JP2010035558A - 色素蛋白質及び蛍光蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明によれば、ベリルイソギンチャク(Anthopleura inornata)由来の所定の特性を有する色素蛋白質、並びにヒユサンゴ(Trachyphyllia geoffroyi)及びアザミハナガタサンゴ(Scolymia Vitiensis)由来の所定の蛍光特性を有する蛍光蛋白質が提供される。
【選択図】なし
Description
即ち、本発明によれば、ベリルイソギンチャク(Anthopleura inornata)由来の下記の特性を有する色素蛋白質が提供される。
(1)吸収極大波長が605nmである;
(2)605nmにおけるモル吸光係数が47550である;
(3)光吸収特性のpH感受性がpH5〜10で安定である:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列:
本発明の別の側面によれば、ベリルイソギンチャク(Anthopleura inornata)由来の下記の特性を有する色素蛋白質が提供される。
(1)吸収極大波長が553nmである;
(2)553nmにおけるモル吸光係数が25300である;
(3)光吸収特性のpH感受性がpH5〜10で安定である:
(a)配列番号3に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号3に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列:
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのDNAが提供される。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするDNA:
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのDNAが提供される。
(a)配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号3に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするDNA:
(a)配列番号2に記載の塩基配列;又は、
(b)配列番号2に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列:
(a)配列番号4に記載の塩基配列;又は、
(b)配列番号4に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列:
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のDNA又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質をアクセプター蛋白質として用いてFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質、DNA、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛋白質を含む、吸光試薬キットが提供される。
(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が508nm(緑)及び572nm(赤)であり、蛍光極大波長が518nm(緑)及び581nm(赤)である;
(2)508nmにおけるモル吸光係数(緑)が98800M−1cm−1であり、572nmにおけるモル吸光係数(赤)が60400M−1cm−1である;
(3)量子収率が0.80(緑)及び0.33(赤)である;及び
(4)緑色及び赤色のpH感受性についてのpKaは共に5.7である:
(a)配列番号5に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列:
本発明の別の態様によれば、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が508nm(緑)及び578nm(赤)であり、蛍光極大波長が518nm(緑)及び588nm(赤)である;
(2)508nmにおけるモル吸光係数(緑)が102250M−1cm−1であり、578nmにおけるモル吸光係数(赤)が76950M−1cm−1である;
(3)量子収率(蛍光)が0.43(緑)及び0.51(赤)である;及び
(4)緑色(508nm)のpH感受性についてpKaが5.8であり、赤色(578nm)のpH感受性についてpKaが6.5である。
(a)配列番号9に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号9に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列:
本発明の別の態様によれば、配列番号11、13、15又は17の何れかに記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
(a)配列番号5に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(c)配列番号6に記載の塩基配列を有するDNA;又は、
(d)配列番号6に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(a)配列番号7に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号8に記載の塩基配列を有するDNA。
(a)配列番号9に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号9に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(c)配列番号10に記載の塩基配列を有するDNA;又は、
(d)配列番号10に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(a)配列番号11、13、15又は17に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号12、14、16又は18に記載の塩基配列を有するDNA。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のDNA又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質が提供される。好ましくは、他の蛋白質は、細胞内に局在する蛋白質である。さらに、好ましくは、他の蛋白質は、細胞内小器官に特異的な蛋白質である。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の蛍光蛋白質、DNA、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キットが提供される。
(1)本発明の色素蛋白質
本発明の第一の色素蛋白質は、ベリルイソギンチャク(Anthopleura inornata)由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
(1)吸収極大波長が605nmである;
(2)605nmにおけるモル吸光係数が47550である;
(3)光吸収特性のpH感受性がpH5〜10で安定である:
(1)吸収極大波長が553nmである;
(2)553nmにおけるモル吸光係数が25300である;
(3)光吸収特性のpH感受性がpH5〜10で安定である:
本発明の第一の色素蛋白質(Be−G)は、以下の実施例で示す通り、吸収極大波長が605nmであり、また、605nmにおけるモル吸光係数は47550である。
本発明の第二の色素蛋白質(Be−R)は、以下の実施例で示す通り、吸収極大波長が553nmであり、また、553nmにおけるモル吸光係数は25300である。
(a)配列番号1又は3に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号1又は3に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列:
本明細書で言う「吸光特性」とは、ある波長の光を吸収できる特性を意味し、例えば、本明細書に示した色素蛋白質と同様に吸収極大波長が605nm又は553nmであってもよいし、あるいは吸収極大波長の値がシフトしたものであってもよい。なお、光吸収特性のpH感受性は、pH5〜10で安定であることが好ましい。
本発明の色素蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
本発明の第一の蛍光蛋白質は、ヒユサンゴ(Trachyphyllia geoffroyi)由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が508nm(緑)及び572nm(赤)であり、蛍光極大波長が518nm(緑)及び581nm(赤)である;
(2)508nmにおけるモル吸光係数(緑)が98800M−1cm−1であり、572nmにおけるモル吸光係数(赤)が60400M−1cm−1である;
(3)量子収率が0.80(緑)及び0.33(赤)である;及び
(4)緑色及び赤色のpH感受性についてのpKaは共に5.7である:
本発明の第一の蛍光蛋白質は、紫外光によって色が変わることを特徴とし、光によって特定の細胞や器官のマーキング(optical marking)が可能である。
(a)配列番号5に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列:
本発明の第一の蛍光蛋白質の別の具体例としては、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が508nm(緑)及び578nm(赤)であり、蛍光極大波長が518nm(緑)及び588nm(赤)である;
(2)508nmにおけるモル吸光係数(緑)が102250M−1cm−1であり、578nmにおけるモル吸光係数(赤)が76950M−1cm−1である;
(3)量子収率(蛍光)が0.43(緑)及び0.51(赤)である;及び
(4)緑色(508nm)のpH感受性についてpKaが5.8であり、赤色(578nm)のpH感受性についてpKaが6.5である。
本発明の第二の蛍光蛋白質は、紫外光によって色が変わることを特徴とし、光によって特定の細胞、器官又は蛋白質のマーキング(optical marking)が可能である。
(a)配列番号9に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号9に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列:
本発明の蛍光蛋白質の別の具体例としては、配列番号11、13、15又は17の何れかに記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
本明細書で言う「蛍光を有する」とは、蛍光を発することができる全ての場合を包含し、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、pH感受性などの諸特性は、配列番号5に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と比較して、変動していてもよいし、同様のままでもよい。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
本発明によれば、本発明の色素蛋白質及び蛍光蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の第一の色素蛋白質をコードするDNAの具体例としては、以下の何れかのDNAが挙げられる。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするDNA:
(a)配列番号2に記載の塩基配列;又は、
(b)配列番号2に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列:
本発明の第二の色素蛋白質をコードするDNAの具体例としては、以下の何れかのDNAが挙げられる。
(a)配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号3に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードするDNA:
(a)配列番号4に記載の塩基配列;又は、
(b)配列番号4に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列:
(a)配列番号5に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(c)配列番号6に記載の塩基配列を有するDNA;又は、
(d)配列番号6に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(a)配列番号7に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号8に記載の塩基配列を有するDNA。
本発明の第二の蛍光蛋白質をコードするDNAの具体例としては、以下の何れかのDNAが挙げられる。
(a)配列番号9に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号9に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(c)配列番号10に記載の塩基配列を有するDNA;又は、
(d)配列番号10に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(a)配列番号11、13、15又は17に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号12、14、16又は18に記載の塩基配列を有するDNA。
本発明のDNAは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって製造することもできる。本発明のDNAの作製方法については、本明細書中上述した通りである。
本発明のDNAは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター(例えばプラスミド等)でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のDNAは、転写に必要な要素(例えば、プロモーター等)が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ADH3プロモータまたはtpiAプロモータなどがある。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするDNA配列を具備してもよく、その一例としてはSV40複製起点(宿主細胞が哺乳類細胞のとき)が挙げられる。
本発明のDNA、プロモータ、および所望によりターミネータおよび/または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
本発明のDNA又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のDNAまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のDNA構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
哺乳類細胞の例としては、HEK293細胞、HeLa細胞、COS細胞、BHK細胞、CHL細胞またはCHO細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたDNA配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、DNA構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
本発明の色素蛋白質は、他の蛋白質と融合させることにより、融合蛋白質を構築することができる。本発明の色素蛋白質に融合させる他の蛋白質の種類は特に限定されないが、他の分子と相互作用する蛋白質であることが好ましく、例えば、受容体蛋白質又はそのリガンド、あるいは抗原又は抗体などが挙げられる。
本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。
本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
次いで、これらのDNA断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードするDNAを得ることができる。このDNAを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質(被検アミノ酸配列)の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル(例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列)等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするDNAが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
上記被検アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモーター活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「pNEO」(P. Southern, and P. Berg (1982) J. MOl. Appl. Genet. 1:327)、「pCAGGS」(H.Niwa,K.Yamamura,and J.Miyazaki. Gene 108,193-200(1991))、「pRc/CMV」(インビトロゲン社製)、「pCDM8」(インビトロゲン社製)などが、酵母用ベクターでは、「pRS303」,「pRS304」,「pRS305」,「pRS306」,「pRS313」,「pRS314」,「pRS315」,[pRS316](R.S.Sikorski and P.Hieter (1989) Genetics 122: 19-27)、「pRS423」,「pRS424」,「pRS425」,「pRS426」(T.W.Christianson, R.S.Sikorski, M.Dante, J.H.Shero, and P. Hieter (1992) Gene 110: 119-122)などが好適に用いられる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質(蛋白質Xとする)とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Xの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするDNAで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Xの局在や動態を可視化して分析することができる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡(カールツァイス社 アキシオフォト フィルターセット09)や画像解析装置(ATTO デジタルイメージアナライザー)などを用いて行うことが可能である。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。
本発明の第二の蛍光蛋白質の場合、励起極大波長が508nm、蛍光極大波長が518である緑色を検出する場合は、励起光490〜510nm、蛍光510〜530nm程度のフィルターを使用することが好ましい。また、励起極大波長が578nmであり、蛍光極大波長が588nmである赤色を検出する場合は、励起光570〜580nm、蛍光580〜595nm程度のフィルターを使用することが好ましい。
本発明によれば、本明細書に記載した色素蛋白質、融合蛋白質、DNA、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも1種以上を含むことを特徴とする、吸光試薬キットが提供される。さらに本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、DNA、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも1種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び/又は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
(1)total RNAの抽出
イソギンチャクより色素蛋白遺伝子の単離を行った。材料には緑色を呈する1個体のベリルイソギンチャク(Anthopleura inornata)を用いた。凍結したベリルイソギンチャクを乳鉢で砕き、湿重量1グラムに"TRIzol"(GIBCO BRL)を7.5ml加えてホモジナイズし、1500xgで10分間遠心した。上清にクロロホルム1.5mlを加え、15秒間攪拌した後、3分間静置した。7500xgで15分間遠心した。上清にイソプロパノール3.75mlを加え、15秒間攪拌した後、10分間静置した。17000xgで10分間遠心した。上清を捨て70%エタノールを6ml加えて17000xgで10分間遠心した。上清を捨て沈殿をDEPC水200μlで溶解した。DEPC水で溶解したtotal RNAを100倍に希釈してO.D.260とO.D.280の値を測定してRNA濃度を測った。2.2mgのtotal RNAを得た。
total RNA 4μgを使用し、First strand cDNAの合成キット"Ready To Go"(Amersham Pharmacia)によりcDNA(33μl)を合成した。
合成したFirst strand cDNA(33μl)のうち3μlを鋳型としてPCRを行った。
プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。
使用プライマー
5'- GAAGGRTGYGTCAAYGGRCAY -3' (primer1)(配列番号19)
5'- ACVGGDCCATYDGVAAGAAARTT -3'(primer2)(配列番号20)
Iはイノシン、RはA又はG、YはC又はT、VはA,C 又はG、DはA,G又は T、 SはC又はG、HはA, T又は C を示す。
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3μl
X10 taq バッファー 5μl
2.5mM dNTPs 4μl
100μM primer1 1μl
100μM primer2 1μl
ミリQ 35μl
taq polymerase(5U/μl) 1μl
94℃ 1分(PAD)
94℃ 30秒 (変性)
52℃ 30秒 (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72℃ 1分 (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行い、アニーリング温度を1サイクルごとに0.3℃下げた。30サイクル時の温度は43℃。
72℃ 7分 (最後の伸長)
4℃で保持
一回目のPCR反応で得られた増幅産物1μlをテンプレートとして、もう一度同じ条件でPCRを行った。アガロースゲル電気泳動で、350bpを切り出し、精製した。
精製したDNA断片をpT7-blue vector(Novagen)にライゲーションした。大腸菌株(TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりplasmid DNAを精製して、挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのDNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、5'-RACE法および3'-RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。
Degenerated PCRで得られたDNA断片の5'側の塩基配列を決定するために5'-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0(GIBCO BRL)を用いて、5'-RACE法を行った。鋳型として(1)で調製したtotal RNAを4μg使用した。
dC-tailed cDNAの一回目の増幅には
5'-ggccacgcgtcgactagtacgggiigggiigggiig-3' (primer3)(配列番号21)
5'- AAGAGACTCCTTGAAGTAATCGGGA -3' (primer4)(配列番号22)
のプライマーを用いた。
Iはイノシンを示す。
二回目の増幅には
5'-ggccacgcgtcgactagtac-3' (primer5)(配列番号23)
5'- AAAATATCGTACGCAAAGGG -3' (primer6)(配列番号24)
のプライマーを用いた。PCR反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された200bpのバンドを切り出し、精製した。精製したDNA断片をpT7-blue vector(Novagen)にライゲーションした。大腸菌株(TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりplasmid DNAを精製して、挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーにより決定した。
Degenerated PCRで得られたDNA断片の3'側部分は、(4)の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴdTプライマーのPCRで得た。鋳型として(2)で調製したfirst strand cDNAを3μl使用した。
作成したプライマーは、
5'- AGGAGGTCCGCTACCCTTTG -3' (primer7)(配列番号25)
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3μl
X10 taq バッファー 5μl
2.5mM dNTPs 4μl
20μM primer7 1μl
10μM オリゴdTprimer 1μl
ミリQ 35μl
taq polymerase(5U/μl) 1μl
94℃ 1分(PAD)
94℃ 30秒(変性)
52℃ 30秒 (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72℃ 1分 (プライマ伸長)
上記3ステップを30サイクル行った。
72℃ 7分 (最後の伸長)
4℃で保持
アガロースゲル電気泳動で、増幅された約1000bpのバンドを切り出し、精製した。精製したDNA断片をpT7-blue vector(Novagen)にライゲーションした。大腸菌株(TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりplasmid DNAを精製して、挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーにより決定した。得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号2に示し、全長のアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示す。
得られた全長の塩基配列より、蛋白のN末端に相当する部分でプライマーを作製し、C末端側はオリゴdTプライマーを使用して、実施例A−1の(2)で調製したFirst strand cDNAを鋳型としてPCRを行った。
使用プライマー
5'- CCCGGATCCGACCATGGCTACCTTGGTTAAAGA -3' (primer8)(配列番号26)
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3μl
X10 pyrobest バッファー 5μl
2.5mM dNTPs 4μl
100μM primer8 1μl
100μM オリゴdTプライマー 1μl
ミリQ 35μl
pyrobest polymerase(5U/μl) 1μl
94℃ 1分(PAD)
94℃ 30秒 (変性)
52℃ 30秒 (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72℃ 1分 (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行った。
72℃ 7分 (最後の伸長)
4℃で保持
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約1100bpのバンドを切り出し、精製してpRSET vector(Invitrogen)のBamHI、EcoRI部位にサブクローニングして、大腸菌株(JM109-DE3)で発現させた。発現蛋白はN末端にHis-tagが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はNi-Agarose gel(QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。この色素蛋白質をBe−Gと命名する。以下の実施例3では、精製した蛋白の性質を解析した。
(1)光吸収特性の解析
20μM色素蛋白(Be−G)、50mM HEPES pH7.9溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。緑色個体由来色素蛋白(Be−G)では605nmに吸収のピークが認められた(表1、図1)。
50mMの下記の緩衝液中で蛋白質の吸収スペクトルを測定した(図2)。
各pHの緩衝液は次の通り、
pH4、5 : 酢酸バッファー
pH6 : リン酸バッファー
pH7、8 : HEPESバッファー
pH9、10 : グリシンバッファー
図2の結果から分かるように、pH5〜10でピークの値は安定していた。
(1)total RNAの抽出
イソギンチャクより色素蛋白遺伝子の単離を行った。材料には赤色を呈する1個体のベリルイソギンチャク(Anthopleura inornata)を用いた。凍結したベリルイソギンチャクを乳鉢で砕き、湿重量1グラムに"TRIzol"(GIBCO BRL)を7.5ml加えてホモジナイズし、1500xgで10分間遠心した。上清にクロロホルム1.5mlを加え、15秒間攪拌した後、3分間静置した。7500xgで15分間遠心した。上清にイソプロパノール3.75mlを加え、15秒間攪拌した後、10分間静置した。17000xgで10分間遠心した。上清を捨て70%エタノールを6ml加えて17000xgで10分間遠心した。上清を捨て沈殿をDEPC水200μlで溶解した。DEPC水で溶解したtotal RNAを100倍に希釈してO.D.260とO.D.280の値を測定してRNA濃度を測った。3mgのtotal RNAを得た。
total RNA 4μgを使用し、First strand cDNAの合成キット"Ready To Go"(Amersham Pharmacia)によりcDNA(33μl)を合成した。
合成したFirst strand cDNA(33μl)のうち3μlを鋳型としてPCRを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。
使用プライマー
5'- GAAGGRTGYGTCAAYGGRCAY -3' (primer1)(配列番号19)
5'- ACVGGDCCATYDGVAAGAAARTT -3'(primer2)(配列番号20)
Iはイノシン、RはA又はG、YはC又はT、VはA,C 又はG、DはA,G又はT、SはC又はG、HはA, T又はCを示す。
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3μl
X10 taq バッファー 5μl
2.5mM dNTPs 4μl
100μM primer1 1μl
100μM primer2 1μl
ミリQ 35μl
taq polymerase(5U/μl) 1μl
94℃ 1分(PAD)
94℃ 30秒 (変性)
52℃ 30秒 (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72℃ 1分 (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行い、アニーリング温度を1サイクルごとに0.3℃下げた。30サイクル時の温度は43℃。
72℃ 7分 (最後の伸長)
4℃で保持
一回目のPCR反応で得られた増幅産物1μlをテンプレートとして、もう一度同じ条件でPCRを行った。アガロースゲル電気泳動で、350bpを切り出し、精製した。
精製したDNA断片をpT7-blue vector(Novagen)にライゲーションした。大腸菌株(TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりplasmid DNAを精製して、挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのDNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、5'-RACE法および3'-RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。
Degenerated PCRで得られたDNA断片の5'側の塩基配列を決定するために5'-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0(GIBCO BRL)を用いて、5'-RACE法を行った。鋳型として(1)で調製したtotal RNAを4μg使用した。
赤色の個体由来のDC-tailed cDNAの一回目の増幅には
5'-ggccacgcgtcgactagtacgggiigggiigggiig-3' (primer3)(配列番号21)
5'- AAGAGACTCCTTGAAGTAATCGGGA -3' (primer4)(配列番号22)
のプライマーを用いた。
Iはイノシンを示す。
二回目の増幅には
5'-ggccacgcgtcgactagtac-3' (primer5)(配列番号23)
5'- AAAATATCGTACGCAAAGGG -3' (primer6)(配列番号24)
のプライマーを用いた。PCR反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された200bpのバンドを切り出し、精製した。精製したDNA断片をpT7-blue vector(Novagen)にライゲーションした。大腸菌株(TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりplasmid DNAを精製して、挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーにより決定した。
Degenerated PCRで得られたDNA断片の3'側部分は、(4)の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴdTプライマーのPCRで得た。鋳型として(2)で調製したfirst strand cDNAを3μl使用した。
作成したプライマーは
5'- AGGAGGTCCGCTACCCTTTG -3' (primer7)(配列番号25)
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3μl
X10 taq バッファー 5μl
2.5mM dNTPs 4μl
20μM primer7 1μl
10μM オリゴdTprimer 1μl
ミリQ 35μl
taq polymerase(5U/μl) 1μl
94℃ 1分(PAD)
94℃ 30秒(変性)
52℃ 30秒 (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72℃ 1分 (プライマ伸長)
上記3ステップを30サイクル行った。
72℃ 7分 (最後の伸長)
4℃で保持
アガロースゲル電気泳動で、増幅された約1000bpのバンドを切り出し、精製した。精製したDNA断片をpT7-blue vector(Novagen)にライゲーションした。大腸菌株(TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりplasmid DNAを精製して、挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーにより決定した。得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号4に示し、全長のアミノ酸配列を配列表の配列番号3に示す。
得られた全長の塩基配列より、蛋白のN末端に相当する部分でプライマーを作製し、C末端側はオリゴdTプライマーを使用して、実施例B−1の(2)で調製したFirst strand cDNAを鋳型としてPCRを行った。
使用プライマー
5'- CCCGGATCCGACCATGGCTACCTTGGTTAAAGA -3' (primer8)(配列番号26)
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3μl
X10 pyrobest バッファー 5μl
2.5mM dNTPs 4μl
100μM primer8 1μl
100μM オリゴdTプライマー 1μl
ミリQ 35μl
pyrobest polymerase(5U/μl) 1μl
94℃ 1分(PAD)
94℃ 30秒 (変性)
52℃ 30秒 (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72℃ 1分 (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行った。
72℃ 7分 (最後の伸長)
4℃で保持
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約1100bpのバンドを切り出し、精製してpRSET vector(Invitrogen)のBamHI、EcoRI部位にサブクローニングして、大腸菌株(JM109-DE3)で発現させた。発現蛋白はN末端にHis-tagが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はNi-Agarose gel(QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。この色素蛋白質をBe−Rと命名する。以下の実施例3では、精製した蛋白の性質を解析した。
(1)光吸収特性の解析
20μM色素蛋白、50mM HEPES pH7.9溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。赤色の個体由来色素蛋白(Be−R)では553nmに吸収のピークが認められた(表2、図3)。
50mMの下記の緩衝液中で蛋白質の吸収スペクトルを測定した(図4)。
各pHの緩衝液は次の通り、
pH4、5 : 酢酸バッファー
pH6 : リン酸バッファー
pH7、8 : HEPESバッファー
pH9、10 : グリシンバッファー
図4の結果から分かるように、pH5〜10でピークの値は安定していた。
色彩に富む蛍光を放つヒユサンゴTrachyphyllia geoffroyi から、蛍光蛋白遺伝子を以下の手順で単離した。
(1)total RNAの抽出
Acid Guanidium-Phenol-Chroloform法でtotal RNAを抽出した。
凍結したヒユサンゴをMulti-Beads Shocker(安井器械)を用いて変性溶液中で砕き、フェノール/クロロホルムを加え、遠心して蛋白質、DNAとRNAを分離する。RNAを含む水層をisopropanolに加え遠心すると、沈殿としてtotal RNAが得られる。
Oligotex-dT30 (Roche社製)を用いて、total RNAからmRNAを分離した。
total RNA にOligotex-dT30<super> を加え、加熱してRNAの2次構造を壊してから、37℃でRNAとOligotex-dTを結合させる。洗浄後、加熱、遠心すると、mRNAが溶出された上清が得られる。Oligotex-dTを取り除いた上、ethanolとNaClでmRNA沈殿させ、水に溶した。
TimeSaverとDirectional Cloning Toolbox(共にAmersham pharmacia社製)を用いてcDNA 断片を作製した。
mRNAを加熱して2次構造を壊した後、First-Strand Reaction MixにDTTとNotI-dT primerと共に加え、first-strandを合成する。更にそれをSecond-Strand Reaction Mixに加え、second-strandを合成し、付属のスパンカラムで精製する。精製したdouble-stranded cDNAの両端にEcoRI adaptor を付け、NotIで3'側のみカットする。もう一度スパンカラムで精製して、cDNA 断片(EcoRI- NotI)を得た。
pRSETB (Invitrogen社製)にEcoRI、NotIサイトを設け、作製したcDNAを挿入、大腸菌のJM109 DE3株に導入して、LAプレートで培養した。この株では蛋白が合成されるため、UVを照射した時に蛍光を発するコロニーを単離した。
その結果、約13万個から2個の蛍光を持つコロニーを得た。塩基配列をDNAシークエンサーにより決定し、このクローンをKaedeと命名した。Kaedeのアミノ酸配列を配列表の配列番号5に記載し、塩基配列を配列表の配列番号6に記載する。
(a)蛋白の発現と精製
得られた全長cDNAのN末端にBamHIサイトを、C末端にEcoRIサイトを設け、pRSETB(Invitrogen社製)にin frameでサブクローニングして、大腸菌のJM109 DE3株で発現させた。発現蛋白はN末端のHis-tagを利用して、Ni-Agarose gel(QIAGEN社製)を用いて精製した。
(b)吸収スペクトルとモル吸光係数、蛍光スペクトルと量子収率
この蛍光蛋白質は、UVを照射することで吸収及び蛍光スペクトルが緑から赤に長波長シフトする。図5は、精製蛋白のUV照射前後の吸収スペクトルを示す(実線が前、点線が後)。モル吸光係数は、蛋白濃度と吸収極大での吸光度より求めた(表3)。
蛍光スペクトルは、UV照射前後を480nmで励起して測定し(図6)、量子収率をFluorescein (Molecular Probes社製)と比較して算出した(表3)。
Kaedeの蛍光特性を以下の表3に示す。
緑、赤それぞれにつきpH4〜11のバッファー中での吸収スペクトルを測定した。緑、赤共にpH9を境に吸収は徐々に落ちてくる。吸収極大の変化から算出したpKaを上記の表3中に示した。
HeLa細胞にLIPOFECTIN Reagent (Gibco社)を用いてKaedeの遺伝子を導入した。図7は、470nmで励起して510nmの蛍光で測定したもので、導入後9時間前後で蛍光が確認できる。哺乳類細胞中でも、UVを照射すると蛍光が長波長にシフトする。
Kaedeは四量体を形成するため、他の蛋白質を融合させた際に発現パターンに異常が見られる場合がある。そこで、Kaedeの158番目のトレオニン(T)をアルギニン(R)に、160番目のアラニン(A)をグルタミン酸(E)に置換し、二量体変異体を作製した。この変異体をKaede2とした。Kaede2のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号7及び8にそれぞれ示す。12.5%アクリルアミドゲルのサンプルを煮沸しない電気泳動(Pseudonative SDS/PAGE)において、Kaede2はKaedeよりも低分子としてバンドが検出された(図8)。また、HeLa細胞の細胞形質膜にKaede、Kaede2を発現させたとき、Kaedeは明らかに正常でない発現パターンを示した。しかし、Kaede2に於いては正常に細胞形質膜にターゲティングされた発現パターンを示した(図9)。
紫(外)光照射によるKaedeの緑から赤への蛍光特性変換はタンパク質の切断を伴う。12.5%アクリルアミドゲルの電気泳動の結果は、365 nm光照射により27kDaのKaede分子が17kDaと10kDaのペプチド鎖に切断される事を示し(図10上段)、且つ、365 nm光照射により508 nmの吸収値が減少し、572 nmの吸収値が増加するという緑から赤への蛍光特性変換と一致することを示した(図10中段、下段)。この性質はタンパク質の切断を光によりコントロールする技術となる。タンパク質を光によって切断する技術はこれまでに報告されていない。またこの切断はタンパク質内でのβ脱離反応であるが、タンパク質内のβ脱離反応、あるいはアミド基が脱離基となるβ脱離反応はこれまでに報告されていない。
(1)total RNAの抽出
蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはアザミハナガタサンゴ(Scolymia Vitiensis)を用いた。アザミハナガタサンゴをハンマーで砕き、砕いたサンゴ10グラムに"TRIzol"(GIBCO BRL)を15 ml加えて攪拌し、1500 x gで10分間遠心した。上清にクロロホルム3 mlを加え、15秒間攪拌した後3分間静置した。7500 x gで15分間遠心した。上清にイソプロパノール7.5 mlを加え、15秒間攪拌した後10分間静置した。17000 x gで10分間遠心した。上清を捨て70%エタノールを6 ml加えて、17000 x gで10分間遠心した。上清を捨て沈殿をDEPC水200 μlで溶解した。DEPC水で溶解したtotal RNAを100倍に希釈してO.D. 260とO.D. 280の値を測定してRNA濃度を測った。230 μgのtotal RNAを得た。
total RNA 3 μgを使用し、First strand cDNAの合成キット"Ready To Go" (Amersham Pharmacia)によりcDNA(33 μl)を合成した。
合成したFirst strand cDNA (33 μl)のうち3 μlを鋳型としてPCRを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。
使用プライマー
5'- ATCAAGNTNWRYATGGAAGG -3' (primer1)(配列番号27)
5'- acVggDccatYDgVaagaaaRtt-3' (primer2)(配列番号28)
RはA又はGを示し、YはC又はTを示し、VはA,C又はGを示し、DはA,G又はTを示す。
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3 μl
X 10 taq バッファー 5 μl
2.5m M dNTPs 4 μl
100 μM primer1 1 μl
100 μM primer2 1 μl
ミリQ 35 μl
taq polymerase(5 U/μl) 1 μl
94 ℃ 1分(PAD)
94 ℃ 30 秒 (変性)
52 ℃ 30 秒 (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72 ℃ 1 分 (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行い、アニーリング温度を1サイクルごとに0.3 ℃下げた。30サイクル時の温度は43 ℃。
72 ℃ 7 分 (最後の伸長)
4 ℃で保持
一回目のPCR反応で得られた増幅産物1 μlをテンプレートとして、もう一度同じ条件でPCRを行った。アガロースゲル電気泳動で予想された大きさの350 bpのバンドを切り出し、精製した。
精製したDNA断片をpT7-blue vector (Novagen)にライゲーションした。大腸菌株 (TG1)にトランスフォーメーションしてX-gal存在下でブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりplasmid DNAを精製して、挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのDNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、5'-RACE法および3'-RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。
Degenerated PCRで得られたDNA断片の5'側の塩基配列を決定するために5'-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0 (GIBCO BRL)を用いて、5'-RACE法を行った。鋳型として1)で調整したtotal RNAを3 μg使用した。DC-tailed cDNAの一回目の増幅には
5'-ggccacgcgtcgactagtacgggiigggiigggiig-3' (primer3)(配列番号29)
5'- AGTTCACACCATGATATTCAATATCATA -3' (primer4)(配列番号30)
のプライマーを用いた。
Iはイノシンを示す。
二回目の増幅には
5'-ggccacgcgtcgactagtac-3' (primer5)(配列番号31)
5'-TCTTCGTAAGTCATGCTTCGTTC-3' (primer6)(配列番号32)
のプライマーを用いた。PCR反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された400 bpのバンドを切り出し、精製した。精製したDNA断片をpT7-blue vector (Novagen)にライゲーションした。大腸菌株(TG1)にトランスフォーメーションしてX-gal存在下でブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりplasmid DNAを精製して、挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーにより決定した。
Degenerated PCRで得られたDNA断片の3'側部分は、(4)の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴdTプライマーのPCRで得た。鋳型として(2)で調整したfirst strand cDNAを3 μl使用した。
作成したプライマーは 5'- GGTATTCGCCAAATACCCAAA -3'(primer7)(配列番号33)
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3 μl
X 10 taq バッファー 5 μl
2.5 mM dNTPs 4 μl
20 μM primer3 1 μl
10 μM oligo dT primer 1 μl
ミリQ 35 μl
taq polymerase(5 U/μl) 1 μl
94 ℃ 1 分(PAD)
94 ℃ 30 秒(変性)
52 ℃ 30 秒(プライマーの鋳型へのアニーリング)
72 ℃ 1 分 (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行った。
72 ℃ 7 分 (最後の伸長)
4 ℃で保持
得られた全長の塩基配列より蛍光蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを決定した。N末端、C末端に相当する部分でプライマーを作製し、(2)で調製したFirst strand cDNAを鋳型としてPCRを行って全長のcDNAを得た。このクローンをMomijiと命名した。Momijiのアミノ酸配列を配列表の配列番号9に記載し、塩基配列を配列表の配列番号10に記載する。
使用プライマー
5'- CCCGGATCCGACCATGGTGAGTGTGATTAAGGACGAAATG -3'(primer8)(配列番号34)
5'- CCGCTCGAGTTGTTGTTGTTTCTCTTTGTCCTG -3' (primer9)(配列番号35)
PCR反応液組成
テンプレート(first strand cDNA) 3 μl
X 10 pyrobest バッファー 5 μl
2.5 mM dNTPs 4 μl
20 μM primer4 1 μl
20 μM primer5 1 μl
ミリQ 35 μl
pyrobest polymerase(5 U/μl) 1 μl
94 ℃ 1 分(PAD)
94 ℃ 30 秒 (変性)
52 ℃ 30 秒 (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72 ℃ 1 分 (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行った。
72 ℃ 7 分(最後の伸長)
4 ℃で保持
実施例D−1(7)で増幅された700 bpのバンドをアガロースゲルの電気泳動で、切り出し、精製してpET28 vector (Novagen)のNcoI、XhoI部位に挿入して、大腸菌株(JM109-DE3)で発現させた。C末端にHis-tagが付くようにコンストラクトし、産生させた蛋白はNi-Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。以下、実施例D−3で、精製した蛋白(Momiji)の性質を解析した。
(1)蛍光特性の解析
蛍光蛋白(Momiji)20 μM、50 mM HEPES pH 7.4、150 mM KCl溶液を用いて、吸収スペクトルを測定した。さらに上記の緩衝液で20倍希釈し、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを測定した。別にBradford法で求めた蛋白質濃度と吸収スペクトルのピークの値より、508 nmと578 nmにおけるモル吸光係数を計算した。450 nmの吸収が0.002となるように蛍光蛋白を同緩衝液で希釈し、450 nmで励起した時の蛍光スペクトルを測定した。EGFP (CLONTECH)を同様に450 nmの吸収が0.002となるようにして蛍光スペクトルを測定し、両スペクトルの面積比から今回クローニングされた蛍光蛋白の蛍光の量子収率を求めた。EGFPの蛍光の量子収率を0.6とした。測定結果等は表4及び図11に示す。
本発明の蛍光蛋白(Momiji)はUV(365 nm付近)の照射により、蛍光、及び、吸収スペクトルが変化するため、その変化を測定した。蛍光蛋白を50 mM HEPES pH 7.4、150 mM KCl溶液で希釈して、365 nmの光を照射し、365 nmで励起した時の蛍光スペクトルを測定した。また蛍光蛋白20 μM、50 mM HEPES pH 7.4、150 mM KCl溶液を用いて、365 nmの光を照射した後の吸収スペクトルを測定した。測定結果等は図13及び図14に示す。なお、蛍光スペクトルと吸収スペクトルの測定を行ったときの365 nmの光量が違うため、蛍光スペクトルと吸収スペクトルの変化と時間は一致しない。
pH 4から11の緩衝液で吸収スペクトルをとりpH感受性(pKa)を測定した。
各pHの緩衝液は次の通り、
pH 4、5 : 酢酸バッファー
pH 6、11 : リン酸バッファー
pH 7、8 : HEPESバッファー
pH 9、10 : グリシンバッファー
測定結果等は表4及び図12に示す。
Momijiの86番目のグルタミン酸(E)をリジン(K)に111番目のアスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)に、142番目のグルタミン(Q)をプロリン(P)に、203番目のアルギニン(R)をヒスチジン(H)にアミノ酸置換する事によりモル吸光係数の値が102250(508nm)から127200(505nm)に上昇し、緑から赤への紫(外)光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持したまま、緑の蛍光が明るくなった(表5、図15及び21)。また、紫(外)光照射依存的に蛍光特性が変わった赤い蛍光を放つ分子は、野生型(Momiji)のそれにくらべて低いpHに抵抗性をもった(図17及び18)。この変異体をMomiji2とした。Momiji2のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号11及び12にそれぞれ示す。
Momijiの197番目のイソロイシン(I)をメチオニン(M)にアミノ酸置換した。この変異体をMomiji4とした。Momiji4のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号13及び14にそれぞれ示す。紫(外)光照射依存的な緑から赤への蛍光変化が365 nm光照射後1分からMomiji4では観測されたが、野生型(Momiji)に於いては365 nm光照射後10分がMomiji4の1分間照射に相当し、明らかにMomiji4が野生型(Momiji)より光照射依存的蛍光特性変換効率が高いことを示した(図16、20及び22)。HeLa細胞にMomiji、Momiji4を発現させて、細胞内での410 nm光照射による緑から赤への蛍光特性の変化(Red/Green)を測定した結果も、光照射依存的蛍光特性変換効率がMomiji4のほうが良いことを示した。紫(外)光照射依存的に蛍光特性が変わった赤い蛍光を放つ分子は、野生型(Momiji)のそれにくらべて低いpHに抵抗性を持ち、特性変換光照射前の緑の蛍光を放つ分子は低いpHに感受性となった(図17及び19)。
12.5%アクリルアミドゲルを用いてMomijiを煮沸せずに電気泳動(Pseudonative SDS/PAGE)を行うとMomijiは四量体を形成していることを示した。Momijiの11番目のアスパラギン(N)をアルギニン(R)に、29番目のロイシン(L)をトレオニン(T)に、122番目のチロシン(Y)をグルタミン酸(E)に、136番目のリジン(K)をアスパラギン(N)に、138番目のグルタミン(Q)をロイシン(L)に、142番目のグルタミン(Q)をプロリン(P)に、159番目のアスパラギン(N)をアスパラギン酸(D)に、161番目のアラニン(A)をセリン(S)に、190番目のチロシン(Y)をトレオニン(T)に、192番目のフェニルアラニン(F)をチロシン(Y)に、196番目のシステイン(C)をセリン(S)にアミノ酸置換し、224番目から229番目までの6アミノ酸を削除する事により二量体となった(図24)。Momijiと同様に緑から赤への紫(外)光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持していた(図25)。この変異体をd16とした。d16のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号15及び16にそれぞれ示す。
Momijiの11番目のアスパラギン(N)をアルギニン(R)に、29番目のロイシン(L)をトレオニン(T)に、95番目のイソロイシン(I)をトレオニン(T)に、101番目のイソロイシン(I)をバリン(V)に、103番目のイソロイシン(I)をトレオニン(T)に、122番目のチロシン(Y)をグルタミン酸(E)に、124番目のバリン(V)をトレオニン(T)に、138番目のグルタミン(Q)をロイシン(L)に、142番目のグルタミン(Q)をプロリン(P)に、159番目のアスパラギン(N)をアスパラギン酸(D)に、161番目のアラニン(A)をセリン(S)に、174番目のフェニルアラニン(F)をメチオニン(M)に、190番目のチロシン(Y)をトレオニン(T)に、192番目のフェニルアラニン(F)をチロシン(Y)に、196番目のシステイン(C)をセリン(S)に、212番目のフェニルアラニン(F)をチロシン(Y)にアミノ酸置換し、224番目から229番目までの6アミノ酸を削除する事により単量体となった(図24)。Momijiと同様に緑から赤への紫(外)光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持していた(図26)。この変異体をm16とした。m16のアミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号17及び18にそれぞれ示す
Claims (11)
- 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
(a)配列番号5に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列: - 配列番号7に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
- 以下の何れかのDNA。
(a)配列番号5に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA:
(c)配列番号6に記載の塩基配列を有するDNA;又は、
(d)配列番号6に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするDNA: - 以下の何れかのDNA。
(a)配列番号7に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号8に記載の塩基配列を有するDNA。 - 請求項3又は4に記載のDNAを有する組み換えベクター。
- 請求項3又は4に記載のDNA又は請求項5に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
- 請求項1又は2に記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。
- 他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、請求項7に記載の融合蛍光蛋白質。
- 他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、請求項7又は8に記載の融合蛍光蛋白質。
- 請求項7から9の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法。
- 請求項1又は2に記載の蛍光蛋白質、請求項3又は4に記載のDNA、請求項5に記載の組み換えベクター、請求項6に記載の形質転換体、又は請求項7から9の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キット。
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