KR20000073485A

KR20000073485A - 신규의 백금(ｉｖ)착제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20000073485A
Application number: KR1019990016801A
Authority: KR
Inventors: 황규자; 김원규
Original assignee: 권영이
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2000-12-05
Also published as: KR100317473B1; JP3354532B2; JP2000319290A; US6340770B1

Abstract

본 발명은 신규의 백금(IV)착제 및 그 제조방법에 대한 것으로서 보다 상세하게는, 항암제로서 유용한 신규의 백금(IV)착제 및 그 제조방법에 대한 것으로서, 하기 화학식 3으로 표시되는 백금(IV)착제가 개시된다.

<화학식 3>

상기 식에서,

X는 Cl_2,말로네이토(malonato ;),

1,1-시클로부틸-디카르복실레이토(1,1-cyclobuthyl-dicarboxylato ;), 옥살레이토(oxalato ;) 또는 글리콜레이토(glycolato ;) 이며,

R₁및 R₂는 각각 -OH, -Cl, -OCOCH₃, -OCOCF₃또는 -OCO(CH₂)_nCH₃(n은 1 내지 4 중의 정수)이다.

Description

신규의 백금(ＩＶ)착제 및 그 제조방법{Novel Pt(IV) complex and preparing method thereof}

본 발명은 신규의 백금(IV)착제 및 그 제조방법에 대한 것으로서 보다 상세하게는, 항암제로서 유용한 신규의 백금(IV)착제 및 그 제조방법에 대한 것이다.

오늘날 인류에게 가장 큰 고통을 주고있는 질환중의 하나가 암(cancer)이다. 인류는 암의 존재를 확인한 이후 항암제 개발, 유전자치료, 수술요법, 방사선 요법등 암을 정복하기 위한 다각적인 노력과 연구를 계속해오고 있다.

그중에서도, 시스-디아민디클로로플라티늄(cis-Diaminedichloroplatinum(II) : cisplatin) (이하, 시스플라틴이라 한다)을 비롯한 여러 백금착체들은 매우 우수한 항암제로 인정되어 임상적으로 현재 쓰이고 있으며, 임상시험중에 있는 유도체들이 있고, 계속해서 새로운 유도체들도 등장하고 있다.

특히, 시스플라틴(cis-Diaminedichloroplatinum(II), cisplatin)^1-2)은 1972년에 소개되어 현재까지 임상적으로 쓰이고있는 항암제로써 기존의 다른 항암제로는 치료가 어려웠던 전립선암에서 탁월한 치료효과를 나타내고 있으며, 그외에도 난소암, 방광암등의 고형암에 뛰어난 치료효과를 보여주었다.^3-10)화학식 1에 도시된 바와 같이, 시스플라틴은 백금(II)착물이며, 중앙에 위치한 백금이 아민과 안정한 화합물을 이루고 있다.

<화학식 1>

시스플라틴의 항암작용기전을 살펴보면 다른 알킬화제와 마찬가지로 염소배위자가 DNA와 자리바꿈하여 안정한 결합을 이룸으로써^66-67)DNA의 구조에 현저한 변화를 주는 것으로 고찰되었다.^68-69)

시스플라틴을 생체내에 투여하면 혈액, 임파액, 장내액등 염소이온 농도가 높은 곳에서는(103mM) 충분한 양의 염소이온이 존재하고있기 때문에 시스플라틴의 염소이온이탈이 억제되고, 전하를 띠지 않은 착체상태로 수동적 확산에 의해 세포내로 들어간 후 가수분해를 받아 디아쿠아(diaqua)착체가 되는 것으로 알려졌는데. 그 이유는 세포외부보다 세포내의 염소이온 농도가 30배나 낮기(4mM) 때문으로 보고되었다.⁹¹⁾일단 세포내로 들어가 아쿠아착체인 Pt(OH)₂(NH₃)₂또는 Pt(OH)(OH₂)(NH₃)₂형태로 양이온화된 시스플라틴은 음이온화된 DNA의 나선구조와 전기적 인력이 작용하여 결합하게 되는 것으로 알려졌다.^92-93)

시스플라틴과 DNA와의 결합은 암세포와 정상세포에 대하여 같은 정도로 일어나는데 암세포는 증식속도가 정상세포보다 훨씬 빠른 반면, 손상되었을 때 회복되는 정도가 매우 느리기 때문에 정상세포보다 암세포에 대한 장해가 큰 것으로 보고되었다.^87-90)

그러나 시스플라틴은 다음의 몇가지 문제점들로 인하여 임상에서 제한된 경우에만 사용되고 있다.

첫째, 치료받는 환자의 20%정도에서 심각한 부작용인 신독성 및 오심, 구토, 난청, 신경독성등을 일으키며^15-17)

둘째, 항암작용이 광범위하지 못하여 유방암이나 직장암등 몇몇 암에 대하여 낮은 치료효과를 나타내고¹⁸⁾

셋째, 시스플라틴내성 종양 세포의 발현과^19-21)

넷째, 낮은 수용성등의 문제점들이 있다.

다섯째, 신장독성이 심각하여 많은 문제를 유발시키고 있는데 시스플라틴의 신장독성은 용량증가에 따른 독성증가(dose-limiting)로서²²⁾주로 세뇨관 괴사를 일으키는데 신피질에 직접적으로 독성을 나타내고 원위세뇨관과 집합관에도 손상을 주며 근위세뇨관(renal proximal tubule)의 손상이 가장 심한 것으로 보고되었다.^23-26)

이러한 시스플라틴의 문제점들을 극복하기 위한 제2 세대 백금착제로서 시스-디아민(1,1-시클로부탄-디카르복실레이토)플라티늄(II)(cis-diamine(1,1-cyclobutane-dicarboxylato)platinum(II) : carboplatin) (이하, 카보플라틴이라 한다)이 개발되어 현재 임상에서 사용되고 있다.

카보플라틴(화학식 2)은 시스플라틴의 염소기(chloro)가 1,1-시클로부탄디카르복실레이토(1,1-cyclobutanedicarboxylato)로 치환된 화합물로, 신독성이나 오심등의 부작용이 시스플라틴보다 적고,^31-32)수용성이 좋으며, 난소암, 소세포 폐암등의 몇종류의 암에서 시스플라틴과 비슷한 효과를 나타내어 우수한 항암제로 인정되었다.^33-34)

<화학식 2>

그러나 여전히 좁은 항암스펙트럼^33),35)과 시스플라틴과의 교차내성발현으로 시스플라틴에 내성이 있는 암세포에 적용하지 못하는 문제점을 나타내었다.^36-37)

시스플라틴의 내성세포가 발현되는 기전을 살펴보면, 백금착체가 DNA에 작용하여 장애를 줄때 손상받은 DNA가 복구되는 율이 증가하며, 세포내 글루타티온(glutathion)과 같은 분자량이 적은 티올(thiol)기를 가진 세포내 물질의 수치가 올라감으로 인하여 약물을 불활성화시키고, 약물의 세포내 재흡수를 감소시키는 작용 등을 유발하게 된다.

따라서, 앞으로 개발되는 유도체는 시스플라틴 내성세포주의 살멸에 초점을 맞추어야 할것으로 전망된다. 그 이유는 30여년간 항암제로 사용된 시스플라틴에 대하여 암세포들이 내성을 가지게 되었기 때문이다. 다양한 백금(II)착체들이 개발되었고 임상시험중에 있지만 시스플라틴과 교차내성을 보여 그 한계를 갖는 바, 이를 극복할 수 있는 대체 물질의 개발이 요구된다.

또한 환자의 고통을 완화시키기 위해, 주사제로만 적용하였던 한계를 극복하기 위하여 경구용으로도 사용이 가능한 백금착체의 개발이 또하나의 과제가 되고 있다. 이러한 과제들을 해결할 수 있는 물질로서 현재 백금(IV)착체가 개발되고 있다. 그러나, 이외에도 우수한 수용성과 지용성 및 신장 독성의 유발 위험성이 낮아야 하는 등 신규의 항암제가 만족해야 할 조건은 여러 가지가 있다.

본 발명은 첫째, 뛰어난 항암활성을 가지며 둘째, 시스플라틴 내성세포주에도 항암활성을 보이고 셋째, 지용성이 좋으며, 넷째, 신장 독성이 적고 다섯째, 경구로 투여할 수 있는 신규의 항암제 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 신규 항암제의 합성에 사용되는 중간체 및 이를 이용한 항암제의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1 내지 도 3은 X-레이 회절법에 의해 측정한 본 발명에 따른 백금(IV)착체의 결정구조를 도시한다.

도 4 내지 도7b는 전자현미경으로 측정한 본 발명에 따른 백금(IV)착체의 미세구조를 도시한다.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 백금(IV)착제를 제공한다.

<화학식 3>

상기 식에서,

X는 Cl_2,말로네이토(malonato ;),

또한, 상기 화학식 3의 화합물을 합성하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명자는 수 많은 연구 및 실험을 반복한 결과, 상기 화학식 3으로 표시되는 신규의 백금(IV)착체가 항암제로서 우수한 특성을 가짐을 발견하였다.

상기한 화학식 3의 화합물은 우선 7원환 백금착체를 기본 구조로 함으로써, 시스플라틴 보다 우수한 항암활성을 갖도록 하였다. 이때, 상기 7원환을 구성하는 배위자는 1,4-부탄다이아민(1,4-butanediamine)으로 선택하였다.

1,4-부탄다이아민에 다른 기능기를 추가로 도입하지 않은 이유는 단순한 7원환 자체만으로도 5원환이나 6원환보다 환의 크기가 더 커서 DNA와 결합할 때 나선 구조를 심하게 틀어지게 하므로, 추가적인 기능기를 도입할 경우 분자가 더욱 커져 DNA의 이중나선 구조에 더 많은 영향을 주어 독성을 유발시킬 가능성을 배제할수 없기 때문이다.

탈리기로는 지용성이 좋은 염소배위자 등과, 수용성이 좋은 생체내의 대사물인 말론산 등을 각각 도입하였다.

또, 평면구조인 백금(II)착체의 항암활성의 한계를 극복하고, 생체내 이용효율을 높이기 위해서 수직배위자를 도입하여 팔면체 구조를 이루도록 하였다.

대개 백금(IV)착체는 2가의 백금착체가 산화되어 4가 형태의 백금착체가 된것으로 4가 백금착체는 생체내 리포필리서티(liphopilicity)를 높여주어 생체내 이용효율이 높고 프로드러그(prodrug) 형태로 작용하여 생체내에서 2가로 환원되어 항암활성을 나타내므로 독성이 적은 것으로 알려져 있다.^145-148)

본 발명에 따른 보다 바람직한 화합물에는 하기 화학식 4 내지 9의 화합물이 있다.

(1) 트랜스, 시스-디하이드록소,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체 (이하, 7(OH)Cl라 약칭한다) : trans, cis-dihydroxo,dichloro-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

<화학식 4>

상기 화학식 4의 백금(IV)착체는 하기 반응식 1에 도시된 바와 같이, 디클로로-1,4-부탄디아민 Pt(II) 착물(dichloro-1,4-butanediamine Pt(II) complex)에 30%H₂O₂를 가하여 평면인 백금(II)착체를 산화하여 수직으로 하이드록시(hydroxy)기를 도입함으로써 팔면체 구조의 [7(OH)Cl]를 얻는다.

상기 디클로로-1,4-부탄디아민 Pt(II) 착물(dichloro-1,4-butanediamine Pt(II) complex)는 반응식 1에 도시된 바와 같이 통상의 방법에 따라 얻은 것을 사용한다.

<반응식 1>

(2) 트랜스,시스-디아세테이토,디클로로-1,4-부탄디아민 Pt(IV) 착체(이하, [7(Ac)Cl]라 약칭한다) : trans, cis-diacetato,dichloro-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

<화학식 5>

상기 화학식 5의 백금(IV)착체는 상기 화학식 4의 화합물 즉 7(OH)Cl에 아세틸기를 도입한 것으로서, 하기 반응식 2에 도시된 바와 같이, 용매로 CH₂Cl₂를 사용하여 7(OH)Cl에 무수초산을 과량 가하여 반응시켜 합성하였다.

<반응식 2>

(3) 트랜스, 시스-디트리플로로아세테이토-1,4-부탄디아민 Pt(IV) 착제 (이하,[7(TF)Cl]라 약칭한다) : trans, cis-ditriflioroacetato,dichloro-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

<화학식 6>

상기 화학식 6의 백금(IV)착체는 하기 반응식 3에서와 같이, 7(OH)Cl에 트리플루오르아세트 안하이드라이드(trifluoracetic anhydride)를 과량 가하여 반응시킴으로써 얻는다.

<반응식 3>

(4) 트랜스-디하이드록소,말로네이토-1,4-부탄디아민 Pt(IV) 착제 (이하, [7(OH)M]라 약칭한다): trans-dihydroxo,malonato-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

<화학식 7>

상기 화학식 7의 백금(IV)착체를 합성하기 위해서, 반응식 4에 도시된 바와 같이, 먼저, 시스-디아이오도-1,4-디부탄디아민 Pt(II) 착물( cis-diiodo-1,4-butanediamine Pt(II) complex )에 디실버 말로네이트염(disilver malonate salt)을 반응시킨 후, 침전인 AgI를 제거하고 수용액을 농축시켜 흰색의 비늘상의 침전인 말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(II) 착물( malonato-1,4-butanediamine Pt(II) complex : 이하 7M라 한다)를 얻는다.

이어서, 상기 합성된 7M에 과량의 30%H₂O₂를 가하여 [7(OH)M]를 합성한다.

<반응식 4>

(5) 트랜스-디아세테이토,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체 (이하,[7(Ac)M]라 한다) : trans-diacetato,malonato-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

<화학식 8>

반응식 5에 도시된 바와 같이, CH₂Cl₂를 용매로 하여, 7(OH)M에 무수초산을 과량 가하여 반응시킨 후, 이어서, 물과 메탄올을 3:2로 한 용매로 재결정하면, 침상의 흰색 결정성 침전 형태로 상기 화학식 8의 [7(Ac)M]이 얻어진다.

<반응식 5>

(6) 트랜스-디트리플로로아세테이토,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체 (이하,[7(TF)M]) ; trans-ditrifluoroacetato,malonato-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

<화학식 9>

상기 화학식 9의 백금(IV)착체는 생체내 이용효율을 높일수 있는 불소원자가 도입된 물질로서, 하기 반응식 6에 도시된 바와 같이, 먼저, 7(OH)M에 트리플루오르아세틱 안하이드라이드(trifluoroacetic anhydride)를 과량 가하여 반응시켜 트랜스-트리플루오르아세토, 말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV)착물 ( trans-trifluoroacetato,malonato-1,4-butanediamine Pt(IV) complex ; 이하 [7(TF)M]라 한다 )를 합성한 후, 이를 메탄올로 정제하여 정육면체의 투명한 단일 결정으로 얻는다.

<반응식 6>

합성 및 구조 규명

이하에서는 본 발명에 따른 바람직한 백금(IV)착체의 합성예 및 합성에 의해 얻어진 화합물의 구조를 규명한다. 그러나 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

트랜스,시스-디하이드록소,디클로로-1,4-부탄디아민 Pt(IV) 착체 / [ 7(OH)Cl ]의 합성 : trans,cis-Dihydroxo,dichloro-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

[7Cl] 3g(8.48mM)을 물 100ml에 현탁하고 30% 과산화수소수 30ml를 가하여 80˚C에서 5시간 반응시켰다. 반응 후, 감압 농축하여 미황색의 침전이 생성되면 메탄올을 300ml 가하여 4˚C에서 2시간 이상 방치한 후, 여과하여 침전을 메탄올로 세척한 후, 60˚C에서 감압 건조하여 밝은 미황색의 결정성 침전 2.17g을 얻었다.

수득률 : 65.95%

IR (KBr,cm^-1) : 3502, 3200, 1572, 1027, 545

¹H-NMR (D₂O) : 3.2(2H), 2.8(4H),2.5(4H), 1.7(4H),

원소분석결과 : C₄H₁₄N₂Cl₂O₂Pt에 대한 이론치

C; 12.37%, H; 3.61%, N; 7.22%, O; 8.25%

측정치

C; 12.35%, H; 3.63%, N; 7.25%, O; 8.25%

합성한 [ 7(OH)Cl ]의 OH기를 확인하기 위하여 적외선 분광법으로 분석한 결과 3500cm^-1부근에서 O-H결합의 강한 신축진동이 단일 피크로 나타났으며 N-H결합의 신축진동은 3200cm^-1부근에서 넓게 나타났다.

실시예 2

트랜스,시스-디아세테에토,디클로로-1,4-부탄디아민 Pt(IV) 착체의 합성 (이하, [ 7(Ac)Cl ] ) : trans,cis-Diacetato,dichloro-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

7(OH)Cl 1g(2.577mM)을 메틸렌클로라이드 100ml에 현탁시키고 아세틱안하이드라이드(acetic anhydride) 20ml를 가하여 환류하면서 3일간 반응시켰다. 반응후 감압농축하여 얻은 침전을 메탄올에 녹이고 여과한 후, 여액을 재결정하여 투명한 미황색 직육면체 형태의 결정 0.96g을 얻었다.

수득률 : 78.9%

IR(KBr,cm^-1) : 3159, 3039, 1598, 1363, 1295, 986, 704, 503

¹H-NMR(DMSO-d₆) : 7.9(4H), 2.5-2.7(4H), 1.9-2.0(6H), 1.65(4H)

¹H-NMR(CD₃OD) : 2.85-2.95(4H), 2.1(6H), 1.85(4H)

¹³C-NMR(CD₃OD) : 183.1, 49.5, 49.3, 49.1, 49, 48.8, 48.6, 48.5, 48.2,

27.6, 23.6

원소분석결과 : C₈H₁₈N₂Cl₂O₄Pt에 대한 이론치

C; 20.34%, H; 3.81%, N; 5.93%,

실험치 C; 20.33%, H; 3.80%, N; 5.93%,

상기 합성에 의해 얻어진 결정을 적외선 분광법, 핵자기공명 분광법, 원소분석으로 구조를 확인하였고, X-선 회절법으로 구조를 규명하였다.

적외선 분광법으로 분석한 결과 3500cm^-1부근의 O-H결합의 강한 신축진동이 하이드록시기가 없어짐으로 인하여 사라졌으며, 1600cm^-1부근에서 카보닐(C=O)기의 강한 신축진동 피크가 나타남을 확인할수 있었다.

¹H-NMR 스펙트라는 용매를 DMSO-d₆를 사용하여 분석한 결과 질소와 결합된 수소가 7.8-7.9ppm사이의 저자장에서 피크가 나타났고, 알킬기의 수소들은 1.6-3.9ppm사이에서 각 탄소에 결합된 수소의 비율로 피크를 나타내 보였으나 분리 상태가 나빠서 CD₃OD를 용매로 다시 분석한 결과 1.85ppm에서 아민과 가장 멀리 떨어진 2개의 탄소와 결합된 4개의 수소 피크와 2.1ppm에서 수직배위자에 존재하는 2개의 메틸기의 수소 6개의 피크와 2.9ppm에서 아민과 인접한 2개의 메틸기의 수소 4개의 피크가 각각 나타났다.¹³C-NMR 스펙트라에서는 183.1ppm에서 카보닐의 탄소피크를 확인할수 있었다. 원소분석 결과 분자내 탄소, 수소, 질소의 함량비가 이론치와 일치하였다.

한편, 합성된 [ 7(Ac)Cl ] 의 분자구조를 X-선 회절법으로 규명하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 보여지는 바와 같이, 7(Ac)Cl은 서로 비슷한 형태(conformation)를 갖는 두 개의 분자(A, B)가 결정내에 배열되어 있었고, 이들 두 개의 분자들은 N(1B)-H……O(2A) 분자간 수소결합으로 결합되어 있었다. A분자내의 수소결합은 N(1a)-H와 O(4a)사이에서와 N(2a)-H와 O(2a)사이에서 존재하였으며, B분자에서의 수소결합도 같은 위치에서 발견되었다. 백금(IV)이온과 1,4-부탄다이아민(1,4-butanediamine)이 만든 7원환 구조는 비틀어진 의자형(twist-chair)이었다.

하기 표 1은 X-선 회절법에 의해 얻어진 데이터로서, [ 7(Ac)Cl ] 착체내의 백금과 백금주위의 원소들과의 결합길이와 결합각도를 나타낸다.

<표 1>

Bond Length and Angle of trans,cis-Diacetato,dichloro-

(1,4-butanediamine) Pt(Ⅳ) complex

	A	B
Pt(1)-O(1)Pt(1)-O(3)Pt(1)-N(1)Pt(1)-N(2)Pt(1)-Cl(1)Pt(1)-Cl(2)	2.013(12)Å1.998(14)Å2.058(16)Å2.055(14)Å2.302( 5)Å2.315( 5)Å	2.014(14)Å2.018(15)Å2.052(15)Å2.054(16)Å2.304( 5)Å2.302( 5)Å
O(3)-Pt(1)-O(1)O(3)-Pt(1)-N(2)O(1)-Pt(1)-N(2)O(3)-Pt(1)-N(1)O(1)-Pt(1)-N(1)N(2)-Pt(1)-N(1)O(3)-Pt(1)-Cl(1)O(1)-Pt(1)-Cl(1)N(2)-Pt(1)-Cl(1)N(1)-Pt(1)-Cl(1)O(3)-Pt(1)-Cl(2)O(1)-Pt(1)-Cl(2)N(2)-Pt(1)-Cl(2)N(1)-Pt(1)-Cl(2)Cl(1)-Pt(1)-Cl(2)	175.6(6)85.4(7)96.5(6)97.6(7)86.2(6)98.0(6)83.6(5)92.5(4)85.7(5)176.3(5)90.3(5)87.7(4)175.2(5)84.6(5)91.9(2)	176.1(6)84.5(6)98.7(6)97.2(6)84.5(6)98.6(6)86.1(5)91.9(5)84.9(4)175.3(4)90.2(5)86.5(4)174.0(5)84.9(4)91.8(2)

상기 x-선 회절분석 결과에 따르면, R = 0.071(신뢰도)로 나타났다.

실시예 3

트랜스,시스-트리플루오로아세테이토,디클로로-1,4-부탄디아민 Pt(IV) 착체의 합성 / [7(TF)Cl] : trans,cis-Trifluoroacetato,dichloro-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

7(OH)Cl 1g(2.577mM)을 메틸렌클로라이드 100ml에 현탁시키고 트리플루오로아세틱안하이드라이드(trifluoroacetic anhydride) 15ml를 가하여 환류하면서 3일간 반응시켰다. 반응후 감압농축하여 얻은 침전을 메탄올에 녹이고 여과한 후, 여액을 재결정하여 투명한 미황색 다이아몬드형 결정 1.22g을 얻었다.

수득률 : 81.62%

IR(KBr,cm^-1) : 3254, 3209, 3177, 1724, 1565, 1376, 1224, 1166, 739

¹H-NMR(DMSO-d₆) : 7.4(4H), 2.5-2.75(4H), 1.7(4H)

¹H-NMR(CD₃OD) : 3.0-2.8(4H), 1.85(4H)

¹³C-NMR(CD₃OD) : 165.4, 165.1, 115, 112.7, 49.5, 49.3, 49.2, 49, 48.8, 48.5, 47.8, 26.9

원소분석결과 : C₈H₁₂N₂Cl₂O₄F₆Pt의 이론치

C; 16.55%, H; 2.07%, N; 4.83%,

실험치. C; 16.54%, H; 2.08%, N; 4.80%,

상기 미황색의 육각형 결정을 적외선분광법, 핵자기공명 분광법, 원소분석법으로 구조를 확인하였고, X-선 회절법으로 구조를 규명하였다.

적외선 분광법으로 분석한 결과 7(Ac)Cl에서와 마찬가지로 3500cm^-1부근의 O-H 강한 신축진동이 하이드록시기가 없어짐으로 인하여 사라졌으며, 1700cm^-1부근에서 카보닐(C=O)의 강한 신축진동이 하나의 피크로 나타났다. 대체적으로 카보닐기의 신축진동이 1600cm^-1에서 나타나는 것에 비하여 100cm^-1정도가 저파장쪽(더 높은 파수)으로 이동하였는데 이는 강력한 친전자체인 불소가 인접된 카보닐기의 전자를 끌어당겨 카보닐의 전자가 부족해졌기 때문으로 여겨진다. C-F결합의 신축진동은 1166cm^-1에서 강한 흡수를 나타내었다.

¹H-NMR 스펙트라는 용매를 DMSO-d₆를 사용하여 분석한 결과 아민의 수소가 7.4ppm의 저자장에서 피크가 나타났으며 아세틸기가 있는 백금착체보다 약 0.5ppm 고자장쪽으로 이동하였다. 이 현상 역시 불소원자의 친전자적인 성질 때문인 것으로 보여진다. 알킬기의 수소들은 1.7-2.8ppm 사이에서 나타났느나, 분리상태가 좋지 못하여 용매를 CD₃OD로 사용하여 분석한 결과 1.85ppm에서 아민과 가장 멀리 떨어진 2개의 탄소와 결합된 4개의 수소 피크와 2.9ppm에서 아민과 인접한 2개의 메틸기의 수소 4개의 피크가 각각 나타났다.

¹³C-NMR 스펙트라에서는 165.1, 165.4ppm에서 2개의 카보닐 탄소를 확인하였는데 7(Ac)Cl이 183.1ppm에서 카보닐의 탄소피크가 확인된데 비하여 약 18ppm가량 고자장쪽으로 이동하였는데 이는 불소의 영향으로 보였다. 그외 알킬기의 탄소들은 47.8-49.5ppm에서 확인되었다. 원소분석 결과 분자내 탄소, 수소, 질소의 함량비가 이론치와 일치하였다.

합성된 [7(TF)Cl] 의 분자구조를 확인하기 위해 X-선 회절법을 이용하여 X-ray 결정구조를 얻었으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 보여지는 바와 같이, [7(TF)Cl] 역시 분자내 수소결합이 존재하는데, N2-H와 O4사이에서와 N1-H와 O2사이에서 수소결합의 존재가 확인되었고, Pt이온과 1,4-부탄다이아민(1,4-butanediamine)이 만든 7원환 구조는 7(Ac)Cl과 마찬가지로 비틀어진 의자형(twist-chair)이었다.

표 2는 X-ray 결정구조로부터 측정된 분자내 백금과 백금주위의 원소들과의 결합길이 및 결합각도를 도시한다.

<표 2>

Bond Length and Angle of trans,cis-ditrifluoroacetato,

dichloro-(1,4-butanediamine)Pt(Ⅳ) complex

Pt-O(1)Pt-O(3)Pt-N(2)Pt-N(1)Pt-Cl(1)Pt-Cl(2)	2.002(7)2.015(7)2.040(9)2.080(9)2.303(3)2.306(3)
O(1)-Pt-O(3)O(1)-Pt-N(2)O(3)-Pt-N(2)O(1)-Pt-N(1)O(3)-Pt-N(1)N(2)-Pt-N(1)O(1)-Pt-Cl(1)O(3)-Pt-Cl(1)N(2)-Pt-Cl(1)N(1)-Pt-Cl(1)O(1)-Pt-Cl(2)O(3)-Pt-Cl(2)N(2)-Pt-Cl(2)N(1)-Pt-Cl(2)Cl(1)-Pt-Cl(2)	178.5(3)82.5(4)98.5(4)94.0(4)87.1(4)95.5(4)88.7(2)90.2(2)86.0(3)177.1(3)93.6(2)85.3(2)174.3(3)88.9(3)89.8(9)

상기 x-선 회절분석 결과의 신뢰도 R = 0.035 였다.

실시예 4

트랜스-하이드록소,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체의 합성 /[ 7(OH)M ] : trans-Hydroxo,malonato-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

7M( malonato-1,4-butanediamine Pt(II) complex ) 5g(12.99mM)을 물 300ml에 녹이고 30%과산화수소수 30ml를 가하여 상온에서 72시간 교반하면서 반응시켰다. 이때, 7(OH)Cl의 합성 때와는 달리 80℃의 고온에서 반응시키면 합성이 되지 않았고 상온에서 반응시켜야 합성이 완성된다. 이는 X-선 회절법으로 규명된 구조에서 보듯이 탈리기가 말로네이트인 백금착체는 분자내 약한 수소결합이 존재하며, 7원환의 형태가 가장 안정한 형태인 뒤틀린 의자형(twist chair form)이 아니라 의자형(chair form)이므로 고온으로 가열했을 때는 이 수소결합이 끊어져서 합성이 되지 않는 것으로 추정된다.

이 용액을 감압농축하여 5ml 정도가 되면 냉각된 메탄올을 가하여 침전을 생성시켰다. 여과하여 취한 침전을 메탄올 및 에테르로 세척하고 60˚C에서 감압건조하여 흰색의 침전 3.67g을 얻었다.

수득률 : 67.43%

IR(KBr,cm^-1) : 3525, 3205, 1660, 1370, 975, 753, 569

¹H-NMR(D2O) : 1.8-2.0(4H), 2.8(2H), 2.9(4H), 3.0(2H)

원소분석결과 : C₇H₁₆N₂O₆Pt에 대한 이론치

C; 20.05%, H; 3.82%, N; 6.68%,

실험치 C; 19.98%, H; 3.79%, N; 6.62%,

적외선 분광법으로 분석한 결과 3500cm^-1부근에서 O-H결합의 강한 신축진동을 발견할수 있었고 C=O의 신축진동은 1660cm^-1에서 강한 흡수를 보였으며 1370cm^-1에서 C-O결합의 강한 흡수가 나타났다.

원소분석결과는 분자내 탄소, 수소, 질소의 함량비가 이론치와 일치하였다.

실시예 5

트랜스-아세테이토,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체의 합성 / [ 7(Ac)M ] : trans-Acetato,malonato-1,4-butanediamine Pt(IV) complex 의 합성

7(OH)M ( trans-Hydroxo,malonato-1,4-butanediamine Pt(IV) complex ) 1.5g(3.58mM)을 취하여 이하 7(Ac)Cl과 동일한 방법으로 합성하여 물과 메탄올의 비를 2:3으로한 용액으로 재결정하여 흰색의 침상 결정 0.98g을 얻었다.

수득률 : 54.42%

IR(KBr,cm^-1) : 3444, 3172, 3049, 1660, 1362, 709, 532

¹H-NMR(D₂O) : 2.95-2.75(8H), 1.95-1.8(8H)

¹³C-NMR(D₂O) : 188, 183.9, 179.8, 179.2, 49.2, 48.7, 28.4, 28.1, 24.9

원소분석결과 : C₇H₁₆N₂O₆Pt 에 대한 이론치

C; 26.24%, H; 3.98%, N; 5.57%,

실험치. C; 26.19%, H; 3.95%, N; 5.53%,

적외선 분광법으로 분석한 결과 7(OH)M에서 보였던 3500cm^-1부근의 O-H피크는 사라지고 C=O의 신축진동은 1660cm^-1에서 강한 흡수를 보였으며 1370cm^-1와 1278 cm^-1에서 C-O결합의 강한 흡수가 나타났다.

¹H-NMR 스펙트라는 용매로 D₂O를 사용하여 측정하였으나 분리상태가 좋지 않았고¹³C-NMR스펙트라로 분석한 결과 4개의 카보닐(C=O) 탄소는 179.2, 179.8, 183.8, 187.9 ppm에서 나타났으며, 알킬기의 탄소들은 24.9-49.2ppm 부근에서 나타났다.

실시예 6

트랜스-트리플루오르아세테이토, 말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) complex의 합성 / [ 7(TF)M ] : trans-Trifluoroacetato,malonato-1,4-butanediamine Pt(IV) complex

7(OH)M 1.5g(3.58mM)을 취하여 이하 7(TF)Cl과 동일한 방법으로 합성하고 메탄올로 재결정하여 투명한 흰색 정육면체형태의 결정 1.45g을 얻었다.

수득률 : 66.29%

IR(KBr,cm^-1) : 3440, 3200, 3089, 1716, 1651, 1368, 1161, 739, 523

¹H-NMR(CD₃OD) : 3.6(2H), 2.9(4H), 2(4H)

¹³C-NMR(CD₃OD) : 176.4, 49.5, 49.3, 49.2, 49, 48.8, 48.6, 48.5, 47.4, 47.3, 26.5

원소분석결과 : C₁₁H₁₄N₂O₈F₆Pt에 대한 이론치

C; 21.6%, H; 2.29%, N; 4.58%,

실험치 C; 21.58%, H; 2.30%, N; 4.57%,

적외선분광법, 핵자기공명 분광법, 원소분석을 실시하여 구조를 확인하였고, X-선 회절법으로 구조를 규명하였다.

적외선 분광법으로 분석한 결과 7(Ac)M의 경우와 마찬가지로 3500cm^-1부근의 O-H피크는 사라지고 C=O의 신축진동은 불소의 친전자적인 영향을 받아 불소와 인접한 카보닐은 1716cm^-1에서 강한 흡수를 나타내었고, 말로네이트(malonate)의 카보닐은 1651cm^-1에서 강한 흡수를 보였으며 1368cm^-1에서 C-O결합의 강한 흡수를, 1161cm^-1에서 C-F결합의 신축진동이 강한 흡수를 나타내었다.

¹H-NMR 스펙트라는 용매로 CD₃OD를 사용하여 측정한 결과 아민과 가장멀리 떨어진 2개의 메틸기의 4개의 수소는 2ppm부근에서 피크가 나타났고, 아민과 인접한 2개의 메칠기에 대한 4개의 수소는 2.9ppm부근에서 피크가 나타났으며, 카보닐 사이에 위치한 탄소와 결합한 2개의 수소는 3.6ppm부근에서 피크가 나타났다.

¹³C-NMR스펙트라로 분석한 결과 불소원자의 친전자적인 영향을 받아 대부분의 피크가 고자장쪽으로 이동하여 47.3-49.5ppm사이에 집중적인 피크가 나타났다. 원소분석결과는 분자내 탄소, 수소, 질소의 함량비가 이론치와 일치하였다.

X-선 회절법에 의해 얻어진 결정구조를 도 3에 나타내었다.

도 3에 보여지는 바와 같이, [ 7(TF)M ] 역시 분자내 수소결합이 존재하는데, N1-H와 O6, N2-H와 O2간의 수소결합이 확인되었고, 7(Ac)Cl이나 7(TF)Cl과는 달리 7원환(seven-membered ring)의 구조는 의자형(chair형)이었으며 백금-말로네이트(Pt-malonate)가 만드는 6원환은 보트형(boat)이었다.

X-선 회절법에 의해 얻어진 백금과 백금주위의 원소들과의 결합길이 및 결합각도를 표 3에 나타내었다.

<표 3>

Bond Length and Angle of trans-ditrifluoroacetato,

malonato-(1,4-butanediamine)Pt(Ⅳ) complex

Pt-O(3)Pt-O(1)Pt-O(6)Pt-O(5)Pt-N(2)Pt-N(1)	1.979(5)1.997(5)2.003(5)2.009(5)2.024(6)2.035(6)
O(3)-Pt-O(1)O(3)-Pt-O(6)O(1)-Pt-O(6)O(3)-Pt-O(5)O(1)-Pt-O(5)O(6)-Pt-O(5)O(3)-Pt-N(2)O(1)-Pt-N(2)O(6)-Pt-N(2)O(5)-Pt-N(2)O(3)-Pt-N(1)O(1)-Pt-N(1)O(6)-Pt-N(1)O(5)-Pt-N(1)N(2)-Pt-N(1)	175.2(9)90.7(2)86.7(2)92.5(2)91.9(2)97.4(8)85.5(2)97.1(2)176.2(2)82.3(2)84.8(2)90.8(2)82.8(2)177.3(2)97.4(3)

상기 X-선 회절분석 결과의 신뢰도 R = 0.030 이었다.

약제학적 조성물의 제조

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 백금(IV)착체는 약제학적으로 수용가능한 담체와 함께 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.

본 발명에 따른 백금(IV)착체는 약제학적으로 수용가능한 담체와 함께 경구용으로 사용되거나, 또는 적절한 용매 및 희석액과 함께 주사제로 투약될 수 있다.

(1) 경구용으로 사용

본 발명에 따른 백금(IV)착체는 pH 1의 강산 분위기에서도 매우 안정한 상태를 유지하므로 위산에서 파괴되지 않아 경구투여가 가능하다. 경구 투여시는 캅셀제나 정제로 사용이 가능한데, 캅셀제인 경우 전분, 유당, 탈크, 스테아린산 마그네슘 등의 일반적인 부형제들이 모두 사용가능하며, 정제의 경우도 과립으로 만들어 타정하므로 일반적인 정제 부형제들이 모두 사용할 수 있다.

또한, 기타 통상의 담체가 모두 사용가능하다.

또, 첨가제로는 전분. 결정셀룰로오스, 하이드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리에칠렌글리콜, 유당, 폴리비닐피롤리돈, 글리세릴 비하네이트(glyceryl behanate) 등을 사용할 수 있으며,

희석제로는 포도당, 분무건조 유당, 패스트-프로 락토오즈(Fast-flo lactose), 무수유당, 백당, 전분, 스타크 1500(starch 1500), 인산일수소칼슘, 임콤프레스( Emcompress), 결정성셀룰로오스(Avicel)이 있으며,

습식 결합제 및 과립액으로는 물, 에탄올, 아라비아고무당, 트라가칸타장, 젤라틴 용액, 전분호액, 포도당시럽, 백당시럽, 포비돈, 셀룰로오스 유도체류 등이 있고,

활택제류는 폴리에칠렌글리콜 4000, 6000, 8000, 라우릴황산나트륨, 라우릴 황산마그네슘, 안식향산나트륨, 폴리에칠렌모노스테아레이트, 글리세릴트리아세테이트, 스테아린산-마그네슘,-아연,-칼슘, 스테아린산, 탈크, 경화식물유, 유동파라핀, 파라핀류, 납류 등이 있으며,

유동화제로 전분, 탈크, 이산화규소, 칵??실리케이트, 탄산마그네슘, 산화마그네슘 등을 사용할 수 있고,

부착방지제로 전분, 탈크 등이 있고,

제어방출 첨가제로는 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시에칠셀룰로오스, 에칠셀룰로오스, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 폴리아크릴산, 아크릴산, 아크릴산유도체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에칠렌글리콜등을 사용할 수 있다.

(2) 주사제로서의 사용

한편, 주사용으로 사용되는 경우에는 용제로서 알코올류(에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린), 고급지방산에스텔(올레인산에칠) 등을 사용하는 것이 바람직하며,

희석액으로, 인산완충식염액(phosphate buffer saline, PBS)이나 생리식염액(0.9% NaCl, saline)을 사용하여 희석하고

방부제로 소디움벤조에이트(sodium benzoate), 메틸파라벤(methylparaben) 또는 프로필파라벤(propylparaben) 등을 첨가할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 주사제 형태로 제조하는 경우에는, 본 발명에 따른 백금(IV)착체 결정을 동결 건조하여 분말상태로 한 후, 알코올류 등의 용제에 녹이고, 이를 생리식염액이나 인산완충식염액으로 희석하여 인체에 투여한다.

항암 활성에 대한 실험

본 발명에 따른 백금(IV)착체들의 항암활성을 검사하기 위하여 각각 사람과 마우스의 백혈암 세포인 HL60와 L1210에 대하여 엠티티 분석 (MTT 분석 ; [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay)을 실시하였다.

MTT 분석은 세포내 효소인 마이토콘드리얼 디하이드로게나아제(mitochondrial dehydrogenase)가 황색 수용성 물질인 MTT를 물에 녹지 않는 짙은 청색의 포르마잔(formazan)으로 바꾸는 능력에 기초하여 분석하는 방법으로, 생성된 포르마잔(formazan)이 생세포수와 비례하는 정량적인 발색분석법이다.^122-124)

(1)시약 및 기기

항암활성실험에 사용한 암세포주는 부유세포로서 사람과 마우스의 백혈암 세포인 HL60, L1210 세포주들이며 한국세포주은행에서 냉동세포를 분양받아 배양하여 사용하였다. RPMI 1640배지, 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycine) 1000unit/ml, 페이탈 보빈 세럼(fetal bovin serum ; 이하 FBS), 포스페이트 버퍼 셀린(phosphate buffer saline ; 이하 PBS)은 Gibco에서 구입하였다.

시스플라틴(Cisplatin)과 MTT( 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte- trazolium bromide)시약은 시그마(sigma)에서 구입하였다. CO₂가스는 동아가스사에서 구입하여 사용하였고, 그외에 사용된 시약은 세포배양용 또는 특급시약을 사용하였다.

세포수 계수는 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 광학현미경(olympus CK2)으로 관찰하여 실시하였고 ELISA 플레이트 리더(ELISA plate reader)는 Dynatech MR5000을 사용하였다.

(2) 세포배양

RPMI 1640 배지에 1% 페니실린-스트렙토마이신( penicillin-streptomycine) (10,000unit/ml), 10% FBS의 농도로 조제하여 37˚C, 5% CO₂존재하에 2-3일 간격으로 세포수 2 x10⁵개 - 5 x10⁵개/ml 정도로 계대 배양하였다.

(3) 시약 및 약물조제

약물은 본 발명의 실시예들에서 합성한 백금(IV)착체들로서, 수용성인 것은 그대로 사용하고, 물에 녹지 않는 것은 DMSO나 95% 에탄올에 녹이고 PBS를 가하여 각각 2mM의 농도가 되도록 조제하고 0.2μ주사기 필터(syringe filter)로 여과하여 무균상태로 만들어 세포주에 접촉하기 직전에 배지로 계열 희석하여 각각의 해당농도로 조제하였다. DMSO나 95%에탄올은 세포배양용 배지에서 최종 농도가 0.1%미만이 되도록 하였다. MTT시약은 PBS에 녹여 0.2μ주사기 필터로 여과하여 무균상태로 만들어 사용하였다.

(4) 실험방법

HL60 및 L1210 세포주를 각각 96-웰 플레이트(96-well plate)에 10⁴개/well 이 되도록 취하고 37˚C, 5% CO₂존재하에 30분간 안정화시켜 합성한 백금(II)착체 및 백금(IV)착체를 1ml당 10^-4M - 10^-7M의 농도로 조제하여 100㎕씩 가하였다. HL60 세포주는 37˚C, 5% CO₂존재하에 72시간 배양 후, L1210 세포주는 48시간 배양후에 MTT시약(2mg/1ml) 50㎕/well씩 가하여 주고 37˚C, 5% CO₂존재하에 4시간 배양한 다음 2000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액 170㎕/well씩 제거하였다.

이어서, DMSO 150㎕/well씩 가하여 40˚C, 30분간 방치후 3분간 흔들어주고 ELISA reader로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 같은 조건으로 동일한 96-well plate에서 공시험하여 보정하였다. 이 실험은 각 농도별로 3개이상의 well에 동일 시행하고 동일실험을 3회 이상 반복하였다.

(5) 실험결과

MTT 분석 결과를 하기 표 4 내지 표 6에 나타내었다.

<표 4> 비트로(Vitro) 실험에서 L1210의 항암활성도

	7(Ac)Cl	7(TF)Cl	7(Ac)M	7(TF)M	7(OH)Cl	7(OH)M	7Mal
100μM	2.2	0.5	20.6	17.1	20.5	40.5	20.5
50μM	5.1	1.6	25	20	30.5	55.1	26.1
10μM	9.6	2.8	60	49	62.5	76.8	55
5μM	31.1	25	65.5	59	66	80	68
1μM	59.5	55	78	72	83.1	88.5	80.1
0.5μM	69	66.2	84	78	85.5	92	84.8
0.1μM	82	78.5	91	88	91.2	97	93
0.05μM	86.1	83.2	93	93	92.8	101.1	95
0.01μM	90.4	88.5	95	93.5	94	96	91

*배양 배지에서 백금(IV)착체의 농도단위는 μM/ml

*셀 성장(Cell Growth)의 값은 하기식에 의한 백분율로 표시된 값이다.

*셀 성장률(%) =

* OD(optical density)는 흡광도를 나타낸다.

<표 5> 비트로(Vitro) 실험에서 HL60의 항암 활성도

	7(Ac)Cl	7(TF)Cl	7(Ac)M	7(TF)M	7(OH)Cl	7(OH)M	7Mal
100μM	5	0	20	15.1	19	37.4	20
50μM	5	0	20	24.5	27.5	52.9	27
10μM	15.9	2	60	45	58.4	70.5	57
5μM	29.7	20	64.8	55	60	75.4	63.2
1μM	55.9	53.5	72	68	80.1	86.9	78.8
0.5μM	65	60	85	70	83.5	97	82.6
0.1μM	80	75.2	87	87	91.8	98	89
0.05μM	84.5	78.9	90	90	90.8	100	89
0.01μM	90.8	82.5	96	90.5	92	103	92

*배양 배지에서 백금(IV)착체의 농도단위는 μM/ml

*셀 성장률(%) =

* OD(optical density)는 흡광도를 나타낸다.

<표 6> L1210 및 HL60 세포주에서의 IC₅₀

	L1210(μM/ml )	HL60(μM/ml )
CDDP	2.86	2.74
7(Ac)Cl	1.49	1.28
7(TF)Cl	0.96	0.69
7(Ac)M	14.44	12.17
7(TF)M	8.72	6.72
7Cl	2.01	1.83
6Cl	19.26	16.05
5Cl	11.04	11.7
7(OH)Cl	17.38	13.84
7(OH)M	64.42	49.7
7Mal	15.02	13.8

* 7Cl : 7원환 백금(II)착체인 시스-디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(II)착체(cis-dichloro-1,4-butanediamine Pt(II) complex)를 나타낸다.

* 6Cl : 6원환 백금(II)착체인 시스-디클로로-1,3-프로판디아민 Pt(II)착체 (cis-dichloro-1,3-propanediamine Pt(II) complex)를 나타낸다.

* 5Cl : 5원환 백금(II)착체인 시스-디클로로에틸렌디아민 Pt(II)착체(cis-dichloro,ethylenediamine Pt(II) complex)를 나타낸다.

* IC₅₀는 세포 성장 억제 농도가 50%에 달했을 때의 값을 나타낸다.

(6) 실험결과의 분석

실험예 1 : 7(TF)Cl 및 7(Ac)Cl의 항암활성 결과

먼저, 쥐의 L1210 세포주에서 시스플라틴(CDDP), 7(TF)Cl 및 7(Ac)Cl의 항암활성에 대한 IC₅₀값을 표 7에 나타내었다.

표 7에 도시된 바와 같이, 7(TF)Cl의 IC₅₀가 0.96μM/ml로 가장 항암활성이 높은 것으로 분석되었고, 7(Ac)Cl의 IC₅₀는 1.49μM/ml로 나타났다. 이는 현재 임상에서 사용되고 있는 시스플라틴(CDDP)의 IC₅₀가 2.86μM/ml인데 비하여 훨씬 낮은 값으로서, 암세포 증식 억제효과가 훨씬 우수한 것이다.

<표 7>

이어서, 사람의 백혈암 세포주인 HL60 세포주에서 시스플라틴(CDDP), 7(TF)Cl 및 7(Ac)Cl의 항암활성 테스트의 결과를 표 8에 나타내었다. 표 5에 도시된 바와 같이, 시스플라틴의 IC₅₀는 2.74μM/ml인데 비하여 7(TF)Cl 및 7(Ac)Cl의 IC₅₀값은 각각 1.28μM/ml, 0.69μM/ml로서 시스플라틴(CDDP)에 비해 항암 활성이 훨씬 높은 것으로 나타났다.

<표 8>

실험예 2 : 7(Ac)M 및 7(TF)M의 항암활성실험 결과

쥐의 L1210 세포주에 대해 시스플라틴(CDDP), 7(Ac)M 및 7(TF)M의 항암활성을 테스트한 후, 그 결과를 표 9에 도시하였다.

<표 9>

표 9에서 보여지는 바와 같이, 7(Ac)M과 7(TF)M의 IC₅₀는 각각 14.44μM/ml 및 8.72μM/ml로서 상당히 유의성있는 암세포 증식 억제효과를 보였다. 이 수치는 시스플라틴보다 각각 약 3 내지 4.5배 가량 높은 수치이다. 그러나, 현재 임상에서 쓰이고 있는 제 2세대 백금착체인 카보플라틴의 IC₅₀(시스플라틴의 약 10배이상의 수치: J. Med. Chem. 1994, vol.37, No.10, 1471-1485)에 비해 훨씬 낮은 값이다.

이어서, 사람의 백혈암 세포주인 HL60 세포주에서 시스플라틴(CDDP), 7(Ac)M 및 7(TF)M의 항암활성을 테스트한 후, 이를 표 10에 나타내었다.

<표 10>

표 10에 보여지는 바와 같이, HL 60에 대한 항암활성실험에서도 쥐의 L1210 세포주에 대한 실험과 유사한 결과를 나타내었다.

표 9 및 10에서 알수 있는 바와 같이, 7(Ac)M과 7(TF)M의 IC₅₀값은 시스플라틴(CDDP)의 IC₅₀값에 비해 상대적으로 높은 값이기는 하나, 카보플라틴이 시스플라틴의 약 10배가량의 IC₅₀값을 갖는 것에 비하여 7(TF)M은 약 3배, 7(Ac)M은 약 4.5배의 IC₅₀값을 가지므로 카보플라틴보다는 낮은 값이다.

따라서, 7(Ac)M과 7(TF)M은 시스플라틴에 비해 항암활성이 떨어지기는 하나, 카보플라틴에 비해서는 훨씬 우수한 항암활성을 갖는다. 또한, 하기한 바와 같이, 시스플라틴에 비해 신독성 등의 부작용을 한결 완화할 수 있다는 점에서 시스플라틴에 비해 우수한 항암특성을 갖는다. 또한, 시스플라틴 및 카보플라틴에 대해 내성을 갖는 종양세포에 대해 우수한 활성을 나타내는 바, 시스플라틴이나 카보플라틴이 갖는 문제점을 해결하고 있는 바, 이들에 대한 대체물질로서 유용하다.

실험예 3 : 7(OH)Cl과 7(OH)M의 항암활성실험 결과분석

쥐의 백혈암 세포주인 L1210 세포주 및 사람의 백혈암 세포주인 HL60에 대한 7(OH)Cl 및 7(OH)M의 항암활성 실험결과를 각각 표 11 및 표 12에 나타내었다.

<표 11>

<표 12>

표 11 및 표 12에서 보여지는 바와 같이, 이 두 백금(IV)착체는 시스플라틴보다 낮은 항암활성도를 나타내었다.

그러나, 7(OH)Cl과 7(OH)M 역시 종래 항암제가 갖는 문제점 예를 들어, 신독성 등의 부작용이나, 시스플라틴 및 카보플라틴에 대해 내성문제를 해결할 수 있는 장점을 갖는다.

특히, 7(OH)Cl과 7(OH)M는 7(TF)Cl 및 7(Ac)Cl 합성을 위한 중간물질로서도 독자적인 유용성을 갖는다.

하기 표 13은 본 발명에 따른 신규의 백금(IV)착제와 종래의 시스플라틴의 IC₅₀값을 막대그래프로 도식화한 것이다.

<표 13>

신장 독성 실험

(A) 혈청학적 분석

합성된 백금착체의 신장독성을 혈청학적으로 분석하기 위하여 약물별로 복강내 주사후 6시간, 1일, 3일, 7일 경과후 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후, 혈중뇨질소(BUN : Blood urea nitrogen), 크레아티닌(creatinine) 및 요산(uric acid)을 분석하였다.¹³³⁾

(1) 실 험 동 물

실험동물은 체중 약 25g내외의 숫컷 ICR 마우스(ICR mouse)를 대한실험동물센터에서 구입하여 사용하였다. 실험기간중 동물은 한양대학교 의과대학 해부학교실내 청정동물실에서 사육하였으며 사료(삼양사)와 물은 무제한 공급하였다.

실험동물은 정상대조군, 대조군과 실험군으로 분류하고, 실험군은 다시 시스플라틴(cisplatin) 투여군, 7(Ac)Cl 투여군, 7(TF)Cl 투여군, 7(Ac)M투여군, 7(TF)M투여군 및 7FMN투여군으로 세분하였다. 각군에 대하여 20-22마리씩 배정하였고 이것을 다시 6시간, 24시간, 3일, 7일 처리군으로 나누어 한 군에 각각 5-6마리씩 약물처리하였다.

(2) 실험동물의 처치

사용한 약물은 시스플라틴(cisplatin ; CDDP), 7(Ac)Cl, 7(TF)Cl, 7(Ac)M, 7(TF)M, 7FMN등 모두 6종으로 체중 1kg당 투여한 약물용량은 시스플라틴은 6mg(IC₅₀x7), 7(Ac)Cl은 6mg(IC₅₀x8), 7(TF)Cl은 5.3mg(IC₅₀x8), 7(Ac)M은 58.8mg(IC₅₀x8), 7(TF)M은 50.5mg(IC₅₀x8), 7FMN은 88mg(IC₅₀x8) 으로 하였다.

각각 해당량만큼 취하여 DMSO나 에탄올에 녹이고 PBS를 가하여 6.6ml로 하였다. 이때 DMSO나 에탄올의 함량이 5%미만으로 하였고 이것은 마우스 1마리당(30g) 적용될수 있는 20㎕ 보다 훨씬 적은 양으로 실험에 끼치는 영향이 없도록 하였다. PBS에 녹인 약물들을 0.2μ주사기용 필터로 여과하여 멸균하여 복강내 주사하고 주사일을 0일로하여 6시간, 1일, 3일 및 7일 경과후 5-6마리씩 심장채혈 또는 경부절단하여 채혈 후 경추탈구법으로 희생시켰다.

(3) 혈중뇨질소(BUN : Blood urea nitrogen), 크레아티닌(creatinine) 및 요산(uric acid)의 측정

마우스에서 얻은 혈액을 4,500 rpm에 15분간 원심분리하여 혈청만 취하여 실험값 측정시까지 -20℃이하에서 보관하였다. 혈중뇨질소, 크레아티닌(creatinine) 및 요산(uric acid)는 생화학 자동분석기(olympus reply, Japan)로 측정하였으며 각 동물의 평균치와 표준편차로 나타내었다.

(3) 실험결과

혈중뇨질소, 크레아티닌(creatinine) 및 요산(uric acid)의 측정결과를 각각 표 14 내지 표 16에 나타내었다.

대조군(control group)은 PBS에 녹여 6.6ml/Kg의 용량으로 주사되었으며, 각 실험결과값은 5-6마리의 ICR 마우스에 대한 (평균값±표준편차)의 형태로 표시되었다.

<표 14> Pt(IV)착체의 단회투여후 마우스의 BUN값

<표 15> Pt(IV)착체의 단회투여후 마우스의 크레아티닌 값

<표 16> Pt(IV)착체의 단회투여후 마우스의 요산 값

(4) 분석

합성된 백금착체의 신장독성을 혈청학적으로 분석하기 위하여 투여된 약물의 용량은 시스플라틴을 기준으로 하여 산정하였다. 시스플라틴이 독성을 나타내거나 독성이 나타나더라도 반감기가 지남에 따라 정상으로 회복될수 있는 용량이 단회 투여인 경우 6mg/kg으로, 이 용량은 항암활성시험에서 얻었던 IC₅₀의 7배의 양이 되었다. 합성한 다른 약물들이 항암제로 개발되기 위해서는 최소한 시스플라틴보다는 독성이 적게 나타나야만 하므로 이 실험에서는 생쥐 1kg당 IC₅₀의 8배의 양을 투여하였다.

분리된 혈청을 분석한 결과 모든 약물이 정상대조군과 비교하여 차이가 없었다. 이는 단회 투여로 실험 동물들에게 심한 손상은 주지 않은 것으로 분석되었다.

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 백금(IV)착체들이 적어도 시스플라틴보다 더 강한 신장독성을 나타내지는 않았음을 알 수 있다.

(B) 전자현미경적 관찰

(1) 실험방법

절취한 신장조직은 근위세뇨관(proximal convoluted tubule)의 미세 구조적 변화를 관찰하기 위하여 콩팥의 겉질(cortex of kidney)조직 일부룰 1㎣ 크기로 세절하고, 밀로니크으 포스페이트 완충액(Millonig's phosphate buffer ; pH 7.2)으로 제작한 2% 글루타르알데하이드-2.5% 파라포름알데하이드( 2% glutaraldehyde- 2.5% paraformaldehyde)용액에 4℃에서 2-4시간 전고정한 후, 동일 완충액으로 희석한 1% 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)로 2시간동안 후고정하였다. 이것을 에탄올-아세톤(ethanol-acetone) 농도차에 따라 조직을 탈수하여 Epon 812에 포매한 후 미세절편기(ultramicrotome)로 두께 2-5㎛인 박절편을 제작하여 메틸렌 블루(methylene blue)로 임시 염색하여 적정부위를 확인한후 다시 두께 60-80㎚의 초박절편(ultrathin section)을 제작하고 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 리드 사이트레이트(lead citrate)로 이중염색을 시행하여 투과전자현미경(Hitachi-600, Japan)으로 관찰하였다.

(2) 실험결과

① 대조군 근위세뇨관 상피세포

도 4에서 보여지는 바와 같이, 대조군 근위세뇨관 상피세포는 인접한 세포와 치밀반(desmosome)으로 연결되어 있었고, 원형의 핵이 세포질 중앙에 위치하고 있었으며, 세포질첨부에는 관강(lumen)을 향하여 무수한 미세융모(microvilli)가 돌출되어 있었고, 미세융모 직하방 세포질첨부에는 다양한 크기의 많은 흡수소포(endocytic vesicle)와 공포(vacuole)가 관찰되었으며, 크고 작은 여러 형태의 사립체(mitochondria)와 사립체에 인접하여 조면내형질세망(rough endoplasmic reticulum)이 분포하고 있었고, 단일막으로 한계된 용해소체(lysosome)와 3-4층의 소조(cisternae)로 구성된 골기(Golgi) 복합체(Golgi complex)가 관찰되었으며, 세포질 기저부에서는 기저주름(basal folding)이 관찰되었으며, 기저주름에 평행하게 사립체가 위치하고 있었고, 사립체에 인접하여 조면내형질세망이 분포하고 있었다.

② 시스플라틴 투여군의 근위세뇨관 상피세포

도 5a 내지 도 5b에서 보여지는 바와 같이, 시스플라틴 투여 6시간 경과군 근위세뇨관 상피세포에서는 미세융모가 세포질 첨부에서 관강을 향하여 돌출되어 있었고, 미세융모 직하방에서 많은 흡수소포와 공포가 분포하고 있었으며, 단일막으로 둘러싸인 식소체(phagosome;Ph)들과 자식공포(autophagic vacuole;APV) 및 수초양체(myeloid body;MB)등의 이차용해소체가 관찰되었고, 사립체릉(mitochondrial cristae)이 용해되거나(M1) 이중막이 파괴된 손상받은 사립체(M2)와 말발굽형의 변형된 사립체(M3)가 관찰되었으며, 소조(cisternae)가 단절 혹은 낭상화되거나 리보솜(ribosome)이 탈락된 조면내형질세망(RER)이 관찰되었다.(도 5a 상부 그림 참조)

시스플라틴 투여 1일 경과군 근위세뇨관 상피세포의 세포질내에는 자식공포(APV), 식소체(Ph) 및 수초양체(MB) 등의 이차용해소체가 다수 관찰되었으며, 사립체릉이 용해되거나 이중막이 파괴된 사립체(M1)와 형태가 변형된 사립체(M2)와, 소조가 단절된 조면내형질세망이 관찰되었다.(도 5a 하부 그림참조)

시스플라틴 투여 3일 경과군 근위세뇨관 상피세포의 세포질내에는 많은 식소체(Ph)와 수초양체(MB)가 위치하고 있었으며, 이중막이 파괴되거나 사립체릉이 파괴된 손상받은 사립체가 많이 관찰되었고, 소조가 단절되거나 ribosome이 탈락된 조면내형질세망(RER)과 소조가 확장된 Golgi 복합체(Go)가 관찰되었다.(도 5b 상부그림 참조)

시스플라틴 투여 7일 경과군 근위세뇨관 상피세포에서는 원형의 핵이 세포질 중앙에 위치하고 있었고, 세포질첨부에는 많은 용해소체가 분포하고 있었으며, 세포질 전반에 걸쳐 무수한 사립체와 이에 인접하여 조면내형질세망이 관찰되었고, 세포질기저부에는 기저주름이 잘 발달되어 있었으며, 당원과립이 분포하고 있었다.(도 5b 하부 그림 참조)

③ 7(Ac)Cl 투여군의 근위요세관상피세포

도 6a 내지 도 6b에 도시된 바와 같이, 7(Ac)Cl 투여 6시간 경과군 근위세뇨관 상피세포의 세포질에는 식소체(Ph) 및 자식공포(APV)가 관찰되었으며, 일부의 사립체에서 사립체릉이 용해(M1)되어 있었으며, 핵에 인접하여 골기(Golgi) 복합체(Go)가 관찰되었다.(도 6a 상부 그림 참조)

7(Ac)Cl 투여 1일 경과군 근위세뇨관 상피세포에서는 많은 수초양체(MB)가 관찰되었으며, Golgi 복합체(Go)의 소조는 위축되어 있었고, 이중막이 파괴된 사립체(M1), 형태가 변형된 사립체(M2) 및 사립체릉이 용해된 사립체(M3)가 관찰되었으며, 소조가 단절되거나 낭상화된 조면내형질세망(RER)이 관찰되었다.(도 6a 하부 그림 참조)

7(Ac)Cl 투여 3일 경과군 근위세뇨관 상피세포에서는 수초양체(MB), 자식공포(APV), 식소체(Ph)등의 이차용해소체가 다수 관찰되었고, 소조가 단절된 조면내형질세망과 소조가 위축된 Golgi 복합체(Go)와 이중막이 파괴(M1)되거나 형태가 변형된(M2) 사립체가 관찰되었다.(도 6b 상부 그림 참조)

7(Ac)Cl 투여 7일 경과군 근위세뇨관 상피세포에서는 무수한 사립체와 이에 인접한 조면내형질세망이 관찰되었고, 세포질기저부에서는 잘 발달된 기저부주름과 이에 평행하게 위치하고 있는 사립체가 관찰되었다.(도 6b 하부 그림 참조)

④ 7(TF)Cl 투여군의 근위세뇨관 상피세포

도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이, 7(TF)Cl 투여 6시간 경과군 근위세뇨관 상피세포의 세포질내에는 수초양체(MB), 식소체(Ph) 및 자식공포(APV)등의 이차용해소체가 많이 관찰되었으며, Golgi 복합체(Go)의 소조는 위축되어 있었고, 사립체릉이 용해되거나 이중막이 파괴된 손상받은 사립체(M1)와 형태가 변형된 사립체(M2) 및 소조가 팽대되거나 단절된 조면내형질세망(RER)이 관찰되었다.(도 7a 상부 그림 참조)

7(TF)Cl 투여 1일 경과군 근위세뇨관 상피세포에서는 식소체(Ph), 수초양체(MB) 및 자식공포(APV)가 관찰되었고, Golgi 복합체(Go)의 소조가 위축되어 있었으며, 사립체릉이 팽대(M1)되거나 용해된 사립체(M2)가 많이 관찰되었다.(도 7a 하부 그림 참조)

7(TF)Cl 투여 3일 경과군 근위세뇨관 상피세포의 세포질첨부에는 식소체(Ph), 용해소체(Ly)가 분포하고 있었으며, Golgi 복합체(Go)의 소조는 극도로 위축되어 있었고, 이중막이 파괴되거나 사립체릉이 용해된 손상받은 사립체(M1)가 관찰되었다.(도 7b 상부 그림 참조)

7(TF)Cl 투여 7일 경과군 근위세뇨관 상피세포의 세포질첨부에서는 식소체(Ph), 자식공포(APV)등의 이차용해소체가 다수 관찰되었으며, 형태가 변형된 사립체(M1), 이중막이 파괴되고 사립체릉이 용해된 사립체(M2)가 관찰되었다.(도 7b 하부 그림 참조)

(3) 분석

전자현미경적 소견상 시스플라틴 투여군 및 7(TF)Cl 투여군에서는 6시간 경과후부터 심하게 손상받은 소견을 보였고, 3일 경과후에는 세포질내 소기관의 대부분이 손상받은 소견을 나타내어 두 약제는 투여 초기부터 근위세뇨관에 독성으로 작용함을 관찰할 수 있었으며, 7일 경과후에는 대조군 근위세뇨관 상피세포의 미세구조와 유사한 양상을 나타내어 회복된 소견을 보였다.

7(Ac)Cl 투여군에서는 1일 경과후에 이차용해소체, 손상받은 사립체 및 소조가 위축된 골기(Golgi) 복합체의 출현 등 손상받은 소견을 보였다가 시간이 경과함에 따라 회복되어 7일 경과후에는 대조군과 유사한 소견을 나타내었다.

이러한 전자현미경적 소견은 산 포스페이타아제(acid phosphatase) 활성의 감소와 관련이 있는 것으로 판단된다.

(C) 신장독성에 대한 최종분석 결과

상기 신장독성에 관한 2가지 종류의 실험에서 나타난 결과에 따르면, 본 발명에 따른 백금(IV)착체는 시스플라틴에 비해 신장독성이 약한 것으로 추정할 수 있다.

예를 들어, (i) 7(Ac)Cl의 경우 시스플라틴보다 독성이 적게 나타났으며, (ii) 7(TF)Cl 등은 시스플라틴과 비슷한 경향을 보였으나 이는 시스플라틴의 주사용량이 마우스 체중 1kg당 6mg(IC₅₀의 7배)인데 비하여, 7(Ac)Cl과 7(TF)Cl의 주사용량은 각각 6mg과 5.3mg으로 IC₅₀의 8배였음을 감안하면, 결론적으로는 시스플라틴보다는 독성이 적음을 알 수 있다.

본 발명에 따른 항암제는 (i) 7원환 백금착체를 기본 구조로 함으로써 우수한 항암활성을 갖는다. 또, (ii) 탈리기로서 염소배위자 또는 말로네이트를 가짐으로써 체내에 대해 만족할만한 수용성 및 지용성을 가지며, (iii) 수직배위자가 도입된 팔면체 구조의 백금(IV)착체로서 시스플라틴에 대해 내성을 갖는 암세포에 대해서도 우수한 항암활성을 가지며, 우수한 생체내 이용효율을 갖는다.

이외에도, (iv) 신장 독성이 적고 (v) 경구 투여가 가능하여 환자의 고통을 경감시킬 수 있는 등의 장점을 갖는다.

참고로, 본 발명에 관련된 여러 문헌을 참고문헌으로서 이하에 개시하며, 이중 일부는 상술한 종래기술 및 상세한 설명중에 인용하였다.

Claims

하기 화학식 3으로 표시되는 화합물.

<화학식 3>

상기 식에서,

X는 Cl_2,말로네이토(malonato ;),

1,1-시클로부틸-디카르복실레이토(1,1-cyclobuthyl-dicarboxylato ;), 옥살레이토(oxalato ;) 또는 글리콜레이토(glycolato ;) 이며,

R₁및 R₂는 각각 -OH, -Cl, -OCOCH₃, -OCOCF₃또는 -OCO(CH₂)_nCH₃(n은 1 내지 4 중의 정수)이다.
제1항에 있어서,

상기 화학식 3의 화합물은 하기 화학식 4 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 화합물.

<화학식 4>

트랜스, 시스-디하이드록소,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체

<화학식 5>

트랜스,시스-디아세테이토,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체

<화학식 6>

트랜스, 시스-디트리플로로아세테이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착제

<화학식 7>

트랜스-디하이드록소,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착제

<화학식 8>

트랜스-디아세테이토,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체

<화학식 9>

트랜스-디트리플로로아세테이토,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체
제1항에 있어서,

상기 화합물은 항암제로 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
(i) 하기 화학식 3의 화합물; 및

(ii) 약제학적으로 수용가능한 담체

를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

<화학식 3>

상기 식에서,

X는 Cl_2,말로네이토(malonato ;),

1,1-시클로부틸-디카르복실레이토(1,1-cyclobuthyl-dicarboxylato ;), 옥살레이토(oxalato ;) 또는 글리콜레이토(glycolato ;) 이며,

R₁및 R₂는 각각 -OH, -Cl, -OCOCH₃, -OCOCF₃또는 -OCO(CH₂)_nCH₃(n은 1 내지 4 중의 정수)이다
제4항에 있어서,

상기 조성물은 경구투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 디클로로-1,4-부탄디아민 Pt(II) 착체(dichloro-1,4-butanediamine Pt(II) complex)를 준비하는 단계와,

(b) 상기 디클로로-1,4-부탄디아민 Pt(II) 착체에 30%H₂O₂를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 4의 화합물 제조방법.

<화학식 4>

트랜스, 시스-디하이드록소,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체
(a) 트랜스, 시스-디하이드록소,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체를 준비하는 단계와,

(b) 용매로 CH₂Cl₂를 사용하여, 상기 트랜스, 시스-디하이드록소,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체와 무수초산을 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 5의 화합물 제조방법.

<화학식 5>

트랜스,시스-디아세테이토,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체
(a) 트랜스, 시스-디하이드록소,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체를 준비하는 단계와,

(b) 용매로 CH₂Cl₂를 사용하여, 상기 트랜스, 시스-디하이드록소,디클로로-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체와 트리플루오르아세트 안하이드라이드(trifluoracetic anhydride)를 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 6의 화합물 제조방법.

<화학식 6>

트랜스, 시스-디트리플로로아세테이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착제
(a) 말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(II) 착물( malonato-1,4-butanediamine Pt(II) complex)을 준비하는 단계와,

(b) 말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(II) 착물에 과량의 30%H₂O₂를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 7의 화합물 제조방법.

<화학식 7>

트랜스-디하이드록소,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착제
제9항에 있어서,

상기 (a)단계는

(i) 시스-디아이오도-1,4-디부탄다이아민 Pt(II) 착물( cis-diiodo-1,4-butanediamine Pt(II) complex )에 디실버 말로네이트염(disilver malonate salt)을 반응시키는 단게와,

(ii) 상기 결과물 용액으로부터 침전인 AgI를 제거한 후, 수용액을 농축시켜 말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(II) 착물( malonato-1,4-butanediamine Pt(II) complex)을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,

상기 (b)단계는 실온에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 트랜스-디하이드록소,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착제를 준비하는 단계와,

(b) CH₂Cl₂를 용매로 사용하여, 상기 트랜스-디하이드록소,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착제에 무수초산을 과량 가하여 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 8의 화합물 제조방법.

<화학식 8>

트랜스-디아세테이토,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체
(a) 트랜스-디하이드록소,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착제를 준비하는 단계와,

(b) CH₂Cl₂를 용매로 사용하여, 상기 트랜스-디하이드록소,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착제에 프리플로로아세틱 안하이드라이드를 과량 가하여 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 9의 화합물 제조방법.

<화학식 9>

트랜스-디트리플로로아세테이토,말로네이토-1,4-부탄다이아민 Pt(IV) 착체