JP2009523427A - グリホサート耐性を付与するepspシンターゼ酵素ドメイン - Google Patents
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Abstract
Description
D−C−X1−X2−S−G(配列番号29)、但しX1はグリシン、セリン、アラニン又はアスパラギンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
D−A−X1−X2−S−G(配列番号30)、但しX1はアラニン又はアルギニンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
K−L−K−X1−S−A(配列番号31)、但しX1はグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
W−C−E−D−A−G(配列番号32)、から選択される少なくとも1つの配列ドメインを含む。
更に、前記アミノ酸配列を解析して、前記アミノ酸配列が本発明の少なくとも1つの配列ドメインを含むかどうかを判定することができる。
生物において、除草剤抵抗性又は耐性、特にグリホサート抵抗性又は耐性を付与するための組成物及び方法が提供される。前記方法は、グリホサート耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列で生物を形質転換することを含み、ここで該遺伝子は、極性が増大したアミノ酸配列を含むQループを有するポリペプチドをコードする。Qループの領域は、アミノ酸配列を、配列番号22の90〜105位に相当するアミノ酸領域において保存されたアルギニンとアラインメントすることによって同定され得る。本明細書で用いられる「相当している」又は「相当する」というフレーズは、アミノ酸(又はヌクレオチド)の位置番号を参照する際、1つ以上のアミノ酸(又はヌクレオチド)配列が参照配列内の特定の位置番号において参照配列と並ぶことを意味する。例えば、配列番号22のアミノ酸90〜105に相当するアミノ酸配列内のQループ領域を同定することを目的とするならば、本明細書の他の箇所で考察されるアラインメント方法を用いて当該のアミノ酸配列を配列番号22のアミノ酸配列とアラインメントし、次いで配列番号22のアミノ酸残基90〜105と並ぶ当該のアミノ酸配列の領域を同定することができる。前記アミノ酸番号においてはQループの両側で約20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸の増減があり得ことが認識される。前記領域は基質PEPの認識に関与するものと考えられる。特に、本発明は、グリホサート抵抗性又は耐性を付与する酵素の種類、及びかかる酵素をコードするヌクレオチド配列を認識するものである。または、かかる酵素は、本発明の少なくとも1つの配列ドメインを有することによって同定することもできる。「本発明の配列ドメイン」によって、以下の:
D−C−X1−X2−S−G(配列番号29)、但しX1はグリシン、セリン、アラニン又はアスパラギンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
D−A−X1−X2−S−G(配列番号30)、但しX1はアラニン又はアルギニンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
K−L−K−X1−S−A(配列番号31)、但しX1はグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
W−C−E−D−A−G(配列番号32)、から選択される少なくとも1つのドメインが意味される。
別の実施形態において、本発明の配列ドメインは、配列番号22の残基98に相当するアミノ酸位でのセリン又はスレオニンを更に含む。「Qループ領域の極性増大」とは、Qループ内のアミノ酸の1個以上が有する極性が、本発明の配列ドメインを含まないEPSPシンターゼの同じ領域に比べて増大していることを意図する。前記配列によって、除草剤のグリホサートに対する抵抗性の増大を示す植物の調製における使用がなされる。従って、形質転換された細菌、植物、植物細胞、植物組織及び種子が提供される。
本発明において、グリホサート抵抗性を付与する酵素の種類はEPSPシンターゼである。本明細書で使用される「EPSPシンターゼ」という用語は、天然のEPSPシンターゼ或いはその変異体又はフラグメントの双方を意味する。EPSPシンターゼは、芳香族アミノ酸と、テトラヒドロ葉酸塩やユビキノンやビタミンK等の多くの2次代謝産物との生合成のためのシキミ酸経路における最後から2番目の工程に関与する(Gruys et al.(1999)Inhibitors of Tryptophan, Phenyalanine, and Tyrosine Biosynthesis as Herbicides (Dekker, New York))。EPSPシンターゼは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)及び3−ホスホシキミ酸(S3P)を5−エノールピルビル−3−ホスホシキミ酸に変換する(Amrhein et al.(1980)Plant Physiol. 66:830−834)。単量体EPSPシンターゼは、エノールピルビルトランスフェラーゼの種類における2種の酵素の内の1種である。ポリペプチドのこの種類は、インバースα/βバレル構造の類を形成するβシート及びαヘリックスから構成される2つの球状ドメインを含む固有の構造を共有する。前記2つのドメインは、活性部位内の基質を挟んで、蝶番のように作用することで上下のドメインをまとめる2つの鎖によって接続される。リガンド結合によって、前記酵素は、誘導適合機構のパターン後に開口状態から密集した閉口状態に変換される(Schonbrunn et al.(2001)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1376−1380, Stauffer et al.(2001)Biochemistry 40:3951−3957)。
EPSPシンターゼは、広域スペクトル除草剤グリホサートの標的である。「グリホサート」とは、グリホサートアニオンの産生をもたらすN−ホスホノメチルグリシン(その任意の塩を含む)及びその活性誘導体の任意の除草剤の形態を意図する。グリホサートによるEPSPシンターゼの阻害は、EPSPシンターゼ−S3P−グリホサートの3元複合体の形成中に進行することが示されており、そして前記結合は、EPSPシンターゼ−S3Pの2元複合体の形成後においてのみ前記酵素に結合するグリホサートによって引き起こされる。EPSPシンターゼへのグリホサートの結合は、PEPと競合し、S3Pに対して競合しないことが示されている(Kishore et al.(1988)Annu. Rev. Biochem. 57:627−663)。EPSPシンターゼへの結合によってグリホサートはシキミ酸経路を遮断し、それによって芳香族アミノ酸生合成の喪失並びに植物の死滅又は重度の成長減退を引き起こす。
D−C−X1−X2−S−G(配列番号29)、但しX1はグリシン、セリン、アラニン又はアスパラギンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
D−A−X1−X2−S−G(配列番号30)、但しX1はアラニン又はアルギニンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
K−L−K−X1−S−A(配列番号31)、但しX1はグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
W−C−E−D−A−G(配列番号32)、から選択される少なくとも1つのドメインを有することを特徴とし得る。
種々の方法を用いてEPSPシンターゼ活性を測定することができる。例えば、Lewendon et al.((1983)Biochem J. 213:187−191)は、検出可能な産物を産生した他の酵素との反応をEPSPシンターゼに起こさせる2つのアッセイを記載する。前方方向において、EPSPシンターゼは、EPSPをコリスマートに変換するシキミ酸経路における酵素であるコリスミ酸シンターゼに結合することができ;EPSPシンターゼがEPSPを産生する場合、コリスミ酸シンターゼは、EPSPを、275nmで検出され得るコリスマートに変換することができる。また、EPSPシンターゼは後方方向にも進行し得ることから、活性は、ピルベートの分解においてNADHを酸化させるピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼへの結合ともアッセイされ得、それによってEPSPシンターゼによるピルベートの発生に相当する340nmでのNADHの減失の検出が可能になる。また、EPSPシンターゼの活性は、グリホサート抵抗性EPSPシンターゼが存在する場合のグリホサートに対する植物の抵抗性の増大を測定することによって、或いはグリホサート感受性EPSPシンターゼ及び/又はグリホサート耐性EPSPシンターゼが発現する場合の植物収量の増加を測定することによってアッセイすることもできる。
幾つかの態様において、本発明は、Qループ領域の極性増大を有するポリペプチドをコードする配列番号1、3、5、11、13、38又は40のポリヌクレオチド以外の単離又は精製されたポリヌクレオチド(或いは例えば配列番号46〜52の本発明のドメインの内の1つ以上を含むポリペプチドをコードする任意の他の既知の又は公表されたポリヌクレオチド配列)を含む。更なる実施形態は、上記のドメインの内の1つ以上を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。「単離された」又は「精製された」ポリヌクレオチド又はポリペプチド或いはその生物学的に活性な部分は、実質的に他の細胞形質成分や、組換法によって作製する場合は培養培地を含まず、或いは化学的に合成される場合は実質的に化学的前駆体や他の化学物質を含まない。「生物学的に活性」とは、天然のポリペプチドの所望の生物学的活性を有すること、即ち除草剤抵抗性または耐性活性を保持することを意図する。「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが誘導される生物のゲノムDNA内の核酸を天然にフランクする配列(例えばタンパク質コード配列)(即ち核酸の5’及び3’末端に位置する配列)を含まなくてもよい。本発明のために、「単離された」は、ポリヌクレオチドについて言及する場合、遊離染色体(isolated chromosome)を含まない。例えば、各種実施形態において、単離グリホサート抵抗性コードポリヌクレオチド(isolated glyphosate resistance−encoding polynucleotide)は、ポリヌクレオチドが誘導される細胞のゲノムDNA内のポリヌクレオチドを天然にフランクするヌクレオチド配列の約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb又は0.1kb未満を含み得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号2、4、7、12、14、39及び41以外の単離又は精製された除草剤抵抗性ポリペプチド(或いは例えば配列番号46〜52等の本発明のドメインの内の1つ以上を含む任意の他の既知の又は公表されたポリペプチド)を含む。細胞形質成分を実質的に含まない「単離された」又は「精製された」除草剤抵抗性ポリペプチドは、非除草剤抵抗性ポリペプチドの約30%、20%、10%又は5%未満(乾燥重量で)を有するポリペプチドの調製物(また、本明細書において「混在タンパク質」とも称される)を含む。本発明において、「除草剤抵抗性タンパク質」は、Qループ領域の極性増大を有する、或いは本発明のドメインの内の少なくとも1つを有するEPSPシンターゼ酵素を意味する。また、フラグメント、生物学的に活性な部分及びその変異体も提供され、それらを用いて本発明の方法を実施することができる。
本発明の方法及び組成物において使用されるポリヌクレオチドを修飾して、植物細胞の発現を得るか若しくは高めることができる。本発明のドメインをコードするポリヌクレオチドは、関連する植物の発現のための発現カセットにおいて提供され得る。「植物発現カセット」は、植物細胞内のポリヌクレオチドの発現を引き起こし得るDNA構築体を含む。前記カセットは、転写の5’−3’方向において、関連する1つ以上のポリヌクレオチドに操作可能に結合する転写開始領域(即ちプロモーター)、及び植物において機能的な翻訳及び転写終了領域(即ち終了領域)を含み得る。前記カセットは、選択可能なマーカー遺伝子等の生物内に導入される少なくとも1つの更なるポリヌクレオチドを更に含み得る。或いは、前記更なるポリヌクレオチドは、複数の発現カセットにおいて提供され得る。かかる発現カセットは、調節領域の転写調節を受けるポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限部位を有する。
「植物」とは、全植物、植物器官(例えば葉、茎、根等)、種子、植物細胞、繁殖体、胚及びその後代を意図する。植物細胞は分化又は未分化であり得る(例えばカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉)。本発明は、単子葉植物及び双子葉植物を含む任意の植物種内にポリヌクレオチドを導入するために使用され得るがこれらに限定されない。関連する植物の例としては、トウモロコシ(corn(maize))、モロコシ、小麦、ヒマワリ、トマト、十字花科植物、トウガラシ、ジャガイモ、綿、米、大豆、テンサイ、砂糖きび、タバコ、オオムギ及びアブラナ(アブラナ(Bassica)属)、ムラサキウマゴヤシ、ライ麦、キビ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、カッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、お茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミヤ、アーモンド、オート麦、野菜、観賞植物及び球果植物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
A.植物形質転換
本発明の方法は、配列番号1、13及び38以外の1つ以上のポリヌクレオチド(或いは、例えば配列番号46〜52の本発明のドメインの内の1つ以上を含むポリペプチドをコードする任意の他の既知の又は公表されたポリヌクレオチド配列)を植物内に導入することを含む。「導入」とは、ポリヌクレオチドが植物の細胞の内部に接近するように、植物にポリヌクレオチドを供与することを意図する。本発明の方法は、ポリヌクレオチドを植物に導入する特定の方法を用いることを必要とせず、ただポリヌクレオチドが植物の少なくとも1つの細胞の内部に接近することだけを必要とする。
植物細胞内へのDNAの導入後、植物ゲノムへのポリヌクレオチドの形質転換又は組込みは、各種の方法、例えば一体化した配列と会合したポリヌクレオチド、ポリペプチド及び代謝物の分析によって確認される。
植物を含む圃場における雑草を選択的に制御する方法もまた提供される。一実施形態において、植物種子又は植物は、極性が増大したQループドメインを有するポリペプチドをコードする配列番号1、13及び38以外のポリヌクレオチド(或いは、例えば配列番号46〜52の本発明のドメインの内の1つ以上を含むポリペプチドをコードする任意の他の既知の又は公表されたポリヌクレオチド配列)、或いは植物種子又は植物内に挿入される本発明のEPSPシンターゼドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの結果として、グリホサート抵抗性である。特異的な方法において、除草剤の使用によって雑草又は他の非形質転換植物の選択的な制御がもたらされる場合、植物は有効濃度の除草剤で処理される。「有効濃度」とは、グリホサート抵抗性植物又は植物種子に著しく影響を及ぼすことなく雑草又は他の非形質転換植物の成長又は広がりを制御する濃度を意図する。関連する除草剤のためのかかる有効濃度は、一般に当該技術分野で知られている。除草剤は、除草剤に対して抵抗性とされた植物又は植物種子を含む圃場への除草剤の使用のための通常の技法に従って、出芽前又は出芽後に使用され得る。
本発明の方法及び同定されたドメインの方法を使用して、グリホサート耐性を付与する更なるポリペプチド(例えば、配列番号8及び10)が同定され得る。これらの更なるポリペプチドは、EPSPシンターゼ配列を含む配列データベースを検索することによって、及び/又は本明細書の別の箇所に記載される方法を使用して本発明のドメインの存在を検索するためのポリペプチド配列のアラインメントによって同定され得る。これらのポリペプチドとしては、新しく同定されたポリペプチドだけでなく、既知のポリペプチドも挙げられる。これらのドメインの多少の修飾は、これらのドメインのグリホサート抵抗性付与の性質を途絶させることなく実際に許容され、そしてそれ故に本明細書においてリストが示されるドメインに相当するものと判断される。
GRG1は、細菌及び植物にグリホサート抵抗性を付与するEPSPシンターゼである。GRG1アミノ酸配列(配列番号2)を他のグリホサート抵抗性EPSPシンターゼ酵素のアミノ酸配列と比較することによって、GRG1が、配列番号2のアミノ酸90〜105に相当する領域におけるこれらの酵素とは著しく異なることが示唆される。この領域は、基質PEPの認識に関与することが知られている(Schonbrunn et al.(2001)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1376−1380、Stauffer et al.(2001)Biochemistry 40:3951−3957)。特にGRG1は、他の既知のグリホサート抵抗性EPSPシンターゼ酵素とは異なるこの領域におけるDCxESのモチーフ及びPIのモチーフを有する。DNAコード配列(配列番号1)及びgrglオープンリーディングフレームのアミノ酸配列(配列番号2)は、2003年12月18日に出願の米国特許出願第10/739,610号において提供される。
以下のプライマー:CAGGGATCCGCCATGAATTGTGTTAAAATAAATCCATG(上流側)(配列番号42)及びCAGGGCGCGCCTTATTCCCCCAAACTCCACTC(下流側)(配列番号43)を用いて、Genbank受入れ番号NC_003030において同定されるクロストリジウム・アセトブチリクムEPSPシンターゼ遺伝子(配列番号5)のコード配列をPCRで増幅した。上流側のプライマーは、天然で生じる通りに開始コドンをTTGからATGに変化させた。結果として生じる1.3kb産物を、BamHI及びAscIで消化させ、pUC18の修飾バージョンの同一部位に連結し、そして大腸菌株DH5αに形質転換させた。EPSPシンターゼ挿入物を含む陽性のクローンを、制限消化によって同定し、そしてpAX714と名づけた。pAX714のコロニーを、IPTG、カルベニシリン及び0、20、50又は100mMのグリホサートを含有する最小M63培地上に付け、次いで前記プレートを37℃でインキュベーションした。pAX714含有細胞は、テストされたグリホサートの全ての濃度でよく成長し、このことによって、コードされたEPSPシンターゼが少なくとも100mMまではグリホサート抵抗性であったことが示された。コードされたEPSPシンターゼ(配列番号6)は、grg10と名づけられた。
以下のプライマー:CAGGGATCCGCCATGATTGTAAAGATTTATCCATC(上流側)(配列番号44)及びCAGGGCGCGCCGGTCTCATTCAATAGAAATCTTCGC(下流側)(配列番号45)を用いて、Sulfolobus solfataricus(ATCC35092D及び配列番号11)のゲノムDNAからEPSPシンターゼコード配列をPCRで増幅した。上流側のプライマーは、開始コドンをTTGからATGに変化させ、大腸菌の翻訳を容易にした。結果として生じる1.3kb PCR産物を、BamHI及びAscIで消化させ、BamHI及びAscIで消化された修飾pUC18(pAX700主鎖)に連結し、次いでDH5α細胞に形質転換させた。EPSPシンターゼ挿入物を含む陽性のクローンを、制限消化及びDNA塩基配列決定によって同定し、そしてpAX716と名づけた。コードされたEPSPシンターゼは、grg20と名づけられた(配列番号12)。
grg10及びgrg20をそれぞれ含むプラスミドpAX714及びpAX716を大腸菌細胞内に形質転換し、次いでIPTG、カルベニシリン、及びグリホサートの各種濃縮物を含むM63寒天培地上へ画線した。pAX701(野生型大腸菌aroA遺伝子を含む)のコロニーをグリホサート感受性対照として使用した。結果は下表に示され、そしてgrg10又はgrg20の発現によって高レベルのグリホサートに対する抵抗性が付与されることを示している。
グリホサート抵抗性を予測する主要なドメインを更に同定するために、大腸菌EPSPシンターゼの公表された結晶構造に基づいて分子モデリングデータを分析した。最初に、GRG1のアミノ酸配列を、グリホサート及びシキミ酸3−ホスフェート(Shonbrunn et al.(2001)PNAS98:1375−1380;タンパク質データバンクコード(pdb)1G6T)に基づくその結晶大腸菌EPSPシンターゼ(AroA)の3次元構造に組み込んだ。グリホサート結合への効果のための本発明のドメインの各々の改変の結果、或いは基質結合ポケットの改変の結果を分析した。この分析によって、PEPのための結合ポケットの一部及びその阻害剤グリホサートを形成し、且つ直接PEPのホスフェートと水素結合することが知られている不変のアルギニンを含むループ内の関連する領域が明らかにされた。この領域には、極性が増大するアミノ酸配列、及び:
D−C−X1−X2−S−G(配列番号29)、但しX1はグリシン、セリン、アラニン又はアスパラギンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
D−A−X1−X2−S−G(配列番号30)、但しX1はアラニン又はアルギニンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
K−L−K−X1−S−A(配列番号31)、但しX1はグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
W−C−E−D−A−G(配列番号32)、からなる群から選択される少なくとも1つの配列ドメインを含む。
本発明のドメインの極性が増加したQループ領域を含む幾つかのグリホサート抵抗性EPSPシンターゼ酵素(例えば、GRG1、GRG10並びにウェルシュ菌及びFusobacterium nucleatum由来のEPSPシンターゼを包含する)もまた、保存されたLKドメインを含む。大腸菌結晶構造に組み込むことによるこの配列の位置の分析によって、この配列が分子の外面に曝露されることが示される。この配列は、EPSPシンターゼの任意の既知の主要な領域の近くに存在せず、PEP、グリホサート又はシキミ酸3−ホスフェートの結合に直接関与すると思われないことから、グリホサート抵抗性に対するこの配列の寄与についてはまだ知られていない。更に、このドメインが、本発明のドメインを含むもの以外の多くのEPSPシンターゼ酵素において認められることから、この配列は、ここで記載されるドメインの極性が増加したQループ領域の非存在下でグリホサート抵抗性にほとんど又は全く影響を及ぼし得ない。しかし、それはタンパク質の他の性質に影響を及ぼし得る。
これらの主要なドメインが発見されたものとして、我々は幾つかのグリホサート抵抗性EPSPシンターゼ酵素の存在を予測することができた。
Fusobacterium nucleatumEPSPシンターゼ(配列番号7)の公表されたアミノ酸配列を、GENBANK(登録商標)から入手し、次いで逆翻訳により合成的に設計し、次いでDNA2.0を用いてin vitroで合成した。結果として生じるDNA配列を、サブクローニングを容易にするためにフランキングBamHI及びAscI部位を含むように設計した。合成遺伝子を、BamHI及びAscIを使用してDNA2.0のドナーベクターから切除し、ゲル精製し、BamHI及びAscIで消化された修飾pUC18の同じ部位内に連結し、次いでDH5α細胞内に形質転換した。EPSPシンターゼ挿入物を含む陽性のクローンを、制限消化及びDNA塩基配列決定によって同定し、pAX723(synFusoΠ)と名づけた。コードされたEPSPシンターゼを、grg21(配列番号8)と名づけた。
Methanopyrus kandleriEPSPシンターゼの公表されたアミノ酸配列をGENBANK(登録商標)から入手し、逆翻訳によって合成的に設計し、次いでDNA2.0を用いてin vitroで合成した。結果として生じるDNA配列(配列番号9)を、サブクローニングを容易にするためにフランキングBamHI及びAscI部位を含むように設計した。合成遺伝子を、BamHI及びAscIを使用してDNA2.0のドナーベクターから切除し、ゲル精製し、BamHI及びAscIで消化された修飾pUC18の同じ部位内に連結し、次いでDH5α細胞内に形質転換した。EPSPシンターゼ挿入物を含む陽性のクローンを、制限消化及びDNA塩基配列決定によって同定し、pAX724(synMethII)と名づけた。コードされたEPSPシンターゼを、grg22(配列番号10)と名づけた。
grg21及びgrg22をそれぞれ含むプラスミドpAX723及びpAX724を大腸菌細胞内に形質転換し、次いでIPTG、カルベニシリン、及びグリホサートの各種濃縮物を含むM63寒天培地上へ画線した。pAX701(野生型大腸菌aroA遺伝子を含む)のコロニーをグリホサート感受性対照として使用した。結果は下表に示される。grg21又はgrg22の発現によって高レベルのグリホサートに対する抵抗性が付与される。
強いグリホサート抵抗性を示す菌株からGRG23(2005年12月1日に出願された米国特許出願第60/741,166、配列番号14)を単離した。GRG23は、本発明のドメインを含まないEPSPシンターゼ酵素よりもQループ領域内の極性が増大した本発明のEPSPシンターゼドメインを含む。この酵素は、GRG23を発現する発現構築体で形質転換された生物にグリホサート耐性を付与する。
本明細書において提供されるドメインは、既に定義されたクラスII(米国特許第5,627,061号)又はクラスIII(2005年6月29日に出願の米国特許出願第60/695,193号)のEPSPシンターゼドメインに対して重複しない。従って、本発明のドメインの及びクラスII又はクラスIIIのドメインの両方の全て又は一部のエレメントを含むと考えられるタンパク質が実際に存在し得ると考えられる(例えば、破傷風菌に由来するEPSPシンターゼ(Swissprot受入れ番号Q894D2及び配列番号28)はクラスII及び本発明のドメインの両方を含む)。
本発明の方法を使用して、EPSPシンターゼ酵素を含むデータベースを検索することによって、及び/又はEPSPシンターゼ酵素のアミノ酸配列のアラインメント及びQループ領域の極性増大又は本発明のドメインを含むタンパク質についての分析によって、グリホサート抵抗性EPSPシンターゼを更に同定することができる。このQループ領域又はこれらのドメインの多少の修飾は、これらのドメインのグリホサート抵抗性付与の性質を途絶させることなく実際に許容され、そしてそれ故に本明細書においてリストが示されるドメインに相当するものと判断される。それ故、本発明のドメインに対して約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%。約99%以上の相同性を有する酵素であればグリホサート耐性を付与し得るものと認められる。
トウモロコシの穂先は、受粉の8〜12日後に最も採集される。胚は穂先から単離され、そして形質転換における使用には、0.8〜1.5mmの大きさの胚が好ましい。胚を、DN62A5S培地(3.98g/LのN6塩;(1000×のストックの)1mL/LのN6ビタミン;800mg/LのL型アスパラギン;100mg/Lのミオイノシトール;1.4g/LのL−プロリン;100mg/Lのカザミノ酸;50g/Lのスクロース;(1mg/mLのストックの)1mL/Lの2,4−D)等の適切なインキュベーション培地上に胚盤側を上にして平板培養する。しかし、DN62A5S以外の培地及び塩が適切であって、当該技術分野で知られている。胚を、25℃の暗所で終夜インキュベーションする。しかし、胚を終夜インキュベーションすることは、それ自体が必要なことではない。
穂先は、受粉の8〜12日後に最も採集される。胚は穂先から単離され、そして形質転換における使用には、0.8〜1.5mmの大きさの胚が好ましい。胚を、適切なインキュベーション培地上に胚盤側を上にして平板培養し、25℃の暗所で終夜インキュベーションする。しかし、胚を終夜インキュベーションすることは、それ自体が必要なことではない。約5〜10分間、Tiプラスミドによって媒介される移送のために、Qループ領域の極性増大又は本発明のドメインを有するEPSPシンターゼ酵素を有する適当なベクターを含むアグロバクテリウム株を胚に接触させ、次いで約3日間(25℃の暗所で)、共存培養培地上に胚を平板培養する。共存培養後、約5日間(25℃の暗所で)、回復期培地へ外植片を移す。外植片を、使用される特定の選択の性質及び特徴に応じて、最高で8週間まで選択培地中でインキュベーションする。選択期間後、結果として生じるカルスを、成熟体細胞胚の形成が認められるまで胚成熟培地に移す。次いで、その結果生じる成熟体細胞胚を弱光下で置床し、そして当該技術分野で知られている通りに再生のプロセスを開始する。その結果生じる苗条を発根培地上で発根させ、そして結果として生じる植物を苗容器に移し、トランスジェニック植物として増殖させる。
Claims (21)
- Qループを有するEPSPシンターゼポリペプチドをコードする、配列番号1、3、5、11、13、38、40のポリヌクレオチド以外の単離されたポリヌクレオチド及び配列番号2、8、10、46、47、48、49、50、51又は52をコードするポリヌクレオチドであって、該Qループは極性が増大したアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドはグリホサートに抵抗性である、ポリヌクレオチド。
- 前記Qループが、
a)D−C−X1−X2−S−G(配列番号29)、但しX1はグリシン、セリン、アラニン又はアスパラギンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;
b)D−A−X1−X2−S−G(配列番号30)、但しX1はアラニン又はアルギニンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;
c)K−L−K−X1−S−A(配列番号31)、但しX1はグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
d)W−C−E−D−A−G(配列番号32)、からなる群から選択される少なくとも1つの配列ドメインを有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 - 前記Qループが、配列番号22のアミノ酸残基98に相当する少なくともセリン又はスレオニンを有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、アミノ末端葉緑体トランジットペプチド(amino−terminal chloroplast transit peptide)及びEPSPシンターゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- グリホサート除草剤に対して耐性がある遺伝的に形質転換した植物を作製する方法であって、
a)Qループを有するポリペプチドをコードする、配列番号1、13、38のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド又は配列番号2、46、47、48、49、50、51又は52をコードするポリヌクレオチドを、植物細胞のゲノム内に挿入する工程であって、該Qループは極性が増加したアミノ酸配列を含む、工程;
b)形質転換された植物細胞を得る工程;及び
c)グリホサート除草剤に対する増大した耐性を有する遺伝的に形質転換された植物を、該形質転換された植物細胞から再生する工程、
を含む、方法。 - 前記Qループが、
a)D−C−X1−X2−S−G(配列番号29)、但しX1はグリシン、セリン、アラニン又はアスパラギンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;
b)D−A−X1−X2−S−G(配列番号30)、但しX1はアラニン又はアルギニンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;
c)K−L−K−X1−S−A(配列番号31)、但しX1はグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
d)W−C−E−D−A−G(配列番号32)、からなる群から選択される少なくとも1つの配列ドメインを有する、請求項5に記載の方法。 - 前記Qループが配列番号22のアミノ酸残基98に相当する少なくともセリン又はスレオニンを有する、請求項5に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがアミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びEPSPシンターゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項5に記載の方法。
- Qループを有するEPSPシンターゼポリペプチドをコードする、配列番号1、13、38のポリヌクレオチド以外の異種のポリヌクレオチド又は配列番号2、46、47、48、49、50、51又は52をコードするポリヌクレオチドを含むグリホサート耐性植物細胞であって、該Qループは極性が増大したアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドはグリホサートに抵抗性である、グリホサート耐性植物細胞。
- 前記Qループが、
a)D−C−X1−X2−S−G(配列番号29)、但しX1はグリシン、セリン、アラニン又はアスパラギンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;
b)D−A−X1−X2−S−G(配列番号30)、但しX1はアラニン又はアルギニンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;
c)K−L−K−X1−S−A(配列番号31)、但しX1はグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
d)W−C−E−D−A−G(配列番号32)、からなる群から選択される少なくとも1つの配列ドメインを有する、請求項9に記載のグリホサート耐性植物細胞。 - 前記Qループが配列番号22のアミノ酸残基98に相当する少なくともセリン又はスレオニンを有する、請求項9に記載のグリホサート耐性植物細胞。
- 前記ポリヌクレオチドがアミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びEPSPシンターゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項9に記載のグリホサート耐性植物細胞。
- トウモロコシ、小麦、米、オオムギ、大豆、綿、テンサイ、アブラナ、カノーラ、亜麻、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ムラサキウマゴヤシ、ポプラ、松、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、エンドウ、レンズマメ、ブドウ及び芝草からなる群から選択される請求項9に記載のグリホサート耐性植物細胞。
- 請求項9に記載の植物細胞を含むグリホサート耐性植物。
- 請求項14に記載の植物の形質転換された種子。
- トウモロコシ、小麦、米、オオムギ、大豆、綿、テンサイ、アブラナ、カノーラ、亜麻、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ムラサキウマゴヤシ、ポプラ、松、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、エンドウ、レンズマメ、ブドウ及び芝草からなる群から選択される請求項14に記載のグリホサート耐性植物。
- 作付けされた種子または植物(plant)を有する植物(plant)を含む圃場内における雑草を選択的に制御するための方法であって、
a)該種子又は該植物内に挿入される配列番号1、13、38のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド又は配列番号2、8、10、46、47、48、49、50、51又は52をコードするポリヌクレオチドの結果としてグリホサート耐性である該種子又は該植物を作付けする工程であって、該ポリヌクレオチドがQループを有し、該Qループが極性が増大したアミノ酸配列を含む、工程;及び
b)該植物に著しく影響を及ぼすことなく雑草を制御するために有効な濃度のグリホサート除草剤を、圃場内の該植物及び雑草に加える工程、
を含む、方法。 - 前記Qループが、
a)D−C−X1−X2−S−G(配列番号29)、但しX1はグリシン、セリン、アラニン又はアスパラギンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;
b)D−A−X1−X2−S−G(配列番号30)、但しX1はアラニン又はアルギニンを示し、及びX2はアスパラギン又はグルタミン酸を示す;
c)K−L−K−X1−S−A(配列番号31)、但しX1はグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸を示す;又は、
d)W−C−E−D−A−G(配列番号32)、からなる群から選択される少なくとも1つの配列ドメインを有する、請求項17に記載の方法。 - 前記Qループが配列番号22のアミノ酸残基98に相当する少なくともセリン又はスレオニンを有する、請求項17に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがアミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びEPSPシンターゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項17に記載の方法。
- 配列番号7及び9を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
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