JP2010100578A - Ｈｔｌｖ−ｉ関連脊髄症を治療または予防するための医薬、およびｈｔｌｖ−ｉ関連脊髄症の患者に対する抗体療法の効果を予測する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＨＡＭに対する抗体療法に用いられる医薬を提供すること。
【解決手段】本発明の医薬は、ＨＡＭを治療またはその発症を予防するための医薬であって、ヒトＣＣＲ４に特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片を含む。ＨＡＭ患者のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞はＣＣＲ４を発現しているため、本発明の医薬はＨＡＭの治療に使用されうる。また、本発明の医薬は、体内のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の数を減少させることができるため、ＨＡＭなどのＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の発病の予防薬としても使用されうる。
【選択図】図５

Description

本発明は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症を治療または予防するための医薬、およびＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の患者に対する抗体療法の効果を予測する方法に関する。

現在、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（human T-cell leukemia virus type-1；以下「ＨＴＬＶ−Ｉ」と略記する）の感染者は、日本に約１２０万人存在する。感染者の一部はＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（HTLV-I associated myelopathy；以下「ＨＡＭ」と略記する）を発症し、感染者の別の一部は成人Ｔ細胞白血病（adult T-cell leukemia；以下「ＡＴＬ」と略記する）を発症する。

ＨＡＭは、発症者の数が大変少ないため、病因解明および治療薬開発のための研究が進みにくい。現在、ＨＡＭに対する有効な治療法は確立されておらず、一刻も早い治療法の開発が切望されている。

ＨＡＭの病態の特徴として、末梢血および脳脊髄液中においてＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の数が非常に多くなり、その量に比例して過剰な免疫応答が誘発されて、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocyte）が異常に増加することが挙げられる。ＨＡＭの脊髄病変では、神経組織へのウイルス感染は観察されないが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびそれを取り囲むＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞浸潤、ならびに炎症性サイトカインの過剰産生が観察される。これらのことから、ＨＡＭの病態は、感染細胞に起因した過剰な免疫応答による神経組織障害であると考えられている。

これらの病態をふまえたＨＡＭの治療戦略として、（１）ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除、（２）過剰免疫応答（脊髄炎症）の沈静化、（３）損傷した脊髄の再生、が挙げられる。ＨＡＭを根治するためには、最終的には脊髄の再生治療が必要である。しかし、再生治療を成功させるためには、まず（１）および（２）を実現することが必要不可欠である。これまでのＨＡＭの治療として、（２）過剰免疫応答の沈静化を実現するためにステロイドやインターフェロンなどが用いられてきた。しかし、これらの治療方法は、短期的な効果は発揮するものの長期的には副作用や治療効果の減弱が認められ、治療を継続しても病気が進行し、また病気の主原因である感染細胞の減少効果に乏しいという重大な問題点を抱えている。さらに、ＨＴＬＶ−Ｉはウイルス遺伝子の発現量が少ないため、逆転写酵素阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤による治療効果も乏しい。これらの問題点を解決する治療法として、（１）ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除のために感染細胞を特異的に攻撃して死滅させる抗体療法が考えられる。

本発明者は、これまでＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に着目して研究を進めてきた。その結果、ＨＡＭ患者において、ＨＴＬＶ−ＩはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞に選択的に感染しており、さらにこの感染細胞が免疫応答を過剰に刺激していることがわかった（非特許文献１参照）。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞は、自己免疫疾患の発症を抑制する制御性Ｔ細胞（regulatory T cell）を含むことが知られている。本発明者は、さらに研究を進めた結果、ＨＡＭ患者のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞において制御性Ｔ細胞の量的および機能的減少が認められること、ＨＴＬＶ−Ｉのｔａｘ遺伝子の発現により制御性Ｔ細胞のマーカー転写因子であるＦｏｘＰ３の発現が抑制されることを見出した（非特許文献２参照）。

一方、同じＨＴＬＶ−Ｉが引き起こすＡＴＬでは、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞をとりまく獲得免疫系がＨＡＭのそれとは全く異なっている。ＡＴＬでは、末梢血中のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球の数が非常に少ないことが報告されている。また、ＡＴＬ患者でも、ＨＴＬＶ−ＩはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞に選択的に感染しているが、ＡＴＬ患者のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋）はその多くがＦｏｘＰ３陽性であることも報告されている。これらのことから、ＡＴＬでは、ＨＴＬＶ−Ｉ感染ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞が腫瘍性に増殖し、本来の制御性機能を発揮して宿主に低免疫応答状態を生じさせていると考えられる。

以上のことから、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の相違が、同一のウイルスによって引き起こされる二つの全く異なる疾患（自己免疫疾患（ＨＡＭ）と白血病（ＡＴＬ））の表現型を決定していると考えられる。

近年、ＣＣケモカイン受容体４（C-C chemokinereceptor 4；以下「ＣＣＲ４」と略記する）が、ＡＴＬ患者のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞で発現していることが報告されている。これに伴い、ＡＴＬに対する抗体療法に用いることができる抗ＣＣＲ４抗体が開発されている（特許文献１〜４）。現在、ＡＴＬを対象として、ヒト化抗ＣＣＲ４抗体を用いた第Ｉ相臨床試験が行われている。

ＣＣＲ４は、健常者ではＴヘルパータイプ２（以下「Ｔｈ２」と略記する）細胞および制御性Ｔ細胞で発現することが知られている。このことから、制御性Ｔ細胞の減少が特徴的なＨＡＭ患者では、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞はＣＣＲ４を発現しないと予想されていた。
国際公開第０１／６４７５４号パンフレット 国際公開第０３／０１８６３５号パンフレット 国際公開第２００５／０３５５８２号パンフレット 国際公開第２００５／０５３７４１号パンフレット Yamano Y., Cohen C. J., Takenouchi N., YaoK., Tomaru U., Li H. C., Reiter Y., Jacobson S., "Increased Expression of Human T Lymphocyte Virus Type I (HTLV-I) Tax11-19 Peptide-Human Histocompatibility Leukocyte Antigen A*201 Complexes on CD4+ CD25+ T Cells Detected by Peptide-specific, Major HistocompatibilityComplex-restricted Antibodies in Patients with HTLV-I-associated Neurologic Disease", J Exp Med., 199(10), 1367-1377, 2004. Yamano Y., Takenouchi N., Li H. C., TomaruU., Yao K., Grant C. W., MaricD. A., Jacobson S., "Virus-induced dysfunction of CD4+CD25+ T cells in patients with HTLV-I-associated neuroimmunologicaldisease", J Clin Invest., 115(5), 1361-1368, 2005.

前述のとおり、ＨＡＭを効果的に治療するためには、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を排除しうる抗体療法を開発する必要があるが、ＨＡＭに対する抗体療法に使用可能な医薬はまだ開発されていない。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ＨＡＭに対する抗体療法に用いられうる医薬、およびその抗体療法の効果を予測する方法を提供することを目的とする。

本発明者は、鋭意研究を行ったところ、驚くべきことにＨＡＭ患者のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）がＣＣＲ４を発現することを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。

すなわち、本発明の第一は、以下の医薬に関する。
［１］ヒトＣＣＲ４に特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ４抗体または前記抗体の断片を含む、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症を治療または予防するための医薬。
［２］前記抗体は、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合する、［１］に記載の医薬。

また、本発明の第二は、以下の予測方法に関する。
［３］ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の患者に対する、抗ヒトＣＣＲ４抗体または前記抗体の断片を用いた抗体療法の効果を予測する方法であって、前記患者から採取された末梢血単核球細胞を準備するステップと、前記末梢血単核球細胞からヒトＣＣＲ４を発現している細胞を除去した細胞群を準備するステップと、前記末梢血単核球細胞の増殖活性および前記細胞群の増殖活性を測定するステップと、前記末梢血単核球細胞の増殖活性および前記細胞群の増殖活性を指標として、前記抗体療法の効果を予測するステップと、を有する予測方法。
［４］前記細胞群の増殖活性が、前記末梢血単核球細胞の増殖活性よりも低いときに、前記抗体療法が前記患者に対して有効であると予測する、［３］に記載の予測方法。

本発明の医薬によれば、ＨＡＭ患者のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）を効率的に排除することができるため、ＨＡＭを効果的に治療することができる。また、本発明の医薬によれば、ＨＴＬＶ−Ｉ感染未発病者の体内のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の数を減少させることができるため、ＨＡＭなどのＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の発病を予防することができる。

さらに、本発明の予測方法によれば、抗体療法を行う前にその患者に対して抗体療法が有効であるか否かを予測することができるため、抗体療法が有効な患者のみに抗体療法を行うことができる。

１．本発明の医薬
本発明の医薬は、ＨＡＭを治療またはその発症を予防するための医薬であって、ヒトＣＣＲ４に特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片を含むことを特徴とする。

本発明者は、様々な細胞表面分子についてＨＡＭ患者のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）のマーカーとなりうるか否かを検討したところ、驚くべきことに、ＣＣＲ４が感染細胞の有用なマーカーとなりうることを見出した。実施例（後述）に示すように、ＨＡＭ患者の末梢血単核球細胞（peripheral blood mononuclear cells；以下「ＰＢＭＣｓ」と略記する）中のＣＣＲ４陽性（ＣＣＲ４^＋）細胞のＨＴＬＶ−Ｉ感染率は、ＣＣＲ４陰性（ＣＣＲ４⁻）細胞のＨＴＬＶ−Ｉ感染率よりも極めて高い。このことから、本発明者は、抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法がＨＡＭの治療法となりうる可能性があると考えた。

健常者のＰＢＭＣｓは、刺激が無ければ試験管内で自発的に増殖することはほとんど無いが、ＨＡＭ患者のＰＢＭＣｓは、刺激が無くても試験管内で自発的に増殖することが知られている。この自発的な増殖は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）の増殖と、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞により引き起こされた過剰免疫応答を反映しているものと考えられている。本発明者は、抗ヒトＣＣＲ４抗体を用いてＨＡＭ患者のＰＢＭＣｓからＣＣＲ４^＋細胞を除去したところ、この試験管内における自発的増殖が抑制されることを証明した（実施例参照）。このことから、本発明者は、抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法がＨＡＭの治療法となりうると判断した。

抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法がＨＡＭの治療法となりうるか否かを検討する上で最も重要な点は、副作用をもたらす可能性の有無である。この点について検討するためには、ＨＡＭの病態におけるＣＣＲ４^＋細胞の役割を明らかにする必要がある。

ＨＡＭ患者のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞のＨＴＬＶ−Ｉ感染率は極めて高い（実施例参照）。前述のとおり、ＣＣＲ４は、健常者ではＴｈ２細胞および制御性Ｔ細胞で発現することが報告されている。本発明者は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３（制御性Ｔ細胞のマーカー分子）の発現について調べた。その結果、ＡＴＬ患者のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞では、ＦｏｘＰ３の強い発現が見られたが、ＨＡＭ患者のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞では、ＦｏｘＰ３の発現がほとんど見られなかった。このことから、ＨＡＭ患者のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞をほとんど含んでいないと考えられる。

また、本発明者は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞が産生するサイトカイン（インターフェロン−γやインターロイキン２、インターロイキン１７など）について調べた。その結果、ＡＴＬ患者のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞では、炎症性サイトカインであるインターフェロン−γの産生はほとんど見られなかったが、ＨＡＭ患者のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞では、インターフェロン−γの過剰産生が見られた。このことから、ＨＡＭ患者のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞は、Ｔｈ２細胞や制御性Ｔ細胞などの抑制性のＴ細胞の機能を発揮しておらず、むしろ機能異常をきたしていると考えられる。

以上のことから、ＨＡＭ患者から機能異常のＣＣＲ４^＋細胞を除去しても有害性は低いことが予想され、抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法について、現時点では大きな副作用がある可能性は低いと考えられる。

本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片は、ヒトＣＣＲ４を発現する細胞（以下「ヒトＣＣＲ４発現細胞」という）に特異的に結合しうる抗体またはその断片であれば特に限定されないが、ヒトＣＣＲ４発現細胞に対して細胞障害活性を有する抗体またはその断片が好ましい。抗体の細胞障害活性により、ＨＡＭの病因細胞を含むヒトＣＣＲ４発現細胞を除去することができるからである。また、本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片は、ヒトＣＣＲ４発現細胞に特異的に結合するという観点から、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合しうる抗体であることが好ましい。

ヒトＣＣＲ４発現細胞の例には、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞が含まれる。細胞障害活性の例には、補体依存性細胞障害活性（complement-dependent cytotoxicity；以下「ＣＤＣ」と略記する）および抗体依存性細胞障害活性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；以下「ＡＤＣＣ」と略記する）が含まれる。

本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＣＲ４抗体の例には、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体が含まれる。

ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下「ＶＨ」と略記する）および軽鎖可変領域（以下「ＶＬ」と略記する）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下「ＣＨ」と略記する）および軽鎖定常領域（以下「ＣＬ」と略記する）とからなる抗体である。可変領域についての動物の種類は、マウスやラット、ハムスター、ウサギなどのハイブリドーマを作製しうる動物であれば特に限定されない。ヒト型キメラ抗体は、ヒトＣＣＲ４に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで作製されうる。ヒト型キメラ抗体のＣＨは、ヒトイムノグロブリン（以下「ｈＩｇ」と略記する）であれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト型キメラ抗体のＣＬは、ｈＩｇに属すれば特に限定されない。

ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」と略記する）をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体である。ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＣＣＲ４に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下「ＦＲ」と略記する）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで、作製されうる。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば特に限定されない。ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨは、ｈＩｇであれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬは、ｈＩｇに属すれば特に限定されない。

本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＣＲ４抗体の断片の例には、上記各抗体の断片が含まれる。抗体の断片の種類は特に限定されず、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどである。

Ｆａｂは、ＩｇＧをパパイン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＣＲ４抗体のＦａｂは、抗ヒトＣＣＲ４抗体をパパインで処理するか、前記抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧをペプシン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＣＲ４抗体のＦ（ａｂ’）_２は、抗ヒトＣＣＲ４抗体をペプシンで処理するか、Ｆａｂ’（後述）をチオエーテル結合またはジスルフィド結合で結合させることで、作製されうる。

Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＣＲ４抗体のＦａｂ’は、抗ヒトＣＣＲ４抗体のＦ（ａｂ’）_２をジチオスレイトールで処理するか、前記抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーを用いて連結した抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＣＲ４抗体のｓｃＦｖは、抗ヒトＣＣＲ４抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＣＲ４抗体のｄｉａｂｏｄｙは、抗ヒトＣＣＲ４抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片である。抗ヒトＣＣＲ４抗体のｄｓＦｖは、抗ヒトＣＣＲ４抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含むペプチドである。抗ヒトＣＣＲ４抗体のＣＤＲを含むペプチドは、抗ヒトＣＣＲ４抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。また、抗ヒトＣＣＲ４抗体のＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によっても作製することができる。

前述のとおり、本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片は、ヒトＣＣＲ４発現細胞に対して細胞障害活性を有する抗体またはその断片が好ましい。ヒトＣＣＲ４発現細胞に対して細胞障害活性を有する抗体の例には、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗ヒトＣＣＲ４抗体であって、前記Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗ヒトＣＣＲ４抗体が含まれる。このように還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体は、強いＡＤＣＣ活性を有することが知られている（特許文献３参照）。また、ヒトＣＣＲ４発現細胞に対して細胞障害活性を有する抗体の断片の例には、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を含む抗体Ｆｃ領域を有する抗ヒトＣＣＲ４抗体の断片であって、前記Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗ヒトＣＣＲ４抗体の断片が含まれる。

本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片は、例えば、前述の特許文献１〜４に記載された抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片である。

本発明の抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片を含む医薬は、ＨＡＭ治療薬として単独でも投与されうるが、通常は薬理学的に許容される１または２以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供されるのが好ましい。

投与経路は、特に限定されず、ＨＡＭの治療に最も効果的なものを適宜選択することができる。投与経路の例には、経口投与、ならびに口腔内投与や気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの非経口投与が含まれる。通常は、静脈内投与が好ましい。

投与形態も、特に限定されず、投与経路などに応じて適宜選択することができる。投与形態の例には、注射剤や噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、座剤、軟膏、テープ剤などが含まれる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などが挙げられる。非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などが挙げられる。通常は、注射剤が好ましい。

注射剤は、塩溶液またはブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製されうる。また、粉末注射剤は、抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることにより製造されうる。

投与量および投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、有効成分の量として通常成人１日あたり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ程度である。

本発明の医薬は、ＨＡＭ患者体内のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）を除去して過剰な免疫応答を抑制しうるので、ＨＡＭに対する抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法に使用されうる。すなわち、本発明の医薬は、ＨＡＭの治療薬として使用されうる。

また、本発明の医薬は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染未発病者に対する発症予防薬としても使用されうる。ＨＴＬＶ−Ｉ感染未発病者において、ウイルス感染細胞数の多い集団は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の発病リスクが高いことが知られている。したがって、ウイルス感染細胞数を減らすことは、発症の予防に有効である。本発明の医薬は、体内のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の数を減少させることができるため、ＨＡＭなどのＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の発病の予防薬としても使用されうる。

２．本発明の予測方法
本発明の予測方法は、ＨＡＭ患者（被験者）に対する、抗ヒトＣＣＲ４抗体またはその断片を用いた抗体療法の効果を予測する方法である。

本発明の予測方法は、（１）ＨＡＭ患者から採取されたＰＢＭＣｓを準備する第１のステップと、（２）第１のステップで準備したＰＢＭＣｓからヒトＣＣＲ４を発現している細胞を除去した細胞群を準備する第２のステップと、（３）第１のステップで準備したＰＢＭＣｓの増殖活性および第２のステップで準備した細胞群の増殖活性を測定する第３のステップと、（４）第３のステップで測定したＰＢＭＣｓの増殖活性および前記細胞群の増殖活性を指標として、前記抗体療法の効果を予測する第４のステップとを含む。

第１のステップでは、ＨＡＭ患者から採取されたＰＢＭＣｓを準備する。このＰＢＭＣｓには、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）が含まれている（実施例参照）。ＰＢＭＣｓを準備する方法は、特に限定されない。例えば、患者の血液から常法により末梢血単核球細胞を分離すればよい。

第２のステップでは、第１のステップで準備したＰＢＭＣｓからヒトＣＣＲ４を発現している細胞を除去した細胞群を準備する。この工程は、抗体療法における抗ＣＣＲ４抗体の作用を模したものである。

前述のとおり、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）の多くはＣＣＲ４を発現している。したがって、この工程により、ＰＢＭＣｓからＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の多くを除去することができると考えられる。ＰＢＭＣｓからＣＣＲ４を発現している細胞を除去する方法は特に限定されず、抗ＣＣＲ４抗体を用いた磁気ビーズ法やカラム法などの当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。

第３のステップでは、第１のステップで準備したＰＢＭＣｓの増殖活性および第２のステップで準備した細胞群の増殖活性を測定する。

細胞の増殖活性を測定する方法は特に限定されず、^３Ｈ−チミジン取り込み法などの当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）では、培養開始後６〜７日目に増殖活性が最も高くなる。したがって、本発明の予測方法では、培養開始後６〜７日目における細胞の増殖活性を測定することが好ましい。細胞の培養方法は、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。

第４のステップでは、第３のステップで測定したＰＢＭＣｓの増殖活性および前記細胞群の増殖活性を指標として、前記抗体療法の効果を予測する。

前述のとおり、健常者の末梢血単核球細胞は、刺激が無ければ試験管内で自発的に増殖することはほとんど無いが、ＨＡＭ患者の末梢血単核球細胞は、刺激が無くても試験管内で自発的に増殖することが知られている。この自発的な増殖は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（病因細胞）の増殖と、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞により引き起こされた過剰免疫応答を反映しているものと考えられている。したがって、患者ごとに個人差はあるものの、第１のステップで準備したＰＢＭＣｓの増殖活性は通常高い。一方、この自発的増殖がＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞により引き起こされたものであるならば、第２のステップで準備した細胞群の増殖活性は、第１のステップで準備したＰＢＭＣｓの増殖活性よりも低いはずである。したがって、第２のステップで準備した細胞群の増殖活性が、第１のステップで準備した末梢血単核球細胞の増殖活性よりも低いときに、前記抗体療法が前記患者に対して有効であると予測する。

本発明の予測方法は、抗体療法を行う前にその患者に対して抗体療法が有効であるか否かを予測することができる。

以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

［実施例１］
本実施例では、ＨＡＭに抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法が適用可能であることを示すため、ＨＡＭ患者のＰＢＭＣｓに含まれるＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の多くがＣＣＲ４を発現していることを示す。

１．ＰＢＭＣｓの調製と細胞の分離
ＨＡＭ患者の血液からフィコール遠心比重法によりＰＢＭＣｓを分離した。得られたＰＢＭＣｓからＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻の細胞およびＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋の細胞をフローサイトメーター（FACSCalibur；ベクトン・ディッキンソン社）を用いて分離した。抗ＣＤ４抗体には、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体（ｅバイオサイエンス社）を用いた。抗ＣＤ２５抗体には、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた。

図１（Ａ）は、ＨＡＭ患者のＰＢＭＣｓにおけるＣＤ４およびＣＤ２５の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。図中「Ｂ」で示す領域に含まれる細胞をＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻の細胞として分離し、「Ｃ」で示す領域に含まれる細胞をＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋の細胞として分離した。

次いで、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻の細胞集団からＣＣＲ４⁻の細胞およびＣＣＲ４^＋の細胞をフローサイトメーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて分離した。同様に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋の細胞集団からＣＣＲ４⁻の細胞およびＣＣＲ４^＋の細胞を分離した。抗ＣＣＲ４抗体には、ＰＥ−Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＣＲ４抗体（１Ｇ１；ベクトン・ディッキンソン社）を用いた。結果として、ＨＡＭ患者のＰＢＭＣｓから、（１）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＣＲ４⁻、（２）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＣＲ４^＋、（３）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４⁻、（４）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋の４つの細胞集団を得た。

図１（Ｂ）は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻の細胞集団（図１（Ａ）の「Ｂ」で示す領域に含まれる細胞）におけるＣＣＲ４の発現パターンを示すヒストグラムである。図中破線の左側の領域に含まれる細胞を（１）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＣＲ４⁻細胞として分離し、破線の右側の領域に含まれる細胞を（２）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＣＲ４^＋細胞として分離した。

図１（Ｃ）は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋の細胞集団（図１（Ａ）の「Ｃ」で示す領域に含まれる細胞）におけるＣＣＲ４の発現パターンを示すヒストグラムである。図中破線の左側の領域に含まれる細胞を（３）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４⁻細胞として分離し、破線の右側の領域に含まれる細胞を（４）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋細胞として分離した。

２．ＨＴＬＶ−Ｉウイルス量の測定
上記（１）〜（４）の各細胞集団について、リアルタイムＰＣＲ法により１００細胞あたりのプロウイルスのコピー数を測定した。

図２は、各細胞集団についてのプロウイルスのコピー数を測定した結果を示すグラフ（ｎ＝８）である。このグラフに示されるように、（４）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞に感染しているＨＴＬＶ−Ｉの数は、（３）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４⁻Ｔ細胞に感染しているＨＴＬＶ−Ｉの数に比べて有意に多かった。また、（２）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞に感染しているＨＴＬＶ−Ｉの数も、（１）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＣＲ４⁻Ｔ細胞に感染しているＨＴＬＶ−Ｉの数に比べて有意に多かった。

以上の結果から、ＨＡＭ患者のＰＢＭＣｓ中のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞では、ＣＣＲ４が発現していることがわかる。このことから、ＨＡＭに抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法が適用可能であると考えられる。

［実施例２］
本実施例では、ＨＡＭに抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法が適用可能であることを示すため、抗ＣＣＲ４抗体を用いてＣＣＲ４^＋細胞を除去することで、ＰＢＭＣｓ中のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の数を減少させうることを示す。

１．ＰＢＭＣｓの調製と細胞の分離
ＨＡＭ患者の血液からフィコール遠心比重法によりＰＢＭＣｓを分離した。得られたＰＢＭＣｓからＣＣＲ４^＋の細胞集団およびＣＣＲ４⁻の細胞集団を磁気ビーズを含むキット（Rat Anti-Mouse IgG1 MicroBeads；ミルテニーバイオテク社）を用いて分離した。抗ＣＣＲ４抗体には、マウス抗ヒトＣＣＲ４抗体（ＫＭ２１６０；協和発酵キリン株式会社）を用いた。以下、ＫＭ２１６０抗体に結合した細胞集団（ＣＣＲ４^＋の細胞集団）をＫＭ２１６０（＋）と略記し、ＫＭ２１６０抗体に結合しなかった細胞集団（ＣＣＲ４⁻の細胞集団）をＫＭ２１６０（−）と略記する。

２．細胞の培養
丸底の９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにＲＰＭＩ培地（５％ヒト血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンを添加）を分注した。ＲＰＭＩ培地を分注したウェルに５×１０^４個のＫＭ２１６０（−）を播き、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で７日間培養した。対照として、ＲＰＭＩ培地を分注したウェルに５×１０^４個のＰＢＭＣｓを播き、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で７日間培養した。

３．ＨＴＬＶ−Ｉウイルス量の測定
ＰＢＭＣｓから分離した直後のＫＭ２１６０（＋）およびＫＭ２１６０（−）について、リアルタイムＰＣＲ法により１００細胞あたりのプロウイルスのコピー数を測定した。

また、７日間の培養後のＫＭ２１６０（−）およびＰＢＭＣｓについても、リアルタイムＰＣＲ法により１００細胞あたりのプロウイルスのコピー数を測定した。

図３は、ＰＢＭＣｓから分離した直後のＫＭ２１６０（＋）およびＫＭ２１６０（−）についてのプロウイルスのコピー数を測定した結果を示すグラフである。このグラフに示されるように、ＫＭ２１６０（−）に感染しているＨＴＬＶ−Ｉの数は、ＫＭ２１６０（＋）に感染しているＨＴＬＶ−Ｉの数に比べて有意に少なかった。このことは、抗ヒトＣＣＲ４抗体がＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞にある程度特異的に結合していること、および抗ヒトＣＣＲ４抗体を用いて体内のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を減少させうることを示唆する。

図４は、培養後のＫＭ２１６０（−）およびＰＢＭＣｓについてのプロウイルスのコピー数を測定した結果を示すグラフである。このグラフに示されるように、ＫＭ２１６０（−）に感染しているＨＴＬＶ−Ｉの数は、７日間の培養後もＰＢＭＣｓに感染しているＨＴＬＶ−Ｉの数に比べて有意に少なかった。このことは、抗ヒトＣＣＲ４抗体を用いて体内のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を減少させることで、ある程度の期間はＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の数が少ない状態を維持しうることを示唆する。

以上の結果から、ＨＡＭ患者のＰＢＭＣｓ中のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の数を抗ヒトＣＣＲ４抗体を用いて減少させうることがわかる。このことから、ＨＡＭに抗ＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法が適用可能であると考えられる。

［実施例３］
本実施例では、本発明の予測方法により抗ヒトＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法がＨＡＭ患者に効果があるかどうかを予測した例を示す。

１．ＰＢＭＣｓの調製と細胞の分離
ＨＡＭ患者（ｎ＝３）の血液からフィコール遠心比重法によりＰＢＭＣｓを分離した。実施例２と同様の手順により、得られたＰＢＭＣｓからＫＭ２１６０（＋）およびＫＭ２１６０（−）を分離した。

２．細胞の培養
丸底の９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにＲＰＭＩ培地（５％ヒト血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンを添加）を分注した。ＰＢＭＣｓ、ＫＭ２１６０（＋）およびＫＭ２１６０（−）を、ＲＰＭＩ培地を分注したウェルにそれぞれ５×１０^４個播き、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で６日間培養した。

３．細胞増殖活性の測定
培養後のＰＢＭＣｓ、ＫＭ２１６０（＋）およびＫＭ２１６０（−）について、^３Ｈ−チミジンを１６時間取り込ませて細胞増殖活性を測定した。

図５は、ＰＢＭＣｓおよびＫＭ２１６０（−）の細胞増殖活性を患者ごとに示したグラフである。図６は、３名のＨＡＭ患者の結果をまとめた結果を示すグラフである。これらのグラフに示されるように、すべてのＨＡＭ患者においてＫＭ２１６０（−）の増殖活性はＰＢＭＣｓの増殖活性に比べて有意に減少していたが、増殖活性の減少度は患者ごとに異なっていた。このことは、ＨＡＭ患者ごとに、抗ヒトＣＣＲ４抗体を用いた抗体医療の効果が異なることを示唆する。今回の場合、ＨＡＭ１およびＨＡＭ３の患者は、ＨＡＭ２の患者よりも抗体医療がより有効であると予測される。

なお、図５および図６において、ＫＭ２１６０（−）においても細胞増殖活性が見られるのは、ＫＭ２１６０抗体でＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を完全には除去できていないこと、およびＫＭ２１６０抗体で除去されない細胞群なども増殖活性を有することによるものと考えられる。また、ここでは結果を示さないが、ＨＡＭ患者のＫＭ２１６０（＋）の増殖活性は、健常者のＫＭ２１６０（＋）の増殖活性よりも有意に高かった。

以上の結果から、本発明の予測方法により抗ヒトＣＣＲ４抗体を用いた抗体療法がＨＡＭ患者に効果があるかどうかを予測可能であると考えられる。

本発明の医薬は、例えば、ＨＡＭの治療薬として有用である。また、本発明の予測方法は、例えば、ＨＡＭ患者に対して抗体療法を行う前の治療効果予測試験として有用である。

（Ａ）はＨＡＭ患者のＰＢＭＣｓにおけるＣＤ４およびＣＤ２５の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。（Ｂ）はＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻の細胞集団におけるＣＣＲ４の発現パターンを示すヒストグラムである。（Ｃ）はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋の細胞集団におけるＣＣＲ４の発現パターンを示すヒストグラムである。 ５つの細胞集団におけるプロウイルスのコピー数を測定した結果を示すグラフである。 分離直後のＫＭ２１６０（＋）およびＫＭ２１６０（−）におけるプロウイルスのコピー数を測定した結果を示すグラフである。 培養後のＫＭ２１６０（−）およびＰＢＭＣｓにおけるプロウイルスのコピー数を示すグラフである。 ＰＢＭＣｓおよびＫＭ２１６０（−）の細胞増殖活性を示すグラフである。 ＰＢＭＣｓおよびＫＭ２１６０（−）の細胞増殖活性を示すグラフである。

Claims (4)

1. ヒトＣＣＲ４に特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ４抗体または前記抗体の断片を含む、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症を治療または予防するための医薬。
2. 前記抗体は、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に結合する、請求項１に記載の医薬。
3. ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の患者に対する、抗ヒトＣＣＲ４抗体または前記抗体の断片を用いた抗体療法の効果を予測する方法であって、
   前記患者から採取された末梢血単核球細胞を準備するステップと、
   前記末梢血単核球細胞からヒトＣＣＲ４を発現している細胞を除去した細胞群を準備するステップと、
   前記末梢血単核球細胞の増殖活性および前記細胞群の増殖活性を測定するステップと、
   前記末梢血単核球細胞の増殖活性および前記細胞群の増殖活性を指標として、前記抗体療法の効果を予測するステップと、
   を有する予測方法。
4. 前記細胞群の増殖活性が、前記末梢血単核球細胞の増殖活性よりも低いときに、前記抗体療法が前記患者に対して有効であると予測する、請求項３に記載の予測方法。

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