JP2009542214A - 非天然アミノ酸を含有するタンパク質の無細胞合成の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
タンパク質合成は、ポリペプチド治療薬、ワクチン、診断薬、および工業用酵素の開発の基礎となる根本的な生物学的プロセスである。組み換えDNA(rDNA)技術の出現により、細胞の触媒機構を利用して所望のタンパク質を産生することが可能となった。これは、細胞環境内で、または細胞に由来する抽出物を用いてインビトロで達成することができる。
参照により本明細書に具体的に組み入れられる、2006年5月16日に公表された米国特許 7,045,337号。
本発明の方法において、標的タンパク質は、直交性tRNAがアミノ酸に通常対応していないナンセンスコドン、たとえば終止コドン;4 bpコドン等と塩基対を形成する、非天然アミノ酸によってアミノアシル化された少なくとも一つの直交性tRNAを含む無細胞反応混合物において合成される。方法には、共役した転写-翻訳反応が含まれる。本発明は、非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを高収率で産生するために、無細胞タンパク質合成の際にナンセンスコドン抑制を用いる。関心対象のポリペプチドには、ジスルフィド結合を含有するタンパク質、融合タンパク質、ウイルス外被タンパク質、および/または細胞膜を通して、または細胞膜内部に初めから分泌されるタンパク質を含む、タンパク質の任意の異種または均質な組み合わせが含まれるがこれらに限定されるわけではない。非天然アミノ酸は、天然において一般的に見いだされない任意のアミノ酸類似体、または類似のものからなり、標的化翻訳後修飾のために用いることができる分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。反応混合物は細胞抽出物を含み、細胞抽出物は任意でアミノ酸が安定化、レダクターゼが最小化、および/またはプロテアーゼが変異されていてもよい。
本発明は、記述される特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、および試薬は変化する可能性があることから、それらに限定されないと理解される。同様に、本明細書において用いられる用語は、特定の態様を記述する目的のみのためであって、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるであろう本発明の範囲を制限することを意図しないと理解される。
反応は、大規模リアクター、小規模を利用してもよく、または同時合成を複数行うように多重化されてもよい。連続反応は、フィード機構を用いて試薬の流れを導入し、プロセスの一部として最終産物を単離してもよい。バッチシステムもまた重要であり、この場合活性な合成のための期間を延長させるためにさらなる試薬を導入してもよい。リアクターは、バッチ、拡大バッチ、半バッチ、半連続、フェドバッチおよび連続のような任意の様式で行ってもよく、それらは適応の目的に従って選択される。
実施例として用いられる無細胞タンパク質合成反応は、グルタメートホスフェート/CytomimおよびPANOx-SP系であった。これらの系を、標的タンパク質に非天然アミノ酸を効率よく組み込むように改変した。非天然アミノ酸o-メチル-L-チロシン、p-アセチル-L-フェニルアラニン、またはp-アジド-L-フェニルアラニンは、メタノコッカス・ジャナスシイからの直交性tRNATyr/チロシン-シンテターゼ対を用いてアンバー終止コドンに部位特異的に導入された。非天然アミノ酸は市販されており、遺伝子配列は科学文献において記述されている(参照により本明細書に組み入れられる、Wang et al. (2001) Science 292(5516):498-500;Wang et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100(1):56-61;Chin et al. (2002) J Am Chem Soc 124(31 ):9026-7;Farrell et al. (2005) Nat Methods, 2005. 2(5):377-84;Liu et al. (2003)J Am Chem Soc 125(7): 1702-3)。これらの非天然アミノ酸は、可溶性の細菌タンパク質、ジスルフィド結合を含有する分泌哺乳動物タンパク質、および膜タンパク質に組み込まれた。この無細胞タンパク質合成プラットフォームは、抽出物調製のために用いられる細胞株、正確な調製プロトコール、ヘルパータンパク質濃度、および無細胞反応条件を改変することによって開発された。標的タンパク質活性は、適切であれば比色法、細胞増殖、免疫沈降、および輸送アッセイによって確認してもよい。
非天然アミノ酸を含有する複雑なタンパク質を無細胞タンパク質合成を用いて高収率で発現させるための方法
細菌性タンパク質クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ジスルフィド結合タンパク質mGM-CSFおよびhGM-CSF、ならびに膜タンパク質TetAを本発明の方法を用いて合成した。高収率で標的タンパク質を合成するために、大腸菌tRNAの相対濃度(好ましいコドン)に関して最適化したオリゴヌクレオチドからのオーバーラップPCRによって、鋳型遺伝子を合成した。さらに、遺伝子配列のN-末端を、それが本発明者らの無細胞系において翻訳開始を促進するように最適化した(N-末端をA-Tに富むようにする)。野生型プラスミドpK7CAT、pK7hGM-CSF、pK7hGM-CSFOPT(またはまれなコドンに関してさらに最適化した)、pK7mGM-CSF、およびpK7TetAを、NdeIおよびSalI制限部位でpK7ベクター(添付の配列を参照されたい)に最適化タンパク質配列をライゲーションすることによって開発した。次に、本発明者らは、フォールディングに有意に影響を及ぼさないであろう、または本来のグリコシル化部位であることが知られている残基でアンバー終止コドン(TAG)を挿入するために、オーバーラップPCRおよび/またはQuickChange部位特異的変異誘発を行った。これによって、
が開発された。{質問:これらの配列は出願に含まれるか?それらは末端で欠失しているように思われる}。遺伝子はT7プロモーターおよびターミネーターの制御下にあった。プラスミドを調製した後XL 1-Blue化学コンピテント細胞に形質転換して、Qiagen Plasmid Maxi Kit(Qiagen, Valencia CA)を用いて精製した。
無細胞反応における精製シンテターゼおよび精製/制御されたtRNA転写
非天然アミノ酸組み込み戦略IおよびIIが本実施例において記述される。戦略Iは、無細胞反応に精製直交性シンテターゼおよび精製直交性tRNAを加えることであり、戦略IIは、無細胞反応混合物に精製直交性シンテターゼを加えるが、直交性tRNAは無細胞反応の際に転写されることであった。
直交性tRNAおよびシンテターゼのインビボ発現
本実施例において用いた標準的なPANOx-SP無細胞発現環境は、以下の成分を含有する:170 mMグルタミン酸カリウム、10 mMグルタミン酸アンモニウム、16 mMグルタミン酸マグネシウム、33 mMホスホエノールピルビン酸、2.7 mMシュウ酸ナトリウム、0.6 mM ATP、0.43 mM各GTP、UTP、およびCTP、1.5 mMスペルミジン、1.0 mMプトレシン、17μg/mLフォリン酸、85.3μg/mL大腸菌tRNA混合物、各2 mMの20個の天然アミノ酸、10μM L-[U-14C]-ロイシン、0.33 mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、0.27 mM補酵素A(CoA)、13.3μg/mL pK7CAT_Y109STOP、0.1 mg/mL T7 RNAポリメラーゼ、およびインビボで発現された直交性rRNAおよびtRNAシンテターゼを含有する0.24倍量のKC6大腸菌S30抽出物。直交性tRNAおよびシンテターゼプラスミド(Wang et al.前記によって公表されたpDuleプラスミド)の化学的コンピテントKC6細胞への形質転換後、抽出物を Zawada and Swartz, 前記およびLiu et al, 前記によって記述されるように調製して(以下に記述される改変を加えて)、3 ODで回収した。
tRNAのインビボ発現および精製シンテターゼの付加
無細胞反応において直交性シンテターゼおよびtRNAの濃度を増加させると、無細胞産物の蓄積が増加し、アンバー終止コドンでのタンパク質切断は減少した。この理由は、当該濃度をより高めると、直交性シンテターゼおよびtRNA濃度を制限する可能性のある任意のプロテアーゼまたはヌクレアーゼを圧倒する可能性があり、それによって改変タンパク質産物の産生の増加が起こる可能性があると推論された。
非天然アミノ酸組み込みのための細胞抽出物の改善
活性な細菌および哺乳動物分泌タンパク質が本発明者らの転写/翻訳複合系において産生されたが、本発明者らはより高い収率を求めた。本発明者らは、制限的である成分の一つが直交性シンテターゼの濃度であることを見いだした。この成分が制限される一つの理由を図4、レーン1に示す。これは、標準的なPANOx-SP無細胞タンパク質合成反応において37℃で3時間産生された直交性p-アジド-フェニルアラニンtRNAシンテターゼタンパク質産物である。反応条件は、実施例2において既に記述した(産物をL-[U-14C]-ロイシンによって標識した)。直交性シンテターゼは、タンパク質溶解による分解を受けやすいようにみえる。このことは、KC6細胞抽出物に、500μg/mLより多いL-[U-14C]-ロイシン標識直交性シンテターゼを加えることによって、さらに確認された。37℃で6時間インキュベーション後、完全長のシンテターゼはオートラジオグラフィーによって検出されなかった。本発明者らは、シンテターゼ分解を制御することによって、改変タンパク質の産生増加を試みた。
およびmutR
と共にQuickChange部位特異的変異誘発キットを用いて野生型ompT遺伝子配列に所望のD83A変異を導入した。pKOV遺伝子置換ベクターにクローニングされた変異体対立遺伝子を、KC6(最終的にARG1を生成する)またはKGK10(最終的にARG2を生成する)に電気穿孔して、細胞を30℃で1時間回復させた。細胞を予め加温したクロラムフェニコール/LBプレートに入れて、42℃でインキュベートした。組み込み頻度を測定するために、電気穿孔した細胞をまた30℃のクロラムフェニコール/LBプレートにも播種した。42℃のプレートからコロニー1〜5個をLBブロス1 mlに採取して、連続希釈して、30℃の5%w/v蔗糖プレートに直ちに播種した。5%蔗糖プレート上のコロニーを、置換ベクターの喪失を試験するために、クロラムフェニコールプレートにおいて30℃でスクリーニングした。要約すると、本発明者らは、「コロニー採取」により、置換現象に対する蔗糖耐性およびクロラムフェニコール感受性コロニーを探し、かつプライマーompT5'およびompTD83AによるPCRによって本発明者らの選択を確認した。その結果、ompT遺伝子に不活化D83A変異を含有するであろう新規細胞株ARG1およびARG2が得られた。
無細胞プラットフォームにおける非天然アミノ酸を含有する細菌タンパク質の高レベル産生
既に記述された別のエネルギー系のいずれかを用いることもできたが、非天然アミノ酸を含有するタンパク質産生の増加を例示するために、unAA-PANOx-SPを選択した。具体的に、本実施例に関して無細胞反応には、170 mMグルタミン酸カリウム、10 mMグルタミン酸アンモニウム、0.6 mM ATP、0.43 mM各GTP、UTP、およびCTP、1.5 mMスペルミジン、1.0 mMプトレシン、17 μg/mLフォリン酸、85.3μg/mL大腸菌tRNA混合物、各2 mMの20個の天然アミノ酸、2 mM非天然アミノ酸、150 μg/mLアミノアシルtRNAシンテターゼ、10μM L-[U-14C]-ロイシン、0.33 mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、0.27 mM補酵素A(CoA)、13.3μg/mL鋳型プラスミド、0.1 mg/mL T7 RNAポリメラーゼ、および直交性メタノコッカス・ジャナスシイtRNAを含有する0.29倍量のS30抽出物(明記された細胞株の一つを用いて調製)が含まれた。細胞抽出物の供給源は先に記述されたとおりである。unAA-PANOx-SP系にはまた、16 mMグルタミン酸マグネシウム、33 mMホスホエノールピルビン酸、および2.7 mMシュウ酸が含まれる。
非天然アミノ酸を含有する生物活性哺乳動物分泌タンパク質の合成
細菌に基づく新規の無細胞系の設計およびCAT収率の増加から、非天然アミノ酸を用いて産生されていなかった数多くの異なる複雑なタンパク質への非天然アミノ酸の組み込みを始めることが妥当であった。本報告において示される複雑なタンパク質の例は、mGM-CSF、hGM-CSF、およびTetA膜タンパク質である。そのような基盤技術は、融合タンパク質、一本鎖可変断片(scFvs)、Fab抗体断片、および完全長の抗体が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、例として示されていない多数の複雑なタンパク質に拡大することができる。
膜タンパク質への非天然アミノ酸の組み込み
正確に折り畳まれた膜タンパク質を産生するためにグルタメートホスフェート無細胞系を用いることは、それがMuller and Blobel Proc Natl Acad Sci U S A, 1984. 81(24): p. 7737-41およびOsborn et al J Biol Chem, 1972. 247(12): p. 3962-72から改作された方法を用いることによって小胞溶液の調製も必要とするという点において独特である。KC6細胞を20 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTAにおいて浮遊させて洗浄した。最終的な細胞沈降物を同じ緩衝液に細胞1 グラムあたり1 mLに浮遊させて、氷中で0.2 mg/mLのニワトリ卵白ライソザイムと共に15分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞溶液を20,000 psiでホモジナイザーに3回通過させた。破砕されていない細胞および破片を30,000×gで各20分間2回遠心することによって除去した。次に、小胞を超遠心(154,000×g、1.5時間)によって採取して、緩衝液H(20 mM HEPES-KOH、pH 7.5、1 mM DTT、5 mM EDTA)において250 mM蔗糖を含有する溶液0.5 mL/g細胞によって231,000×gで1時間再度沈降させた。これらの粗精製小胞を20%(w/w)蔗糖に浮遊させて、50%、45%、40%、35%、30%、および25%(w/w)蔗糖の層を含有する段階的勾配の上部にローディングした。114000×gで24時間超遠心後、内膜小胞を含有する分画を採取する。これらの小胞を採取して20 mM HEPES-KOH pH 7.2、60 mM KCl、1 mM DTTにおいて高濃度(1〜2 mg/mL)で最終的に浮遊させる。
最適化MS2遺伝子の合成
材料および方法
プラスミドの構築。MS2外被タンパク質遺伝子を、DNAworksを用いて大腸菌tRNAの相対的濃度(好ましいコドン)およびオリゴヌクレオチドからの合成の双方に関して最適化した。DNAworksによって推奨される配列に基づくオリゴヌクレオチド(長さの平均値60 bp、Operon Technologies, USA)を、2段階PCRを用いて最適化MS2外被タンパク質遺伝子ヌクレオチド配列にアセンブル(assembled)した。pET24a-MS2cpは、NdeIおよびSalI制限部位で最適化MS2外被タンパク質配列をpET-24a(+)ベクター(Novagen, USA)にライゲーション(T4 DNAリガーゼ、NEB、USA)することによって生成した。pET24a-MS2cpをDH5α細胞(One Shot MAXX Efficiency DH5α-T1Rコンピテント細胞、Invitrogen)に形質転換して、プラスミドをQiagen Plasmid Maxi Kit(Qiagen, Valencia, CA)によって精製した。2段階PCRおよびカスタムオリゴヌクレオチド(Operon Technologies, USA)を用いて、T15STOP(アンバー終止コドン)置換をMS2cp配列に変異させた。変異した配列を、Nde IおよびSal I制限部位でpET24a(+)ベクター(Novagen, USA)にライゲーションして、pET24a_MS2cp_T15STOPと命名した。ベクターをDH5α細胞(One Shot MAXX Efficiency DH5α-T1Rコンピテント細胞、Invitrogen)に形質転換して、無細胞タンパク質合成反応において用いるために、プラスミドをQiagen Plasmid Maxi Kit(Qiagen, Valencia, CA)によって精製した。最適化外被タンパク質配列をSEQ ID NO:9として提供する。
非天然アミノ酸を含有するMS2外被タンパク質の発現
材料および方法
PANOx-SP無細胞発現系。本実施例において行ったPANOx-SP無細胞反応は、容積が30μLであり、1.5 mlエッペンドルフチューブにおいて30℃で8時間インキュベートした。反応には、以下の成分が含まれる:1.2 mM ATP、0.85 mM各GTP、UTP、およびCTP、34μg/mLフォリン酸、170.6μg/mL大腸菌tRNA混合物、24 nM pET24aMS2_T15STOPプラスミド、100μg/mL T7 RNAポリメラーゼ、5μM L-[U-14C]-ロイシン、各2 mMの20個の非標識アミノ酸、4 mM p-アジド-フェニルアラニン、〜150μg/mL純粋メタノコッカス・ジャナスシイ変異チロシンシンテターゼ、0.33 mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、0.27 mM補酵素A(CoA)、30 mMホスホエノールピルビン酸、1.5 mMスペルミジン、1 mMプトレシン、170 mMグルタミン酸カリウム、10 mMグルタミン酸アンモニウム、20 mMグルタミン酸マグネシウム、2.7 mMシュウ酸ナトリウム、および以下のように調製した28%v/v KC6_tRNA S30抽出物。T7 RNAポリメラーゼは、Grodberg and Dunnによって記述されるように、大腸菌株BL21(pAR1219)から調製する。
pET24a_MS2cp_T15STOPを用いる30μLのPANOxSP系無細胞反応を行って、総収率および可溶性収率は、図10において示されるように、それぞれ77μg/ml(±6.6μg/ml)および63μg/ml(±3.2μg/ml)と決定された。
p-アジド-フェニルアラニンを組み込んだMS2 VLPの組織化の証明
材料および方法
SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィー。可溶性タンパク質を、15,000×gで15分間の遠心によって不溶性分画から分離した。試料を、Mark12 MW標準物質(Invitrogen)分子量マーカーと共にMES緩衝液において行うNuPAGE 10%Bis-Trisゲル(Invitrogen, La Jolla, CA)にアプライした。ゲルをクーマシーブルー染色(BioRad)によって染色して、ゲルドライヤー、モデル583(Bio-Rad, Richmond, CA)によって乾燥させた後、Kodak scientific造影フィルム(Rochester, NY)に曝露した。
pET24a_MS2cp_T15STOPベクターとのPANOx-SP改変無細胞反応において産生された全てのタンパク質にp-アジド-フェニルアラニン非天然アミノ酸が含まれることを確認するために、陽性および陰性対照を同時に行った。陰性対照は、直交性シンテターゼの非存在下を除き、同じ条件で行った。陽性対照反応は、PANOx-SP改変無細胞反応においてpET24a_MS2cpベクターによって行った。方法の章において記述され、蔗糖勾配速度沈降の後に放射線計数によって決定された原核細胞に基づく反応において、pET24a_MS2cp_T15STOPベクターによって発現された、p-アジド-フェニルアラニンを組み込んだMS2外被タンパク質の組織化の収率は、図11において示されるように22μg/mL(+/-0.6μg/mL、n=2)であった。
ThermoFinnigan LCQ Deca XP+イオントラップLC-MSによる180アクセス可能なp-アジド-フェニルアラニンを有するMS2 VLPの組織化の検証
材料および方法
質量分析プロトコール。濃縮された非天然アミノ酸を組み込んだMS2カプシドおよび対照野生型MS2カプシド試料をAmicon-ultra 4メンブレンフィルターを用いて濃縮した。図11において示される試料と類似の蔗糖密度勾配試料から採取した組織化MS2 VLPからこれらの試料を得た。試料をSDS-PAGE NuPAGE 10%Bis-Trisゲル(Invitrogen, La Jolla, CA)にアプライした。ゲルを、Mark12 MW標準物質(Invitrogen)分子量マーカーと共にMES泳動緩衝液(Invitrogen)によって60 mAで60分間泳動させて、SimplySafe Stain(Invitrogen)によって染色した。水によるすすぎを最小限にしてゲルを水中に終夜浸すことによって脱染色した。可能な限り多くの周辺のブランクゲルを除外しながら、13.7 kDのバンドを湿ったゲルから切り出した。
図13Aは、T15アミノ酸(881.6 m/z)が含まれるMS2野生型カプシド単量体のキモトリプシン消化断片のHPLCトレースを示す。消化後、T15を含有する断片の配列は、
であった。図13Bは、MS2野生型単量体試料を示し、図13Aにおいて示される断片が非天然アミノ酸を含有すれば、出現すると予測されるHPLCトレースの領域を示す(912 m/z)。T15p-アジド-フェニルアラニンを含有する断片の配列は
であると予測され、その予測される分子量および質量対電荷比は、MW=1821、m/z=912であると予測される。予測されるように、野生型MS2対照試料は、キモトリプシン消化物の後に、非天然アミノ酸を組み込んだ断片が溶出すると予想される位置に対応するピークが認められないことから、非天然アミノ酸を含有しない。
Claims (22)
- ナンセンスコドンと塩基対を形成する直交性tRNA、細菌性細胞抽出物、ポリペプチドおよび/またはmRNA合成機構の成分;ポリペプチドの転写用鋳型;ポリペプチドの合成用単量体;ならびに翻訳にとって必要な補因子、酵素、および他の試薬を含む無細胞インビトロ翻訳反応ミックスにおいて、ポリペプチドを合成する段階を含む、無細胞インビトロ反応において少なくとも一つの部位特異的非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを合成するための方法であって、
反応ミックスが、非天然アミノ酸によって直交性コドンをアミノアシル化する、外因的に合成された直交性tRNAシンテターゼを含み、
ポリペプチドが少なくとも一つの部位特異的非天然アミノ酸を用いて合成される方法。 - 外因的に合成された直交性tRNAシンテターゼが少なくとも30μg/mlの濃度で反応ミックスに加えられる、請求項1記載の方法。
- 直交性tRNAが細菌性細胞抽出物の供給源である細菌によって内因性に合成される、請求項2記載の方法。
- 反応混合物が、少なくとも一つの部位特異的非天然アミノ酸を含有するタンパク質の少なくとも約50μg/mlを産生する、請求項1記載の方法。
- 少なくとも一つの部位特異的非天然アミノ酸を含有するタンパク質の少なくとも50%が生物学的に活性である、請求項4記載の方法。
- 少なくとも一つの部位特異的非天然アミノ酸を含有するタンパク質が、転写翻訳共役反応において合成される、請求項1記載の方法。
- 直交性tRNAが終止コドンと塩基対を形成する、請求項1記載の方法。
- 酸化的リン酸化が無細胞インビトロ翻訳反応において活性化される、請求項1記載の方法。
- 外因性の膜小胞が無細胞インビトロ翻訳反応に加えられる、請求項8記載の方法。
- 少なくとも一つの部位特異的非天然アミノ酸を含有するタンパク質が膜結合タンパク質である、請求項1記載の方法。
- 少なくとも一つの部位特異的非天然アミノ酸を含有するタンパク質が分泌型タンパク質である、請求項1記載の方法。
- 少なくとも一つの部位特異的非天然アミノ酸を含有するタンパク質が少なくとも一つのジスルフィド結合を含む、請求項1記載の方法。
- ポリペプチドがウイルス外被タンパク質である、請求項1記載の方法。
- 二つまたはそれより多くの種の外被タンパク質が合成される、請求項13記載の方法。
- ウイルス外被タンパク質がバクテリオファージ外被タンパク質である、請求項13記載の方法。
- バクテリオファージがMS2である、請求項15記載の方法。
- 非天然アミノ酸が、アミノ酸に通常存在しない反応基(reactant group)を提供する、請求項1記載の方法。
- 非天然アミノ酸が修飾されたフェニルアラニンまたはチロシンである、請求項17記載の方法。
- 非天然アミノ酸がオルトまたはパラ位で修飾される、請求項1記載の方法。
- 非天然アミノ酸がp-アセチル-フェニルアラニン、p-エチニル-フェニルアラニン、p-プロパルギルオキシフェニルアラニン、およびp-アジド-フェニルアラニンから選択される、請求項19記載の方法。
- 無細胞インビトロ翻訳反応がompT変異細菌株に由来する細菌性抽出物を含む、請求項1記載の方法。
- 請求項1〜21のいずれか一項記載の方法において用いるためのキット。
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