JP2009521688A - 配向され、固定化された巨大分子を含む組成物とその製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第60/753,816号(2005年12月23日出願)(これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる)の利益を主張する。
巨大分子は、ある巨大分子を他の巨大分子から容易に区別するのに使用できるモノマー又は他の成分のユニークな配列を含むことができる。巨大分子が他の主体(entity)と結合又は会合すると、その主体は巨大分子の特徴により同定することができる。主体は、巨大分子が会合することができる当業者に明らかな任意の主体、例えば支持体、表面、他の分子、アレイ中の位置、又は他の任意の主体であることができる。
特定の態様において、本発明は、伸張された状態で巨大分子を選択的に固定化する方法を提供する。驚くべきことに、本発明では、伸張のためにどのような外力が使用されても、十分に伸張されたまま巨大分子を選択的に固定化することができる。さらに、本発明の方法は、互いに配向している伸張された巨大分子の選択的固定化を容易にする。すなわち、本発明の方法では、複数の巨大分子を互いに同じ配向で容易に固定化することができる。
後述の[図面の簡単な説明]を参照のこと。
本明細書で使用するすべての用語は、特に明記しない場合は、当業者に一般的な意味を有する。以下の用語は以下の意味を有する。
要約に記載されるように、本発明は、伸張された状態で巨大分子を選択的に固定化する方法を提供する。巨大分子はいったん選択的に固定化されると、当業者に公知の任意の目的に使用することができる。
本方法において、巨大分子は、当業者に公知の限定されない任意の巨大分子であることができる。特定の実施形態において、巨大分子は、本発明の方法で伸張することができる巨大分子である。特定の実施形態において、巨大分子は、下記の節に記載されるように1つまたは2つの部分で固定化することができる。
本発明の方法において、巨大分子の第1部分が固定化される。一般に、第1部分は、当業者により固定化されていると認識される場合、固定化されている。第1部分は当業者に公知の任意の技術により固定化することができる。特定の実施形態において、巨大分子の第1部分を固定化するための技術は、本発明の方法にとって決定的に重要なものではない。
本発明の特定の方法において、巨大分子は伸張された状態である。一般に、いずれの巨大分子も、当業者によりそのように認識される場合に、伸張された状態である。
本発明の特定の方法において、巨大分子は配向した状態である。一般に、巨大分子はいずれも当業者により配向していると認識される場合には、そのような状態である。
上記したように、本発明の方法において、巨大分子の第2部分は選択的に固定化される。巨大分子の第2部分は、巨大分子の第1部分とは同一ではない巨大分子の任意の部分であることができる。いくつかの実施形態において、巨大分子の第2部分は、巨大分子の第1部分のどの部分とも重複しない。
特定の実施形態において、本発明は、伸張された状態又は配向した状態で巨大分子の第1部分と第2部分とを選択的に固定化する方法を提供する。重要なことは、本発明のこれらの方法では、巨大分子を伸張又は配向することができる外力を適用する前に、巨大分子を固定化する必要は無いことである。
本発明の方法では、固定化用支持体は、当業者に公知の巨大分子に選択的に結合することができる任意の支持体であることができる。さらに、特定の態様において、本発明は、伸張された状態で選択的に固定化された巨大分子を含む組成物を提供する。前記組成物は、本明細書に記載のように、伸張された状態でそこに結合されている巨大分子を有する支持体を含む。巨大分子はもちろん本発明の方法に従って固定化することができる。
選択的に固定化され伸張及び/又は配向された巨大分子は、当業者に公知の任意の目的に使用することができる。例えば、選択的に固定化され、伸張及び/又は配向された巨大分子は、マッピング、ナノアセンブリー、および表面プラズモン共鳴に有用である。
本発明はさらに、本発明の1つ又はそれ以上の成分を含むキットを提供する。前記キットは、例えば本発明の支持体、および該支持体上に選択的に固定化された1つ又はそれ以上の伸張及び/又は配向された巨大分子、或いはその両方の巨大分子を含むことができる。前記キットは上記を含む当業者に公知の任意の目的に使用することができる。
6.1 実施例1:伸張されたDNAの選択的固定化
7.2Kbの長さの2本鎖RNA-DNAハイブリッドの一端をビオチンで官能化する。もう一方の端で、このDNAは15塩基が4回繰り返された1本鎖配列を含む(5'-GTC TAT CAT CAC AGC GTC TAT CAT CAC AGC GTC TAT CAT CAC AGC GTC TAT CAT CAC AGC-3';配列番号1)。すなわち、DNAは一端に、選択的固定化のための4つの結合部位を含む。このハイブリッドはまた、RNAに取り込まれたCy3蛍光物質を含む4つの領域を有する。
フルオロフォア標識とビオチン親和性タグとを含む巨大分子を調製し、実施例3に従って精製する。巨大分子は、ビオチンを含むカバーガラス表面に結合し、実施例3に従って電場によって延伸される。最後にアークランプを使用して巨大分子を照射し、カメラで画像を撮る。画像の例を図5に示す。個々の色素および、重要なことには、個々の巨大分子上の色素の順序を画像で検出することができる。
これは、種々の成分からのナノレポーターの構築の工程毎の例である。種々の成分を同時に、他の成分の前又は後に加えることができることを理解されたい。例えば足場(scaffold)へのパッチユニット又はフラップのアニーリングを同時に又は順に行うことができる。
1本鎖環状M13mp18 DNA(USB)をBamHI認識部位に相補的な5倍モル過剰のオリゴヌクレオチド(Bam Cutterオリゴ)にアニーリングさせ、BamHI制限酵素で切断して線状1本鎖DNA骨格を得る。次にBamHI Cutterオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド(抗Bamオリゴヌクレオチド)を50倍過剰で加えて、遊離BamHI Cutterオリゴヌクレオチドを隔離することにより、M13が以後の工程で再環状化することを防止する。
M13足場に沿って10種の異なる領域を作製するために、10セットのオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。各対は、5'末端にT7 RNAポリメラーゼプロモーターを有する1つのプライマーを含有する。領域2〜7は、900塩基(約300nm)(これは回折限界スポット(標準的光学系で達成できる最小のスポット)の適切なサイズであるため)の長さであるように設計する。領域1と8は長いバージョンと短いバージョンとを有する:長いバージョンは全900塩基領域をカバーし、短いバージョンは900塩基領域の一部のみをカバーして標的特異的配列を結合させることができる。すなわち、いずれかの末端に標的特異的配列を結合させることができる。末端はまた、アンカー又はタグの結合に使用することができる。
2本鎖鋳型として上記PCR産物を使用して、Ambion製のin vitro転写キット(Megascript T7キット)を使用してRNAセグメントを作製する。転写反応の生成物をQiagen製のRNeasyキットを使用して精製する(鋳型を除去するためのDNAseIによる処理を含む)。
2本鎖鋳型として上記PCR産物を使用して、Ambion製のin vitro転写キット(MessageAmp aRNAキット)を使用して後の色素結合のためのRNAセグメントを作製する。アミノアリル改変型UTPヌクレオチドは、転写中にRNAセグメントに取り込まれる。転写反応の生成物をQiagen製のRNeasyキットを使用して精製する(鋳型を除去するためのDNAseIによる処理を含む)。
Ambion Aminoallyl Labelingキットを使用して、20〜100μgのアミノアリル改変型RNAセグメントをNHS-エステル色素と結合させる。使用される色素には、Alexa 488、Alexa 594及びAlexa 647(Invitrogen/Molecular Probes)ならびにCy3(Amersham)がある。
各位置のセグメントを、1X SSPEバッファー中、2:1のセグメント対M13足場の比で、70℃で2時間アニーリングする。
S2 DNA標的オリゴヌクレオチドを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Integrated DNA Technologies)により精製した。Ambion MegascriptTMキットを製造業者の説明書に従って使用して、クローン化SARSコロナウイルス遺伝子(Invitrogen)の領域に対応するPCR産物のin vitro転写により、S2 RNA標的分子を作製した。S2ゴーストプローブ(図8A(i))はS2標的配列の特異的50塩基領域(S2-a)に相補的であり、5'末端のビオチン−TEGモノマーを用いて合成し、高速液体クロマトグラフィー(Integrated DNA Technologies)により精製した。S2標的(S2-b)と相補的な50bpと、M13足場への結合のために使用される追加の配列の9bp(全部で59塩基)とを含む第2のオリゴヌクレオチドを合成し、HPLC(Integrated DNA Technologies)により精製した。S2-aとS2-b標的領域は重複していなかったことに注意されたい。
オリゴヌクレオチドS2-bを線状化M13(図8A(iii))の5'末端に連結し、生じた生成物を、製造業者の説明書に従うYM100フィルター(Millipore)を介したサイズ排除ろ過により、残存する連結していないオリゴヌクレオチドから精製した。2、4、6、及び8位(図7A)のM13に相補的なアミノ−アリル−改変型RNAセグメントを、製造業者の説明書に従うAmbion MegascriptTMキットにより、DNA鋳型(PCR産物)のin vitro転写から作製した。次にこのセグメントを、Ambionの説明書(アミンアリルMessageAmpTMII aRNAキット)に従って、NHS-エステル改変型Alexa647色素(Invitrogen)に結合させた。M13足場(図7C)の1、3、5、および7位に対応するRNAセグメントを、上記のDNA鋳型から非改変型のin vitro転写RNAとして作製した。10fmol/μlの8つの各セグメントを5fmol/μlのM13-S1-b足場に1X SSPEバッファー(150mM 塩化ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム、1mM EDTA)中70℃で2時間アニーリングして、ナノレポーターのアセンブリーを行った。最終生成物は、暗セグメントが散在しているA647(赤)で標識された4つのセグメントを有するナノレポーターであった。
以下の条件下でナノレポーターとゴーストプローブの標的へのハイブリダイゼーションを行った:5X SSPE(750mM 塩化ナトリウム、50mM リン酸ナトリウム、5mM EDTA 二ナトリウム)、40pMゴーストプローブ(結合オリゴヌクレオチドS2-a)、40pM ナノレポーターS2-b、100ng/μl 剪断したサケ精子DNA、5Xデンハルツ溶液、および0.1% Tween。最終標的濃度は、20pM S2 DNA標的(図8B)と1pM S2 RNA標的(図8C)であった。陰性対照には標的は加えなかった(図8D)。ハイブリダイゼーション反応物は65℃で少なくとも16時間インキュベートした。
ナノレポーターが標的分子と対応する標識核酸(すなわち標識モノマーに結合した核酸)とに結合した時点で、これらを表面に結合させ、延伸して、標識モノマーにより放射されるシグナルの順序を解明することにより、標的分子を同定する。この実施例では、ナノレポーターが延伸されて、特定の標的分子に対応するその蛍光色素コードを空間的に解明する。ナノレポーターは一端を表面(この実施例ではカバーガラス、下記調製物を参照)に結合させることにより延伸される。表面結合のために以下の2つの方法が使用される:A)ビオチン化されているナノレポーターを含むAccelr8 Corporation製のストレプトアビジン被覆スライド、及びB)ストレプトアビジンを有するナノレポーターを含むビオチン被覆スライド。バッファー中で、ナノレポーターは活性表面と接触され、ある期間インキュベートされる。反応は、チャネルを作製するためにエッチングしたシリコンウエハーに成形したPDMSから作製されたフローセル中で行う。バッファーとサンプルの挿入用に、メタルチュービングを使用してチャネルの端でウェルを抜き取る。チャネルの寸法は、幅0.5mm又は1mmで高さ54μmである。サンプルをフローセルのレーンに充填した時点で、ナノレポーターが結合するはずである。電圧を印加するか、又はストリングスを延伸させる後退したメニスカスと共に液体を除去して乾燥することにより、ナノレポーターを延伸させることができる。
結合表面(Accelr8ブランドのストレプトアビジン−OptiChem、被覆カバーガラス)をスライド容器当たり5つの表面の単位で入れ、各容器をホイルポーチ中にシリカ乾燥剤のパッケージと共に封入する。ポーチを、使用するまで-20℃で保存する。
最初に、選択したレーンの1つのウェルにサンプル(現在100mM ホウ酸ナトリウムバッファー、pH9.8、で希釈されている)の5μl液滴を適用して、サンプルを表面体に結合させる。液滴は、チャネルがウェルに結合する場所に接触するはずである(この場所でサンプルの一部はチャネルに入る)。チャネルを充填し、非常に弱い吸引機(<2kPa)を使用して小滴をチャネルを介して反対のウェルに引き込むことにより、結合をチャネルにわたって平衡化させる。この処理を、各レーンの他のサンプルについて繰り返す。次にウェルから過剰の流体を除去し、ウェルにテープを貼って蒸発を減少させ、素子を室温、暗所で20分間インキュベートする。
カバーガラス/PDMS素子の下部に浸漬油をスポットし、顕微鏡上に置く。第1のPDMSチャネルの反対の端のウェルに電極をさし込む(上部のウェルに陰極、下部のウェルに陽極)。チャネルの最初の画像は下部のウェルの近くで撮る。目的の領域に焦点が当たるように顕微鏡のステージを調整する。
アークランプを光源として使用する際、最適なフルオロフォア選択は、蛍光の重複を生じない最も明るいタイプであり、例えばAlexa 488、Cy3、およびAlexa 594である。より弱い蛍光色素(例えば、Alexa 647及びCy5.5)も使用できる。
選択されたフルオロフォアAlexa 488、Cy3、Alexa 594、及びAlexa 647について、Cy3とAlexa 594間で重複があるかもしれない。しかし、バンド幅572〜600nmの発光フィルターを特注することにより重複が最小化される。
使用される顕微鏡モデルは、倒立型蛍光画像化ステーションを使用するNikon Incorporation製のNikon Eclipse TE2000Eであり、これは複数の蛍光色素候補から蛍光発光の選択を可能にする6つのフィルターカセットを有する。選択された色素について、必要な光学分割はすべての波長(500〜700nm)について約400nmである。選択される対物レンズはNikon Plan Apo TIRFレンズであり、これはNAが1.45で倍率が60である。光学分割は、様々な波長について約210〜300nmである。
Claims (59)
- 伸張させた状態で巨大分子を選択的に固定化する方法であって、伸張される巨大分子の第1部分は固定化されており、巨大分子が伸張された状態で固定化されるように、伸張される巨大分子の第2部分を選択的に固定化する工程を含む、上記方法。
- 固定化される巨大分子は第1部分と第2部分の間で伸張される、請求項1記載の方法。
- 巨大分子の第1部分は選択的に固定化される、請求項1記載の方法。
- 第2部分を選択的に固定化する工程の前に、伸張される巨大分子の第1部分を選択的に固定化する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 固定化される巨大分子の第1部分及び第2部分は単一の表面に選択的に固定化される、請求項1記載の方法。
- 巨大分子の第2部分を選択的に固定化するために、巨大分子の第2部分は、結合対の第2メンバーに選択的に結合することができる該結合対の第1メンバーを含む、請求項1記載の方法。
- 第1メンバーは巨大分子に非共有結合している、請求項6記載の方法。
- 第1メンバーは巨大分子に共有結合している、請求項6記載の方法。
- 表面は、巨大分子の選択的固定化のための結合対の第2メンバーを含む、請求項6記載の方法。
- 結合対の第1メンバーは、リガンド、抗原、炭水化物、核酸、受容体、レクチン、及び抗体よりなる群から選択される、請求項6記載の方法。
- 結合対の第1メンバーは、ビオチン、ジゴキシゲニン、FITC、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、及び抗FITCよりなる群から選択される、請求項6記載の方法。
- 結合対の第2メンバーは、リガンド、抗原、核酸、受容体、及び抗体よりなる群から選択される、請求項6記載の方法。
- 結合対の第2メンバーは、ビオチン、ジゴキシゲニン、FITC、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、及び抗FITCよりなる群から選択される、請求項6記載の方法。
- 巨大分子の第1部分を選択的に固定化するために、巨大分子の第1部分は、結合対の第2メンバーに選択的に結合することができる該結合対の第1メンバーを含む、請求項1記載の方法。
- 第1メンバーは巨大分子に非共有結合している、請求項14記載の方法。
- 第1メンバーは巨大分子に共有結合している、請求項14記載の方法。
- 表面は、巨大分子の選択的固定化のための結合対の第2メンバーを含む、請求項14記載の方法。
- 結合対の第1メンバーは、リガンド、抗原、炭水化物、核酸、受容体、レクチン、及び抗体よりなる群から選択される、請求項14記載の方法。
- 結合対の第1メンバーは、ビオチン、ジゴキシゲニン、FITC、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、及び抗FITCよりなる群から選択される、請求項14記載の方法。
- 結合対の第2メンバーは、リガンド、抗原、核酸、受容体、及び抗体よりなる群から選択される、請求項14記載の方法。
- 結合対の第2メンバーは、ビオチン、ジゴキシゲニン、FITC、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン、及び抗FITCよりなる群から選択される、請求項14記載の方法。
- 選択的固定化は1つ又はそれ以上の非共有結合を介する、請求項1記載の方法。
- 選択的固定化は1つ又はそれ以上の共有結合を介する、請求項1記載の方法。
- 巨大分子の第2部分を選択的に固定化するために、巨大分子の第2部分は、第2成分と選択的に反応することができる第1成分を含む、請求項1記載の方法。
- 表面は、巨大分子の選択的固定化のために結合対の第2メンバーを含む、請求項24記載の方法。
- 第1成分は、スクシンアミド、アミン、アルデヒド、エポキシ、及びチオールよりなる群から選択される、請求項24記載の方法。
- 第2成分は、スクシンアミド、アミン、アルデヒド、エポキシ、及びチオールよりなる群から選択される、請求項24記載の方法。
- 巨大分子は外力により伸張される、請求項1記載の方法。
- 外力は、重力、電磁力、及び流体力よりなる群から選択される、請求項28記載の方法。
- 外力は電位である、請求項28記載の方法。
- 外力は重力である、請求項28記載の方法。
- 外力は流体力である、請求項28記載の方法。
- 巨大分子はポリマーである、請求項1記載の方法。
- ポリマーはポリヌクレオチドである、請求項30記載の方法。
- ポリヌクレオチドは1本鎖である、請求項34記載の方法。
- ポリヌクレオチドは複数の相補鎖を含む、請求項34記載の方法。
- ポリヌクレオチドは2つの相補鎖を含む、請求項34記載の方法。
- ポリヌクレオチドは3つの相補鎖を含む、請求項34記載の方法。
- ポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸又はリボ核酸である、請求項34記載の方法。
- 第2部分は巨大分子の末端である、請求項1記載の方法。
- 第1部分は巨大分子の末端である、請求項1記載の方法。
- 第1部分および第2部分は巨大分子の末端である、請求項1記載の方法。
- 第2部分は巨大分子の末端ではない、請求項1記載の方法。
- 第1部分は巨大分子の末端ではない、請求項1記載の方法。
- 第1部分に加えて、伸張される巨大分子の複数の部分が選択的に固定化されている、請求項1記載の方法。
- 伸張される巨大分子の第3部分を選択的に固定化することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 巨大分子を伸張させかつ選択的に固定化する方法であって、
a)巨大分子を伸張させるのに十分な外力を、少なくとも第1部分が固定化されている巨大分子に適用する工程;及び
b)伸張される巨大分子の第2部分を選択的に固定化する工程
を含む、上記方法。 - 巨大分子を伸張させかつ選択的に固定化する方法であって、
a)巨大分子の第1部分を表面に固定化する工程;
b)巨大分子を伸張させることができる外力を巨大分子に適用する工程;
c)巨大分子の第2部分を、巨大分子の第2部分に結合できる第1成分と前記表面に選択的に結合できる第2成分とを含む分子と、該分子が巨大分子の第2部分に選択的に結合しかつ前記表面に選択的に結合する条件下で接触させることにより、巨大分子を伸張させた状態で選択的に固定化する工程
を含む、上記方法。 - 選択的に固定化され、伸張された巨大分子を含む表面。
- 固定化され伸張された巨大分子の少なくとも2つの部分は、表面に選択的に固定化されている、請求項49記載の表面。
- 固定化され伸張された巨大分子は、少なくとも2つの固定化部分の間で実質的に伸張されている、請求項50記載の表面。
- 請求項1、47、又は48の方法に従って調製された、選択的に固定化され伸張された巨大分子を含む表面。
- 配向させた状態で巨大分子を選択的に固定化する方法であって、伸張される巨大分子の第1部分が固定化されており、巨大分子が配向された状態で固定化されるように、伸張される巨大分子の第2部分を選択的に固定化する工程を含む、上記方法。
- 巨大分子を配向させかつ選択的に固定化する方法であって、
a)少なくとも第1部分が固定化された巨大分子に、該巨大分子を配向させるのに十分な外力を適用する工程;及び
b)配向される巨大分子の第2部分を選択的に固定化する工程
を含む、上記方法。 - 巨大分子を配向させかつ選択的に固定化する方法であって、
a)巨大分子の第1部分を表面に固定化する工程;
b)巨大分子を配向させることができる外力を巨大分子に適用する工程;
c)巨大分子の第2部分を、巨大分子の第2部分に結合できる第1成分と前記表面に選択的に結合できる第2成分とを含む分子と、該分子が巨大分子の第2部分に選択的に結合しかつ該表面に選択的に結合する条件下で接触させることにより、配向された状態で巨大分子を選択的に固定化する工程
を含む、上記方法。 - 選択的に固定化され、配向された巨大分子を含む表面。
- 固定化され配向された巨大分子の少なくとも2つの部分は、表面に選択的に固定化されている、請求項56記載の表面。
- 固定化され配向された巨大分子は、少なくとも2つの固定化部分の間で実質的に伸張されている、請求項57記載の表面。
- 請求項53、54、又は55に従って調製された、選択的に固定化され伸張された巨大分子を含む表面。
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