JP2009534378A - 常態ではなく発現された遺伝子又は異常に発現された遺伝子の発現を修正することによる、個体の遺伝病における治療的介入 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝病を緩和する為の手段及び方法を提供する。分化した細胞における表現型を有する遺伝子の欠陥は、その前駆体細胞において欠陥をもたらしうる。これらのいわゆる第２の欠陥は、個体の全体の疾患に寄与する。本発明において、遺伝子疾患の症状を緩和する為の遺伝子的介入が、分化した細胞における第１の遺伝子の欠陥及び前駆体細胞における第２の欠陥に対し向けられる。
【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝病の分野に関する。特に、本発明は、個体の遺伝病の二次効果の修正による遺伝病の治療の改良に関する。

遺伝病は、個体の遺伝物質中の異常により引き起こされる病気である。個体における病気の発症は、遺伝要因に依存するだけでなく、環境要因も役割を果たす。遺伝病の可能な分類は、２つの異なるタイプの区分、単一遺伝子性又は多遺伝子性である。単一遺伝子性遺伝子疾患は、１つの遺伝子のＤＮＡ配列中に生じる変異により引き起こされる。６０００超の既知の単一遺伝子性疾患がある（ヒトゲノムプロジェクト情報）。例は、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、マルファン症候群、ハンチントン病及び遺伝性ヘモクロマトーシスである。単一遺伝子性の病気は、認知できるパターンで受け継がれる：常染色体優性、常染色体劣性、及びＸ染色体連鎖性。多遺伝子性遺伝病は、複数の遺伝子中の変異により引き起こされる。遺伝子疾患の群のうちで区別されうる２つのカテゴリーは、染色体異常及びミトコンドリア異常である。

染色体の遺伝病は、染色体構造中の異常により引き起こされる。欠落又は過剰コピー又は全体破壊（gross break）及び再結合（転位）のような染色体構造中の異常は、病気を結果しうる。主な染色体異常のいくつかのタイプは、顕微鏡試験により検出されうる。ダウン症候群又は２１番染色体トリソミーは、ヒトが２１番染色体の３つのコピーを有するときに起こる一般的な疾患である。

ミトコンドリアの遺伝病は、遺伝病の比較的稀なタイプである。このタイプの疾患は、ミトコンドリアの非染色体性ＤＮＡ中の変異により引き起こされる。夫々のミトコンドリアは、５〜１０のＤＮＡの環状片を含有しうる。染色体及びミトコンドリアの遺伝病は、単一遺伝子性の病気又は多遺伝子性の病気でありうる。

変異が生じた遺伝子の同定は、特異的な治療を開発するための機会を与える。種々の遺伝病に関係する遺伝子の同定への研究が、過去２０年間、猛烈であった。ヒトＤＮＡの事実上全ての遺伝子を同定したヒトゲノムプロジェクトは、このタイプの研究の前進において重要な役割を有した。遺伝病の多くは、重要な遺伝子における欠陥により引き起こされる。しばしば、該欠陥は、冒された遺伝子の産物の機能の量が無いこと又は減少することを結果する。そのような遺伝子の欠陥の基礎を成す理由の分子の知見を利用する治療は典型的には、冒された細胞に（部分的に）機能的な遺伝子産物を与えることを目的とする。本発明において、冒された遺伝子以外の遺伝子が該個体の細胞中で制限解除されうること及び該制限解除が病気の重症度及び／又は症状を増加させうることが発見された。驚くべきことに、この制限解除（異常発現）は、遺伝子の欠陥の基礎をなす変異により冒された遺伝子が、異常発現遺伝子（aberrantly expressed gene）の発現に直接的に関与しないときでさえ又は遺伝子の欠陥により冒されたタンパク質の機能に遺伝子の異常発現が直接的に関係しないときでさえ発見された。本発明の１つの目的はそれ故に、該異常発現遺伝子の発現を調節することにより、該患者の該遺伝子欠陥の、二次的な、潜在的に病気を悪化させる効果の少なくとも１つを修正することである。このように、遺伝病にとっての原因となる因子として同定されうる変異した遺伝子に加えて、異常に発現される他の遺伝子があると考えられるが、それら遺伝子は該変異した遺伝子又はその正常なカウンターパートにより直接的に影響されないと思われる。

本発明は、該異常発現遺伝子のいくつかを同定する。制限解除された遺伝子（異常発現遺伝子）の発現は、健康な個体中の正常な状況と異なる。そのような制限解除された発現、異常発現は望ましくない。本観察は、分化した細胞における欠陥により引き起こされる遺伝病においてもなされる。変異（遺伝子の欠陥にとっての原因）により冒された遺伝子が該前駆体細胞中で正常に発現されないときでさえ、該分化した細胞の前駆体中においてすでに遺伝子は制限解除されうることが発見された。言い換えると、該異常発現遺伝子は、該遺伝病の表現型を表すと一般に考えられる分化した細胞以外の細胞において発見される。本発明は、特には該個体の分化した細胞における遺伝子産物の機能の（部分的な）欠如又は遺伝子産物の不在により引き起こされる遺伝病に関する、遺伝病の処置のための新たな洞察を提供する。本発明において、該異常発現遺伝子の発現が、該分化した細胞の前駆体細胞の培養物において又は直接に患者において、修正される。該前駆体細胞培養物で適用されたときに、該前駆体細胞の患者への移植後にそれは、該前駆体細胞の新たな分化した細胞を作る能力を高め、それにより該細胞移植治療の成功を改善する。患者に直接に適用されたときに、本発明は、個体の遺伝病の悪化する症状を緩和する方法を提供し、ここで該症状は好ましくは該前駆体細胞の該分化した細胞へ分化する能力の減少であり、ここで該病は該個体の分化した細胞の正常に働かない遺伝子の結果であり、該方法は該前駆体細胞における少なくとも１の異常発現遺伝子の発現を修正することを含み、該異常発現遺伝子は該正常に働かない遺伝子でない。該正常に働かない遺伝子及びその欠陥により引き起こされる直接の影響は典型的には、第１の影響といわれ、一方で該遺伝子欠陥を含む細胞の故障の結果として次に起こる間接的な影響が、しばしば第２の影響といわれる。これらの第２の影響は典型的には、遺伝子の故障の直接の結果でない。

本発明はさらに、個体の遺伝病の症状を緩和するための医薬の製造の為に、少なくとも１の遺伝子の発現を修正する化合物を使用する方法を提供し、ここで該病は該個体の分化した細胞中の遺伝子の欠陥の結果であり、該遺伝子は該分化した細胞の前駆体において異常に発現され且つ該異常発現は該遺伝子の欠陥の基礎をなす変異（正常に働かない遺伝子）に直接的に関係しない。

遺伝子の欠陥は典型的に、遺伝子の機能又はその産物の機能の少なくとも一部に影響する。これは、多くのさまざまな変異により引き起こされうる。例えば、変異は遺伝子のコード領域中にあり得て、それにより、欠陥のあるタンパク質／ＲＮＡの産生を結果する。他方で、変異は、遺伝子産物の発現を支配する調節配列の１以上においてもありうる。そのような変異は、該遺伝子の遺伝子産物の（一部の）機能の欠損を結果しうる。なぜなら、細胞中の遺伝子産物の水準又は細胞中の発現の時期が変化されるからである。変異のタイプもまたさまざまでありうる。変異は例えば、欠失、挿入、逆位又は点変異でありうる。また、いわゆるサイレント変異である変異もあり、すなわち個体の健康に有意に影響しないものである。そのような変異の例は、コードする能力の重複の故に、タンパク質に組み込まれるアミノ酸を変えない、コドン中の点変異である。サイレント変異は、本発明の範囲内でないことが明らかであろう。本発明において用いられるときに、遺伝病の原因としての、変異した遺伝子は、非サイレント変異を有する遺伝子である。

体細胞は典型的には、限定された寿命を有する。これらの細胞の多くは、いわゆる前駆体細胞により補充される。例えば、死んだ皮膚細胞は連続的に、前駆体（幹）細胞から補充される。腸の内側の細胞は同様に、いわゆる幹細胞により補充される。筋細胞は典型的には、筋芽細胞と呼ばれる前駆体細胞との融合により産生（再生）される；血液細胞は究極的には個体の骨髄に由来する前駆体細胞により補充される。再生は、分化と呼ばれる過程において前駆体細胞がその原始的状態をあきらめる時にだけ起こりうる。前駆体細胞それ自身も限定された寿命及び／又は活性を有し、もしその場合はそれらは、より長い寿命及び／又はより大きな再生能力を有する他の前駆体細胞により置き換えられる。限定された寿命と限定された自己再生能力を有する終末細胞は、分化した細胞といわれ、他方該前駆体はしばしば、自己再生の為のより大きな能力を有し、分化していない細胞と呼ばれる。この後者はしばしば、分化した細胞が前駆体により示されない機能を示すという事実に起因する。好ましい実施態様において、該前駆体細胞は、筋芽細胞及び／又はその前駆体である。好ましい実施態様において、該分化した細胞は筋細胞である。遺伝病を有する個体は多くの症状を示しうる。病気の症状の緩和へ言及がなされたとき、症状の重症度が少なくとも減少されることが意味される。筋消耗の場合、例えば、病気の症状はとりわけ、年齢に伴う筋力の減少、年齢に伴う筋肉量の減少、限定された寿命及び年齢に伴う生活の質の減少（例えば歩行不能、介護への依存及び投薬）を包含する。筋消耗の例において、症状の緩和は一般に、処置の不在において、処置された個体が有するであろうと同じ予後を有する処置されていない個体と比較したときに、筋力、寿命を改善すること及び／又は生活の質を改善することであり得る。

該遺伝病を患う個体において異常発現遺伝子は、健康な個体において生理学的に発現されるのと同じ遺伝子と比べて低すぎて又は高すぎて発現されうる。本発明に従う方法又は使用方法において発現を修正することは、正常な状態における該遺伝子より低く発現されたときに該異常発現遺伝子の発現を上昇させること又は該正常な状態における該遺伝子より高く発現されたときに該異常発現遺伝子の発現を低めることを含む。低すぎて発現されたときに発現を上昇させること又は高すぎて発現されたときに発現を低下させることは、根本の遺伝子欠陥に続発する変化を修正し、そして、遺伝病の症状を緩和する。そうすることにおいて、該異常発現遺伝子の発現は、生理学的により許容でき、より妥当であり及び／又はより典型的な水準にもたらされる。本発明の好ましい実施態様において、該異常に発現された遺伝子の発現は本質的に正常化される。生理学的に許容でき、より妥当であり及び／又はより典型的な水準は、しばしば、おおよそ正常な水準である水準であろう。正常な水準は、同じ年齢及び体格の健康な個体において見られる水準である。生理学的に許容でき、より妥当であり及び／又はより典型的な水準は、正常な範囲外でありうるが、個体にとって十分な機能をなお提供する。好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該発現を修正することは、正常状態の水準に近づけることを含む。

発現を修正することは、多くの様式で達成されうる。異常発現遺伝子の発現を低めることは、例えば、アンチセンス治療を適用することにより又は該異常発現遺伝子のプロモーターと結合するリプレッサータンパク質を投与することにより実現されうる。例えば、異常発現遺伝子を発現する導入遺伝子の追加により、該異常発現遺伝子の発現を刺激する転写因子の追加及び／又は活性化により、及び／又は該異常発現遺伝子のプロモーター配列及び／又はエンハンサー配列を活性化することにより、該異常発現遺伝子の発現を上昇させることは影響される。本発明の好ましい実施態様において、発現は、該異常発現遺伝子のアンチセンス配列を該個体に与えることにより修正される。現在、遺伝子産物の産生を下方制御する為の多くの種々のアンチセンスアプローチがある。アンチセンス技術は、ワトソン−クリックハイブリッド形成を通じた、標的ＲＮＡへ結合する為のオリゴヌクレオチド類似体を利用する。一旦結合すると、該アンチセンス剤は、標的ＲＮＡの分解を無能にし又は誘発する。アンチセンス剤は、スプライシングも変化させうる。過去２０年間に、アンチセンスの基本的機構、アンチセンス分子の医薬品化学、及び薬理学、薬物動態学的、及び毒物学的特性についてたくさんの研究がされている。アンチセンス技術は、遺伝子機能付与及び標的確認において価値があることが分かった。市販されている１の薬剤であるＶｉｔｒｏｖｅｎｅ及び約２０の臨床開発中のアンチセンス薬剤により、アンチセンス薬剤は、広い範囲の病気の処置において重要な薬剤である（概説について[１]を参照されたい）。より新しいアンチセンスアプローチのいくつかの非限定的な例は、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡi）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び、エキソンスキッピングのようなスプライス干渉技術である。アンチセンス配列は好ましくは、１本鎖分子として又はヘアピン分子の一部として投与される。アンチセンス配列は、直接に投与されてよく、又は（ウィルス的に形質導入された）発現カセットにより細胞中で産生されてよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、遺伝子送達媒体の一部として細胞へ与えられる。そのような媒体は好ましくはリポソーム又はウィルス遺伝子送達媒体である。リポソームは当技術分野でよく知られており、そして多くの変型が遺伝子移動目的の為に利用可能である。種々のウィルス遺伝子送達が現在、標的細胞中に遺伝子を運ぶ為に用いられる。本発明において、ウィルスベクター自身の遺伝子を発現しないが、移された遺伝子だけ発現するそれらウィルスベクターを使用することが好ましい。アンチセンス分子は、遺伝子送達媒体中にあるようなものとして存在しうる。ウィルスベクター中において、アンチセンス分子は好ましくは発現カセットとして与えられ、ここで該発現カセットは該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする。好ましいウィルス性送達媒体は、アデノウィルスベクターであり、より好ましくはアデノ随伴ウィルスベクターである。このように、本発明は、そのような発現カセット、ベクター及び遺伝子送達媒体も提供する。適当な転写物を設計することは、当業者の技術の範囲内である。ＰｏｌＩＩＩ駆動転写物が本発明にとって好ましく、好ましくはＵ１又はＵ７転写物との融合転写物の形である。そのような融合は参考文献[２〜４]に記載されたとおりに産生されうる。本発明において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドのポリマーである（典型的には５〜３００ヌクレオチド）。オリゴヌクレオチドは、インビトロ又はインビボで合成されうる。後者の文脈において、それらは時々アンチセンス分子／配列、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び同様物ともいわれる。

好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは５〜３００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜４０ヌクレオチド及びより好ましくは１５〜２５ヌクレオチドを含む。該オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物の相補性の領域についての該長さが好ましい。１５〜４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、該オリゴヌクレオチド又は機能的等価物に相補的である領域との１又は２のミスマッチを有しうる。該１又は２のミスマッチの場合、相補性領域は好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドの連続する長さを含む。すなわち、１５の任意の長さに相補的であるオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、１又は２のミスマッチを有しうる。好ましくは、該オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、それが相補的な領域と１異常のミスマッチを有し、好ましくはミスマッチを有さない。もしオリゴヌクレオチドが１５ヌクレオチド超を有するならば、それは最大で１５％のミスマッチ有しうる。もし百分率のルールに基づき計算されたミスマッチの数が２つの整数の間の数字ならば、最大の許容されるミスマッチの数は、より高い整数である。例えば、１６ヌクレオチド相補性の連続する長さを有するオリゴヌクレオチドは、１６×０．１５＝２．４ヌクレオチドミスマッチを有しうる。すなわちこのオリゴヌクレオチド中に許容されるミスマッチの最大の数は３である。好ましい実施態様において、産生されるオリゴヌクレオチドは、１５〜５０ヌクレオチドの連続する一部と相補し、そしてより好ましくは該オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含みそしてさらにより好ましくは該オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり且つ完全長ホスホロチオエート骨格を有する。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、良いハイブリダイゼーション特性により特徴付けられる核酸類似体であり、該特性は、相補的なＤＮＡ又はＲＮＡと一緒にでも同様に、天然の核酸と比較して酵素分解に対する増加した安定性を授ける。現在臨床開発中の多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート骨格修飾を組み込み、ヌクレアーゼへの抵抗性を増進する一方で、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）ＨによるｍＲＮＡ標的の開裂を刺激する為の能力を保存する。相補的オリゴヌクレオチドは好ましくは、該エキソンＲＮＡの１３〜５０ヌクレオチドの連続する一部と相補的である。他の実施態様において、相補性オリゴヌクレオチドは、該エキソンＲＮＡの１６〜５０ヌクレオチドの連続する一部と相補的である。好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、該エキソンＲＮＡの１３〜２５ヌクレオチド、好ましくは該エキソンＲＮＡの１４〜２５ヌクレオチドの連続する一部と相補的である。核酸の種々のタイプが、オリゴヌクレオチドを産生する為に用いられうる。好ましくは、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはとても安定であるので、該オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む。エキソンスキッピング技術の目的の１つは、対象においてスプライシングを指示することであるので、該オリゴヌクレオチドＲＮＡが、追加の特性、例えばエンドヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨに対する抵抗性、追加のハイブリダイゼーション強度、（例えば体液中での）増加した安定性、増加した又は減少した柔軟性、減少した毒性、増加した細胞内輸送、組織特異性等、該ＲＮＡに備える修飾を含むことが好ましい。好ましくは、該修飾は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド修飾を含む。好ましくは、該修飾は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド修飾、ロックされた核酸、ＰＮＡ又はモルホリノ修飾又はそれらの組み合わせを含む。１の実施態様において、本発明は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾を含むオリゴヌクレオチド及びロックされた核酸を含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを提供する。この特定の組み合わせは、ロックされた核酸からなる等価物と比較したときにより良い配列特異性を含み、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエート オリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾からなるオリゴヌクレオチドと比較したときに、改善された有効性を含む。核酸を模倣する技術の出現により同様のハイブリダイゼーション特徴を有する、好ましくは核酸それ自身と種類において同じだが量において必ずしも同じでないハイブリダイゼーション特徴を有する分子を産生することが可能となった。そのような等価物はもちろん、本発明の一部でもある。そのような模倣等価物の例は、ペプチド核酸、ロックされた核酸及び／又はモルホリノホスホロジアミデートである。適当だが限定されない、本発明のオリゴヌクレオチドの等価物の例が、（Wahlestedt, C. et al. (2000), Elayadi, A.N. & Corey, D.R. (2001), Larsen, H.J., Bentin, T. & Nielsen, P.E. (1999), Braasch, D.A. & Corey, D.R. (2002), Summerton, J. & Weller, D. (1997)中に見られる。１以上の等価物の夫々の間でのハイブリッド及び／又は１以上の等価物と核酸とのハイブリッドは、もちろん本発明の一部である。好ましい実施態様において、等価物はロックされた核酸（locked nucleic acid）を含み、なぜならロックされた核酸はより高い標的親和性及び減少された毒性を示し、そしてそれ故にエキソンスキッピングのより高い効率を示すからである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１以上のヌクレオチド類似体を含みうる。新たなヌクレオチド類似体が、ウィルス感染に対する処置の為の方法として、現在開発されている。もっとも、これらのヌクレオチド類似体は典型的には、それらが置換するヌクレオチドと同様の結合性特徴を必ずしも有さない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのようなヌクレオチドアナログを組み込みうる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、２０％超のそのようなヌクレオチドアナログを含まない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、１０％超のそのようなヌクレオチドアナログを含まない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、３超のそのようなヌクレオチドアナログを含まない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、１超のそのようなヌクレオチドアナログを含まない。オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物はさらに、得られた分子にさらなる機能を与える追加の実体を含みうる。蛍光タグ又は、ＣｐＧアイランドのような免疫調節性化合物が、該オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物に付加されうる。

アンチセンス配列は、インビボ又はエクスビボで、すなわち前駆体細胞へと、送達されうる（アンチセンスは、内因性前駆体細胞へインビボで送達されもしうるので、私はこれを言わないだろう；代わりに：）。好ましい実施態様において、アンチセンス配列を含む前駆体細胞は、細胞移植治療の為に用いられる。好ましい実施態様において、該化合物は、アンチセンス分子又はその機能的等価物を含む。本発明のアンチセンス分子の機能的等価物は、該アンチセンス分子と、種類において同じだが、量において必ずしも同じでない発現抑制性効果を有する。アンチセンス分子又はその機能的等価物は、種々のやり方で設計されうる。[１]及びその中の参考文献に、アンチセンス分子の設計についての詳細について言及されている。この参考文献及びその中の参考文献はそれ故に、引用することにより本明細書に組み込まれる。異常発現遺伝子の発現を低めること又は下方制御することは、典型的には、該細胞中で該遺伝子によりコードされた遺伝子産物の減少された水準を結果する。該遺伝子産物は好ましくは、該遺伝子により作成されるＲＮＡであり、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡである。

他の好ましい実施態様において、該化合物は、該異常発現遺伝子の機能を抑制し及び／又は拮抗することができるタンパク質を含む。好ましい実施態様において、該化合物は、ノギン又は、その機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体を含む。ノギンは、ＢＭＰ−４の機能を抑制し及び／又は拮抗することができる[５]。ＢＭＰ−４アンタゴニストは、ＢＭＰ−４の機能を抑制する。本発明の他のＢＭＰ−４インヒビター／アンタゴニストは、コーディン、ベントロプティン（ｖｅｎｔｒｏｐｔｉｎ）、ねじれ嚢胚形成（ｔｗｉｓｔｅｄ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）、グレムリン又はＢＭＰ４アンタゴニストのＤＡＮファミリーの他のメンバー、ＰＲＤＣ、スクレロスチン、ＣＴＧＦ及びフォリスタチンである。すなわち、好ましい実施態様において、本発明は、個体の遺伝性筋ジストロフィーの症状を緩和する為の医薬の製造の為に、（細胞中のＢＭＰ４の発現を拮抗する為の）ＢＭＰ−４アンタゴニストを使用する方法を提供する。好ましくは、該アンタゴニストは、ノギン、コーディン、ベントロプティン（ｖｅｎｔｒｏｐｔｉｎ）、ねじれ嚢胚形成（ｔｗｉｓｔｅｄ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）、グレムリン又はＢＭＰ４アンタゴニストのＤＡＮファミリーの他のメンバー、ＰＲＤＣ、スクレロスチン、ＣＴＧＦ及び／又はフォリスタチン、又は該タンパク質の機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体を含む。該アンタゴニストは、タンパク質として又は、細胞中での該アンタゴニストの発現の為の発現カセットを含む核酸として与えられうる。この後者の実施態様において、本発明の化合物は好ましくは、細胞中での該アンタゴニストの発現の為の該発現カセットを含む。さらに、筋芽細胞の分化を刺激する方法であって、該筋芽細胞にＢＭＰ−４アンタゴニストを備えること及び／又はＢＭＰ−４アンタゴニストを接触させることを含む上記方法が提供される。さらに、筋芽細胞の分化を刺激する方法であって、該細胞中の該アンタゴニストの発現の為の発現カセットを含む核酸を該筋芽細胞に備えることを含む上記方法が提供される。そのような発現カセットを隣接する細胞に備えることは、付近の筋芽細胞に該ＢＭＰ−４アンタゴニスト、すなわち該タンパク質を備えること及び／又は接触させることになると考えられる。好ましい実施態様において、該隣接する細胞は筋細胞である。

細胞中で（異常発現）遺伝子の発現を増加する為の多くの方法がある。非限定的な例は、該遺伝子のコード配列を含む発現コンストラクトの導入であり、これにより、該細胞中で、内在的に存在する遺伝子の発現及び該遺伝子の類似体、誘導体及び／又は部分の発現を活性化し又は刺激する転写因子を発現する。該細胞中に、該遺伝子によりコードされるタンパク質又はＲＮＡを直接に導入することも可能である。これらの方法はまとめて、本明細書において、遺伝子治療といわれる。１つの実施態様において、それ故に、本発明は方法又は使用方法を提供し、ここで該発現を修正することは遺伝子治療を含む。該遺伝子治療は、エクスビボでの方法又はインビボでの方法で実行されうる。細胞中の遺伝子産物の発現を増加することは好ましくは、該細胞における遺伝子産物の増加された水準を結果する。出発水準は検出不可能でありうる。

筋疾患は、通常は個体の生命に重大な影響を有する病気である。筋疾患の結果を緩和する為に取られうるいずれの手段も、それ故に、該筋疾患を有する個体の為の救済を意味しうるだろう。分化した筋細胞は、筋芽細胞前駆体細胞を経て補充され及び／又は再生されるので、本発明は特に、筋疾患の処置にとって適当である。本発明は、本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該遺伝病を患う該個体により示される症状の少なくとも一部は、健康な個体と比較したときに、該筋疾患を有する個体の分化した筋細胞の機能障害に加えて、筋肉の前駆細胞の異常な分化に起因する。筋疾患は、遺伝性の原因又は非遺伝性の原因を有しうる。遺伝性の原因による病気の好ましい例は、遺伝性筋ジストロフィーである。

遺伝性筋ジストロフィーは、進行性の筋消耗又は筋力低下により特徴付けられる遺伝性疾患の一群を構成する。これらの疾患の多くは、筋肉タンパク質に関する遺伝子における欠陥により引き起こされる。遺伝性筋ジストロフィーの種々の形はしばしば、関連するタンパク質（群）において異なる。これらの疾患における冒された遺伝子の多くは、筋線維の構造を支持する役割を果たすと思われるタンパク質をコードし、あるいはいくつかのタンパク質は、筋線維において生じる生化学的過程に関係しうる。本発明は、本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該遺伝病は、遺伝性筋ジストロフィーを含む。筋ジストロフィーは、病気の家族歴が存在しない場合にもあるが、一般的には遺伝する。遺伝性筋ジストロフィーの種々の形の臨床的所見は、とりわけ、最初にそして最もしばしば冒される筋肉において、症状が進行する速さにおいて及び発症年齢において、さまざまに変化する。

遺伝性筋ジストロフィー群及びそれらの間の差異の診断の為に利用可能である複数の診断方法がある。いくつかの方法の組み合わせが、最もしばしば、診断をする為に用いられる。診断は通常は、患者の病歴の評価及び健康診断により始まる。利用可能な診断試験の例は、血液酵素試験（例えばクレアチンキナーゼについて、ＣＫ）、筋肉の組織学の評価、ＤＮＡ試験、磁気共鳴（ＭＲ）、筋電図（ＥＭＧ）及び神経伝道速度検査（ＮＣＶ）である。本発明は、本発明に従う使用方法又は方法を開示し、ここで該遺伝性筋ジストロフィーは、以下の疾患の１つである：ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）。上記の遺伝性筋ジストロフィーの原因の簡潔な説明が、以下に与えられる。
ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋細胞の完全な状態を維持するのを助けるタンパク質である機能的ジストロフィンの不十分な産生。
先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、筋肉にとって、及び時々目及び／又は脳にとって必要ないくつかのタンパク質に影響する遺伝子変異。
遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、筋肉の機能に必要なタンパク質に影響する少なくとも７の遺伝子のいずれかにおける変異。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋細胞の完全な状態を維持するのを助けるタンパク質であるジストロフィンの欠如。
エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、夫々の筋細胞の核を囲む膜中のタンパク質であるエメリン、ラミンＡ又はラミンＣを産生する遺伝子における変異。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、４番染色体上のＤＮＡの欠落部分。
肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋肉の機能に必要なタンパク質に影響する少なくとも１５の異なる遺伝子のいずれかにおける変異。
筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）、１９番染色体又は３番染色体上のＤＮＡの繰り返し部分。
眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、ポリ（Ａ）−結合性タンパク質１（ＰＡＢＰＮ１）に関する欠陥遺伝子、これは筋細胞の核中のＲＮＡ及びタンパク質の凝集が疑われる。

デュシェンヌ型及びベッカー型の筋ジストロフィーの両方において、筋肉タンパク質ジストロフィンが影響される。デュシェンヌ型において、ジストロフィンが欠如し、一方でベッカー型において、いくつかのジストロフィンが存在するが、その産生はほとんどの場合十分でなく及び／又は存在するジストロフィンが異常に形成される。両方の病気は、劣性Ｘ連鎖遺伝に関係する。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子中のフレームシフト変異から生じる[６；７]。ＤＭＤ遺伝子中の該フレームシフトは、切断された機能的でないジストロフィンタンパク質の産生を結果する[８]。ＢＭＤは、ＤＭＤ遺伝子中の複数の変異の結果として起こる。ジストロフィンが欠如するデュシェンヌ型と比較して、ベッカー型ではいくつかのジストロフィンが存在するので、ベッカー型はデュシェンヌ型よりも重度でない症状を有する。ＤＭＤの発病は、ＢＭＤよりも早い。ＤＭＤは通常、小児期早期にそれ自身を顕在化し、ＢＭＤは１０代又は成人早期に顕在化する。ベッカー型の進行は、デュシェンヌ型よりもゆっくりであり、そしてより予測可能でない。ＢＭＤを有する患者は、中期から後期の成人期の間へ生き抜くことができる。デュシェンヌ型を有する患者は、３０代を超えて生き抜くことはめったにない。

ジストロフィンは、細胞外マトリックス及び細胞骨格を結合する筋線維において重要な構造的役割を果たす。Ｎ−末端領域は、アクチンに結合し、他方でＣ−末端は、ジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の一部であり、これは筋細胞膜に架かる[９]。ジストロフィンの欠如において、機械的な負荷は、筋細胞膜の破壊をもたらし、筋線維内部へのカルシウムの制御されない流入を引き起こし、それによってカルシウムにより活性化されたプロテアーゼ及び線維壊死を誘発する[１０]。

分化した細胞の前駆体は、それを特定の機能を有する細胞へと分化させる特定の特徴を有する。これらの特定の特徴は、細胞の分化の制御に関係する遺伝子のカテゴリーの存在及び活性化状態を含む。本発明において、前駆体細胞において異常に発現されたときに、特に制御する遺伝子が、遺伝子欠陥の症状を増加すことが発見された。好ましい実施態様において、該異常発現遺伝子は、骨形成タンパク質４（Bone Morphogenetic Protein 4）（ＢＭＰ４）を含む。骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein）（ＢＭＰ）は、タンパク質の形質転換成長因子−βスーパーファミリーのメンバーである制御因子である。それらは、タンパク質分解酵素により開裂される大きな前駆体分子として合成される。その活性型は、２つの同一のタンパク質の二量体からなりうるか又は２つの関連する骨形成タンパク質のヘテロ二量体からなりうる。骨形成タンパク質群は、広くさまざまな細胞プロセスに関係する[１２]。ＢＭＰは、筋芽細胞を含む或る細胞タイプの分化に関係する。１つの好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該形質転換成長因子−βは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体であり、好ましくはＢＭＰ４又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体である。

他の局面において、本発明は、本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該異常発現遺伝子は、該分化した細胞への該前駆体細胞の分化における制御因子である。制御因子は、単独で又は他の制御因子と一緒に、分化した細胞への前駆体細胞の分化における少なくとも１の段階を制御する因子である。該分化における該少なくとも１の段階の制御は、刺激性又は抑制性でありうる。該制御因子は、シグナル伝達カスケードの一部であることによりこの制御を実現する。該制御因子は好ましくは、該シグナル伝達カスケードの始まりに置かれて、例えば該カスケードが置かれる細胞の外側から来る、シグナルを受ける。本発明の他の好ましい実施態様において、該制御因子は、該シグナル伝達カスケードの終わりに置かれて、該カスケードにより伝達されるシグナルに影響する。制御因子は例えば、成長因子又は転写因子である。

成長因子は、細胞の表面上の特異的な受容体に付く小さいタンパク質であり、そして、これらの細胞の増殖、成長、分化及び／又は成熟を促進する。成長因子の例は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）及び／又は線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）である。好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該制御因子は成長因子又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体、好ましくは線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）又はインスリン様成長因子結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ３）、ＢＭＰ４又はそれらの機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体を含む。線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）は、創傷治癒の過程における重要な役割を果たす一本鎖ポリペプチド成長因子であり、そして、血管新生の強力な誘導因子である。ヒトのタンパク質のいくつかの異なる形態が、ｆｇｆ−２遺伝子内の選択的な開始部位の使用により、サイズにおいて１８〜２４ｋＤａで存在する。それは、線維芽細胞成長因子１と５５％のアミノ酸残基同一性を有し、そして、強力なヘパリン結合性活性を有する。該成長因子は、中胚葉系統及び神経外胚葉系統由来のさまざまな細胞タイプにおけるＤＮＡ合成の非常に強力な誘導因子である。

インスリン様成長因子ＩＩは、増殖刺激性因子である。それは、肝臓により分泌され且つ血液中を循環すると考えられている、よく特徴づけされた中性のペプチドである。それは、成長調節活性、インスリン様活性及び分裂促進活性を有する。インスリン様成長因子結合性タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）は、インスリン様成長因子（ソマトメジン）に結合する６の相同な可溶性タンパク質の１つであり、そして、細胞レベルでそれらの分裂促進作用及び代謝作用を調節する。

形質転換成長因子（ＴＧＦ）は、天然に存在する多くの特徴付けされた成長因子の１つである。形質転換成長因子は、正常で、形質転換されていない細胞に加えられたときに、形質転換された表現型を誘起できる、ホルモン的に活性なポリペプチドである。それらの形質転換する活性は、２のほかの関連しない因子である、形質転換成長因子α及び形質転換成長因子βの同時の作用に起因する。好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該成長因子は、形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属するか又はそれらの機能的な部分、誘導体及び／若しくは類似体である。ＴＧＦβは、広くさまざまな組織で合成される因子である。それは、表現型の形質転換を誘起するときにＴＧＦ−αと相乗的に作用し、そして、負の自己分泌型成長因子としても作用できる。ＴＧＦ−βは、胚発生、細胞分化、ホルモン分泌及び免疫機能において役割を有する。ＴＧＦ−βは大抵、別個の遺伝子産物ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ−β３のホモ二量体型として発見される。ＴＧＦ−β１と２から成るヘテロ二量体（ＴＧＦ−β１．２）又はＴＧＦ−β２と３から成るヘテロ二量体（ＴＧＦ−β２．３）が単離されている。ＴＧＦ−βタンパク質は、前駆体タンパク質として合成される。形質転換成長因子αは、上皮を含むさまざまな組織及び子宮脱落膜において単離された因子である。それは、上皮成長因子と近縁であり、そして、ＥＧＦ受容体に結合する。ＴＧＦ−αは、表現型の形質転換を誘起することにおいて、ＴＧＦ−βと一緒に相乗的に作用するが、その生理学的な役割は知られていない。

ミオスタチン（成長及び分化因子８としても知られる）は筋肉組織の成長を制限する成長因子であり、すなわち、より高い濃度のミオスタチンは、個体が、より発達していない筋肉を有することを引き起こす。ミオスタチンタンパク質は、筋細胞において産生され、血液中を循環し、そして、筋肉の幹細胞の発達を遅らせることにより明らかに、筋肉組織に対して作用する[１１]。ミオスタチンは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質のメンバーである。好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従う使用方法及び方法を提供し、ここで該制御因子は、ミオスタチンを含む。

細胞分化を制御する機構は、転写因子にも関係する。１つの実施態様において、本発明は本発明に従う使用方法及び方法を提供し、ここで該制御因子は転写因子を含む。転写因子は、遺伝子の転写を開始するのに必要とされるタンパク質である。転写因子は、組織特異的であってよく、これは、それらの因子が、１又はいくつかの特異的な遺伝子（群）の転写において機能を有するだけであることを意味する。代わりに、転写因子は普遍的であってよく、多くの種々の遺伝子の転写の開始に関与する。

特に好ましい実施態様において、本発明の方法又は使用方法は、遺伝子の欠陥の為の他の処置と組み合わされる。第１の例として、分化した細胞における、欠如した遺伝子産物又は機能異常の遺伝子産物の結果である遺伝子の欠陥において、本発明の方法又は使用方法は好ましくは、該分化した細胞における、欠如した遺伝子産物又は機能異常の遺伝子産物の発現を高める方法と組み合わされる。すなわち、本発明はさらに、本発明に従う使用方法又は方法であって、さらに該変異した遺伝子の正常な機能の少なくとも一部を該分化した細胞に与える為の医薬を該個体に与えることを含む上記使用方法又は方法を提供する。第２の例として、分化した細胞における、欠如した遺伝子産物又は機能異常の遺伝子産物の結果である遺伝子の欠陥において、本発明の方法又は使用方法は好ましくは、新しく且つ機能的な分化した細胞を産生するために、該分化した細胞の為の前駆体細胞の該患者への移植を用いる方法と組み合わされる。該前駆体細胞は、健康なドナーに由来してよいが、その場合、拒絶のリスクが高い[１３]。それ故に、該患者に由来する前駆体細胞が好ましい。該前駆体細胞は、該変異により冒された該遺伝子の機能的なコピーを発現する為に、エクスビボで遺伝学的に変化される。本発明は、該遺伝子変異に続発する該前駆体細胞における他の欠陥を修正する為の方法を提供し、且つインビボでの該前駆体細胞の分化能を高める。

さらなる実施態様において、本発明は本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該異常発現遺伝子は、遺伝子欠陥を患う個体の該前駆体細胞の発現プロファイルを、健康な個体の対応する前駆体細胞と比較することにより同定される。遺伝子は、それが該健康な個体における該対応する前駆体細胞と比較して少なくとも２倍異なって発現されるときに、異常に発現されるといわれる。

本発明の実施例において、初代のヒト筋芽細胞培養物を用いるラージスケール遺伝子発現の時間的経過の研究が実施され、ここで、ＤＭＤ細胞中の筋形成及びジストロフィンの欠如への分化する細胞の第１の反応が監視される。結果は、筋形成における種々の段階の明白なフェージング（phasing）を示す。筋芽細胞段階ですでに違いが現れ、そして、健康な培養物及びＤＭＤ培養物において同時に分化が開始すると思われるが、ＤＭＤ細胞がより効率的でなく分化することが示される。該病気の機構に関する経路を発見する為に、遺伝子発現プロファイリングを用いた研究が前に実施されている[１４〜１６]。しかしながら、これらの研究は、該前駆体細胞（筋芽細胞）レベルでの分子の違いを分析しなかったが、該分化した細胞（筋細胞）それ自身に対して全て焦点が当てられた。

本発明の好ましい実施例のように、健康細胞培養物及びＤＭＤ細胞培養物の間の遺伝子発現における有意な差異が観察された。この観察は予期されなかったであろう。なぜなら、完全長ジストロフィンは筋芽細胞中でまだ発現されず且つＤｐ７１筋芽細胞発現は、変異が翻訳開始部位の上流に置かれるので該変異により妨げられるべきだからである[１７]。異なって発現された遺伝子の１つである線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）は、ＤＭＤ筋芽細胞において有意により低く発現される。インビトロ及びインビボでの研究は、衛星細胞の増殖への補充（recruitment）におけるＦＧＦ２についての重要な役割を示した。組み換えＦＧＦ２の添加は、増殖する筋芽細胞の数を２倍だけ高め、そして、分化の開始を抑制しなかった[１８〜２０]。加えて、Doukasらは、ＦＧＦ２及びＦＧＦ６遺伝子の標的とした導入遺伝子送達が、骨格筋の修復の増強をもたらしたことを示し、これは再生におけるＦＧＦ遺伝子の重要性を示す[２１]。これらの観察は、本発明の実施例において観察されるより低いＤＭＤ筋芽細胞ＦＧＦ２発現が、以前に報告された、ＤＭＤ培養物における減少した筋芽細胞増殖を説明しうることを示唆する[２２〜２４]。

ＤＭＤ細胞培養物において、増殖能はおそらく減少されそして分化は抑制されるが、本発明の実施例の結果は、種々の過程の時期が類似であることを示唆する。増殖に関与する遺伝子は、健康な細胞培養物及びＤＭＤ細胞培養物の両方において、融合誘起後に同時に下方制御される（ＭＣＭ６、ＣＣＮＢ２、ＣＤＣ２８、ＣＫＳ２及びＲＰＡ３、図５、群「細胞増殖及び維持」）。しかしながら、筋管への筋芽細胞の実際の融合過程の間、遺伝子発現の違いが、健康な細胞培養物及びＤＭＤ細胞培養物の間で現れ、やはりＤＭＤ細胞の損なわれた融合能を指す。本発明の実施例において、健康な筋芽細胞の融合に関与するがＤＭＤ筋芽細胞融合におそらく関与しない遺伝子が異常に発現されることが発見された。これらのうち、メンブレンメタロエンドペプチダーゼ（Membrane metallo-endopeptidase）（ＭＭＥ）及びアドリカン（Adlican）（ＤＫＦＺｐ５６４Ｉ１９２２）は、細胞接着及び細胞−細胞情報伝達に関与すると考えられ、これは、細胞融合にとって重要である[２５]。該遺伝子発現の研究において、ラミニンα２（ＬＡＭＡ２）は、ＤＭＤ細胞培養物中において連続的により低く発現され、それらをより低い接着能力にする。これは、Angoliらにより前に報告された、ラミニンα２依存の接着力の欠如を説明する[２６]。

驚くべきことに、両方ともに情報伝達に関与すると推測されるミトコンドリア腫瘍抑制因子１（ＭＴＵＳ１）及びエンドセリン受容体タイプＡ（ＥＤＮＲＡ）は、分化の開始のときに、ＤＭＤ細胞において上方制御されるだけである。これらの遺伝子はもしかすると、ジストロフィンの欠如に起因する代わりの情報伝達経路の一部である。

時間経過の研究において、初代ヒト筋芽細胞の分化及び筋管への融合は約４日かかる。この後、ほとんど発現の変化は視認されず、そして遺伝子は安定的に発現される[２７]。目立つ現象は、健康な細胞培養物及びＤＭＤ細胞培養物の両方において分化の開始後のサルコメアの遺伝子発現の上方制御、及び続く、ＤＭＤ筋管だけにおいて検出できる第６日で始まる有意な減少である。ジストロフィンの欠如は、サルコメアの不安定性を引き起こし、構造遺伝子の下方制御を開始する第２の応答を結果する。筋芽細胞分化の間に同時に上方制御又は下方制御されるタンパク質の他の機能的なクラスは、より遅い時点における違いを示さず、これは、この負のフィードバックがＤＭＤ培養物におけるサルコメアタンパク質の特有の特徴であることを示唆する。

２つの現在の有望な遺伝子治療は、micro−ＤＭＤ遺伝子のＡＡＶにより媒介される誘導によるか又は該遺伝子の読み枠を元に戻す為にエキソンをスキップすることによる、ＤＧＣ複合体におけるジストロフィンの再構築に基づく[２８〜３６]。本発明の実施例の結果は、これらの治療の有効性が、現在の予想を満たさないかもしれないことを示唆する。これまで、研究は、ジストロフィンタンパク質及びその局在に焦点を当てたが、治療後の筋肉の再生能力は明確に調べなかった。ジストロフィンの存在は、サルコメアの安定性を修正だけし、そして（一時的に）ただ緩和するが、再生情報伝達経路が回復されないので患者を治癒しない。この観点から、これらの変化が起こる前に、人生において早期に治療を開始することが必須であるだろう。あるいは、正常な筋肉の再生能を取り戻す為の追加の（医薬的）介入が実行されるべきである。本発明に従う使用方法又は方法は、有望な遺伝子治療と組合せて適用されうる。１つの実施態様において、本発明は本発明に従う使用方法又は方法を提供し、ここで該遺伝性筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）又はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。１つの好ましい実施態様において、本発明は本発明に従う使用方法又は方法であって、ジストロフィン遺伝子のエキソンをスキップすることを含む上記方法を提供する。本発明の実施例は、筋形成の間の健康な筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞の間の分子の違いを示す。ＤＭＤ筋芽細胞における、減少したＦＧＦ２水準及び高められたＢＭＰ４の発現は、増殖能力を減少し及びそれらをより分化する能力がないものとする。加えて、ＤＭＤ筋管におけるサルコメアタンパク質のより低い発現が観察される。ＤＭＤ筋管の減少した増殖、損なわれた融合、及び損なわれた維持のこの組合せは、無能な筋再生をもたらし、及びＤＭＤ患者の重度の表現型の一因となる。

エクスビボで展開された筋芽細胞のＤＭＤ患者への移植は、１つの選択肢であり且つ有望な治療である[３７]。少なくとも２つの選択肢がある。健康な対象からの筋芽細胞による処置又は自己の細胞の移植。第１の場合、免疫応答の誘導に起因する宿主による細胞の拒絶が主要な問題である[１３]。免疫適合的な供与体、好ましくは家族のメンバー[３７、３８]、又は免疫抑制剤[３９、４０]が、この免疫応答を制御する為に採用される。自己の細胞移植は、免疫系による拒絶の機会が減少されることの利点を有する。自己移植の前に、遺伝子欠陥は、機能的な導入遺伝子の導入[４１]により又はエキソンをスキップするアンチセンス配列を産生する発現カセットの導入[４]により修正される必要がある。本発明の実施例において、microＤＭＤ遺伝子が、組み換えＡＡＶを用いて導入される。１つの実施態様において、本発明は、自己の筋芽細胞におけるＢＭＰ４の発現を減少する為の及び患者における該自己の筋芽細胞の再生能力を高める為の、ＢＭＰ４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡの本発明に従う使用方法又は方法を提供する。

本発明はさらに、個体における遺伝病の症状を緩和する為の医薬の製造の為に、遺伝子の発現を修正する為の化合物の使用をする方法を提供し、ここで該病は、該個体の分化した細胞における遺伝子の欠陥の結果であり、該遺伝子は該分化した細胞の前駆体において異常に発現され、及び、該異常発現は、該遺伝子の欠陥の基礎をなす変異に直接に関係しない。好ましい実施態様において、該遺伝子の欠陥の基礎をなす該変異は、遺伝子に付随し、及び、該遺伝子（変異した遺伝子）からのタンパク質の合成が無いことの結果又は欠陥のあるタンパク質の合成の結果である。さらに好ましい実施態様において、該発現を修正することは、該異常発現遺伝子が該前駆体細胞において過剰発現されたときに発現を低めること及び該異常発現遺伝子が該前駆体細胞において低く発現されたときに発現を高めることを含む。好ましい実施態様において、該異常発現遺伝子は、該前駆体細胞の該分化した細胞への分化における制御因子である。好ましくは、該制御因子は、成長因子又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体を含む。好ましくは、該成長因子は、形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属し又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体である。好ましくは、形質転換成長因子−βスーパーファミリーに属する該成長因子は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体である。好ましくは、該制御因子は、該異常発現遺伝子の発現に影響する（転写）因子を含む。

本発明はさらに、筋芽細胞の分化を刺激する方法であって、該筋芽細胞において成長因子の発現を抑制する為の化合物を該筋芽細胞に備えることを含む上記方法を提供する。好ましくは、該抑制は、該筋芽細胞におけるＢＭＰ−４ｍＲＮＡ発現を抑制することを含む。好ましくは、該方法はさらに、該筋芽細胞と成熟筋細胞を接触させることを含む。好ましくは、該成熟筋細胞は、遺伝性筋ジストロフィーを患う対象に由来する。好ましくは、該接触することは、該筋芽細胞を該個体へ移植することによりなされる。好ましくは、該移植された筋芽細胞は、適合する供与体に由来する。好ましくは、該筋芽細胞は、自己の筋芽細胞である。好ましくは、該筋芽細胞におけるＢＭＰ−４ｍＲＮＡ発現を抑制することは、該筋芽細胞又はその前駆体に、該ＢＭＰ−４遺伝子に相補的なＢＭＰ−４オリゴヌクレオチド（アンチセンス）を与えることを含む。好ましくは、該筋芽細胞又はその前駆体は、該ＢＭＰ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドをインビトロで与えられる。本発明はさらに、ＢＭＰ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、筋芽細胞又はその前駆体のコレクションを提供する。

さらに、本発明の使用方法又は方法が提供され、ここで該前駆体は筋芽細胞又はその前駆体である。好ましくは、該発現は、ウィルス的に形質導入された（virally transduced）ＤＮＡ配列により抑制される。好ましくは、該遺伝病は、遺伝性筋ジストロフィーを含む。好ましくは、該遺伝性筋ジストロフィーは、以下の疾患の１を含む：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）。好ましくは、該化合物は、タンパク質インヒビターを含む。好ましくは該タンパク質インヒビターは、成長因子インヒビター又はアンタゴニスト、好ましくはＢＭＰ−４インヒビター又はアンタゴニストを含み、好ましくは該インヒビター又はアンタゴニストは、ノギン、コーディン、ベントロプティン（ｖｅｎｔｒｏｐｔｉｎ）、ねじれ嚢胚形成（ｔｗｉｓｔｅｄ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）、グレムリン又はＢＭＰ４アンタゴニストのＤＡＮファミリーの他のメンバー、ＰＲＤＣ、スクレロスチン、ＣＴＧＦ及び／又はフォリスタチン又は機能的部分、誘導体及び／又は類似体又はそれらの機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体である。

好ましくは、本発明の方法又は使用方法はさらに、該個体の処置の為の医薬の調製のための第２の化合物の使用を含み、ここで該第２の化合物は、該変異した遺伝子の正常な機能の少なくとも一部を該分化した細胞に備える。好ましくは、該遺伝性筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である。好ましくは、該第２の化合物は、ジストロフィン遺伝子のエキソンをスキップする為のオリゴヌクレオチド、又はその機能的等価物を含む。好ましくは、該第２の化合物は、ジストロフィン遺伝子のエキソンに相補的なオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を含む。

好ましい局面において、本発明は、個体における遺伝性筋ジストロフィーの症状を緩和する為の医薬の製造の為に、細胞における骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の発現を減少し、抑制し及び／又は拮抗する為の化合物の使用をする方法を提供する。好ましくは、該細胞は、筋芽細胞又はその前駆体である。好ましくは、該化合物は、アンチセンスＲＮＡ又はその機能的等価物を含む。

本発明はさらに、筋芽細胞の分化を刺激する方法であって、該筋芽細胞におけるＢＭＰ４の発現を減少し、抑制し及び／又は拮抗する為の化合物を該筋芽細胞に与えることを含む上記方法を提供する。好ましくは、該化合物は該筋芽細胞におけるＢＭＰ４ｍＲＮＡ発現を（減少し及び／又は抑制することができ、）減少し及び／又は抑制する。他の好ましい実施態様において、該化合物はＢＭＰ−４の機能を（拮抗することができ、）拮抗する。本発明に従う使用方法及び／又は方法はさらに、成熟筋細胞と該筋芽細胞を接触させることを含む。好ましい実施態様において、該成熟筋細胞は、該遺伝性筋ジストロフィーを患う対象に由来する。該筋芽細胞におけるＢＭＰ４ｍＲＮＡ発現を減少し及び／又は抑制する為の本発明の方法は、該筋芽細胞又はその前駆体に、該ＢＭＰ４遺伝子に相補的なＢＭＰ４オリゴヌクレオチド（アンチセンス）を与えることを含む。好ましくは、該筋芽細胞又はその前駆体は、該ＢＭＰ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドをインビトロで与えられる。

本発明はさらに、ＢＭＰ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、筋芽細胞又はその前駆体のコレクションを提供する。

ＢＭＰ４の発現を減少し及び／又は抑制することは好ましくは、ウィルス的に形質導入されたＤＮＡ配列により達成される。好ましくは該化合物は、ウィルス性ベクターにより該細胞に与えられる。好ましくは該遺伝性筋ジストロフィーは以下の疾患の１つを含む：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）。好ましくは、該化合物はタンパク質インヒビターを含む。好ましくは該化合物はＢＭＰ４インヒビター又はアンタゴニストを含む。好ましくは該インヒビター又はアンタゴニストは、ノギン、コーディン、ベントロプティン（ｖｅｎｔｒｏｐｔｉｎ）、ねじれ嚢胚形成（ｔｗｉｓｔｅｄ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）、グレムリン又はＢＭＰ４アンタゴニストのＤＡＮファミリーの他のメンバー、ＰＲＤＣ、スクレロスチン、ＣＴＧＦ及び／又はフォリスタチン又は機能的部分、誘導体及び／又は類似体又はそれらの機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体を含む。好ましくは、本発明の方法又は使用方法はさらに、該対象の処置の為の医薬の調製の為の第２の化合物の使用を含み、該第２の化合物は、該遺伝性筋ジストロフィーに関連する遺伝子（変異した遺伝子）の正常な機能の少なくとも一部を該対象の筋細胞に与える。好ましくは、該遺伝性筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である。好ましくは該第２の化合物は、ジストロフィン遺伝子のエキソンをスキップする為のオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を含む。

さらなる局面において、本発明は、ＢＭＰ４アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が、エキソンのスキップを該エキソンを有するＢＭＰ４前駆ｍＲＮＡにおいて誘発することができるかどうかを決定する方法であって、該ＢＭＰ４前駆ｍＲＮＡは該エキソンを含み、該方法は細胞発現において該ＢＭＰ４前駆ｍＲＮＡに該オリゴヌクレオチドを備えること及び該前駆ｍＲＮＡから産生される成熟ｍＲＮＡから該エキソンが欠如しているかどうかを決定することを含む上記方法を提供する。好ましくは、該ＢＭＰ４ｍＲＮＡにおけるエキソンのスキッピングは、機能的なＢＭＰ４タンパク質水準の産生水準を減少する。ＢＭＰ４及びＤＭＤにおけるエキソンスキッピングは異なる目的を有する：読み枠の破壊（又はアミノ酸の必須の伸張の排除；ＢＭＰ４）に対して読み枠の修正（ＤＭＤ）。オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、（該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物により標的とされる）該エキソンに隣接するエキソン中のプライマーによる核酸増幅反応（好ましくはポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）によりインビトロで測定されるときに、もし該方法における該前駆ｍＲＮＡのスプライシングから生じるｍＲＮＡの５％超、好ましくは１０％超が該エキソンを含まなければ、該エキソンのスキップを誘発することにおいて有効であるといわれる。好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、該エキソンと相補的である。好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、該エキソンと相補的である。特に好ましい実施態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、該エキソンのエキソン内部部分と相補的である。該エキソンのエキソン内部部分は、本明細書において、該エキソンと相補的であり且つ該エキソンに直に隣接するイントロン配列を含まない部分として定義される。好ましくは、該エキソン内部オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、該エキソンに隣接する２つのエキソンスプライス受容体及び／又はエキソンスプライス供与体ヌクレオチドの１つ又は両方を含まない。好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、ＢＭＰ４のエキソン４に相補的である。いくつかのＢＭＰ４転写物は、エキソン−２において開始する。オルタナティブスプライス変異体もまた存在しうる。これらの場合、エキソンのナンバリングは、ＡＯＮ ｈＢＭＰ４＃２により同定されるエキソンから数えられ、そしてこのエキソンはまた、もしエキソン４の前のｍＲＮＡにおいて含まれるエキソンの実際の数が３より低い又は高いならば、数字４が与えられる。本発明はさらに、ＡＯＮ ｈＢＭＰ４＃２の配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明はさらに、ＢＭＰ４前駆ｍＲＮＡにおけるＢＭＰ−４のエキソンをスキップする為の、該エキソンと相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を使用する方法を提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、遺伝性筋ジストロフィーの処置における使用の為に、ＢＭＰ−４のエキソンと相補的である。さらに、遺伝性筋ジストロフィーの処置の為の医薬の調製の為に、ＢＭＰ−４のエキソンと相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物の使用をする方法が提供される。該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、多くの種々の方法により該細胞に与えられうる。好ましい方法は、該オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物の該細胞への移行を高める為の何らの手段を伴わない。これは、該オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物のインビボでの投与の場合に特に好ましい。他の好ましい実施態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウィルス性ベクターにより該細胞に与えられる。好ましい実施態様において、該ウィルス性ベクターは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現の為の発現カセットを含む。

材料と方法

細胞培養物
初代ヒト筋芽細胞が、３の健康な個体（ＫＭ１０９、ＫＭ１０８及びＨＰＰ４）及び３のＤＭＤ患者（ＤＬ５８９．２[エキソン５１−５５欠失]、ＤＬ４７０．２[エキソン４６−５０欠失]及び５０６８５．１[エキソン４８−５０欠失]）の骨格筋バイオプシー[４２]から単離された[４２；４３]。バイオプシーの時の年齢は、２〜１４歳である。培養物は、筋芽細胞及び最初のバイオプシーにおいて存在した他の細胞タイプからなる。筋芽細胞の割合は、夫々のバイオプシーについて、記載されたとおりの、デスミン染色及び細胞計数により決定された[４４]。健康な培養物及びＤＭＤ培養物は、筋芽細胞の平均の百分率において異ならなかった（５７±２０％）。細胞は、コラーゲンにより被覆された培養フラスコ中の増殖培地中で増殖された。細胞が８０％コンフルエントになったとき、高血清培地を低血清培地により置き換えることにより分化が開始された[２７]。本実験の為に用いられた全ての細胞培養物は、４〜１０の継代数を有した。

ｃＤＮＡハイブリダイゼーション
ヒト配列の認証された４０Ｋ Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．ｃＤＮＡライブラリーからの４４１７の筋肉関連遺伝子そしてＥＳＴを有するｃＤＮＡマイクロアレイ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（３通りにスポットされた）が用いられ、そして、これらは、記載されたとおりにＰＣＲにより増幅され、プリントされ及び予備ハイブリダイズされた[２７；４５]。６の異なる細胞培養物からの全てのＲＮＡが、記載されたとおりに、０、１、２、４、６、１０及び１４日で単離され、増幅され、ラベル化されそして、共通の参照とともに共ハイブリッド形成された[２７；４５]。全てのＲＮＡ及びｃＲＮＡの質及び量が、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ ＲＮＡ ｎａｎｏ ａｓｓａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりチェックされた。

データ分析
全てのスライドが、Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ２５６５ＢＡ）によりスキャンされ及びスポット強度がＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ３．０プログラム（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により定量された。未加工の強度のファイルが、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｒｅｓｏｌｖｅｒ（商標）ｖ４．０（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ）にインポートされ、そしてＡｘｏｎ／Ｇｅｎｅｐｉｘ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅｌにより正規化された。状態（健康又はＤＭＤ）当たり、遺伝子当たり９の測定値が考慮され（３の生物学的複製、３の技術的複製）そして厳密なデータ分析手順が実施された。負のアレイ対照の平均＋２標準偏差（ＳＤ)より高い正規化された強度を有する遺伝子が、分析された。これは、１の状態（健康又はＤＭＤ）において且つ少なくとも１の時点において、一致する必要があった。誤差加重の２要因ＡＮＯＶＡが、変数として、時間、病気状態、及び時間と病気状態との交互作用（interaction）により実施された。遺伝子は、病気状態についてのＰ値が＜１×１０^−５（Ｂｏｎｆｒｒｏｎｉ補正された）であるときに、異なって発現されると考えられた。時間において異なって発現される遺伝子（Ｐ＜１×１０^−５）は、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｔｒｅｅ Ｍａｃｈｉｎｅを用いて集団に機能的に分類された[４６]。

定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ｃＤＮＡが、テンプレートとしてランダムヘキサマー及び０．５ｍｇの全ＲＮＡを用いて、逆転写により、全ての６の細胞培養物の全ＲＮＡから調製された。ＰＲＣプライマー対は、Ｐｒｉｍｅｒ３（http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi/）を用いて設計された。この研究において遺伝子の夫々について用いられたオリゴヌクレオチドプライマー対は、以下のヌクレオチドに対応する：グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、５１０−５２９及び６２５−６４４（ＮＭ＿００２０４６）；ＢＭＰ４ ３９４−４１３及び４８４−５０３（ＮＭ＿００１２０２）及びＡＱＰ１ １１２９−１１４８及び１２２７−１２４６（ＮＭ＿１９８０９８．１）。定量的ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ，Ｒｏｃｈｅ）は、５８℃（ＧＡＰＤＨ及びＢＭＰ４について）又は６２℃（ＡＱＰ１について）のアニーリング温度により、記載されたとおりに実施された[２７]。最適なｃＤＮＡ希釈及び相対的な濃度は、遺伝子当たりの希釈系列を用いて決定された。夫々の遺伝子は、多量のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡに正規化された（アレイ上での時間にわたる一定の発現を示す）。

ＲＴ−ＭＬＰＡ
ＭＬＰＡプローブが、[４７]において記載された基準に従い設計された。反応は、ハーフプローブ（half probe）として用いられた全てのオリゴヌクレオチドが化学的に合成されたこと（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）以外は、[４８]において記載されたとおりに、５０ｎｇ全ＲＮＡに対して実施され、そして２つのフルオロフォアがＰＣＲ反応の間に用いられた[４９]。２ｍｌのラベル化ＰＣＲ産物が、１０ｍｌホルムアミド及び０．０５ｍｌＲＯＸ５００サイズスタンダードと混合され、そして、ＡＢＩ３７００キャピラリーシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分離された。ピークの高さにおいて相当な範囲があるので、１：１０希釈が、十分な不飽和のシグナルを得る為に必要に応じてロードされた。データは、さらなる分析の為にＥｘｃｅｌにエクスポートされた。夫々のプローブについて、相対的なピークの高さが、強度の大きさとして用いられた。正規化が、夫々のプローブの相対的なピークの高さを、同じフルオロフォアと一緒に増幅された２つの対照プローブのピークの高さの合計により割り算することによって実施された。対照プローブは、アレイ分析における発現水準において有意な変化を示さなかった遺伝子を標的とした（Ｃａｌｎｅｘｉｎ及びＰｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ３調節サブユニットＢ）。標準誤差が、６の測定値に基づき計算された（２回測定された３の培養物）。

分化検定及び免疫組織化学的分析
組み換えヒトＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）が、分化の開始の際に、種々の濃度（０．３〜３０ｎｇ／ｍｌ）で細胞に添加された。培地交換の間、新しいＢＭＰ４が添加された（４日毎）。細胞は、血清の剥脱後、７又は１１日で、１００％メタノール（−２０℃）により固定された。免疫組織化学的染色が、前に記載されたとおりに実施された[４４；４９]。分化指標がデスミン陽性細胞（分化できる筋原細胞）の数によりミオシン陽性細胞の数を割り算すること×１００％により計算された。該分析の為に、一般化線形回帰モデルが、日数（７又は１１）、濃度（０、０．３、１、３、１０及び３０ｎｇ／ｍｌ）及び細胞株（健康及びＤＭＤ）の関数として、分化における違いを説明する為に適合された。計算は、Ｒ ２．０．１を用いて実行された[５０]。該モデルは、細胞株と濃度との交互作用を表す項を含み、これは細胞株が統計的に有意な分化割合を示した個々の濃度水準を同定する為に用いられる項である。確率分布は（モデル）誤差に関係し、そして、正規分布及び二項誤差分布の両方が計算された。

結果

ヒトＤＭＤ筋芽細胞の分化する能力を調査する為に、ラージスケール遺伝子発現分析が実施された。６の異なる個体（３は健康、３はＤＭＤ）のヒト初代骨格筋細胞培養物が、筋肉に関連するｃＤＮＡアレイにより分析された。ＲＮＡが、筋芽細胞段階（日数０）で及び分化の種々の日数（日数１、２、４、６、１０及び１４）で単離された。異なって発現される遺伝子を発見する為に、誤差加重の２要因ＡＮＯＶＡが、変数として、時間、病気状態、及び時間と病気状態と交互作用により実施された。アレイ上に存在する４０１０の特定の遺伝子のうち、２４２３が、全ての健康な試料又は全てのＤＭＤ試料のいずれかにおいて少なくとも１の時点で有意なシグナルを与えた。９４の遺伝子が、健康な培養物とＤＭＤ培養物との間で異なって発現された（ＤＭＤにおいて５２が下がり、４２が上昇、ｐ（病気状態）＜１・１０^−５）。驚くべきことに、分化していない細胞（ｔ＝０）においてすでに、７の遺伝子が、ＲＮＡ発現水準において２倍超の違いを示した（表１及び補足表１ａ／ｂ）。これらの２つ（ＡＱＰ１及びＢＭＰ４）は、全時間経過にわたり、ＤＭＤにおいて連続的により高く発現される。この違いは、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより確認された（図１）。

Ｄａｈｌｑｖｉｓｔらは、前に、不死化マウス筋芽細胞において、ＢＭＰ４が筋肉の分化に対して抑制効果を有することを示した[５１]。これが、初代ヒト筋芽細胞培養物においてもあてはまるかどうかを決定する為に、及び、健康細胞及びＤＭＤ細胞が異なって応答するかどうかを解明する為に、組み換えＢＭＰ４が、該細胞に添加された。ｔ＝０での融合培地への組み換えＢＭＰ４の添加は、健康細胞培養物及びＤＭＤ細胞培養物の両方において、細胞融合の濃度依存的減少を結果した（より多核性でない、ミオシン陽性細胞）（図２、３及び補足図１）。３倍低い濃度が、同様の程度の分化抑制を引き起こすので、ＤＭＤ細胞はＢＭＰ４に対して有意により感受性であった（ｐ＜０．０５）（表２及び３）。提示された該結果は、誤差分布としての正規分布を用いることに対応する（正規分布及び二項誤差分布の両方が同様の結論を生じた）。

全時間経過にわたり健康及びＤＭＤの間で異なって発現された遺伝子に加えて、分化の誘導後に発現パターンが分岐を開始する遺伝子の小さな集団があった（ｐ（病気状態）＜１・１０^−５）。図４は、これらの遺伝子が２つの集団に分けられることを示す。第１に、健康細胞培養物では融合の間に上方制御される遺伝子（ＢＦ、Ａｄｌｉｃａｎ及びＭＭＥ）、これはＤＭＤ培養物では低いままである。第２に、健康な細胞培養物では、常に低い発現水準であるが、ＤＭＤ細胞の融合の間は上方制御される２つの遺伝子（ＭＴＵＳ１及びＥＤＮＲＡ）。これらの結果は、ＲＴ−ＭＬＰＡにより確認された（補足図２）。ＲＴ−ＭＬＰＡは、１回の反応で最大で４０の転写物の迅速且つ同時の定量を許す技術である。この技術は、複数の試料及び転写物が、定量的ＲＴ−ＰＣＲよりもより速く且つより安い分析において試験されることを許すので、この技術が選ばれた。

二要因ＡＮＯＶＡも、健康培養物及びＤＭＤ培養物の両方の時間経過において等しく発現が変化する遺伝子を明らかにする（ｎ＝６８、ｐ（時間）＜１・１０^−５）。筋形成におけるこれらの遺伝子の役割は、以前の文書において議論された[２７]。Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｔｒｅｅ Ｍａｃｈｉｎｅを用いて、これらの遺伝子が、機能的にアノテートされた[４６]。図５は、健康な細胞及びＤＭＤ細胞についての平均の発現パターンを示す（≧６の遺伝子を有する機能的な群）。サルコメアタンパク質（ｎ＝１０）は、健康細胞と比較して、ＤＭＤにおけるより遅い時点で、有意に減少した発現を示した（対応のあるＴ検定、ｐ＜０．０１）。他の機能的なカテゴリーは、健康な培養物及びＤＭＤ培養物において、同様の発現パターン変化を示した。

デュシェンヌ筋芽細胞におけるＢＭＰ４発現の、エキソンをスキップするＡＯＮによる下方制御

デュシェンヌ患者（ＤＬ５８９．２）の骨格筋バイオプシーから単離されたヒト筋芽細胞が、６ウェルのディッシュ中で、５０％の集密度に増殖された（詳細については実施例１を参照されたい）。形質導入前２４時間で、細胞は、低血清分化培地上に置かれた。細胞は、下記で述べられるＡＯＮ（２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート）によって、１００、２００若しくは５００ｎＭの濃度で形質導入され、又は、非処理のままであった。

ＡＯＮ配列：

最初の２つのオリゴヌクレオチドが、ヒトＢＭＰ４のエキソン４の中のエキソン内部配列に対して設計された、転写物変異体１（ＮＭ＿００１２０２）。最後のオリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ４発現に影響しないべきである対照オリゴヌクレオチドであり、そしてオリゴヌクレオチド取り込みの蛍光検出を許すために、５’ＦＡＭラベルを有する。

ＡＯＮは、Ｅｘｇｅｎ５００形質導入試薬（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、μｇＡＯＮ当たり２μｌ）により形質導入された。形質導入の３時間で、形質導入複合体が、洗い流され、そして新しい分化培地が、該細胞に添加された。形質導入後６時間で、ＦＡＭ−ＡＯＮにより形質導入された筋芽細胞の核は、明るく蛍光であり、ＡＯＮの高い核取り込みを示す。

形質導入後２４時間で、細胞は、ＲＮＡＢｅｅ溶液（Ｉｓｏｔｅｘ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で溶解され、そしてＲＮＡが、製造者により提供されたプロトコルを用いて単離された。ＲＮＡは、２００ｎｇの全ＲＮＡを、４０ｎｇのランダムヘキサマープライマーと、１３μｌのＤＥＰＣ−水の中で、１０分間７０℃でインキュベートすることにより、ｃＤＮＡへと転写された。氷上での冷却後、４μｌの５×第１ストランドバッファー（first strand buffer）、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、及び１μｌのＲｅｖｅｒｔａｉｄ ＲｎａｓｅＨ−逆転写酵素（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）が添加され、そして、反応混合物が、４２℃で２時間インキュベートされた。該逆転写酵素は、７０℃で１５分間のインキュベーションにより不活化された。得られたｃＤＮＡは５倍に希釈された。

ＢＭＰ４におけるＡＯＮ媒介のエキソンスキッピングを評価する為に、以下のＰＣＲが実施された：

ＰＣＲは、９４℃での３０秒の変性、５６℃での３０秒のアニーリング及び７２℃での３０秒の伸長の４０サイクルにより実施された。ＰＣＲ断片は、エチジウムブロマイドにより染色されたアガロースゲル上で視覚化された。

結果
結果が図１に示される。全ての３のＰＣＲが、予期されたサイズの断片を産生した。ＡＯＮ ｈＢＭＰ４＃２は、試験された最も高い濃度（５００ｎＭ）で、エキソン４のスキッピングを誘発し（図１；パネルＢ）、１４２ｂｐのより短い断片として目に見え、ここにおいてエキソン３はエキソン５に直接にスプライスされる。ＡＯＮ ｈＢＭＰ４＃２のより低い濃度（２００ｎＭ）による形質導入は、ＢＭＰ４転写物の完全な欠如を結果した。これは、ＢＭＰ４遺伝子のエキソン３のエキソン内部ＰＣＲにより確認された（パネルＡ）。対照的に、対照遺伝子ＧＡＰＤＨは、なお、安定に発現され（パネルＣ）、ＢＭＰ４転写物の選択的な喪失を示唆する。エキソン４のスキッピングはＢＭＰ４転写物中のオープンリーディングフレームを破壊するので、我々は、この濃度のＡＯＮによるエキソンスキッピングが非常に有効であったので、ナンセンス媒介の非常に有効な減衰活性に起因して該転写物が喪失されると考える。両方の濃度で、ＡＯＮ ｈＢＭＰ４＃２は、完全なＢＭＰ４転写の水準を減少し、すなわち健康な対象由来の筋芽細胞培養物における正常な水準へとＢＭＰ４ｍＲＮＡ水準を修正する。ＡＯＮ ｈＢＭＰ４＃１及び対照ＦＡＭ−ＡＯＮは、エキソンスキッピングを誘発しなかった。時々、エキソン４における隠れたスプライス部位の活性化が観察された。

ｍｄｘ×ユートロフィン^−／−マウスにおける、ＢＭＰ４に対するアンチセンス及びアンチセンス配列をスキップするＤＭＤエキソン；筋肉強度、生存率、タンパク質水準及びＲＮＡ水準の評価

ジストロフィン及びユートロフィン欠損のマウス（ｍｄｘ．ｕｔｒｎ^−／−マウス）が、オスのｍｄｘ^＋／０．ｕｔｒｎ^−／−．ｈＤＭＤ^＋／−マウス及びメスのｍｄｘ^＋／＋．ｕｔｒｎ^−／−．ｈＤＭＤ^＋／−マウスの交雑により産生された（'t Hoen et al, 投稿準備中）。マウスは、標準的な実験環境下で飼育された。動物は、通常の食事が与えられ、そして自由に随意で水を飲むことができた。

２０merの２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートリボ核酸が、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃにより合成された。該アンチセンス配列は、
１．マウスDmd遺伝子のエキソン２３−イントロン２３境界である、配列

。このAONの配列は、Mannら及びLuらにより、ｍｄｘマウスにおける彼らの実験において用いられたAONと同一であり、そしてDmd遺伝子の変異したエキソン２３の有効なスキッピングを結果し、機能的ジストロフィンタンパク質の産生を結果する［３１、５２］。

。

注入の前に、AONは、０．９％（ｗ／ｖ）NaCl中に、最終濃度５０ｍｇ／ｍｌへと希釈された。マウスは、無作為に３つの群に分けられた。第１の群は、静脈内に、２１日齢で始まる、５連続日間、５ｍｌのAON-1により、注入された。第２及び第３の群は夫々、AON-1に加えて、５×５ｍｇのAON-2又はAON-3を受けた。

第１の注入の前に、及び第１の注入後１、２及び３週後に、血液試料が、クレアチンキナーゼ活性の測定（筋肉損傷のよく確立されたバイオアッセイ）のために採取された。これらの同じ時点で、動物はロータロッド装置上で走らされ、そして、マウスが落ちる前までの時間が記録された（筋肉強度についてのバイオアッセイ）。注入後３週間で、エバンスブルーが、腹腔内に投与されて（１０ｍｇ／ｋｇ体重）、損傷した筋肉を染色した。マウスは、頚椎脱臼により殺され、腓腹筋、四頭筋、前頸骨筋、心筋及び横隔膜筋が単離されて、さらなる工程の前まで、液体窒素中に瞬間凍結（snap frozen）された。

修正されたジストロフィンｍＲＮＡ転写物の水準が、前に記載されたとおりに測定された[５３]。ジストロフィンタンパク質水準は、記載されたとおりに、ウェスタンブロッティングにより測定された[５３]。標準的なヘマトキシリン／エオシン染色が、筋肉組織学を評価するために、筋肉の１０μｍ凍結切片について実施された。平均の線維断面の面積が測定された。筋肉当たり１０の切片においてエバンスブルー陽性面積が、筋肉の損傷についての尺度として測定された。NCL-DYS２及びCD4抗体による免疫染色が、存在するジストロフィン及び存在する免疫浸潤について分析するために、該切片上で実施された。

ｍｄｘ筋芽細胞培養物における遺伝子の欠陥の遺伝子的修正及び、これら筋芽細胞とＢＭＰインヒビターノギンとのｍｄｘマウスへの混注

ジストロフィン及びユートロフィン欠損マウス（ｍｄｘ．ｕｔｒｎ^−／−マウス）が、オスのｍｄｘ^＋／０．ｕｔｒｎ^−／−．ｈＤＭＤ^＋／−マウス及びメスのｍｄｘ^＋／＋．ｕｔｒｎ^−／−．ｈＤＭＤ^＋／−マウスの交雑により産生された（'t Hoen et al, 投稿準備中）。マウスは、標準的な実験環境下で飼育された。動物は、通常の食事が与えられ、そして自由に随意で水を飲むことができた。

マウス筋芽細胞が、オスのｍｄｘ^＋／０．ｕｔｒｎ^−／−．ｈＤＭＤ^＋／−マウスの単離された後肢筋から、標準的なコラーゲナーゼ／ディスパーゼ処理及び標準的な増殖培地中でコラーゲン被覆されたディッシュ上での培養により得られた[２２]。増殖する筋芽細胞（１×１０^６細胞／マウス）が、ポリエチレンイミン（Ｅｘｇｅｎ５００、ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、μｇＡＯＮ当たり３．５μｌ）と複合された、５００ｎＭの

（２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）により形質導入された。形質導入後２日で、細胞はペレット化され、そして、よく知られたＢＭＰ４インヒビターであるノギンを含む（種々の量：０、１０、５０又は１００ｎｇ）又は含まない７μｌのＨａｎｋ’ｓ平衡塩溶液中に採取された。細胞は、メスのｍｄｘ^＋／＋．ｕｔｒｎ^−／−マウスの前頸骨筋中に、５０μｍチップのガラスピペットにより注入された。注入後３日又は１０日で、マウスは殺され、そして連続する凍結切片が作成された。切片は、細胞の生存、遊走及びジストロフィン発現について分析するために、ヘマトキシリン／エオシンにより並びにジストロフィン及びＹ染色体特異的抗体により染色された。

図面の簡単な説明

図１．オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（上のパネル）により又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ（下のパネル）（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ，Ｒｏｃｈｅ）により測定されたＡＱＰ１（Ａ）及びＢＭＰ４（Ｂ）の遺伝子発現。ｘ軸に、時間が日数で示されている。ｙ軸に、ｌｏｇ２発現比（ｔ＝０で健康に対して正規化された）又はΔ（Ｃｔ）（ｔ＝０で健康に対して正規化された）が示されている。該Ｃｔ値は、ｍＲＮＡの最初の量の^２ｌｏｇに比例し、すなわち、^２ｌｏｇ発現比と比較できる。垂直なバーは、種々の培養物の標準偏差を表す（ｎ＝３）。

図２．分化の第７日で評価された、種々の濃度のＢＭＰ４とともにインキュベートされた健康筋管又はＤＭＤ筋管の免疫組織化学的染色。細胞は、ＤＡＰＩ（青）並びにデスミンに対する抗体（赤）及びミオシンに対する抗体（緑）により染色された。

図３．種々の濃度の組み換えＢＭＰ４の添加後の、健康な筋芽細胞及びＤＭＤ筋芽細胞の分化指標。細胞は第７日で固定された。回帰モデル、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

図４．分化の誘発後の、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞との間で異なって発現された遺伝子のｌｏｇ２遺伝子発現比；ＢＦ、ＭＭＥ、Ａｄｌｉｃａｎ、ＭＴＵＳ１、ＥＤＮＲＡ。垂直なバーは、用いられた種々の系列の標準偏差を示す（ｎ＝３）。

図５．健康な筋芽細胞融合及びＤＭＤ筋芽細胞融合の間の、種々の機能的カテゴリーの遺伝子の平均ｌｏｇ２遺伝子発現。サルコメア遺伝子は、遅いＤＭＤ筋形成において（第６、１０及び１４日）、遺伝子発現における減少を示す。^＊対応のあるｔ−検定、ｐ＜０．０１。他の機能的カテゴリー（細胞の増殖及び維持、タンパク質結合性、代謝上昇及び代謝低下）に関する遺伝子はいずれの時点でも健康とＤＭＤとの間で有意な差を示さない（ｎ≧６）。

図６．デュシェンヌの患者の筋芽細胞において、ヒトのＢＭＰ４のエキソン４の、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより媒介されたスキッピングを示す、エチジウムブロマイドにより染色されたアガロースゲル（実施例２として記載された実験）。パネルＡは、ＰＣＲ１により得られた断片を示す（ＢＭＰ４ ｍＲＮＡのエキソン３）；パネルＢは、ＰＣＲ２により得られた断片を示す（ＢＭＰ４ ｍＲＮＡのエキソン３−５）。エキソン４がスキップされる産物は、１４２ヌクレオチドのサイズを有する。パネルＣは、ＰＣＲ３により得られた断片を示す（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ）。

補足図１．種々の濃度の組み換えＢＭＰ４の添加後の、健康筋芽細胞及びＤＭＤ筋芽細胞の分化指標。細胞は、第１１日で固定された。回帰モデル、^＊ｐ＜０．０５。

補足図２．ＲＴ−ＭＬＰＡにより試験された、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞の間の、時間において、異なって発現された遺伝子の遺伝子発現水準；ＢＦ、ＭＭＥ、Ａｄｌｉｃａｎ、ＭＴＵＳ１。垂直のバーは、用いられた種々の系列についての標準誤差を示す（ｎ＝３）。

オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（上のパネル）又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ（下のパネル）により測定されたＡＱＰ１の遺伝子発現を示すグラフである。 オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（上のパネル）又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ（下のパネル）により測定されたＢＭＰ４の遺伝子発現を示すグラフである。 分化の第７日で評価された、種々の濃度のＢＭＰ４とともにインキュベートされた健康筋管又はＤＭＤ筋管の免疫組織化学的染色を示す図である。 種々の濃度の組み換えＢＭＰ４の添加後の、健康筋芽細胞及びＤＭＤ筋芽細胞の分化指標を示すグラフである。 分化の誘発後の、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞との間で異なって発現された遺伝子ＢＦのｌｏｇ２遺伝子発現比を示すグラフである。 分化の誘発後の、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞との間で異なって発現された遺伝子ＭＭＥのｌｏｇ２遺伝子発現比を示すグラフである。 分化の誘発後の、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞との間で異なって発現された遺伝子Ａｄｌｉｃａｎのｌｏｇ２遺伝子発現比を示すグラフである。 分化の誘発後の、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞との間で異なって発現された遺伝子ＭＴＵＳ１のｌｏｇ２遺伝子発現比を示すグラフである。 分化の誘発後の、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞との間で異なって発現された遺伝子ＥＤＮＲＡのｌｏｇ２遺伝子発現比を示すグラフである。 健康筋芽細胞融合及びＤＭＤ筋芽細胞融合の間の、サルコメアにおける遺伝子の平均ｌｏｇ２遺伝子発現を示すグラフである。 健康筋芽細胞融合及びＤＭＤ筋芽細胞融合の間の、細胞の増殖及び維持における遺伝子の平均ｌｏｇ２遺伝子発現を示すグラフである。 健康筋芽細胞融合及びＤＭＤ筋芽細胞融合の間の、タンパク質結合性における遺伝子の平均ｌｏｇ２遺伝子発現を示すグラフである。 健康筋芽細胞融合及びＤＭＤ筋芽細胞融合の間の、代謝上昇における遺伝子の平均ｌｏｇ２遺伝子発現を示すグラフである。 健康筋芽細胞融合及びＤＭＤ筋芽細胞融合の間の、代謝低下における遺伝子の平均ｌｏｇ２遺伝子発現を示すグラフである。 デュシェンヌの患者の筋芽細胞において、ヒトのＢＭＰ４のエキソン４の、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより媒介されたスキッピングを示す図である。 ［補足図１］種々の濃度の組み換えＢＭＰ４の添加後の、健康筋芽細胞及びＤＭＤ筋芽細胞の分化指標を示すグラフである。 ［補足図２-１］ＲＴ−ＭＬＰＡにより試験された、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞の間の、時間において、異なって発現された遺伝子ＢＦの遺伝子発現水準を示すグラフである。 ［補足図２-２］ＲＴ−ＭＬＰＡにより試験された、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞の間の、時間において、異なって発現された遺伝子ＭＭＥの遺伝子発現水準を示すグラフである。 ［補足図２-３］ＲＴ−ＭＬＰＡにより試験された、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞の間の、時間において、異なって発現された遺伝子Ａｄｌｉｃａｎの遺伝子発現水準を示すグラフである。 ［補足図２-４］ＲＴ−ＭＬＰＡにより試験された、健康筋芽細胞とＤＭＤ筋芽細胞の間の、時間において、異なって発現された遺伝子ＭＴＵＳ１の遺伝子発現水準を示すグラフである。

Claims (28)

1. 個体における遺伝性筋ジストロフィーの症状を緩和する為の医薬の製造の為に、細胞における骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の発現を減少し、抑制し及び／又は拮抗する為の化合物を使用する方法。
2. 該細胞が筋芽細胞又はその前駆体である、請求項１に記載の方法。
3. 該化合物がアンチセンスＲＮＡ又はその機能的等価物を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 筋芽細胞の分化を刺激する方法であって、該筋芽細胞におけるＢＭＰ４の発現を減少し、抑制し及び／又は拮抗する為の化合物を該筋芽細胞に与えることを含む前記方法。
5. 該化合物が該筋芽細胞におけるＢＭＰ４ ｍＲＮＡ発現を減少し及び／又は抑制する、請求項４に記載の方法。
6. 該筋芽細胞を成熟筋細胞と接触させることをさらに含む、請求項４又は請求項５に記載の方法。
7. 該成熟筋細胞が遺伝性筋ジストロフィーを患う対象に由来する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 該筋芽細胞におけるＢＭＰ４ ｍＲＮＡ発現を減少し及び／又は抑制することが、該筋芽細胞又はその前駆体に、該ＢＭＰ４遺伝子と相補的なＢＭＰ４オリゴヌクレオチド（アンチセンス）を与えることを含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 該筋芽細胞又はその前駆体が、該ＢＭＰ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドをインビトロで与えられる、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ＢＭＰ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、筋芽細胞又はその前駆体のコレクション。
11. 発現が、ウィルス的に形質導入されたＤＮＡ配列により減少され、抑制され及び／又は拮抗される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法又は請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
12. ウィルス性ベクターにより該細胞に該化合物が与えられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法又は請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
13. 該遺伝性筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）の疾患の１つを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 該化合物がタンパク質インヒビターを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 該化合物がＢＭＰ４インヒビター又はＢＭＰ４アンタゴニストを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 該インヒビター又はアンタゴニストが、ノギン、コーディン、ベントロプティン（ｖｅｎｔｒｏｐｔｉｎ）、ねじれ嚢胚形成（ｔｗｉｓｔｅｄ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）、グレムリン又はＢＭＰ４アンタゴニストのＤＡＮファミリーの他のメンバー、ＰＲＤＣ、スクレロスチン、ＣＴＧＦ及び／又はフォリスタチン、又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体である、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、該個体の処置の為の医薬の調製の為の第２の化合物の使用をさらに含み、該第２の化合物が、該遺伝性筋ジストロフィーに関係する遺伝子（変異した遺伝子）の正常な機能の少なくとも一部を該個体の筋細胞に与える、上記方法。
18. 該遺伝性筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 該第２の化合物が、ジストロフィン遺伝子のエキソンをスキップする為のオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を含む、請求項１８に記載の方法。
20. ＢＭＰ４アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が、エキソンを含むＢＭＰ４前駆ｍＲＮＡにおいて該エキソンのスキッピングを誘発することができるかどうかを決定する方法であって、細胞発現において該ＢＭＰ４前駆ｍＲＮＡに該オリゴヌクレオチドを備えること及び該前駆ｍＲＮＡから産生された成熟ｍＲＮＡから該エキソンが欠如するかどうかを決定することを含む、上記方法。
21. 該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が該エキソンに相補的である、請求項２０に記載の方法。
22. 該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が、該エキソンのエキソン内部部分に相補的である、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。
23. 該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が、ＢＭＰ４のエキソン４に相補的である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. ＢＭＰ−４のエキソンに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を、ＢＭＰ４前駆ｍＲＮＡ中のエキソンをスキップする為に使用する方法。
25. 遺伝性筋ジストロフィーの処置における使用の為の、ＢＭＰ−４のエキソンに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物。
26. 遺伝性筋ジストロフィーの処置の為の医薬の調製の為に、ＢＭＰ−４のエキソンに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を使用する方法。
27. 該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ウィルス性ベクターにより該細胞に与えられる、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 該ウィルス性ベクターが、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のための発現カセットを含む、請求項２７に記載の方法。

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