JP2010008047A - 分取液体クロマトグラフ装置及び該装置を用いた分取精製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料液に含まれる目的成分を抽出し、これを同量ずつ小分けにした粉体を取得できるようにする。
【解決手段】ピーク検出部１２は検出器５による検出信号に基づいて作成されたクロマトグラム上で目的成分のピークの開始点を検出し、これにより制御部１４は溶出液がトラップカラム７ａに流れるようにバルブ６を切り替える。ピーク面積演算処理部１３は時間経過に伴い目的成分のピークの面積を計算し、その面積が閾値を超えると制御部１４は溶出液が次のトラップカラム７ｂに流れるようにバルブ６を切り替える。こうして１つのピークの中で各面積が同一になるようにトラップカラム７ａ〜７ｄを順次切り替え、トラップカラム７ａ〜７ｄに溶出液中の目的成分を捕集させる。その後、トラップカラムから目的成分を溶出させて溶媒を蒸発させることにより、目的成分の粉体を得る。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体クロマトグラフのカラムで分離された成分を複数のトラップカラムに捕集する分取液体クロマトグラフ装置、及び該装置を用いた分取精製方法に関する。

例えば製薬分野などにおいては、化学合成により得られた各種の化合物をライブラリとして保管したり或いは詳細に分析したりするためのサンプルを収集するために、液体クロマトグラフを利用した分取精製装置が使用されている。こうした分取精製装置として、従来、特許文献１、特許文献２などに記載の装置が知られている。

これら従来の装置では、試料溶液中の目的成分（化合物）を液体クロマトグラフにより時間的に分離することにより目的成分毎に別のトラップカラムに導入して一旦捕集する。その後に各トラップカラムに溶媒を流して該カラム内に捕集していた成分を短時間で溶出させることで、目的成分を高い濃度で含有する溶液を容器に回収する。こうして分取した各溶液について蒸発・乾固処理を行って溶媒を除去し、目的成分を固形物として回収する。こうした蒸発・乾固処理は、回収した溶液を加熱したり、真空遠心分離したりするなどといった方法により行われるのが一般的である。

こうした分取精製を行う際に、試料溶液中に比較的多量に含まれる成分については、まとまった固形物としてではなく、高い精度で等量に小分けした状態で固形物を回収したいという要望がある。こうした要望に応えるためには、例えば、目的成分を含む溶出液を分取する際に、溶出液を等量ずつ分取するのではなく、含まれる目的成分の量が等量になるように溶出液の量自体を調整して分取を行う必要がある。

分取ＬＣ装置において、複数の容器に分取する溶出液中の目的成分の量を均一にすることを意図したものとして、特許文献３に記載の装置が知られている。この従来の分取装置では、クロマトグラムに現れるピークの高さに基づいて、ピーク高さが高いほど容器に分取される溶出液の容量が少なくなるように分取制御を実行している。このようにピーク高さに基づいて分取する溶出液の容量を制御する構成では、ピーク波形形状が比較的きれいであればよいが、ピーク波形形状がきれいでない場合、例えばピークトップの前方でカーブが単調増加でなく、ピークトップの後方でカーブが単調増加でないような場合、分取された溶出液中の目的成分の量のばらつきが大きくなり易い。

また、特許文献３に記載の分取装置のように試験管などの容器に分取を行う場合、試料に含まれる目的成分の濃度が低いと、多量の溶出液を容器に採取する必要があり、容器の容量を超えて溶出液が溢れ出てしまうおそれがある。

特開平２−１２２２６０号公報 特開２００３−１４９２１７号公報 特許第３８６４８７６号公報

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その第１の目的は、ピーク波形形状に拘わらす従来よりも高い精度で均一量の目的成分を分取することができ、且つ成分濃度が低い場合であっても溶出液の溢れ等の問題が生じることのない分取液体クロマトグラフ装置を提供することにある。また、本発明の第２の目的は、試料液中の目的成分を高い精度で等量に小分けして固形物として回収することができる分取精製方法を提供することにある。

上記課題を解決するために成された本発明は、試料中の成分を分離するカラム及び該カラムからの溶出液中の成分を検出する検出器を含む液体クロマトグラフと、前記溶出液中の成分を捕集するための複数のトラップカラムと、前記溶出液を前記複数のトラップカラムの１つに選択的に流すように流路を切り替える流路切替え手段と、を具備する分取液体クロマトグラフ装置において、
a)試料のクロマトグラフ分析実行中に前記検出器による検出信号に基づいてクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成手段と、
b)前記クロマトグラム上に出現する目的成分のピークに対し、後記制御手段による流路切替えの時点を起点とするピーク面積をリアルタイムで計算するピーク面積算出手段と、
c)前記ピーク面積算出手段により得られる面積値が所定値に達する毎に、前記溶出液を流すトラップカラムを切り替えるように前記流路切替え手段を制御する制御手段と、
を備えることを特徴としている。

また本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置では、トラップカラムに捕集したい目的成分の量を設定する入力設定手段をさらに備え、前記制御手段は、前記入力設定手段により設定された量に応じて、前記ピーク面積算出手段により得られる面積値を判定する所定値を決定する構成とすることが好ましい。

また本発明に係る分取精製方法は、上述した本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置を用いた分取精製方法であって、
該分取液体クロマトグラフ装置により複数のトラップカラムにそれぞれ目的成分を捕集させる分取行程と、
目的成分がそれぞれ捕集された複数のトラップカラムに溶媒を供給して、捕集されている目的成分を溶出させる溶出行程と、
複数のトラップカラムからの溶出液中の溶媒を蒸発させ、それぞれ固形物の目的成分を回収する回収行程と、
を順次実行することを特徴としている。

本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置では、目的成分のピーク高さではなく、ピーク面積算出手段により算出されるピーク面積に基づいて、複数のトラップカラムへの溶出液の供給が制御される。このピーク面積は溶出液中に含まれる目的成分の量を正確に反映している。したがって、本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置によれば、複数のトラップカラムにそれぞれ捕集される目的成分の量を高い精度でもって揃えることができる。

また、トラップカラムに溶出液が供給されると、溶出液中の目的成分がトラップカラム内の例えば充填剤に捕集され、目的成分が除去された溶出液はトラップカラムを通過して排出される。したがって、１本のトラップカラムに供給される溶出液の量が多い（通常、溶出液の供給流量は一定であるので供給時間が長い）場合でも、容器に採取する場合とは異なり、溶出液が溢れ出るという問題は起こらない。したがって、本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置によれば、試料中の目的成分の濃度の高低に拘わらず、正確に意図する量の目的成分を各トラップカラムに捕集することができる。

また本発明に係る分取精製方法によれば、等量の固形状の目的成分を簡便に得ることができるので、例えば特定の成分を一定量ずつ含有する医薬品や試薬などの作製が容易になる。

以下、本発明の一実施例である分取液体クロマトグラフ（ＬＣ）装置及び該装置を用いた分取精製方法について、添付図面を参照して説明する。

まず、本実施例の分取ＬＣ装置を利用した目的成分の分取精製の手順について、図４のフローチャートに従って説明する。

まず最初の工程として、目的成分のほかに不純物などを含む試料をＬＣにより成分分離し、且つ目的成分を規定量ずつ分割して異なるトラップカラムに捕集する（ステップＳ２０）。このような目的成分の分取を行うために、後述する分取ＬＣ装置が利用される。次の工程として、目的成分が捕集されたトラップカラムに溶媒を流し、目的成分を溶出させる（ステップＳ２１）。このとき溶媒として高い溶離能を有するものを使用することで、短時間で、つまり少ない量の溶媒で、トラップカラムに捕集されている目的成分全てを溶出させることができる。

それから、回収した溶出液を加熱することで溶媒の蒸発を促し、目的成分を乾固して粉体状の目的成分を回収する（ステップＳ２２）。溶出液中の目的成分濃度が高いほど溶媒の蒸発に要する時間が短くて済み、作業の効率化が図れる。ステップＳ２０で複数のトラップカラムにそれぞれ規定量の目的成分を捕集させるようにすることにより、ステップＳ２２において、規定量ずつに小分けされた目的成分を得ることができる。

図１は本実施例の分取ＬＣ装置の概略構成図である。この分取ＬＣ装置において、移動相容器１に貯留されている移動相は送液ポンプ２により吸引され、一定流量でインジェクタ３を介して分離カラム４に流される。インジェクタ３において移動相中に試料が注入されると、試料は移動相に乗って分離カラム４に導入され、分離カラム４を通過する間に試料に含まれる各種成分が時間方向に分離されて溶出する。例えば試料に目的成分と不純物成分とが含まれる場合、分離カラム４を通過する間に目的成分と不純物成分とが分離されて異なる保持時間でもって溶出液中に現れる。

検出器５は例えば紫外可視分光光度計などであり、分離カラム４からの溶出液中に含まれる成分に応じた検出信号を出力する。検出器５を通過した溶出液はその全量（又は一部でもよい）が、流路切替バルブ６を経て複数本（この例では４本）のトラップカラム７ａ〜７ｄのいずれか又は排液流路８に流され、最終的に排出口９に至る。トラップカラム７ａ〜７ｄはそれぞれ目的成分を捕捉する捕集剤が充填されたものである。ここではトラップカラムは４本であるが、これに限定されるものではない。

検出器５によるアナログ検出信号はＡ／Ｄ変換器１６で所定のサンプリング時間ＳＴ間隔毎にデジタル値に変換され、処理・制御部１０に入力される。処理・制御部１０は後述するようなデータ処理を実行するとともに、その処理結果に基づいて流路切替バルブ６の切り替え動作を制御する。処理・制御部１０は機能ブロックとして、クロマトグラム作成部１１、ピーク検出部１２、ピーク面積演算処理部１３、バルブ切替制御部１４、などを備える。この処理・制御部１０はハードウエアとしては汎用のパーソナルコンピュータ（ＰＣ）を中心に構成することができ、このＰＣに搭載された専用の制御／処理用ソフトウエアが実行されることで、上記の各機能ブロックが具現化されるものとすることができる。また、処理・制御部１０にはキーボードやマウス等のポインティングデバイスなどの操作部１５が接続され、この操作部１５から分取のための各種の条件などの設定が可能となっている。

次に、本実施例による分取ＬＣ装置の特徴的な動作について、図２のフローチャート及び図３の波形図を参照して説明する。いま、ここでは、試料中に含まれる既知の１種類の目的成分を分取する場合を想定する。

分析開始前に、まず担当者はトラップカラムに捕集する目的成分の分量、目的成分のおおよその保持時間、ピークの検出条件、などを分取条件として操作部１５から入力する。一般に、ピーク検出方法としては、クロマトグラムの信号レベルが規定の閾値ＬＥＶを超えたときにピークであると判定する方法と、クロマトグラムのカーブの上向きの傾きが所定値を超えた場合にピークが出現したと判断し、該カーブの下向きの傾きが所定値を超えた状態から所定値以下になったときにピークが終了したと判断するという方法とがあり、いずれか１つの方法、又は両方法の併用によりピーク検出が実施される。ここでは、閾値ＬＥＶに対する信号レベルの単純な大小判定によってピーク検出を行うものとして説明するが、ピーク検出方法はこれに限るものではない。また、目的成分の保持時間が不明である場合には、予備的な分析等によりおおよその保持時間を調べておくとよい。

処理・制御部１０においてピーク検出部１２は、設定されたピーク検出条件や保持時間などの情報を記憶する。また、ピーク面積演算処理部１３は設定された成分分量に応じて後述する面積値の閾値ＡＣthを定めこれを記憶する。前述のように送液ポンプ２により送出される移動相中にインジェクタ３から試料が注入され、分析が開始されると、ピーク面積演算処理部１３は計算に用いる面積値ＡＣをリセットする（ステップＳ１）。なお、分析開始時にバルブ切替制御部１４は、検出器５を通過した溶出液が排液流路８に流れるように流路切替バルブ６を切り替えておく。

分析開始とともに、クロマトグラム作成部１１は検出器５から得られる検出信号に基づいて、クロマトグラムの作成を開始する（ステップＳ２）。これにより、図３（ａ）に示すようなクロマトグラムが時間経過に伴って得られる。ピーク検出部１２はクロマトグラムの信号レベルＬＩＮを読み取り（ステップＳ３）、目的成分のピーク開始点であるか否かを判定する（ステップＳ４）。上述のようにピーク開始点の判断は信号レベルＬＩＮを閾値ＬＥＶと比較することにより行う。また、そのピークが目的成分のピークであるか否かは、設定されたおおよその保持時間に基づいて判断する。

目的成分のピークの開始点でないと判定されると、ピーク検出部１２は次に目的成分のピークの終了点であるか否かを判定する（ステップＳ５）。ピーク終了点の判断も信号レベルＬＩＮを閾値ＬＥＶと比較することにより行う。目的成分のピーク開始点・終了点のいずれでもないと判定されると、ピーク検出部１２はピーク検出中、つまりピーク開始点からピーク終了点までの間の期間中であるか否かを判定する（ステップＳ６）。ステップＳ４〜Ｓ６のいずれもＮｏである場合には、目的成分のピークでない期間であるので、定められたサンプリング時間ＳＴだけ待って（ステップＳ１３）、分析終了か否かを判定し（ステップＳ１４）、分析終了でなければステップＳ２へと戻る。

図３（ａ）に示すように、クロマトグラムにピークが出現しても、それが目的成分のピークでない、つまりは不純物成分のピークであると判断されれば、ステップＳ４〜Ｓ６からＳ１３へと進む。したがって、検出器５を通過した溶出液は流路切替バルブ６を経て排液流路８へと流れ、排出口９から排出される。

試料中の目的成分が分離カラム４から溶出し検出器５に到達すると、図３（ａ）、（ｂ）に示すように、目的成分のピークが出現し始める。すると、ピーク検出部１２において目的成分のピーク開始点であると判断され、バルブ切替制御部１４は予め指定されたトラップカラム、例えば第１トラップカラム７ａに溶出液が流れるように流路切替バルブ６を切り替える（ステップＳ７）。すると、溶出液がトラップカラム７ａに流れ、溶出液中の目的成分がトラップカラム７ａ内の充填剤に捕集される。目的成分が除去された溶液が排出口９から排出される。

ピーク開始点と判断された後、サンプリング時間ＳＴだけ待機してステップＳ２に戻ると、次にピーク検出部１２はステップＳ６でピーク検出中であると判断する。すると、ピーク面積演算処理部１３は、信号レベルＬＩＮにサンプリング時間ＳＴを乗じ、それをその直前の面積値ＡＣに加算した値を計算して、この値を新たな面積値ＡＣとする（ステップＳ９）。これは、面積値ＡＣがリセットされた直近の時点からのピーク面積を計算することを意味する。次に、新たに求められた面積値ＡＣが始めに定めた面積閾値ＡＣthを超えたか否かを判定し（ステップＳ１０）、超えていなければステップＳ１３へと進む。したがって、面積値ＡＣが面積閾値ＡＣthを超えるまで、Ｓ２〜Ｓ６→Ｓ９、Ｓ１０→Ｓ１３、Ｓ１４という処理を繰り返し、面積値ＡＣが面積閾値ＡＣthを超えると、ピーク面積演算処理部１３は面積値ＡＣをリセットする（ステップＳ１１）。また、バルブ切替制御部１４は溶出液を次のトラップカラムに流すように、例えば第１トラップカラム７ａから第２トラップカラム７ｂに移行するように、流路切替バルブ６を切り替える（ステップＳ１２）。

上記のように溶出液が供給されるトラップカラムが切り替わった直後に、サンプリング時間ＳＴだけ待機してステップＳ２に戻ると、ピーク検出部１２はステップＳ６でピーク検出中であると再び判断する。このときには面積値ＡＣが直前にリセットされているため、ステップＳ９、Ｓ１０、Ｓ１３と進み、ステップＳ１０で面積値ＡＣが面積閾値ＡＣthを超えると判断されるまで、ステップＳ２〜Ｓ６→Ｓ９、Ｓ１０→Ｓ１３、Ｓ１４を繰り返す。そして、ピーク検出部１２により目的成分のピーク終了点であると判断されると、ステップＳ５からＳ８へと進み、溶出液が排液流路８に流れるように流路切替バルブ６を切り替える。目的成分が１種類のみである場合には、目的成分が溶出し終えた後の任意の時点で分析を終了することができるが、目的成分が複数種であれば、さらにステップＳ２へと戻って上記と同様の処理・制御を繰り返せばよい。

上記処理・制御により、１種類の目的成分のピークの検出中に、ピークの面積値ＡＣが面積閾値ＡＣthを超える毎に溶出液の供給先であるトラップカラムが切り替えられる。即ち、図３（ｂ）に示すように、クロマトグラム上の目的成分のピークにおいて、ａ、ｂ、ｃで示す同面積の範囲に相当する溶出液がそれぞれ第１〜第３トラップカラム７ａ〜７ｃに流され、その溶出液に含まれる目的成分が各トラップカラム７ａ〜７ｃの充填剤に捕集される。この面積は目的成分の量に対応するから、各トラップカラム７ａ〜７ｃには同量の目的成分が捕集されることになる。一方、ピーク終了点と判断された時点で溶出液が供給されていた第４トラップカラム７ｄには、トラップカラム７ａ〜７ｃに捕集された目的成分の量に達しない量の目的成分が捕集されている可能性がある。そこで、第４トラップカラム７ｄに捕集されている目的成分の量が不足している可能性を担当者に知らせるために、表示等による報知を行うようにするとよい。

上記例では、３本のトラップカラム７ａ〜７ｃに同量の目的成分が捕集されるから、これらトラップカラムに対し上述したステップＳ２１、Ｓ２２の工程における目的成分の溶出及び溶媒の蒸発処理を実行することにより、同量の目的成分を小分けした状態で得ることができる。

なお、トラップカラムは捕集可能な成分の最大量が決まっており、その最大量の成分がトラップカラム内に保持された以降に、該成分を含む溶出液が供給されても、該成分は捕集されることなくそのまま流出してしまう。こうした無駄をなくすには、分取条件として設定する、各トラップカラムに捕集する成分の量をトラップカラムの捕集可能最大量以内に制限するようにするとよい。

このようにトラップカラムを利用して目的成分のみを選択的に捕集する装置は、試験管などの容器に目的成分を含む溶出液を分取する装置に比べて有利である。即ち、試料中の目的成分の濃度が低い場合、同じ量の成分を採取するためには多量の溶出液が必要である。溶出液を容器に分取する場合には、溶出液量が想定した量よりも多くなると、溶出液が容器から溢れ出るおそれがあり、その場合には規定量の成分を採取することができなくなる。これに対し、溶出液をトラップカラムに流して目的成分のみを捕集する場合には、トラップカラムで成分が除去された後の溶液は排出されてしまうので、溶出液量が多くても何ら問題はない。

なお、上記実施例は本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

本発明の一実施例による分取ＬＣ装置の概略構成図。 本実施例の分取ＬＣにおける分取のための処理・制御のフローチャート。 本実施例の分取ＬＣにおける分取動作を説明するための波形図。 本実施例の分取ＬＣを用いた目的成分の分取精製の手順を示すフローチャート。

符号の説明

１…移動相容器
２…送液ポンプ
３…インジェクタ
４…分離カラム
５…検出器
６…流路切替バルブ
７ａ〜７ｄ…トラップカラム
８…排液流路
９…排出口
１０…処理・制御部
１１…クロマトグラム作成部
１２…ピーク検出部
１３…ピーク面積演算処理部
１４…バルブ切替制御部
１５…操作部
１６…Ａ／Ｄ変換器

Claims (3)

1. 試料中の成分を分離するカラム及び該カラムからの溶出液中の成分を検出する検出器を含む液体クロマトグラフと、前記溶出液中の成分を捕集するための複数のトラップカラムと、前記溶出液を前記複数のトラップカラムの１つに選択的に流すように流路を切り替える流路切替え手段と、を具備する分取液体クロマトグラフ装置において、
   a)試料のクロマトグラフ分析実行中に前記検出器による検出信号に基づいてクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成手段と、
   b)前記クロマトグラム上に出現する目的成分のピークに対し、後記制御手段による流路切替えの時点を起点とするピーク面積をリアルタイムで計算するピーク面積算出手段と、
   c)前記ピーク面積算出手段により得られる面積値が所定値に達する毎に、前記溶出液を流すトラップカラムを切り替えるように前記流路切替え手段を制御する制御手段と、
   を備えることを特徴とする分取液体クロマトグラフ装置。
2. 請求項１に記載の分取液体クロマトグラフ装置であって、
   トラップカラムに捕集したい目的成分の量を設定する入力設定手段をさらに備え、前記制御手段は、前記入力設定手段により設定された量に応じて、前記ピーク面積算出手段により得られる面積値を判定する所定値を決定することを特徴とする分取液体クロマトグラフ装置。
3. 請求項１又は２に記載の分取液体クロマトグラフ装置を用いた分取精製方法であって、
   該分取液体クロマトグラフ装置により複数のトラップカラムにそれぞれ目的成分を捕集させる分取行程と、
   目的成分がそれぞれ捕集された複数のトラップカラムに溶媒を供給して、捕集されている目的成分を溶出させる溶出行程と、
   複数のトラップカラムからの溶出液中の溶媒を蒸発させ、それぞれ固形物の目的成分を回収する回収行程と、
   を順次実行することを特徴とする分取精製方法。

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