JP2009517641A - 溶液中の物質の濃度の測定方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ３００ｎｍ以下に吸収を有する物質の溶液中での検出及び濃度測定のための方法及び装置の提供。
【解決手段】 装置（１０）は、透明セル（３０）、光源（２０）、バンドパスフィルター（２２）、ビームスプリッター（２４）、対照検出器（４２）及び試料検出器（４０）を備えており、波長３００ｎｍ以下の光を放射する発光ダイオード（２０）を光源として用いる。光源（２０）からバンドパスフィルター（２２）を通して波長３００ｎｍ以下の紫外光を送り、ビームスプリッター（２４）に通し、ビームスプリッターで分岐した電磁波を対照検出器（４２）で定量して対照値を得、既知の光路長のセル（３０）を通過した電磁波を試料検出器で定量して試料値を得、試料値と対照値から吸光度（Ａ）を計算する。本発明の方法及び装置はタンパク質及び核酸の検出及び濃度測定に特に有用である。
【選択図】 図１
【解決手段】 装置（１０）は、透明セル（３０）、光源（２０）、バンドパスフィルター（２２）、ビームスプリッター（２４）、対照検出器（４２）及び試料検出器（４０）を備えており、波長３００ｎｍ以下の光を放射する発光ダイオード（２０）を光源として用いる。光源（２０）からバンドパスフィルター（２２）を通して波長３００ｎｍ以下の紫外光を送り、ビームスプリッター（２４）に通し、ビームスプリッターで分岐した電磁波を対照検出器（４２）で定量して対照値を得、既知の光路長のセル（３０）を通過した電磁波を試料検出器で定量して試料値を得、試料値と対照値から吸光度（Ａ）を計算する。本発明の方法及び装置はタンパク質及び核酸の検出及び濃度測定に特に有用である。
【選択図】 図１
Description
本発明は、３００ｎｍ以下に吸収をもつ物質の溶液中での濃度を検出及び測定するための方法及び装置に関する。
多くの物質はその化学組成に基づいて紫外又は可視光を吸収する。物質による光の吸収は、かかる物質の存在の検出及び濃度測定のための基礎として長年にわたって使用されている。物質の濃度は次式のランベルト・ベール則を用いて求めることができる。
Ａ＝Ｅ・ｂ・ｃ
式中、Ａは吸光度であり、ＥはＬ・ｍｏｌ-1・ｃｍ-1単位のモル吸光係数であり、ｂはｃｍ単位で定義される試料の光路長であり、ｃはｍｏｌ・Ｌ-1単位で表される溶液中の化合物の濃度である。
式中、Ａは吸光度であり、ＥはＬ・ｍｏｌ-1・ｃｍ-1単位のモル吸光係数であり、ｂはｃｍ単位で定義される試料の光路長であり、ｃはｍｏｌ・Ｌ-1単位で表される溶液中の化合物の濃度である。
Ｅｍａｘは所与の波長における物質の最大吸収を表す。
ＵＶ域は１〜４００ｎｍの領域の波長の光からなるとみなすことができ、１８０〜３００ｎｍの波長の光は「深ＵＶ」として知られる。
深紫外（ＵＶ）域に吸収を有する物質を検出するための分析機器の大半は、光源として水銀ランプ、重水素ランプ又はキセノンフラッシュランプを用いている。かかる機器の一例はフローセルであり、１種以上のＵＶ吸収性物質を含有する溶液をＵＶ光源（水銀ランプなど）とＵＶ検出器（光電子増倍管又は光ダイオードなど）の間に流し、検出器に到達するＵＶ光の強度の変化を溶液中のＵＶ吸収性物質の濃度と関連付ける。
タンパク質、核酸及びペプチドの検出は環境科学、生物科学及び化学技術を始めとする多くの分野で非常に重要である。タンパク質は深ＵＶ域に主として２つの吸収ピークを有しており、一方のピークは約１９０ｎｍに最大がある極めて強い吸収バンドであってペプチド結合による吸収によるものであり、もう１つの弱いピークは約２８０ｎｍにあって芳香族アミノ酸（チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンなど）による光の吸収によるものである。
核酸は２６０ｎｍ付近でＵＶ光を吸収し、核酸のサブユニットのあるもの（プリン）は２６０ｎｍよりも若干低波長側に吸収極大を有するが、他のもの（ピリミジン）は２６０ｎｍよりも若干長波長側に吸収極大を有する。
ほぼすべてのタンパク質は、光を吸収する芳香族アミノ酸を含んでいるため約２８０ｎｍに最大吸光度を有する。タンパク質の検出及び濃度測定に用いられる分析系の検出器の光源は歴史的に水銀線ランプである。水銀は２８０ｎｍではなく２５４ｎｍの波長の光を発光するので、水銀ランプで生成した２５４ｎｍの光を長波長に変換するため蛍光変換器が必要とされ、２８０ｎｍ付近の領域をカットするのにバンドパスフィルターが用いられる。
水銀ランプは寿命が比較的短く、経時的に不安定であることがあり、さらにランプの廃棄処理は環境問題を引き起こしかねない。紫外光の発生に用いられる重水素ランプ及びキセノンフラッシュランプのような他のランプは、不都合なことに、高電圧が必要とされ、複雑な電子機器が必要とされ、経時的に不安定であることも多い。現在使用されている紫外光源はすべて比較的大型であり、分析機器の小型化には適さない。さらに、これらのランプはすべてその作動に高電圧が必要とされるため大量の熱を発生する。
最近、２５０〜３６５ｎｍ域で発光するＡｌＧａＮ／ＧａＮ型発光ダイオード（ＬＥＤ）が開発された。Ｓｅｎｓｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国サウスカロライナ州コロンビア）は、特に生物学的に汚染された水のような液体の照射及び滅菌用のＵＶ発光ダイオードの開発及び用途の先駆者である（例えば、米国特許出願公開第２００５／００９３４８５号）。他のグループも水の精製系にＵＶ発光ダイオードを利用している（例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、国際公開第２００５／０３１８８１号）。
可視スペクトル域で発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）が、間接吸光度検出（Ｊｏｈｎｓ Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２５， ３１４５−３１５２）及びキャピラリー電気泳動における物質の蛍光検出に用いられている（Ｔｓａｉ Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２４， ３０８３−３０８８）。Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｔ （２００２） １２７， １５６４−１５６７にも、３７９．５ｎｍで発光するＵＶ発光ダイオードを無機陰イオンの間接吸光度検出に使用することが報告されている。
核酸の検出系における光源として深ＵＶ発光ダイオードを使用することが米国特許出願公開第２００５／０１３３７２４号に開示されている。ただし、ＬＥＤを用いた検出系が開示されてはいるが、提案された系がＰＣＲアッセイでの核酸量の測定に実際にうまく使用できたことを示す実験データはない。この系は、バンドパスフィルターも、ビームスプリッターと対照検出器も使用していないので、感度、直線性及びダイナミックレンジに欠けると思料される。ＬＥＤは温度のわずかな変化にも極めて感受性であり、摂氏百分の一度程度の温度変化でもベースラインにドリフトを生じる。しかも、この系には、バンド幅を狭くするとともに可視スペクトル域の光を遮蔽する働きをするバンドパスフィルターが存在しない。試料の本来のバンド幅よりも狭い、好ましくは１／１０比の狭いバンド幅で、応答の良好な直線性及び広いダイナミックレンジが得られる（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｅｄ． Ａ Ｋｎｏｗｌｅｓ ａｎｄ Ｃ． Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
特開２００２−００５８２６号公報には、オゾン濃度の測定系が開示されている。しかし、直線性及びダイナミックレンジを示す実験データはない。この系は、波長２４０〜２７０ｎｍに発光ピークを有する紫外光を放射するため、ダイヤモンド半導体薄膜からなる半導体エミッターを使用している。ＵＶピークの半値幅での発光スペクトルはオゾンの吸収スペクトル（発光最大約２５４ｎｍ）のピークの半値幅より幾分狭い。しかし、オゾン濃度の測定には充分であったとしても、バンド幅を、例えばオゾン吸収ピークの半値幅の十分の一に下げることができるバンドパスフィルターが存在しないため、検出器の直線性及びダイナミックレンジが大きく低下する（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｅｄ． Ａ Ｋｎｏｗｌｅｓ ａｎｄ Ｃ． Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。この系は対照光検出器も欠いており、放射光の強度の測定は行われない。これは、温度変化による発光強度の変化の補正ができないことを意味する。
米国特許出願公開第２００５／００９３４８５号明細書
国際公開第２００５／０３１８８１号パンフレット
米国特許出願公開第２００５／０１３３７２４号明細書
特開２００２−００５８２６号公報
米国特許第６４２６０４５号明細書
米国特許出願公開第２００３／０２５９０９号明細書
米国特許出願公開第２００５／０７４８９６号明細書
米国特許出願公開第２００５／２４７８８８号明細書
Ｊｏｈｎｓ Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２５， ３１４５−３１５２
Ｔｓａｉ Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２４， ３０８３−３０８８
Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｔ （２００２） １２７， １５６４−１５６７
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｅｄ． Ａ Ｋｎｏｗｌｅｓ ａｎｄ Ｃ． Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
本発明は、３００ｎｍ以下の吸収を有する物質の溶液中での検出及び／又は濃度測定用の分析系に現在使用されている光源に付随する上述の問題に取り組んだものである。
本明細書で用いる「物質」という用語は、あらゆる化学物質をいう。特に、有機化合物及び無機化合物が包含される。有機化合物の例としては、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸、タンパク質核酸、薬剤候補物質及び生体異物が挙げられる。無機化合物の例としては、金属塩（例えば、硫酸第二鉄、塩化銅、硝酸ニッケル）がある。
本発明の第１の態様では、３００ｎｍ以下に吸収を有する物質の溶液中での濃度を測定する方法であって、当該方法が、
ｉ）光源からバンドパスフィルターを通して波長３００ｎｍ以下の紫外光を送る段階、
ｉｉ）バンドパスフィルターから出た紫外光をビームスプリッターに通す段階、
ｉｉｉ）光の第１の部分をビームスプリッターで分岐して、第１の部分の電磁波を対照検出器で定量して対照値を得る段階、
ｉｖ）ビームスプリッターを通過する光の第２の部分を既知の光路長の溶液に照射する段階、
ｖ）溶液を通過した電磁波を試料検出器で定量して試料値を得る段階、及び
ｖｉ）試料値と対照値から吸光度（Ａ）を計算する段階
を含んでなり、上記光源が３００ｎｍ以下の波長の光を放射する発光ダイオードであることを特徴とする方法を提供する。
ｉ）光源からバンドパスフィルターを通して波長３００ｎｍ以下の紫外光を送る段階、
ｉｉ）バンドパスフィルターから出た紫外光をビームスプリッターに通す段階、
ｉｉｉ）光の第１の部分をビームスプリッターで分岐して、第１の部分の電磁波を対照検出器で定量して対照値を得る段階、
ｉｖ）ビームスプリッターを通過する光の第２の部分を既知の光路長の溶液に照射する段階、
ｖ）溶液を通過した電磁波を試料検出器で定量して試料値を得る段階、及び
ｖｉ）試料値と対照値から吸光度（Ａ）を計算する段階
を含んでなり、上記光源が３００ｎｍ以下の波長の光を放射する発光ダイオードであることを特徴とする方法を提供する。
本発明の第２の態様では、３００ｎｍ以下に吸収を有する物質の溶液中での濃度を測定するための装置であって、当該装置が、
ｉ）溶液を収容するための既知の光路長のセルであって、３００ｎｍ以下の波長の光に透明なセル、
ｉｉ）光源、
ｉｉｉ）バンドパスフィルター、
ｉｖ）光を第１の部分及び第２の部分に分割するためのビームスプリッター、
ｖ）ビームスプリッターで分岐された電磁波を検出するための対照検出器、及び
ｖｉ）溶液を通過した電磁波を検出するための試料検出器
を備えており、上記光源が３００ｎｍ以下の波長の光を放射する発光ダイオードであることを特徴とする装置を提供する。
ｉ）溶液を収容するための既知の光路長のセルであって、３００ｎｍ以下の波長の光に透明なセル、
ｉｉ）光源、
ｉｉｉ）バンドパスフィルター、
ｉｖ）光を第１の部分及び第２の部分に分割するためのビームスプリッター、
ｖ）ビームスプリッターで分岐された電磁波を検出するための対照検出器、及び
ｖｉ）溶液を通過した電磁波を検出するための試料検出器
を備えており、上記光源が３００ｎｍ以下の波長の光を放射する発光ダイオードであることを特徴とする装置を提供する。
本発明の第３の態様では、タンパク質、ペプチド及び核酸からなる群から選択される物質の濃度を測定するための、本発明の第１及び第２の態様に関して上述した装置の使用を提供する。
図１は、本発明の一実施形態に係る装置の概略横断面図である。装置（１０）はＵＶ発光ダイオード（２０）、入口（３２）と出口（３４）とを有するフローセル（３０）及び光検出器（４０，４２）を備えており、光検出器（４０，４２）はＵＶ感受性光電子増倍管又はＵＶ感受性光ダイオードのいずれでもよい。装置はバンドパス干渉フィルター（２２）を備えているが、これは、問題とするＵＶ波長に対して低い吸光係数を維持しながら、１以上のスペクトル帯又はスペクトル線を反射するとともに他のものを透過する光学フィルターである。フィルターのバンド幅は、良好な直線性と広いダイナミックレンジを得るため、好ましくは１０ｎｍ未満であり、狭いほど好ましい。光は次にビームスプリッター（２４）を通過する。ビームスプリッター（２４）は光の一部を分岐して対照光検出器（４２）に向け、残りの光は窓（３６）を通してフローセル（１０）内の溶液に導かれる。ビームスプリッター（２４）及び対照光検出器（４２）は、発光ダイオード（２０）の強度変化に追従させるのに用いられ、発光ダイオードを注意深く恒温維持する必要がなくなる。フローセル（３０）は、サファイア、石英又は合成溶融石英のようなＵＶ透明材料からなる窓（３６及び３８）を有しており、既知の光路長を有する。
３００ｎｍ以下に吸収を有する物質（タンパク質又は核酸など）を含有する溶液は、通常の矢印で示すように、入口（３２）及び出口（３４）を通してフローセル（３０）を通過する。フローセル（３０）内の溶液の照射にはＵＶ発光ダイオード（２０）を使用し、光は、ブロック矢印で示すようにＵＶ透明窓（３６）を通してフローセル（３０）に入る。溶液及び窓（３８）を通過した光（ブロック矢印で示す）は光検出器（４０）で検出される。
試料の照射に用いるＵＶ光の波長は、特定の波長のＵＶ光を放射する適当なＬＥＤ（例えば、ＵＶＴＯＰ（登録商標）２６０ｎｍ又は２８０ｎｍＬＥＤ）の使用、或いは深ＵＶに広い発光スペクトルを有する発光ダイオードの使用によって選択できる。放射光のバンド幅を狭めるとともに可視域の波長を遮蔽するため、ＬＥＤの手前にバンドパスフィルターを挿入する。ＵＶＴＯＰ（登録商標）ＬＥＤは、Ｓｅｎｓｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国サウスカロライナ州）から入手できる（例えば、「ＴＯ−３９」パッケージは複数のＵＶ発光ダイオードを備えており、２５０〜３６５ｎｍ域で放射する。）。
溶液中の物質の濃度は、物質のモル吸光係数（Ｅ）が既知であれば、ランベルト・ベール則を用いて求めることができる。或いは、物質の濃度は、所定の物質について所定の波長（例えば２８０ｎｍ）で予め作成しておいた用量−応答曲線を用いて決定することもできる。
本発明の別の実施形態に係る装置（１１０）の概略横断面図を図２に示す。３００ｎｍ以下の波長に吸収を有する物質を含有する溶液は、通常の矢印で示すように、入口（１３２）を通ってフローセル（１３０）に入り、セルを通過し、出口（１３４）から出ていく。フローセル（１３０）は光路長が既知のもので、サファイア、石英又は合成溶融石英のようなＵＶ透明材料から作成された窓（１３６及び１３８）を有する。
ＵＶ発光ダイオード（１２０）から出たＵＶ光（ブロック矢印）は、放射光のバンド幅を狭めるとともに光スループットを増大させてノイズレベルを減少させるため、球状又は半球状コリメータレンズ（１５０）、バンドパスフィルター（１５５）及び集光レンズ（１６０）に通す。ＵＶ発光ダイオード（１２０）としては、例えば、Ｓｅｎｓｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国サウスカロライナ州）から得られるＵＶＴＯＰ（登録商標）２６０ｎｍ又はＵＶＴＯＰ（登録商標）２８０ダイオードを用いることができる。光は次にビームスプリッター（１７０）を通過する。ビームスプリッター（１７０）は光の一部を分岐して対照光検出器（１８０）に向け、残りは窓（１３６）を通してフローセル（１３０）内の溶液に導かれる。ビームスプリッター（１７０）及び対照光検出器（１８０）は、発光ダイオード（１２０）の強度変化に追従させるのに用いられ、発光ダイオードを注意深く恒温維持する必要がなくなる。
フローセル（１３０）内の溶液を通過して窓（１３８）から出る紫外光は、ブロック矢印で示すように試料光検出器（１４０）で検出され、ＵＶ検出器（１４０及び１８０）は共にＵＶ感受性光電子増倍管又はＵＶ感受性光ダイオードとすることができる。溶液中の物質の濃度は、物質のモル吸光係数（Ｅ）が既知であれば、ランベルト・ベール則を用いて求めることができる。或いは、物質の濃度は、所定の物質について所定の波長（例えば２８０ｎｍ）で予め作成しておいた用量−応答曲線を用いて決定することもできる。
当業者には明らかであろうが、光路長が未知のフローセル（１３０）を有する同じ装置を用いると、３００ｎｍ以下に吸収を有する物質の存在を単に検出することができる。溶液中の物質の濃度の決定又は測定には光路長を知得しておく必要がある（ランベルト・ベール則参照）。
当業者には明らかであろうが、光路長が未知のフローセル（１３０）を有する同じ装置を用いると、３００ｎｍ以下に吸収を有する物質の存在を単に検出することができる。溶液中の物質の濃度の決定又は測定には光路長を知得しておく必要がある（ランベルト・ベール則参照）。
図３は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＡＭＢＤＡ ９００分光光度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて２００〜３００ｎｍ域で得たウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び合成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）のＵＶスペクトルを示す。ＢＳＡはＳｉｇｍａ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州））から得た。合成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）は、Ｊ Ｓｈａｎａｇａｒ， Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （２００５）， ６４， ２１６−２２５に記載の通り合成した２０量体（５’−ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ−３’）であった。
ＢＳＡ（０．６重量％）及びＳＰＮ（５９μｇ／ｍｌ）のスペクトルはいずれも２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で得た。図３から明らかな通り、ＢＳＡは約２７８ｎｍに吸光度ピーク（Ｅｍａｘ）を有するのに対して、ＳＰＮは約２５８ｎｍに吸光度ピーク（Ｅｍａｘ）を有する。
図４は、０．１Ｍ硫酸中の所定濃度範囲の硫酸第二鉄に対する２８０ｎｍでのＵＶ−ＬＥＤ検出器の応答の直線性を示すグラフである。硫酸第二鉄を０．１Ｍ硫酸で希釈して、ある範囲の濃度に調製した。硫酸第二鉄は深ＵＶに吸収を有することが知られている。ＵＶＴＯＰ（登録商標）２８０ＵＶ発光ダイオード（Ｓｅｎｓｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国サウスカロライナ州）と２８０ｎｍを中心とした７ｎｍバンド幅のバンドパス干渉フィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社（米国）から入手）とを備える上記で説明した図２に記載の装置を用いて、ＵＶ発光ダイオードからの紫外光を各溶液に照射した。約０．１〜０．５ｇ／ｌの範囲での硫酸第二鉄の濃度上昇に対して線形応答が認められた（図４）。
図５は、図２に記載の本発明に係る装置を用いて、所定の範囲の濃度のタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）について２８０ｎｍで得られた用量応答曲線を示す。ＢＳＡはＳｉｇｍａ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州））から入手し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で順次希釈して０．０５〜１％（重量）の濃度範囲の７つの溶液を調製した。各溶液のＵＶ吸光度は、ＵＶＴＯＰ（登録商標）ＵＶ発光ダイオード（Ｓｅｎｓｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手）と、２８０ｎｍを中心とした７ｎｍバンド幅のバンドパス干渉フィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社（米国）から入手）とを用いて、セル光路長５ｍｍで２８０ｎｍで照射して決定した。図から明らかな通り、０．０５〜０．８％（重量）の範囲で線形応答が認められた。２８０ｎｍＵＶ発光ダイオードでの安定性試験で、ＬＥＤは１２０００時間以上安定であることが判明した。
本発明に係る装置（図２）を用いて上記合成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）（図３参照）に対する用量応答曲線を得た。２０量体ＳＰＮはＪ Ｓｈａｎａｇａｒ， Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （２００５）， ６４， ２１６−２２５に記載の方法で調製した。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中５〜９７μｇ／ｍｌの範囲の７通りの異なる濃度のＳＰＮを調製した。各溶液の吸光度を、ＵＶＴＯＰ（登録商標）ＵＶ発光ダイオード（Ｓｅｎｓｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手）と、２６０ｎｍを中心とした７ｎｍバンド幅のバンドパス干渉フィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社（米国））とを用いて、５ｍｍ光路長で２６０ｎｍで照射して決定した。図６に示すように線形応答が得られた。
１０，１１０ 本発明の装置
２０，１２０ ＵＶ発光ダイオード
２２ バンドパス干渉フィルター
２４ ビームスプリッター
３０，１３０ フローセル
３２，１３２ 入口
３４，１３４ 出口
３６，３８，１３６，１３８ 窓
４０ 光検出器
４２ 対照光検出器
１４０ 試料光検出器
１５０ コリメータレンズ
１５５ バンドパスフィルター
１６０ 集光レンズ
１７０ ビームスプリッター
１８０ 対照光検出器
２０，１２０ ＵＶ発光ダイオード
２２ バンドパス干渉フィルター
２４ ビームスプリッター
３０，１３０ フローセル
３２，１３２ 入口
３４，１３４ 出口
３６，３８，１３６，１３８ 窓
４０ 光検出器
４２ 対照光検出器
１４０ 試料光検出器
１５０ コリメータレンズ
１５５ バンドパスフィルター
１６０ 集光レンズ
１７０ ビームスプリッター
１８０ 対照光検出器
Claims (25)
- ３００ｎｍ以下に吸収を有する物質の溶液中での濃度を測定する方法であって、当該方法が、
ｉ）光源からバンドパスフィルターを通して波長３００ｎｍ以下の紫外光を送る段階、
ｉｉ）バンドパスフィルターから出た紫外光をビームスプリッターに通す段階、
ｉｉｉ）光の第１の部分をビームスプリッターで分岐して、第１の部分の電磁波を対照検出器で定量して対照値を得る段階、
ｉｖ）ビームスプリッターを通過する光の第２の部分を既知の光路長の溶液に照射する段階、
ｖ）溶液を通過した電磁波を試料検出器で定量して試料値を得る段階、及び
ｖｉ）試料値と対照値から吸光度（Ａ）を計算する段階
を含んでなり、上記光源が３００ｎｍ以下の波長の光を放射する発光ダイオードであることを特徴とする方法。 - 既知の内容積のセル内の溶液に照射し、該セルが３００ｎｍ以下の波長の光に透明である、請求項１記載の方法。
- 前記対照検出器及び試料検出器がＵＶ感受性光電子増倍管又はＵＶ感受性光ダイオードである、請求項１又は請求項２記載の方法。
- 前記物質が２５０〜３００ｎｍの範囲内に吸収を有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
- 前記物質が２７５〜２８５ｎｍに吸収ピークを有する、請求項４記載の方法。
- 前記物質がタンパク質又はペプチドである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
- 前記物質が２４０〜３００ｎｍの範囲内に吸収を有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
- 前記物質が２５５〜２６５ｎｍに吸収ピークを有する、請求項７記載の方法。
- 前記物質が核酸である、請求項７又は請求項８記載の方法。
- さらに、段階ｉ）及びｉｉ）の前に、溶液中に存在する１種以上の化合物から前記物質を分離する段階を含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
- 前記分離段階がクロマトグラフィーを含む、請求項１０記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、イオン性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、リガンド媒介クロマトグラフィー及びモレキュラーシーブクロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
- 前記物質がタンパク質、ペプチド及び核酸からなる群から選択される、請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
- 前記溶液が細胞抽出液、細胞溶解液及び細胞培養液又はこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
- ３００ｎｍ以下に吸収を有する物質の溶液中での濃度を測定するための装置であって、当該装置が、
ｉ）溶液を収容するための既知の光路長のセルであって、３００ｎｍ以下の波長の光に透明なセル、
ｉｉ）光源、
ｉｉｉ）バンドパスフィルター、
ｉｖ）光を第１の部分及び第２の部分に分割するためのビームスプリッター、
ｖ）ビームスプリッターで分岐された電磁波を検出するための対照検出器、及び
ｖｉ）溶液を通過した電磁波を検出するための試料検出器
を備えており、上記光源が３００ｎｍ以下の波長の光を放射する発光ダイオードであることを特徴とする装置。 - 前記セルが既知の内容積のものである、請求項１５記載の装置。
- 前記対照検出器及び試料検出器がＵＶ感受性光ダイオード又はＵＶ感受性光電子増倍管である、請求項１５又は請求項１６記載の装置。
- さらにコリメータレンズを備える、請求項１５乃至請求項１７のいずれか１項記載の装置。
- さらに、集光レンズを含む、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項記載の装置。
- 当該装置がさらに、溶液中に存在する１種以上の化合物から前記物質を分離するためのクロマトグラフィー分離手段を含む、請求項１５乃至請求項１９のいずれか１項記載の装置。
- 前記クロマトグラフィー分離手段がクロマトグラフィーカラム又はメンブレンである、請求項２０記載の装置。
- 前記クロマトグラフィーカラム又はメンブレンが、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、イオン性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、リガンド媒介クロマトグラフィー及びモレキュラーシーブクロマトグラフィーからなる群から選択されるクロマトグラフィーに基づいて１種以上の化合物から物質を分離する、請求項２１記載の装置。
- 前記物質がタンパク質である、請求項１５乃至請求項２２のいずれか１項記載の装置。
- 前記物質が核酸である、請求項１５乃至請求項２３のいずれか１項記載の装置。
- タンパク質、ペプチド及び核酸からなる群から選択される物質の濃度を測定するための請求項１５乃至請求項２４のいずれか１項記載の装置の使用。
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