JP2009531337A

JP2009531337A - アンペロプシンの不飽和ナトリウム塩の製剤及びその応用

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Publication number: JP2009531337A
Application number: JP2009501811A
Authority: JP
Inventors: 富林范
Original assignee: 富林范
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2009-09-03
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Abstract

本発明は新しいアンペロプシンの不飽和ナトリウム塩、及びその製造方法と用途を提供する。本発明のアンペロプシン不飽和ナトリウム塩はアンペロプシンに比べて、その物理化学性質に顕著な変化が発生し、動物毒性実験により、両方の毒性に根本的な変化が発生し、薬理実験により、アンペロプシン不飽和ナトリウム塩が多数の抗腫瘍薬物と協力作用を有することによって、大幅に抗腫瘍薬物の使用量を減少することができるが、治療効果には影響を与えない。

Description

技術分野
本発明は薬物の分野に関し、具体的に、新しいアンペロプシンの不飽和ナトリウム塩、及びその製造方法と用途に関するものである。

従来の技術
アンペロプシン（ＡＭＰ）は知られている植物から得られる化合物であり、その分子式はＣ₁₅Ｈ₁₂Ｏ₈・２Ｈ₂Ｏであり、構造式は下記のようである。

アンペロプシン（ＡＭＰ）は抗腫瘍の薬理作用を持っていることが証明されている。同時に、AMPは他の腫瘍薬物と配合使用されることによって、腫瘍薬物の使用量を顕著に低下して、腫瘍薬物の副作用を制御する効果が得られる。

ＡＭＰにも大きい欠点が存在する。主にＡＭＰの水溶液の中での溶解度が非常に低いため、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの有機試薬を用いて溶解を促進させるべきである。しかし、有機試薬は強い毒性を持っているので、臨床薬物として使用されるのが適合しない。一方、ＡＭＰ自身も強い毒性を持っているため、これも薬物使用の安全性の方面に対して色々な問題を起こす。

従って、本分野でアンペロプシンの毒性を制御する方法を開発することが切望されている。

発明の開示
本発明は、アンペロプシン毒性を顕著に低下する方法及び製剤を提供することを目的とする。

本発明の第一は、アンペロプシン塩或いはその誘導体を提供することであり、前述アンペロプシン塩は、アンペロプシンの水素原子を一価のカチオンに置換されて形成された塩であり、且つ前述置換は不飽和置換である。

他の好ましい例において、前述誘導体は水和物又は溶媒和物（ｓｏｌｖａｔｅ）である
。
他の好ましい例において、前述アンペロプシン塩は下記の式Ｉで表される。
Ｃ₁₅Ｈ₆Ｏ₈Ｈ_αＭ_β （Ｉ）
式中、Ｍは一価カチオンであるＬｉ⁺、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、

である。
他の好ましい例において、ＭはＮａである。

他の好ましい例において、前述アンペロプシン塩はアンペロプシン不飽和ナトリウム塩を有する二水和物又は五水和物である。

他の好ましい例において、前述誘導体はα＝２、β＝４である不飽和ナトリウム塩を含有するアンペロプシンの水和物であり、分子式はＣ₁₅Ｈ₈Ｏ₈Ｎａ₄・５Ｈ₂Ｏである。
他の好ましい例において、前述五水和物は下記の構造を有する。

本発明の第二は、本発明のアンペロプシン塩又はその誘導体を製造する方法を提供し、次の工程が含まれる。
（ａ）アンペロプシンと式ＩＩで表される成塩剤を反応させて、式Ｉで表せるアンペロプシン塩を形成する。

式中、Ｍは一価カチオンであるＬｉ⁺、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、
ＺはアニオンであるＨＣＯ₃ ^-、ＣＯ₃ ^2-、ＰＯ₄ ^3-、ＨＰＯ₄ ^2-、Ｈ₂ＰＯ^4-、Ａｃ^-からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、
ｎは１、２又は３であり、

である。
工程（ａ）において、アンペロプシンと成塩剤におけるＭのモル比は１：２〜１：５である；
（ｂ）形成されたアンペロプシン塩又はその水和物を分離する。

他の好ましい例において、前述成塩剤は重炭酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムからなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせである。

他の好ましい例において、前述工程（ａ）における反応は水性溶媒又は水の中で反応させ、温度は４-８０℃である。

本発明の第三は、薬物組成物を提供し、それは本願に記載されたアンペロプシン塩又はその誘導体及び薬学的に許容される塩を含む。

他の好ましい例において、前述薬物組成物は注射剤、溶液剤、錠剤、冷凍粉剤、又はカプセルである。

他の好ましい例において、前述薬物組成物は０．２μｇ〜５００ｍｇ／ｍｌアンペロプシンを含有する。

他の好ましい例において、前述薬物組成物は、更に他の抗癌薬物を含有する。
他の好ましい例において、前述他の抗腫瘍薬物はカルボプラチン、５ＦＵ、アマイシン、ＣＴＸ、コルチシンからなる群から選ばれる一つ又はその組み合わせである。

本発明の第四は、腫瘍治療の方法を提供し、該方法には治療の対象に安全有効量の本発明に記載されたアンペロプシン又はその誘導体を使用する工程を含む。
他の好ましい例において、更にアンペロプシン塩又はその誘導体を投与する前、後又は中に、他の抗腫瘍薬物を投与することを含む。

他の好ましい例において、前述安全有効量は、１-５０００ｍｇアンペロプシン塩/人/回を投与することである。
本発明の第五は、薬物組成物を製造する方法を提供し、（ａ）式Ｉで表されるアンペロプシン又はその誘導体と薬物的に許容される担体を混合して、薬物組成物を形成する工程を含む。
Ｃ₁₅Ｈ₆Ｏ₈Ｈ_αＭ_β （Ｉ）
式中、
Ｍは一価カチオンであるＬｉ⁺、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、

である。
他の好ましい例において、工程（ａ）は、さらに他の抗腫瘍薬物を混合することを含む
。

他の好ましい例において、前述抗腫瘍薬物は、カルボプラチン、５ＦＵ、アマイシン、ＣＴＸ、コルチシンからなる群から選ばれる一つ又はその組み合わせである。

本発明の第六は、本発明のアンペロプシン塩又はその誘導体の用途を提供することである。これらは抗腫瘍薬物を製造するに用いられ、又は他の抗腫瘍薬物と配合使用して、他の抗腫瘍薬物の副作用を低下させる。

発明を実施するための最良の形態
本発明者は、広く且つ真剣に研究を行って、意外的に、ＡＭＰに対して一価アルカリ金属イオンの弱酸塩を用いて成塩修飾を行い、且つＡＭＰの６個遊離水素原子に対して不飽和置換を行うと、その理化性質に顕著な変化が発生する。飽和置換を採用し、又は如何なる置換もしない場合、ＡＭＰの溶解性質は基本的に変化しないため、水溶液の中で容易に溶解しない又は次第に析出して微結晶を形成するので、注射した後、人体に局部的な刺激反応を起こす。しかし、一価カチオンを採用して不飽和置換をすると（例えば、２‐５モル一価カチオン比率で１モルＡＭＰを置換する）、ＡＭＰの溶解度を顕著に高めることができる。

技術用語
本願に用いられたように、技術用語「ＡＭＰ」はアンペロプシンを意味する。

本願に用いられたように、技術用語「ＡＭＰ‐Ｍ」は成塩修飾により、アンペロプシンに対して部分的な成塩修飾を行って得られた不飽和一価カチオンアンペロプシン塩（以下ＡＭＰ‐Ｍと略称する）を意味する。

本願に用いられたように、技術用語「アンペロプシン塩又はその誘導体」はアンペロプシン塩、その水和物、又は溶媒和物を意味する。

本願に用いられたように、技術用語「本発明のアンペロプシン塩」、又は「不飽和アンペロプシン塩」、「一価カチオンの不飽和アンペロプシン塩」は互いに交換して使用することができ、アンペロプシンにおける６個ヒドロキシ基のうちの水素を部分的に置換して形成された塩を意味する。又、当該技術用語には更にアンペロプシン塩の活性誘導体が含まれる（例えば、水和物又は溶媒和物である）。

本願に用いられたように、技術用語「ＡＭＰ‐Ｎａ₄」は４個のナトリウムイオンでアンペロプシン分子中の６個ヒドロキシ基中の４個水素を置換して形成された塩又は誘導体を意味する（例えば、水和物である）。

成塩剤
本発明に用いられる成塩剤は特に制限されない。通常の強アルカリ弱酸型塩でもいい。強アルカリイオンと弱酸基から形成される強アルカリ弱酸型塩でもいい。

代表的な弱酸基はＡｃ、ＨＰＯ₄、Ｈ₂ＰＯ₄、ＨＣＯ₃、ＣＯ₃等、好ましくはＨＣＯ₃、ＣＯ₃、より好ましくはＣＯ₃、ｐＨは安定に中性の範囲になる。
代表的な強アルカリイオンは、Ｌｉ⁺、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺又はその組み合わせである。好ましくはナトリウムイオンである。

製造方法
本発明はアンペロプシン塩を製造する方法を提供し、次の工程が含まれる。
（ａ）アンペロプシンと式ＩＩで表される成塩剤を反応させて、式Ｉで表せるアンペロプシン塩を形成する。

式中、
Ｍは一価カチオンであるＬｉ⁺、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、
ＺはアニオンであるＨＣＯ₃ ^-、ＣＯ₃ ^2-、ＰＯ₄ ^3-、ＨＰＯ₄ ^2-、Ｈ₂ＰＯ^4-、Ａｃ^-からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせである;
ｎは１、２又は３であり、

工程（ａ）において、アンペロプシンと成塩剤におけるMのモル比は１:２〜１:５である；
（ｂ）形成されたアンペロプシン塩又はその水和物を分離する。

常に、前述工程（ａ）における反応は水性溶媒（水及びエタノールとの混合溶媒）又は水の中で行われ、温度は４‐８０℃である。

薬物組成物
本発明のアンペロプシン塩は腫瘍の治療又は補助治療に用いられる。常に、本発明のアンペロプシン塩は無毒性、不活性及び薬学的に許容される水性担体媒質に調合することができる。その中で、ｐＨが調合物の性質及び治療しようとする病症によって変化するとしても、ｐＨは常に５‐８であり、より好ましくは６‐８である。調合された薬物組成物は常の方法により投与することができる。それは（しかし、制限されない）、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、皮内、又は局部投与が含まれる。

本発明のアンペロプシン塩は直接に疾病の治療に用いられることができる。例えば、腫瘍方面の治療に用いられる。本発明のアンペロプシン塩を使用する場合、更に他の治療剤と共に使用することができる。例えば、カルボプラチン、５ＦＵ、アマイシン、ＣＴＸ、コルチシン又はその組成物などである。

又、本発明は薬物組成物を提供し、安全有効量（例えば０．００１‐９９．９ｗｔ％、好ましくは０．０１‐９０ｗｔ％である）の本発明のアンペロプシン塩及び薬学的に許容される担体又は賦形剤が含まれる。

これらの担体は（しかし、限定されない）、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、及びその組み合わせが含まれる。薬物製剤は投与方式に合わせるべきである。本発明の薬物組成物は注射剤の形式に調製することができる。例えば、通常の方法
により、生理食塩水またはブドウ糖及び他の助剤を含有する水溶液を用いて調製する。錠剤とカプセル等の組成物は常規の方法により製造される。例えば、注射剤、溶液、錠剤及びカプセルなどの薬物組成物は無菌条件下で製造される。活性成分の投与用量は治療の有効量であり、例えば、毎日約１μｇ／ｋｇ体重-約５ｍｇ／ｋｇ体重である。

好ましい薬物製剤は、アンペロプシン塩濃度が０．２μｇ〜５００ｍｇ／ｍｌである単純な溶液である。

又、本発明の薬物組成物には、ｐＨ調節剤、安定剤、溶解助剤等の薬理作用がない他の化学薬品を添加することができるが、添加しなくてもいい。

本発明の薬物組成物は、単製剤型又は多元製剤型として製造されてもいい。単独又は混合して投与されてもいい。腫瘍の治療剤及び/又は薬物協力剤として用いられてもいい。
薬物組成物を使用する場合、安全有効量のＺＺ蛋白質又はアンタゴニスト、興奮剤を哺乳動物に投与することができる。該安全有効量は常に少なくとも１０μｇ／ｋｇ体重であり、大部分の状況下、約１０ｍｇ／ｋｇを超えない。好ましく、上記剤量は約１０μｇ／ｋｇ体重‐約１ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な剤量は投与方法、患者の健康状態等の要素を考慮すべきであるが、それは熟練の医師の技能の範囲内のことである。

本発明の主な利点は下述のようである。
（ａ）溶解度が高く、安定性に優れる。成塩修飾されたＡＭＰ‐Ｍを用いて、溶解性質を大幅に高める。且つ該溶解性は非常に安定するため、連続的に１５日の安定性の観察によっても混濁、析出などを発見しなかった。且つ、該成塩されたＡＭＰ‐Ｍは、任意の比率で目前臨床で広範に使用されるリン酸緩衝液と希釈調製しても製品の質量に影響を与えない又は理化性質を改変しない。

（ｂ）毒性が低下される。本発明の修飾されたＡＭＰ‐Ｍをマウスに大量に注射した後、毒の副作用を発見しなかった。最大溶解度と最大容量の投与後、動物の半数致死量は２ｇ／ｋｇより大きい。しかし、ＡＭＰを１ｇ／ｋｇ量で使用する場合、半数の動物が致死された。これにより、ＡＭＰ‐Ｍの毒性性質が大幅に改変されたことが確認された。薬物の安全性方面の判定にもっと適合する。

（ｃ）他の腫瘍薬物と配合して使用される。修飾されたＡＭＰ‐Ｍは多種腫瘍薬物と配合して使用されて、薬物の使用量を大幅に減少し、薬物毒性を低下し、腫瘍薬物の作用を充分に発揮することができる、強力な協力剤である。同時に、溶解と毒性の性質が改変されるため、直接に大量のＡＭＰ‐Ｍを使用さすることが可能になることによって、ＡＭＰは単独で抗腫瘍薬物製剤として臨床に用いられることができる。

以下具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例に特に具体的な条件を説明しない実験方法は通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われる。別の説明がある以外は、部と百分比は重量で計算する。

実施例１ＡＭＰ‐Ｎａ塩の製造及び溶解度と安定性の測定
ＡＭＰとＮａＨＣＯ₃を不同のモル濃度比（即ち、１:１、１:２、１:３、１:４）で使用量を計算し、先ず、ＡＭＰを５％エタノールに溶解した後、濃度比により不同量のＮａＨＣＯ₃及びダブル蒸留水を加えて充分に溶解し、溶解時間と溶解安定性を観察し且つ溶液のｐＨ値を測量する。ＡＭＰとＮａ_２ＣＯ_３を取って、質量比でＡＭＰ:Ｎａ_２ＣＯ_３
（ｗ／ｗ）＝５:２、５:３、５:４として薬物、ダブル蒸留水の使用量を計算し、それぞれのＡＭＰ‐Ｎａの試験液を調合し、所定量の試験液を取ってそれぞれ食塩水またはｐＨ＝６、６．５、７．０、７．４、８．０のりん酸塩緩衝液で１０倍に希釈し、溶液のｐＨ値、溶解状況及び異なる条件下の溶液の安定性を観察する。

ＡＭＰとＮａ_２ＣＯ_３成塩溶解状況:
ＡＭＰ: Ｎａ_２ＣＯ_３（ｗ／ｗ）＝５:２で調合し、ＡＭＰは完全に溶解されないし、微粒が析出した。
ＡＭＰ: Ｎａ_２ＣＯ_３（ｗ／ｗ）＝５:３で調合し、ＡＭＰは完全に溶解され、具体的な結果は下記の表を参照する。

結論：
ＡＭＰ純製品は白い粉末であり、水に溶解されないが、ジメチルスルホキシドには溶解される。しかし、ＡＭＰをそれぞれＮａＨＣＯ₃又はＮａ_２ＣＯ_３と一定の比率によりＡＭＰナトリウム塩溶液を製造すると、ＡＭＰの溶解性を顕著に高めることができる。

ＡＭＰとＮａＨＣＯ₃又はＮａ_２ＣＯ_３との成塩溶解性と安定性を比較することにより、ＡＭＰとＮａ_２ＣＯ_３を溶液におけるモル数Ｎａ:ＡＭＰ＝４:１で調合する場合、ＡＭＰはすぐに完全に溶解され、且つ安定性に優れる。溶液はｐＨ＝６、６．５、７．０、７．４、８．０りん酸塩緩衝液で１０倍希釈された後、４℃に保存し溶解性が変えない。

実施例２ＡＭＰ‐Ｎａ_４塩の薬理作用及びＡＭＰとの比較
体外で人の白血病Ｋ５６２細胞に対するＡＭＰ-ＮａとＡＭＰ‐ＤＭＳＯの殺傷作用を、ＭＴＴ方法により比較して、ＡＭＰナトリウム塩製剤と伝統的なＤＭＳＯの溶解方法が薬効学作用の方面で差異が存在するかどうかを観察する。４８ｈと７２ｈに、Ｋ５６２細胞に対するＡＭＰ-ＮａとＡＭＰ‐ＤＭＳＯの殺傷作用を観察した結果、ＡＭＰ‐ＤＭＳＯのＩＣ５０値は３２．２７μｇ／ｍｌであり、ＡＭＰ-ＮａのＩＣ５０値は２９．５６μｇ／ｍｌであることから、両方が人の白血病Ｋ５６２細胞に対する殺傷作用には顕著な差異が存在しないことが確認された。

薬物の採用：
０．５ｇ／管ＡＭＰ粉末粒子（中国中山医学大学の化学教室から購買）、Ｎａ_２ＣＯ_３（分析級)、ダブル蒸留水、りん酸塩緩衝液（ｐＨ＝６．５、７．４）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ、上海旭東海普薬業社、ロット番号Ｈ３１０２０５９３）、ＲＰＭＩ１６４０培養液、胎牛血清、ＭＴＴ、１０％ＳＤＳ。

次の方法により製造される。
１．ＡＭＰ-Ｎａ：実施例1の方法により、ＡＭＰ: Ｎａ_２ＣＯ_３（ｗ／ｗ）＝５：３の
比率でＡＭＰ-Ｎａ溶液を製造した後、ｐＨ＝６．５りん酸塩緩衝液で１０倍に希釈して、ＡＭＰ-Ｎａの貯蓄液を製造する。ＡＭＰ-Ｎａ貯蓄液をｐＨ＝７．４りん酸塩緩衝液で細胞用濃度に調製する。
２．ＡＭＰ‐ＤＭＳＯ：ＡＭＰを５％ＤＭＳＯで溶解し細胞用濃度に調製する。
３．５‐ＦＵ:５‐ＦＵを生理食塩水で細胞用濃度に調製する。

以上の薬物はすべて使用する直前に新たに調製し、薬物細胞用終濃度は全て１００、５０、２５、１２．５、６．２５μｇ／ｍｌである。

腫瘍細胞株
人の白血病Ｋ５６２細胞は中科院上海細胞生物研究室の細胞庫から購買する。

細胞培養
使用された細胞はＲＰＭＩ１６４０培養液で培養し、培養液は１０％胎牛血清と１００Ｕ／ｍｌペニシリン、ストレプトマイシンを含む。

実験組分け：
実験はブランク対照組（溶媒+ＲＰＭＩ１６４０培養液）、陰性対照組（溶媒＋細胞懸濁液）、陽性対照組(５‐ＦＵ）、ＤＭＳＯ＋ＡＭＰ組及びＡＭＰ‐Ｎａを設立する。

実験方法：
１．対数成長期のＫ５６２細胞を収集して、１０００回転／分で５分間遠心分離し、上層を除去した後、ＲＰＭＩ１６４０培養液で細胞濃度を１×１０⁵／ｍｌに調製する。
２．９６穴細胞培養板に１０μｌ／穴で、不同濃度の薬物を順次に添加し、９０μｌ／穴で細胞懸濁液又は培養液を添加して、ＣＯ_２インキュベーターで培養する。
３．実験の終止の４時間の前に、１０μｌ／穴でＭＴＴを添加し、４８又は７２時間まで続いて培養した後、１００μｌ／穴で１０％ＳＤＳを添加して実験を終止する。
４．培養板を微量振動器で１０分間振動させ、５７０ｎｍの波長で吸光値を測定し、その結果をプリントし記録する。

データの統計
以下の式で制御率を計算する。
制御率（％）＝[（陰性ＯＤ平均値-ブランクＯＤ平均値）−（受験薬ＯＤ平均値-受験薬ブランクＯＤ平均値）]／（陰性ＯＤ平均値-ブランクＯＤ平均値）×１００／％
薬物濃度により制御率に対してリニアーレグレッション（ｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を行い、ＩＣ５０値を計算する。

実験結果
量数グラフの測定により、４８ｈ及び７２ｈに、Ｋ５６２細胞に対するＡＭＰ-ＮａとＡＭＰ‐ＤＭＳＯの殺傷作用の強さを比較した結果、４８ｈ細胞培養した場合、ＡＭＰ‐ＤＭＳＯとＡＭＰ-ＮａのＩＣ５０値はそれぞれ３２．２７μｇ／ｍｌ及び２９．５６μｇ／ｍｌであり、７２ｈ細胞培養をした場合、ＡＭＰ‐ＤＭＳＯとＡＭＰ-ＮａのＩＣ５０値はそれぞれ４．０９μｇ／ｍｌ及び４．２３μｇ／ｍｌであることから、両方が人の白血病Ｋ５６２細胞に対する殺傷作用には顕著な差異が存在しないことが確認された（図１）。

結論：
以前ＡＭＰは溶媒としてジメチルスルホキシドを用いて溶解を促進したが、該方法は溶解度が低く、且つこの溶媒も臨床に応用することが困難である。なお、体外、体内実験を行う場合、ジメチルスルホキシドは実験結果に一定の影響を及ばす。本発明の方法により製造されたＡＭＰ-Ｎａ溶液は、ｐＨ＝６．５のりん酸塩緩衝液でｐＨを７．４に調節して、ＡＭＰナトリウム塩製剤とＤＭＳＯ助溶方法が薬効学で差異が存在するかどうかを視察した。本実験はＭＴＴ法により、４８ｈ及び７２ｈにＫ５６２細胞に対するＡＭＰ-ＮａとＡＭＰ‐ＤＭＳＯの殺傷作用の強さを比較した結果、Ｋ５６２細胞に対するＡＭＰ-Ｎａの殺傷作用とＡＭＰ‐ＤＭＳＯの作用は類似であることが確認された。且つＡＭＰ-Ｎａは水溶性であるので、臨床に用いられることができるため、最も好ましい製剤方法である。

実施例３ＡＭＰ-Ｎａ塩の抗腫瘍作用及び協力作用
ＡＭＰ‐Ｎａの抗腫瘍作用を研究し、且つ薬物として単独で使用される場合の腫瘍の成長に与える影響及び化療薬と配合使用される場合の協力作用を確認するため、本実施例において、ＡＭＰ-Ｎａの体内腫瘍制御作用に対して、荷Ｓ１８０肉腫瘍のＫＭマウスを用いて実験を行う。実験は、ＡＭＰ-Ｎａが単独に使用される場合と３種化療薬(ＣＴＸ、５-ＦＵ和カルボプラチン)と配合使用される場合の協力作用を観察する。マウス腋下の皮下にマウスＳ１８０肉腫瘍細胞を０．５−１×１０⁶細胞/匹で接種し、接種した後翌日に組を分けて薬物を投与する。薬物を配合使用する組は、先ず腹腔に化療薬を注射した後、１５分間経てから腹腔にＡＭＰ-Ｎａを注射する。両方とも隔日一回に投与し、共に６−８回を投与する。実験の終わりに腫瘍塊を取って重量を称し、腫瘍の制御率を計算する。制御率≧４０％且つ統計学で処理してＰ＜０．０５である場合を有効であると認定して、受験薬の腫瘍の制御効果を観察する。実験結果、ＡＭＰ-Ｎａを単独使用する場合、抗腫瘍作用の無い或いは比較的に弱い抗腫瘍作用を具備した。しかし、ＡＭＰ-Ｎａと化療薬を配合使用する場合、Ｓ１８０肉腫瘍に対して顕著な抗腫瘍協力作用を具備した。具体的な実験結果は次のようである。

実施例1の方法により、ＡＭＰ-Ｎａを製造した後、ｐＨ＝６．５の１８０ｍｌリン酸塩緩衝液で溶液のｐＨを７．２に調整する。溶液を０．４５、０．２２μｍろ過フィルムでろ過除菌し、分注し、４℃に保存して予備する。臨床に使用する前に、ＡＭＰ-Ｎａを高圧滅菌したｐＨ＝７．４のリン酸緩衝液で目的の濃度に調製した後、投与する。

１．２５−ＦＵ、ＣＴＸ及びカルボプラチンは、すべて使用する前に生理食塩水で新たに調製する。

動物は昆明種マウスを使用し、ＳＰＦ級、１８−２２ｇ、雌雄を兼用し、中国蘭州大学実験動物センターから購買する（生産許可症番号：医動字第１４−００５）。同一の組の実験には同じ性別の動物を使用する。

腫瘍細胞株はマウスＳ１８０肉腫瘍細胞株であり、全部昆明マウスの腹腔内で繁殖し種を保つ。

腫瘍移植増殖及び薬物治療:Ｓ１８０とＨ２２細胞懸濁液(２．５×１０⁶細胞／ｍｌ)を無菌下で取って、マウスあたりに０．２ｍｌをマウス腋下の皮下に接種する（マウス当たりに５×１０⁵個細胞を接種することに相当する。）。接種の翌日に、無作為で組を分けて、薬物治療を行う。投与方法はＡＭＰ-Ｎａ５０、７５、１１２、１６７ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｌ／１０ｇ、ｉｐであり；配合使用する場合、化療薬の投与の１５分後に、ＡＭＰ-Ｎａを投与する。両方はすべて隔日に一回投与し、共６−８回を投与する。

腫瘍重量測定及び腫瘍制御率（％）の計算：最後に投与した翌日に、体重を称し、動物を致死させ、解剖し腫瘍塊を取って、腫瘍の重量を称する。腫瘍の制御率は下記の式で計算する（％）:
腫瘍の制御率（腫瘍の成長制御率、％）＝（陰性対照組の腫瘍の平均重量（ｇ）−薬物投与した組の腫瘍の平均重量（ｇ））／陰性対照組の腫瘍の平均重量（ｇ）×１００％
有効の判定基準：腫瘍制御率（即ち、腫瘍の成長制御率）＜４０％になると無効であり；腫瘍の制御率≧４０％且つ統計学で処理してＰ＜０．０５になると有効である。

実験結果
１．マウスの肉腫瘍Ｓ１８０を治療する際のＡＭＰ-ＮａとＣＴＸの協力作用。
陽性対照組と比べて、ＡＭＰ-ＮａとＣＴＸの配合使用組の腫瘍の重量が顕著に減少され、差異は顕著性を具備した。その中で、５０、７５ｍｇ／ｋｇＡＭＰ-ＮａとＣＴＸを配合使用組の腫瘍の重量はＣＴＸを単独に使用した組より顕著に小さい。５０、７５、１１２、１６７ｍｇ／ｋｇＡＭＰ-Ｎａを単独に使用した組の腫瘍制御率はそれぞれ７．６６、６．８４、−３．８６及び−１６．２５％であり;５０、７５、１１２、１６７ｍｇ／ｋｇＡＭＰ-ＮａとＣＴＸ薬物を配合使用した組の腫瘍制御率はそれぞれ６４．４５、６８．０７、４６．１３和６４．５２％であり;ＣＴＸ組の腫瘍制御率は５３．３０％である。

２. マウスのＳ１８０肉腫瘍を治療する際のＡＭＰ-Ｎａと５−ＦＵの協力作用
陽性対照組に比べて、ＡＭＰ-Ｎａと５−ＦＵの配合使用組の腫瘍の重量が顕著に減少され、差異は顕著性を具備した。さらに、腫瘍の制御率に対する使用量の依頼性関係が存在する。その中で、５０、７５、１１２ｍｇ／ｋｇＡＭＰ-Ｎａと５−ＦＵの配合使用組の腫瘍の重量は５−ＦＵを単独に使用した組に比べて顕著に小さい。５０、７５、１１２、１６７ｍｇ／ｋｇＡＭＰ‐Ｎａを単独に使用した組の腫瘍制御率はそれぞれ４．４３、３１．２８、３３．４９及び４．４５％であり；５０、７５、１１２、１６７ｍｇ／ｋｇＡＭＰ-Ｎａと５−ＦＵを配合使用する組の腫瘍制御率はそれぞれ５７．７５、５１．８７、５９．２１及び３６．６５％であり；５−ＦＵ組の腫瘍制御率は４５．５５％である。

３．マウス肉腫瘍Ｓ１８０を治療際のＡＭＰ‐Ｎａとカルボプラチンの協力作用。
陽性対照組の比べて、ＡＭＰ‐Ｎａとカルボプラチンの配合使用組は、腫瘍の重量が顕著に減少され、差異は顕著性を有する。その中で５０、７５、１１２、１６７ｍｇ／ｋｇＡＭＰ‐Ｎａとカルボプラチンの配合使用する組の腫瘍の重量はカルボプラチンを単独に使用した組より顕著に小さい。５０、７５、１１２、１６７ｍｇ／ｋｇＡＭＰ‐Ｎａを単独に使用した組の腫瘍制御率はそれぞれ２３．２２、３．９９、１３．８７及び−７．４７％であり;５０、７５、１１２、１６７ｍｇ／ｋｇＡＭＰ‐Ｎａとカルボプラチンを配合使用する組の腫瘍の制御率はそれぞれ６５．１１、５４．３５、６６．３７及び５９．２６％であり；カルボプラチンの腫瘍制御率は４９．５２％である。

結論
ＡＭＰ‐Ｎａと３種化療薬ＣＴＸ、５‐ＦＵ和カルボプラチンを腹腔に注射して配合使用した場合、すべて抗マウスＳ１８０肉腫瘍の協力作用を具備した。５０‐１６７ｍｇ／ｋｇＡＭＰ‐Ｎａと化療薬５‐ＦＵ、ＣＴＸ及びカルボプラチンとの配合使用はマウスＳ１８０肉腫瘍の成長を不同の程度で制御し、化療薬５‐ＦＵ、ＣＴＸ及びカルボプラチンを単独に使用した組に比べて、差異は顕著性を具備した。７５‐１１２ｍｇ／ｋｇの範囲内のＡＭＰ‐Ｎａと化療薬物を配合使用する際の抗マウスＳ１８０肉腫瘍の作用がより顕著である。

実施例４ＡＭＰ‐Ｎａ₄塩の毒性の研究
マウスに対するＡＭＰ‐Ｎａの急性毒性作用を研究するため、そのＬＤ５０値と最大耐受量を確定し、ＡＭＰと対比を行う。

昆明種のマウスにＡＭＰ‐Ｎａ静脈注射をし、投与した後７日内に動物の死亡表現及び死亡分布の状況を観察する。慢性死亡動物を解剖して、主な臓器と目視で観察し得る病変臓器を取り、固定し、病理切片を製造して観察する。結果、ＡＭＰ‐Ｎａ静脈注射する場合、雄性と雌性のマウスのＬＤ５０値はすべて２０００ｍｇ／ｋｇ、ＬＤ０＞１０００ｍｇ／ｋｇである。しかし、ＡＭＰ‐ＤＭＳＯ組における動物のＬＤ５０値は１０００ｍｇ／ｋｇであることから、毒性が顕著に低下されたことが表明された。

５ｍｌＡＭＰ‐ＰＥＧ溶液を用いて、ＡＭＰ:Ｎａ₂ＣＯ₃（ｗ／ｗ）＝５:３になるよう
に１．２５ｇＮａ₂ＣＯ₃を添加し、３６．２５ｍｌ生理食塩水及び０．７５ｍｌの３７％ＨＣｌを加えて、濃度が５０ｍｇ／ｍｌ（その中で、溶媒の濃度は、ＰＥＧ４００は０．０３ｇ／ｍｌであり、プロピレングリコールは０．０４４５ｇ／ｍｌであり,エタノールは０．０１５ｇ／ｍｌである）であるＡＭＰ‐Ｎａを得る。最終ＡＭＰ‐Ｎａ溶液のｐＨ値は７．３である。ＡＭＰ‐Ｎａ貯蓄液を生理食塩水で必要である濃度に調製し、０．２ｍｌ／１０ｇで、腹腔又は静脈注射で投与する。

動物は昆明種マウスを使用し、ＳＰＦ級、１８‐２２ｇ、雌雄を兼用し、中国蘭州大学実験動物センターから購買する（生産許可証番号：医動字第１４−００５）。
実験はＡＭＰ‐Ｎａ溶媒組とＡＭＰ‐Ｎａ系剤量組に分け、具体的な組分けは結果を参照する。各組のデータはすべて計数資料であり、ＤＡＳソフト‐ウエアで計算分析を行う。

結論：
マウスのＬＤ５０値は２０００ｍｇ／ｋｇ以上である。その中で、雄性動物がＡＭＰ‐Ｎａに対する最大耐受量は２０００ｍｇ／ｋｇ以上であるが、溶媒としてＤＭＳＯを採用した場合は、ＬＤ５０は１０００ｍｇ／ｋｇである。

実施例５アンペロプシンナトリウム塩の化学構造の分析
分子式Ｃ₁₅Ｈ₈Ｏ₈Ｎａ₄・５Ｈ₂Ｏである実施例１で製造されたＡＭＰナトリウム塩に対して、化学構造分析を行う。

（熱重分析）
室温（２０℃）乃至８０．２℃で重量減少は３．４１％であり、８０．２℃乃至１７６．０℃で重量減少は１２．３１％であり、総計１５．７２％である。該値はサンプルにおける４．５個の結晶水の理論値１６．５７％と基本的に間に合う。示差走査熱量法により検測した結果も１１９．６℃で吸熱ピークが表れ、間接に該構造に結晶が存在することが証明された。

（元素分析）
結果は、サンプルに炭素、水素元素の実測値はそれぞれ３５．８７％、３．６６％であり、理論計算値（炭素、水素はそれぞれ３６．１６％、３．６４％である）と基本的に一致する。

（イオンクロマトグラフ分析）
サンプルにおけるナトリウム元素の含有量の実測値は１８．６％であり、理論値（１８．４６％）と基本的に一致する。

（紫外線吸収スペクトル）
水溶媒における紫外線吸収スペクトルは、Ｅ帯には芳香核の精細構造が存在し、それぞれ２０４．６ｎｍ、２０６．１ｎｍ、２１０．１ｎｍ及び２１８．１ｎｍで４個の吸収ピークが出現した。Ｂ帯は３２８．３ｎｍで１個の吸収ピークが出現して、ナトリウムがないアンペロプシン（メタノールの中で）の吸収ピーク２９２．２ｎｍに比べて、その吸収ピークが３６．１ｎｍをレッドシフト（ｒｅｄｓｈｉｆｔ）されたことを示す。

（核磁気共鳴スペクトル）
機器：美国Ｖａｒｉａｎ ^UNITY ＩＮＯＶＡ５００超伝導脈動フーリエ変換核磁気共鳴スペクトルメーター

水素スペクトルと炭素スペクトルで以下の情報を得ることができる。
（１）アンペロプシンナトリウム塩は、１２．３（１Ｈ，ｂｒｓ）ｐｐｍで、５位ヒドロキシ基プロトンと４位酸素が分子内の水素結合を形成することを示す。

（２）アンペロプシンナトリウム塩の水素スペクトルは、アンペロプシンの水素スペクトルに比べて、３位ＯＨ、７位ＯＨ、３'／５'位ＯＨの吸収ピークが消失した。

（３）アンペロプシンナトリウム塩の炭素スペクトルは、アンペロプシンの炭素ピーク
に比べて、８位ＣＨ、６位ＣＨ、４'位Ｃ、３'／５'位Ｃ、７位Ｃ及びＣ＝Ｏの吸収ピークが約２〜３ｐｐｍシフトした。

（４）ｐＨを６に中和したアンペロプシンナトリウム塩の水素スペクトルとアンペロプシンの水素スペクトスは、各Ｈの化学シフトが基本的に一致する。

上記の結果は、アンペロプシンがナトリウム塩を形成した後、Ａ環、Ｂ環及びＣ環の３個環構造には変化が発生しないし、２、３位の水素が依然として存在し、５位ヒドロキシ基プロトンと４位酸素が分子内で水素結合を形成したことを説明する。上記のデータを総合して見ると、３、７、３'、５'位ＯＨがそれぞれのＨをＮａに置換されたことが推定される。

アンペロプシンナトリウム塩（Ａｍｐ‐Ｎａ）の分子式はＣ₁₅Ｈ₈Ｏ₈Ｎａ₄・５Ｈ₂Ｏであり、相対分子質量は４９８．０３である。その構造は次のようである。

実施例６アンペロプシンナトリウム塩の製造例ＩＩ
モル比が１：２のＮａ₂ＨＰＯ₄で重炭酸ナトリウムを取り替える以外は、実施例１の工程を重複する。結果、実施例１と同じようにＡＭＰナトリウム塩が製造され、分子式はＣ₁₅Ｈ₈Ｏ₈Ｎａ₄・５Ｈ₂Ｏである。
測定した結果から、製造されたアンペロプシンナトリウム塩の溶解性と安定性が同様に顕著に改善されたことが表明された。

実施例７アンペロプシンナトリウム塩の製造例ＩＩＩ
モル比が１：４のＮａＡｃで重炭酸ナトリウムを取り替える以外は、実施例１の工程を重複する。結果、実施例１と同じようにAMPナトリウム塩が製造され、分子式はＣ₁₅Ｈ₈Ｏ₈Ｎａ₄・５Ｈ₂Ｏである。
測定した結果から、製造されたアンペロプシンナトリウム塩の溶解性と安定性が同様に顕著に改善されたことが表明された。

実施例８アンペロプシンナトリウム塩を含有する薬物組成物
以下の処方の薬物組成物を製造する。

該薬物組成物は腫瘍の制御に用いられる。
実施例９アンペロプシンナトリウム塩の複合薬物組成物
以下の処方の薬物組成物を製造する。

該薬物組成物は、ＡＭＰナトリウム塩とＣＴＸの協力効果により、ＣＴＸの副作用を低下することができる。

本発明に係るすべての文献は、それぞれ単独に参考として引用されるように、本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明に対して各種の変動や修正をすることが可能で、それらの等価の様態は同様に本発明の請求書の範囲に含まれることが理解されるのである。

図１は、４８ｈと７２ｈに、Ｋ５６２細胞に対するＡＭＰ‐ＮａとＡＭＰ‐ＤＭＳＯの殺傷作用量の量数グラフの比較を表す。

Claims

アンペロプシン塩は一価のカチオンでアンペロプシンの水素原子を置換して形成された塩であり、且つ前述置換は不飽和置換であることを特徴とするアンペロプシン塩又はその誘導体。
前述アンペロプシン塩は下記の式Ｉで表される、
Ｃ₁₅Ｈ₆Ｏ₈Ｈ_αＭ_β （Ｉ）
式中、Ｍは一価カチオンであるＬｉ⁺、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、

であることを特徴とする請求項１に記載のアンペロプシン塩又はその誘導体。
ＭはＮａであることを特徴とする請求項１に記載のアンペロプシン塩又はその誘導体。
前述アンペロプシン塩はアンペロプシン不飽和ナトリウム塩を有する二水和物又は五水和物であることを特徴とする請求項３に記載のアンペロプシン塩又はその誘導体。
前述五水和物は下記の構造を有することを特徴とする請求項４に記載のアンペロプシン塩又はその誘導体、
（ａ）アンペロプシンと式ＩＩで表される成塩剤を反応させて、式Ｉで表されるアンペロプシン塩を形成し、

式中、
Ｍは一価カチオンであるＬｉ⁺、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、
ＺはアニオンであるＨＣＯ₃ ^-、ＣＯ₃ ^2-、ＰＯ₄ ^3-、ＨＰＯ₄ ^2-、Ｈ₂ＰＯ₄ ^-、Ａｃ^-からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、
ｎは１、２又は３であり、

であり、工程（ａ）において、アンペロプシンと成塩剤におけるＭのモル比は１:２〜１:
５である；
（ｂ）形成されたアンペロプシン塩又はその水和物を分離する；
工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のアンペロプシン塩又はその誘導体を製造する方法。
前述成塩剤は、重炭酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムからなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
請求項１-５のいずれに記載されたアンペロプシン塩又はその誘導体及び薬学で許容される塩を含有することを特徴とする薬物組成物。
前述薬物組成物は、更に他の抗腫瘍薬物を含有することを特徴とする請求項８に記載の薬物組成物。
（ａ）式Ｉで表されるアンペロプシン又はその誘導体と薬物的に許容される担体を混合して、薬物組成物を形成し、
Ｃ₁₅Ｈ₆Ｏ₈Ｈ_αＭ_β （Ｉ）
式中、Ｍは一価カチオンであるＬｉ⁺、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺からなる群より選ばれる一つ又はその組み合わせであり、

である、工程を含むことを特徴とする薬物組成物の製造方法。