディフィリウム・クリプタム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍｃｒｙｐｔｕｍ）、アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）、アルカリゲネス・スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）、アースロバクター・クリスタロポエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）、アースロバクター・プロトフォロミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉｓｅ）アースロバクター・ニコチアーネ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・リヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）バシラス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂａｄｉｕｓ）、バシラス・ファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、エシェリヒア・コリビー（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、シュードモナス・シュッツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）、パエニバシラス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅｉ）、ザントモナス・スピーシーズ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）、キャンディダ・カンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・エチェルシー（Ｃａｎｄｉｄａｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、キャンディダ・ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・ムサエ（Ｃａｎｄｉｄａｍｕｓａｅ）、キャンディダ・ニトラトフィラ（Ｃａｎｄｉｄａｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａｓａｋｅ）、キャンディダ・ステラータ（Ｃａｎｄｉｄａｓｔｅｌｌａｔａ）、キャンディダ・ジラノイデス（Ｃａｎｄｉｄａｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ）、クライベロマイセス・ラクティスバードロソフィラルム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓｖａｒ．ｄｒｏｓｐｈｉｌａｒｕｍ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ヒーディー（Ｐｉｃｈｉａｈｅｅｄｉｉ）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｍｉｎｕｔａ）サッカロマイセス・ユニスポラス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）、サッカロマイセス・バヤナス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・セルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カステリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、スポリディオボルス・ジョンソニー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボルス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、およびチゴサッカロマイセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｉｌｉｉ）からなる群より選ばれた微生物由来のものである。これら微生物は一般に、入手または購入が容易な保存株から得ることができるが、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせて、より光学活性化合物の製造に有利な性質を有する酵素を得ることもできる。

本発明に用いるニトロレダクターゼとは異なる還元酵素遺伝子の導入方法としては、公知の遺伝子工学的手法を用いることができるが、特に、ベクターを用いた導入方法が効率的である。ベクターとしては、適当な宿主生物内でニトロレダクターゼとは異なる還元酵素の遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。

このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレット）などが挙げられる。

本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。

本明細書で用いる用語「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学」（共立出版（東京）、１９８７）などに詳細に記述されている。

また、ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を本発明に用いることにより、より効率的に光学活性化合物を製造することができる。ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。

補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）もしくは酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）を還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、もしくは還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）に変換する能力を有している酸化還元酵素が好ましい。

このような酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素などが挙げられる。好適には、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素が使用される。

ギ酸脱水素酵素としては、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロイッケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、ハイホマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、などの微生物、特にチオバシラス・エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）から得られる酵素が挙げられる。

グルコース脱水素酵素としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの微生物、特にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から得られる酵素が挙げられる。

ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターの例としては、実施例に示すｐＮＭＣが挙げられる。ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、公知の方法で作製したＥ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７のコンピテントセルに当該ベクターを導入すればよい。ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体の例としては、実施例に示すベクターｐＮＣＭでＥ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７株を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＮＣＭ）が挙げられる。

本発明の反応に触媒として用いる組換え微生物（形質転換体）の形態としては、特に限定されないが、例えば組換え微生物の培養液、菌体、またはそれらの処理物などが挙げられる。ここで「処理物」とは、例えば、凍結乾燥品、アセトン乾燥品、摩擦物、自己消化物、超音波破砕物またはアルカリ処理物などを言い、目的とする活性が残存する限りは、本発明の反応に用いることができる。

組換え微生物の培養は、通常これらの微生物が資化できる栄養源を含む培地であれば何でも使用しできる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来る。これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選択すればよい。

組換え微生物の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０〜４５℃の範囲で、好気的に１０〜９６時間培養するのが好ましい。カルボニル化合物に微生物を反応させる場合においては、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用することもできるが、培養液の濃縮物も用いることができる。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用することも出来る。

カルボニル化合物の還元反応の際には、基質であるカルボニル化合物を反応の初期に一括して添加してもよく、反応の進行にあわせて分割して添加してもよい。反応時の温度は通常１０〜６０℃、好ましくは、２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜９、好ましくは、５〜９の範囲である。反応液中の酵素源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。反応は通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、酵素源の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。

還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を０．５〜３０％の割合で加えると優れた結果が得られるので好ましい。一般に生物学的方法による還元反応に必要とされているＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、具体的には、反応液に直接これらを添加する。

また、補酵素再生能有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含まない形質転換体を反応に用いる場合は、反応を促進させるために、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋をそれぞれの還元型へ還元する酵素、及び還元するための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得られるので好ましい。例えば、酵素としてグルコース脱水素酵素、還元するための基質としてグルコースを共存させる。

また更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質または還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。

還元反応により生成したカルボニル化合物の採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度のカルボニル化合物を容易に得ることが出来る。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。また、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。

(参考例１) 還元酵素ＲＣＭ高発現組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）の作製
メチルビニルケトンのカルボニル基を立体選択的に還元し、（Ｓ）−３−ブテン−２−オールを生成する還元酵素ＲＣＭを発現する組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）の作製の方法を以下に示す。プライマー１（配列表の配列番号３）：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＡＡＴＡＣ−３’、プライマー２（配列表の配列番号４）：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣ−３’を用い、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）ＩＦＯ１９７７株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、還元酵素ＲＣＭ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。

上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＣＭを構築した。この組換えベクターｐＮＣＭを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を得た。

（比較例１）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を用いた（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ１．０％、ｐＨ７．０）５００ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養液２５０ｍｌを遠心分離により１００ｍｌに濃縮した後、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）２０００Ｕ、グルコース１８．４ｇ、ＮＡＤ⁺１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。これにメチルビニルケトン１．８ｇを加え、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ５．５に調整しながら、３０℃で攪拌を続けた。１９時間の反応ののち、反応液を２００ｍｌの塩化メチレンで５回抽出し、得られた有機層をあわせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、常圧下有機溶媒を留去したのち、常圧で蒸留し、１．５ｇの（Ｓ）−３−ブテン−２−オールを得た（沸点９６℃）。得られた（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの光学純度は、９９．６％ｅ．ｅ．であった。また、不純物としてメチルエチルケトンが１．０ａｒｅａ％、２−ブタノールが１３．５ａｒｅａ％含まれていた。これらの不純物は蒸留操作で除去できなかった。

なお、（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの生成量及びメチルエチルケトン及び２−ブタノールの量（不純物量）は下記のガスクロマトグラフィー条件で分析することにより決定した。

［ガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：ＧＬサイエンス株式会社製ＩｎｅｒｔＣａｐ５（３０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ
キャリアガス：ヘリウム
カラム温度：３５℃
保持時間：３−ブテン−２−オール２．６５分、メチルビニルケトン２．７１分、メチルエチルケトン２．８２分、２−ブタノール２．８７分
不純物量（ａｒｅａ％）＝メチルエチルケトン（もしくは２−ブタノール）のピーク面積÷３−ブテン−２−オールのピーク面積×１００

なお、生成した３−ブテン−２−オールの光学純度は、ジニトロベンゾイル化後、ＨＰＬＣ分析することにより測定した。３−ブテン−２−オールのジニトロベンゾイル化は、反応液から３−ブテン−２−オールを塩化メチレンで抽出後、トリエチルアミン及び３，５−ジニトロ塩化ベンゾイルを３−ブテン−２−オールの１．２等量添加後、室温で２時間攪拌することにより行なった。１Ｎ塩酸で洗浄後、分取用薄層クロマトグラフィーにより精製取得し、これをエタノールに溶解後、下記の高速液体クロマトグラフィー条件で分析し、光学純度を求めた。

［高速液体クロマトグラフィー分析条件］
カラム：ダイセル化学工業株式会社製ＣｈｉｒａｌｐａｋＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７／３
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２４５ｎｍ
保持時間：Ｓ体１７．２分、Ｒ体１１．０分
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表し、Ａ＞Ｂである）。

（実施例１）メチルエチルケトン、２−ブタノール生成の確認
メチルビニルケトンからメチルケトン、２−ブタノールが生成する原因を調べた。比較例１に示した方法で、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）（Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１株にプラスミドｐＵＣＮ１８を形質転換した株）を培養した。また、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ１．０％、ｐＨ７．０）５００ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。それぞれの培養液１ｍｌについて超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１ｍｌを得た。この無細胞抽出液１ｍｌに１６ｍＭのＮＡＤＨを含む１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．１ｍｌ、メチルビニルケトンもしくは３−ブテン−２−オールを１．４ｍＭになるように添加し、３０℃で５分間反応した。反応液を１ｍｌのジクロロメタンで抽出し、有機層を実施例１に示すガスクロマトグラフィーの分析条件で分析した。結果を表１に示す。また、グルコース脱水素酵素を添加したもの、培養液の代わりに水を用いたもの（ブランク）についても同様の操作により、メチルエチルケトン、２−ブタノールの生成を調べた。結果を表１に示す。

宿主Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１でメチルエチルケトンが検出されたことから、宿主Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の作用により、メチルビニルケトンからメチルエチルケトンが副生成していることが分かった。

また、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）にのみ２−ブタノールが検出されたことから、メチルエチルケトンのカルボニル基が還元酵素ＲＣＭにより還元されて２−ブタノールが副生成していることが明らかになった。

（実施例２）エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１からのメチルビニルケトン二重結合還元酵素の精製
以下の方法に従って、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１株より、メチルビニルケトンの二重結合を還元してメチルエチルケトンを生成する活性を有するポリペプチドを電気泳動的に単一にまで精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。

メチルビニルケトンの二重結合に対する還元活性は以下の方法で測定した。２．８ｍＭのメチルビニルケトン及び３．２ｍＭの補酵素ＮＡＤＨを含む１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に、粗酵素液を添加し、３０℃で５分間反応させた後、反応液をジクロロメタンで抽出し、ガスクロマトグラフィー分析により、メチルエチルケトンの生成量を求めた。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのメチルビニルケトンをメチルエチルケトンに還元する活性を、１ｕｎｉｔと定義し、下記式より還元活性を算出した。

メチルビニルケトンの二重結合に対する還元活性（Ｕ／ｍｌ）＝メチルエチルケトンのエリア面積÷（メチルビニルケトンのエリア面積＋メチルエチルケトンのエリア面積）×反応に用いたメチルビニルケトン量（μｍｏｌ）÷反応時間（分）÷酵素液量（ｍｌ）

（１）微生物の培養
５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、肉エキス１０ｇ、ペプトン１５ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ６）３Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株の培養液を３０ｍｌ接種し、攪拌回転数４００ｒｐｍ、通気量０．９ＮＬ／ｍｉｎ、３７℃で２４時間培養を行った。

（２）無細胞抽出液の調製
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、０．９％塩化ナトリウム水溶液を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０型超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。

（３）プロタミン処理
無細胞抽出液の１０分の１量の１０％（ｗ／ｖ）硫酸プロタミン溶液を無細胞抽出液加えて４℃で２時間攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。

（４）ポリペプチドの精製
プロタミン処理後の無細胞抽出液を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．２Ｍまで）により活性画分を溶出させた。この活性画分を集めて、次に１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で予め平衡化したＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（７０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．２Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集めて、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒＱＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．２Ｍまで）により活性画分を溶出させた。

（５）ポリペプチドの同定
活性画分を集めて、ＵｌｔｒａｆｒｅｅＭＣ（ミリポア株式会社社製）により酵素液を濃縮した。濃縮した酵素液についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し、クマシーブリリアントブルー染色によって可視化された約２６ｋＤａ目的タンパクのバンドを切り出し、アミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。決定したＮ末端アミノ酸配列「ＭＤＩＩＳＶＡＬＫ」について、ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するブラストサーチを用いた相同性検索を行った。その結果、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のニトロレダクターゼＮｆｓＢのＮ末端アミノ酸配列と１００％一致した。

（実施例３）ニトロレダクターゼＮｆｓＢ高発現組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）の作製
ニトロレダクターゼＮｆｓＢを高発現する組換え大腸菌を作製した。プライマー３（配列表の配列番号５）：５’−ＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧ−３’、プライマー４（配列表の配列番号６）：５’−ＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＣＧＧＴＴ−３’を用い、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。

上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＮＲを構築した。この組換えベクターｐＮＮＲを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を得た。Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を実施例１に示した方法で培養し、得られた培養液のメチルビニルケトンの二重結合還元活性を実施例２に示した方法で測定した。結果を表２に示す。

Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）はＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）よりもメチルビニルケトンの二重結合還元活性が高いことから、ニトロレダクターゼＮｆｓＢがメチルビニルケトンの二重結合を還元し、メチルエチルケトンを生成することが確認できた。

（実施例４）ニトロレダクターゼ遺伝子破壊組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＮＣＭ）の作製
ニトロレダクターゼＮｆｓＢの遺伝子を破壊したＥ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７株を奈良先端科学技術大学院大学が保有する大腸菌一遺伝子破壊株Ｋｅｉｏコレクションから入手した（参考文献（ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，６６４０−６６４５（２０００）、参考文献（ｂ）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙ２Ａｒｔｉｃｌｅｎｕｍｂｅｒ：２００６．０００８ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ４１０００５０Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎｌｉｎｅ（２００６））。Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７株及びＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を実施例１に示した方法で培養し、得られた培養液のメチルビニルケトンの二重結合還元活性を実施例２に示した方法で測定した。結果を表３に示す。

Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７はＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１よりもメチルビニルケトンの炭素―炭素二重結合還元活性が低かった。Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７株から塩化カルシウム法にてコンピテントセルを作製した。参考例１に示した組換えベクターｐＮＣＭを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７株コンピテントセルを形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＮＣＭ）を得た。

（実施例５）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＮＣＭ）を用いた（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＮＣＭ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５００ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養液２５０ｍｌを遠心分離により１００ｍｌに濃縮した後、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）２０００Ｕ、グルコース１８．４ｇ、ＮＡＤ⁺１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。これにメチルビニルケトン１．８ｇを加え、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ５．５に調整しながら、３０℃で攪拌を続けた。１９時間の反応後の反応変換率は９６％であった。また、（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの光学純度は９９．０％ｅ．ｅ．であり、不純物としてメチルエチルケトンが０．１ａｒｅａ％、２−ブタノールが１．６ａｒｅａ％含まれていた。反応変換率、光学純度、不純物量は比較例１と同様にして決定した。

ニトロレダクターゼＮｆｓＢの遺伝子を破壊したＥ．ｃｏｌｉを宿主として作製した還元酵素組み換え菌を触媒とすることにより、比較例１に比べて、不純物（メチルエチルケトン及び２−ブタノール）含量が少ない（Ｓ）−３−ブテン−２−オールを得ることができた。

（比較例２）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を用いた（Ｓ）−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を比較例１と同様の方法で培養した。この培養液１ｍｌについて、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１ｍｌを得た。この無細胞抽出液９００μｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）５Ｕ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌ、ｍ−ニトロアセトフェノン１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法により分析することで、反応変換率及び、生成物の光学純度を求めた。変換率は９７％であり、生成物（Ｓ）−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、不純物として
ｍ−アミノアセトフェノンが０．４ａｒｅａ％、１−（ｍ−アミノフェニル）エタノールが０．２５ａｒｅａ％含まれていた。分析条件は以下の通りである。

[ＧＣ分析条件]
生成物及び不純物分析
キャピラリーカラム：Ｒｔｘ−５Ａｍｉｎｅ φ０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍ（Ｒｅｓｔｅｋ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ１５０ｋPa、検出器：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、検出時間：ｍ−ニトロアセトフェノン２５．６分、１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノール３６．８分、ｍ−アミノアセトフェノン２１．７分、１−（ｍ−アミノフェニル）エタノール１８．６分
不純物量は次式より算出した。

不純物量（ａｒｅａ％）＝（ｍ−アミノアセトフェノンもしくはｍ−アミノフェニルエタノールのピーク面積）÷（１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールのピーク面積）×１００

光学純度分析
キャピラリーカラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β φ０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×６０ｍ（Ｊ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ３００ｋPa、検出器：ＦＩＤ、カラム温度：１８０℃、検出時間：（Ｒ）−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノール２９．３分、（Ｓ）−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノール２９．７分
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表し、Ａ＞Ｂである）。

（実施例６）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を用いたニトロアセトフェノンの還元反応
実施例１に示した方法で、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を培養した。Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）の培養液９００μｌ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質ｍ−ニトロアセトフェノンもしくはｐ−アセトフェノン１０ｍｇを加え、３０℃で２４時間攪拌した。反応後、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層中の基質及び生成物量を比較例２に示した方法で分析することにより、反応変換率及び、生成物の光学純度を求めた。ｍ−ニトロアセトフェノンからｍ−アミノアセトフェノンへの変換率は５．６％であった。ｐ−ニトロアセトフェノンからｐ−アミノアセトフェノンへの変換率は５．０％であった。

ニトロレダクターゼＮｆｓＢを発現させたＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）はｍ位及ｐ位がニトロ基に置換されたアセトフェノンのニトロ基をアミノ基に還元することが明らかになった。

（実施例７）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＮＣＭ）を用いた（Ｓ）−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＮＣＭ）を比較例１と同様の方法で培養した。この培養液１ｍｌについて、比較例２と同様の方法で反応した。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層中の基質及び生成物量を比較例２に示した方法で分析することにより、反応変換率及び、生成物の光学純度を求めた。変換率は９８％、生成した（Ｓ）−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、不純物としてｍ−アミノフェニルエタノールが０．１４ａｒｅａ％含まれていた。ｍ−アミノアセトフェノンは検出されなかった。

ニトロレダクターゼＮｆｓＢの遺伝子を破壊したＥ．ｃｏｌｉを宿主として作製した還元酵素組み換え菌を触媒とすることにより、比較例２に比べて不純物の少ない（Ｓ）−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールを得ることができた。また、本実験で用いた還元酵素ＲＣＭの代わりに、参考例２に示すような組換え菌が発現する還元酵素を用いても光学活性な（Ｓ）−１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールを得ることができる。

（参考例２）光学活性１−（ｍ−ニトロフェニル）エタノールの製造
実施例１に示した方法で表４に示す組換え大腸菌を培養した。この培養液を用いて、比較例２と同様の方法で反応した。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層中の基質及び生成物量を比較例２に示した方法で分析することにより、反応変換率及び、生成物の光学純度を求めた。結果を表４に示す。なお、各組換え大腸菌の作製方法については、国際特許公報ＷＯ２００１−００５９９６、ＷＯ２００４−０２７０５５、ＷＯ２００３−０９３４７７に記載されている。

（参考例３）還元酵素ＯＹＥ２高発現組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）の作製
２−ブチルアクロレインの炭素−炭素二重結合を立体選択的に還元し、（Ｒ）−２−メチルヘキサナールを生成する還元酵素ＯＹＥ２を発現する組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）の作製の方法を以下に示す。プライマー５（配列表の配列番号７）：５’−ＣＧＧＴＣＣＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＴＡＡＧ−３’、プライマー６（配列表の配列番号８）：５’−ＧＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＧＧＴＴＡＡＣＡＣ−３’を用い、サッカロマイセス・セレビジエＳ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８）（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８））株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、還元酵素ＯＹＥ２の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＳａｃＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、
ＤＮＡポリメラ−ゼとして、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。

上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで消化し、プラスミドｐ
ＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＣＭを構築した。この組換えベクター
ｐＴＳＹＥ２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）を得た。

（比較例３）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）を用いた（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ１．０％、ｐＨ７．０）５００ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養液２ｍｌを遠心分離により１ｍｌに濃縮し、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１ｍｌを得た。この無細胞抽出液５００μｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）５Ｕ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００μｌ、２−ブチルアクロレイン１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。１９時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法により分析することで、反応変換率及び、生成物の光学純度を求めた。変換率は１００％であり、生成物（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナールの光学純度は９４．５％ｅ．ｅ．であった。分析条件は以下の通りである。

[ＧＣ分析条件]
キャピラリーカラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β φ０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×６０ｍ（Ｊ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ３００ｋPa、検出器：ＦＩＤ、カラム温度：４５℃、検出時間：（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナール４９．９分、（Ｓ）−２−メチル−１−ヘキサナール５１．５分、２−ブチルアクロレイン４４．６分
変換率は９９．７％、生成した（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナールの光学純度は９４．５％ｅ．ｅ．であった。

（実施例８）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を用いた２−ブチルアクロレインの還元反応
実施例１に示した方法で、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を培養した。Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）の培養液９００μｌ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質２−ブチルアクロレインを１０ｍｇ加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層中の基質及び生成物量を比較例３に示した方法で分析することにより、反応変換率及び、生成物の光学純度を求めた。変換率は１００％であり、生成物２−メチル−１−ヘキサナールはラセミ体であった。

ニトロレダクターゼＮｆｓＢは２−ブチルアクロレインを還元しラセミ体の２−メチル−１−ヘキサナールを生成することが明らかになった。

（実施例９）ニトロレダクターゼ遺伝子破壊組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＴＳＹＥ２）の作製
Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７株から塩化カルシウム法にてコンピテントセルを作製した。参考例２に示した組換えベクターｐＴＳＹＥ２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７株コンピテントセルを形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＴＳＹＥ２）を得た。

（実施例１０）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＴＳＹＥ２）を用いた（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＴＳＹＥ２）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５００ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養液２ｍｌを遠心分離により１ｍｌに濃縮した後、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１ｍｌを得た。この無細胞抽出液５００μｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）５Ｕ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００μｌ、２−ブチルアクロレイン１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。１９時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を比較例３に示した方法で変換率と光学純度を分析した。変換率は９９．７％、生成した（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナールの光学純度は９５．０％ｅ．ｅ．であった。

ニトロレダクターゼＮｆｓＢの遺伝子を破壊したＥ．ｃｏｌｉを宿主として作製した還元酵素組み換え菌を触媒とすることにより、比較例３に比べて光学純度が向上した（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサナールを得ることができた。また、本実験で用いた還元酵素ＯＹＥ２の代わりに、参考例４及び５に示すような微生物から得られた酵素を用いても光学活性な２−メチル−１−ヘキサナールを得ることもができる。

（参考例４）光学活性２−メチル−１−ヘキサナールの製造
グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛七水和物６０ｍｇ、硫酸鉄七水和物９０ｍｇ、硫酸銅五水和物５ｍｇ、硫酸マンガン四水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表５に示した微生物をそれぞれ１白金耳植菌し、３０℃で２〜３日間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、菌体を水洗し、氷冷アセトンを添加した後、減圧乾燥することによりアセトン乾燥菌体を調製した。試験管に、アセトン乾燥菌体５ｍｇを量り取り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００μｌに懸濁させた。この溶液に、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質２−ブチルアクロレイン２ｍｇを酢酸エチル５００μｌに溶解させて試験管に加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸エチル層中の基質及び生成物量を比較例３に示した方法で分析することにより、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表５に示す（反応変換率は１０〜１００％）。

実施例８で用いた還元酵素ＯＹＥ２の代わりにこれらの微生物が有する酵素を用いても光学活性な２−メチル−１−ヘキサナールの製造が可能である。

（参考例５）光学活性２−メチル−１−ヘキサナールの製造方法
肉エキス１％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％からなる液体培地（ｐＨ６．５）を調製し、大型試験管に５ｍｌづつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。これらの液体培地に表６に示した微生物をそれぞれ１白金耳植菌し、３０℃で２〜３日間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌで洗浄し、同緩衝液５００μｌに再懸濁させ、試験管に移した。この溶液に、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質２−ブチルアクロレイン２ｍｇを酢酸エチル５００μｌに溶解させて試験管に加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸エチル層中の基質及び生成物量を比較例３と同様の方法で分析することにより、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表６に示す（反応変換率は１０〜１００％）。

実施例１０で用いた還元酵素ＯＹＥ２の代わりにこれらの微生物が有する酵素を用いても光学活性な２−メチル−１−ヘキサナールの製造が可能である。

（比較例４）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）を用いた（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ１．０％、ｐＨ７．０）５００ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養液２ｍｌを遠心分離により１ｍｌに濃縮し、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１ｍｌを得た。この無細胞抽出液５００μｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）５Ｕ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００μｌ、２−ベンジルアクロレイン１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。１９時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、有機層中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法により分析することで、反応変換率及び光学純度を求めた。

[ＧＣ分析条件]
キャピラリーカラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β φ０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×６０ｍ（Ｊ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ３００ｋPa、検出器：ＦＩＤ、カラム温度：８０℃、検出時間：（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナール１１３．９分、（Ｓ）−２−メチル−３−フェニルプロパナール１１６．９分、２‐ベンジルアクロレイン９６．２分
変換率は９９．３％、生成した（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナールの光学純度は９４．７％ｅ．ｅ．であった。

（実施例１１）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を用いた２−ベンジルアクロレインの還元反応
実施例１に示した方法で、ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）を培養した。ＨＢ１０１（ｐＮＮＲ）の培養液９００μｌ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）５Ｕを加えた。その後、基質２−ベンジルアクロレインを１０ｍｇ加え、３０℃で２０時間攪拌した。反応後、反応液を酢酸エチルで抽出し、比較例４に示した分析方法で分析した。反応変換率は１００％であり、生成物２−メチル−３−フェニルプロパナールはラセミ体であった。

ニトロレダクターゼＮｆｓＢは２−ベンジルアクロレインを還元しラセミ体の２−メチル−３−フェニルプロパナールを生成することが明らかになった。

（実施例１２）組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＴＳＹＥ２）を用いた（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナールの製造
実施例１０と同様の方法で得たＥ．ｃｏｌｉＪＷＫ０５６７（ｐＴＳＹＥ２）の培養液２ｍｌを遠心分離により１ｍｌに濃縮した後、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１ｍｌを得た。この無細胞抽出液５００μｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）５Ｕ、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ各０．５ｍｇ、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００μｌ、２−ベンジルアクロレイン１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。１９時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を比較例４に示した方法で変換率と光学純度を分析した。変換率は１００％、生成した（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナールの光学純度は９５．２％ｅ．ｅ．であった。

ニトロレダクターゼＮｆｓＢの遺伝子を破壊したＥ．ｃｏｌｉを宿主として作製した還元酵素組み換え菌を触媒とすることにより、比較例４に比べて光学純度が向上した（Ｒ）−２−メチル−３−フェニルプロパナールを得ることができた。

Claims

ニトロレダクターゼ活性が低い宿主微生物に、前記ニトロレダクターゼとは異なる還元酵素のＤＮＡを導入することにより作製した組換え微生物を用いた還元反応による、光学活性化合物の製造方法。
前記還元酵素がカルボニル基を還元する酵素であり、前記還元反応の基質がエノン化合物、もしくはニトロ基を有するカルボニル化合物である、請求項１に記載の製造方法。
前記微生物がエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の微生物である、請求項１または２のいずれかに記載の製造方法。
前記ニトロレダクターゼが以下の（ａ）又は（ｂ）で表されるポリペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトロレダクターゼ活性を有するポリペプチド。
前記還元酵素がエノン化合物のカルボニル基を還元する酵素であって、前記エノン化合物が、一般式（１）；

（式中、Ｒ¹は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。）であり、得られる光学活性化合物が一般式（２）；

（式中、Ｒ¹は前記と同じ、＊は不斉炭素をそれぞれ表す。）である、請求項１〜２のいずれかに記載の製造方法。
Ｒ¹が直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基である、請求項５記載の製造方法。
アルキル基がメチル基である、請求項６記載の製造方法。
前記カルボニル基を還元する酵素が、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロードスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項５記載の製造方法。
前記カルボニル基を還元する酵素が、アクロモバクター・デニトリフィカンズ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、セルロモナス・エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）、セルロモナス・ウダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｕｄａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、シュードモナス・ツトゼリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ツカムレラ・パウロメタボラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ）、キャンディダ・インコンスピシア（Ｃａｎｄｉｄａｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ディポダスカス・テトラスペルマ（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）、ピキア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａｍｉｎｕｔａｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・ヘンリッキ（Ｐｉｃｈｉａｈｅｎｒｉｃｉｉ）、ロードスポリディウム・ディオボバタム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｄｉｏｂｏｖａｔｕｍ）、ロードスポリジウム・スファエロカプム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｍ）、ロードスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、およびロドトルラ・グルチニス・バー・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項８記載の製造方法。
前記還元酵素がカルボニル基を還元する酵素であり、前記ニトロ基を有するカルボニル化合物が、一般式（３）；

（式中、ｎは０以上の整数、Ｒ²はハロゲン原子、水酸基、置換されていても良いアルコキシ基、置換されていても良いアルキル基またはアミノ基を表し、Ｒ³、Ｒ⁴は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換されていても良いアルコキシ基、置換されていても良いアルキル基、またはアミノを示し、それぞれ同一でも異なっていてもよい、また、ニトロ基はパラ位もしくはメタ位に置換されていること表す）であり、得られる光学活性化合物が一般式（４）；

（式中、ｎ、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴は前記と同じ＊は不斉炭素をそれぞれ表す。）である、請求項１〜２のいずれかに記載の製造方法。
Ｒ²が直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、Ｒ³及びＲ⁴が水素原子、である、請求項１０記載の製造方法。
ｎが０、Ｒ²がメチル基、Ｒ³及びＲ⁴が水素原子、ニトロ基がメタ位にある請求項１０記載の製造方法。
前記カルボニル基を還元する酵素が、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項１０記載の製造方法。
前記カルボニル基を還元する酵素が、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ロドトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項１０記載の製造方法。
前記還元酵素がエノン化合物の炭素−炭素二重結合を還元する酵素であり、前記エノン化合物が、一般式（５）；

（式中、Ｒ²は直鎖または分岐鎖状のアルキル基、もしくはアラルキル基を表す。）であり、得られる光学活性化合物が一般式（６）；

（式中、Ｒ²は直鎖または分岐鎖状のアルキル基、もしくはアラルキル基を、＊は不斉炭素を表す。）である、請求項１〜２のいずれかに記載の製造方法。
Ｒ²が直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、もしくは炭素数６〜１５アラルキル基ある、請求項１５記載の製造方法。
Ｒ²がブチル基もしくはフェニル基である、請求項１５記載の製造方法。
前記炭素−炭素二重結合を還元する酵素が、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシディフィリウム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、スポリディオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、およびチゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項１５記載の製造方法。
前記炭素−炭素二重結合を還元する酵素が、アクロモバクター・キシロキダンスサブスピーシーズデニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アシディフィリウム・クリプタム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍｃｒｙｐｔｕｍ）、アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）、アルカリゲネス・スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）、アースロバクター・クリスタロポエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）、アースロバクター・プロトフォロミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉｓｅ）アースロバクター・ニコチアーネ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・リヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）バシラス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂａｄｉｕｓ）、バシラス・ファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、エシェリヒア・コリビー（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、シュードモナス・シュッツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）、パエニバシラス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｌｖｅｉ）、ザントモナス・スピーシーズ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）、キャンディダ・カンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・エチェルシー（Ｃａｎｄｉｄａｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、キャンディダ・ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・ムサエ（Ｃａｎｄｉｄａｍｕｓａｅ）、キャンディダ・ニトラトフィラ（Ｃａｎｄｉｄａｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａｓａｋｅ）、キャンディダ・ステラータ（Ｃａｎｄｉｄａｓｔｅｌｌａｔａ）、キャンディダ・ジラノイデス（Ｃａｎｄｉｄａｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ）、クライベロマイセス・ラクティスバー．ドロソフィラルム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓｖａｒ．ｄｒｏｓｐｈｉｌａｒｕｍ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ヒーディー（Ｐｉｃｈｉａｈｅｅｄｉｉ）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｍｉｎｕｔａ）サッカロマイセス・ユニスポラス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）、サッカロマイセス・バヤナス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｙａｎｕｓ）サッカロマイセス・セルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カステリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、スポリディオボルス・ジョンソニー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボルス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、およびチゴサッカロマイセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｉｌｉｉ）からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項１９記載の製造方法。
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド、及び／または、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を、共存させることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の製造方法。
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド、及び／または、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素がグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である請求項２０に記載の製造方法。