JP2009508925A - ヒドロキシルラジカル失活剤の添加および電離放射線による滅菌による、タンパク質溶液の安定化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、電離放射線の効果の分析、および水性環境下のタンパク質を電離放射線の影響から保護することができる化合物または化合物の組み合わせの選択を可能とするこの分析に基づくモデルの開発をベースとする。電離放射線の例としてガンマ放射線を用いる該モデルを下に記載する。
(i)5×108Lmol−1s−1以上のヒドロキシルラジカルとの反応速度;および、
(ii)非極性領域、
を有する保護用化合物の水溶液を電離放射線に曝露することを含む、水性環境下でタンパク質を滅菌する方法を提供する。本明細書の目的のために、用語「保護用化合物」とは、必要とされる特性を有する化合物の組み合わせを含む。
ガンマ線照射は、いくつかの種類の高エネルギー電離放射線の1つである。それは、放射性原子の核によって放射される高エネルギー光子(例えば、コバルト60)を含む。電離放射線の化学的および生物学的な効果は、2つの基本的な種類の相互作用から発生する。直接的な作用としては、該放射線エネルギーは、標的分子中に直接に蓄積される。間接的な作用としては、エネルギーの内部吸収は外部の媒体によるものであり、それにより、拡散性中間体の産生を生じ、これは次いで標的を攻撃する。それは主に、水中に溶解された化学種に対して損傷を引き起こす間接的な作用である。このことは、該放射線は最初に溶媒(すなわち、水)と相互作用して、様々なフリーラジカルを生じることを意味する。該フリーラジカルはその後に、該溶解された種(例えば、タンパク質)と反応する。従って、該溶解された種をガンマ線の影響から保護するためには、フリーラジカルの有害な影響を緩和することが必要である。
http://www.rcdc.nd.edu/compilations/Hydroxyl/OH.htm、および
http://www.rcdc.nd.edu/compilations/Eaq/Eaq.htm。
(注意:www.rcdc.nd.eduインターネットソース中に例示されていない化合物の反応速度は、「不明」と呼称する)。
広範囲の芳香族有機化合物(すなわち、少なくとも1個のベンゼン核を含有する化合物)は、ヒドロキシルラジカルとの良好な反応速度(>1×109)を有する。これらの多数はまた、水和電子との良好な反応速度(>1×109)を有する。ベンゼン核の存在により、全ての芳香族化合物は実質的な非極性領域を有し、これによりそれらはガンマ線照射からのタンパク質の保護のための良好な候補となる。該芳香族化合物が負電荷(それらの溶解性を増大し、そして標的アミノ酸とのそれらの相互作用を改善する)または親水性基(それらの溶解性を増大する)を含む場合には、有益である。適当な芳香族化合物の例を表1に示す。
広範囲のヘテロ環化合物(すなわち、環中の1個以上の炭素原子が窒素、酸素、または硫黄によって置換される)は、ヒドロキシルラジカルとの良好な反応速度(>1×109)を有する。これらのいくつかはまた、水和物電子との良好な反応速度(>1×108)を有する。炭素/ヘテロ原子の環の存在により、該ヘテロ環化合物は、実質的な非極性領域を有し、これにより、それらはガンマ線照射からのタンパク質の保護のための良好な候補となる。該ヘテロ環化合物が負電荷(それらの溶解性を増大し、そしてそれらの標的アミノ酸との相互作用を改善する)または親水性基(それらの溶解性を増大する)を含む場合には、有益である。適当なヘテロ環化合物の例を表2に示す。
ヒドロキシル基(1個以上が好ましい)を含有するほとんどの化合物は、ヒドロキシルラジカルとの良好な反応速度(>1×109)を有する傾向がある。それに対して、ヒドロキシル基の存在は、水和電子との良好な反応速度を全く保証せず、よって最善の結果を得るために、該ヒドロキシル化合物は水和電子と反応性である化合物との混合物で使用すべきである。タンパク質のガンマ線照射からの有効な保護のための要件を満たす実質的な非極性領域を有する該ヒドロキシル化合物の例を表3に示す。
いくつかの有機酸は、ヒドロキシルラジカルとの良好な反応速度(>1×109)を有する。それらのいくつかはまた、水和電子との良好な反応速度を有する。タンパク質のガンマ放射線からの有効な保護のための要件を満たす実質的な非極性領域を有する有機酸の例を、表4に示す。各酸は、解離型形態(すなわち、アニオン)およびプロトン化型形態の混合物として存在する。該酸のpKaおよび該環境のpHはどちらの形態が優先するかを決定する。同じ例(例えば、乳酸塩/乳酸)においては、両方の形態が、ヒドロキシルラジカルおよび水和電子の両方について該タンパク質の保護を供するのに必要とされる。
様々な易酸化性の無機イオンが、ヒドロキシルラジカルとの良好な反応速度(>1×109)を有する。これらは典型的に、水和電子との反応の良好な反応速度を有しない。該無機イオンの多数は疎水性領域がなく、よってそれらは、疎水性相互作用を供し得る他の化合物と組み合わせて使用することが必要とされる。該イオンのいくつかの例を表5に示す。
非極性領域を含むかまたは負に荷電するかのいずれかである水和電子との良好な反応速度を有する化合物は、タンパク質をガンマ放射線から保護することができない。しかしながら、それらは、ヒドロキシルラジカルと有効に反応する他の化合物と組み合わせると一層有用であり得る。該化合物の例を表7に示す。
水(伝導率<10μScm−1;分析用試薬グレードのFisherまたはSanyo Fistreem MultiPureのいずれか);
グルコースオキシダーゼ−生体触媒−G638P(〜70U/mgの固体);
ラクトペルオキシダーゼ(牛乳由来、DMV International:pH 5.0でのABTS方法による1,050ユニットmg−1);
グルコース−Fisher−分析用グレード、コードG050061。
各実施例において、タンパク質の水溶液を選んだ添加物と一緒にエッペンドルフチューブ中で調製した。該エッペンドルフチューブを運搬し、そして工業的な滅菌施設によって滅菌医学製品に典型的な用量範囲でガンマ線照射した。ガンマ線照射溶液をインセンス(Insense)に戻し、そしてタンパク質活性について分析した。
試料(2mL エッペンドルフチューブ中に約1.5mL)を、アイソトロンPLC(Swindon, Wilts, 英国)製の工業的に標準の商業的な滅菌施設によって、コバルト60ガンマ源を使用してガンマ線照射した。該放射線量は25〜40kGyの範囲とした。
該溶液は、グルコースオキシダーゼの100μgmL−1を含んだ。ガンマ線照射の前および後の両方の溶液をグルコースオキシダーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の方法に従って行なった。
反応剤混合物(5部の0.1M リン酸ナトリウム pH 6+4部の2重量%のデンプン+1部の1mg/mLのラクトペルオキシダーゼ酵素)の10mL;
100mM ヨウ化カリウムの5mL;
20重量% グルコース溶液の5mL。
該溶液は、100μgmL−1のカタラーゼを含んだ。該溶液(新しいもの、および高温でインキュベート後のものの両方)をカタラーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の方法に従って行なった。
クエン酸塩/リン酸塩緩衝液(0.1M、pH 5.0)の2.73mL、
テトラメチルベンジジン(TMB)(3mg/mL、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解)の100μL、
ラクトペルオキシダーゼの100μL。
Nunc Maxisorp F96(Fisher、コード番号DIS-971-030J)マルチウェルプレートを0.1M 炭酸ナトリウム pH 8.4(Fisher、コード番号S/4240/53)溶液中の2.5μg/mL hGG(Sigma、コード番号C5297)のウェル当たり100μLを用いて感作した。該プレートを4℃で18時間インキュベートした。感作後に、該hCG溶液を除去し、そして該プレートをトリス−緩衝化生理食塩水ツィーン(TBST)(20mM トリス(Fisher、コード番号BPE152-1)+137mM NaCl(Fisher、コード番号S/3160/63)+0.05容量%のツィーン20(Fisher、コード番号BPE337-100)、pH 7.6))を用いて5回洗浄した。ブロックを、0.1M 炭酸ナトリウム pH 8.4中の0.5mg/mL ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma、コード番号A7030)を用いて37℃で1時間行ない、続いてTBSTを用いて5回洗浄した。洗浄後に、該被験(一次)抗体を、TBST中の5μg/mLで、ウェル当たり100μLで加えた。該プレートを37℃で2時間インキュベートし、次いでこのものをTBSTを用いて5回洗浄した。この後に、抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)接合体(シグマ社製、コード番号A8924)のウェル当たり100μLを、TBST中に1/2500希釈で加えた(二次抗体)。次いで、このものを37℃で1時間インキュベートし、その後にTBSTを用いて5回洗浄した。展開は、予め調製した2,2'−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)(シグマ社製、コード番号A3219)(ウェル当たり100μL)を用いて行なった。発色は、ダイナテック(Dynatech)MR5000プレートリーダーを用いて405nmで追跡した。2個のコントロールウェルは、該アッセイから取り除かれた該一次または二次抗体のいずれかを共に含んだ。このものは、いずれかの非特異的な結合について調べ、そしてバックグラウンドの試薬干渉を決定するためのものである。
新しいものおよび高温でインキュベート後のものの両方のパパイン溶液をパパイン活性についてアッセイした。これは、以下の方法に従って行った。
記載の条件下で、約5×108Lmol−1s−1以上のヒドロキシルラジカルとの反応速度は、該タンパク質の保護効果の必須の必要条件である。表8は、ヒドロキシルラジカルおよび水和電子とのそれらの不十分な反応速度のため、ガンマ線照射の影響からグルコースオキシダーゼを防止しなかった単独化合物の選抜を示す。硝酸塩の該ヒドロキシルラジカル速度定数は例示しなかったが、これは低いものと考える。硝酸塩の該水和電子の速度定数は十分に高いが、しかし、これは低いヒドロキシルラジカル反応速度を補償しなかった。
ヒドロキシルラジカルとの十分な反応速度(>5×108Lmol−1s−1として任意に選ばれる)は、該保護効果の必須の必要条件である。この条件は、表9に示す2個の化合物の場合に満たされる(実際に、ヨウ化物はヒドロキシルラジカルスカベンジャーと呼ばれることが多い)。それにもかかわらず、これらの化合物は、以下の理由のために、グルコースオキシダーゼのいずれの保護を与えなかった。第1は、水和電子とのそれらの反応速度は非常に低いことであり、第2には(より重要なことに)、ヒスチジン、リシン、およびチロシンとの有効な相互作用を可能とするであろう、それら2個の分子中に非極性領域が存在することである。
表10に例示する化合物は、ヒドロキシルラジカルおよび水和電子の両方との非常に高い反応速度を有する。それら分子はまた、疎水性相互作用に関与することができる広範な非極性領域を有する。このことは、それらを、ガンマ線照射の影響からの該酵素水溶液についての良好な保護剤とする。それにもかかわらず、該酵素を保護するそれらの能力は、それら分子のヘテロ環上の直接的な正電荷(中性および酸性のpHで)の存在によって損なわれる。グアニンおよびヒスチジンの場合には、該正電荷は保護的な効果を全く生じなかった。ウラシルの場合には、ある程度の保護効果が観察された。それにもかかわらず、ウラシルの保護効果はシトシン(これは、そのヘテロ環上の正電荷を欠く非常に似た化合物)の効果よりも小さかった(表12を参照)。表10に提示される化合物の2個はいずれの保護を与えなかったが、1つはある程度の保護を与えたという事実は、正電荷の存在を該保護効果に対する有害なものであると主張する法則は厳密な法則というよりもむしろ単に一般的な傾向の指標として見られるものであり得ることを意味する。該最終的な影響は更に様々な立体効果によって影響を受け得て、従ってこれは、分子に依存するものであろう。
表11は、ヒドロキシルラジカルおよび水和電子の両方との良好な反応速度を有する非極性化合物の例を示す。ヒスチジン、リシン、およびチロシンとのそれらの相互作用は、それらの疎水的性質および正電荷の不在により可能である。これらの化合物は、ガンマ線照射の影響からのグルコースオキシダーゼへの保護を与え、その結果、元の活性の12.3%はプリンの存在下で、49.2%は1,10−フェナントロリンの存在下で、および8.1%はメトキシフェノールの存在下で回復し得た。
表12は、分子が主に1または2個の極性基が結合した非極性分子を含む、ヒドロキシルラジカルおよび水和電子の両方との良好な反応速度を有する化合物の保護効果を示す。これらの化合物の全ては、グルコースオキシダーゼのある程度の保護を与えた。注意:フェノキシエタノールについての速度定数は入手できなかったが、しかし、それらは(他のフェノキシ化合物についての速度定数に照らして)かなり高いと考える。
表13に例示する化合物は、ヒドロキシルラジカルとの満足すべき反応速度を有する(ビオチンの水和電子との反応速度はpH 9でのみ知られるが、この研究の実験はpH 7で行なったので、よって、示す図面は不確定に関連する)。該化合物のいくつかは(特に、トリプトファンおよびチアミン)はまた、水和電子との非常に高い反応速度を有する。これらの化合物の全ては、それらの分子における広範囲な非極性領域および負電荷の存在のために、ヒスチジン、リシン、およびチロシンとの有効な相互作用を受けると考えられる。これらの化合物の全てはガンマ線照射の影響からのグルコースオキシダーゼへの保護を与えた。
表14に例示した化合物は、相対的に非極性のCN基を含有する複合体アニオンである。該フェロシアン化物アニオン(ヘキサシアノフェレート(II)、Fe(CN)6 4−)はヒドロキシルラジカルとの非常に高い反応速度を有するが、フェリシアン化物アニオン(ヘキサシアノフェレート(III)、FeIII(CN)6 3−)は水和電子との高い反応速度を有する。他の反応速度(すなわち、水和電子とのフェロシアン化物、およびヒドロキシルラジカルとのフェリシアン化物の反応速度)は入手できなかった。ヒスチジン、リシン、およびチロシンとの相互作用は、該分子の負電荷および非極性部分(CN基)により良好であると考えられる。両方の化合物が、ガンマ線照射からのグルコースオキシダーゼへの保護を与えた。このことはヒドロキシルラジカルとの高い反応速度のためにフェロシアン化物の場合には驚くべきことではないが、当該解釈は、ヒドロキシルラジカルとのその反応速度は知られていないので、フェリシアン化物の場合にはより難しい。それにもかかわらず、例えこの反応速度が低かったとしても、該結果はなおもっともらしい説明を有するであろう。フェリシアン化物の水和電子との反応(ガンマ線照射の間)により、フェロシアン化物を発生する。このことは、該照射されたフェリシアン化物試料中に少なくとも微量のフェロシアン化物が常に存在し、これにより、該ヒドロキシルラジカルからの保護を保証するであろうことを意味する。
表15は、グルコースオキシダーゼの保護に及ぼす2個のアニオンの組み合わせの効果を示す。ヨウ化物と亜硝酸塩との組み合わせは、これら2個の化合物がヒドロキシルラジカルおよび水和電子の両方と高い反応速度を有するという事実にかかわらず、グルコースオキシダーゼのいかなる保護をも与えなかった。このことは、非極性構造の不在、およびヒスチジンおよびリシンの正に荷電した結合部位についてのアニオンの直接的な競合によると考えられる。同様に、アニオン競合作用の有害な影響は、ヨウ化物およびフェリシアン化物の組み合わせにおいて観察された。グルコースオキシダーゼのある程度の保護は達成されたが、それは、フェリシアン化物単独によって達成される保護よりも良くなかった(表14参照)。実際に、ヨウ化物の同時の存在は、グルコースオキシダーゼの回復を悪化させた。
表16は、ガンマ線照射後のグルコースオキシダーゼの回復に及ぼす様々な化合物の対の影響を示す。表16に示す全ての化合物は、単独化合物として先の実施例中に例示されている。それらのいくつか、すなわち硝酸塩およびヨウ化物(表8および9を参照)はそれら自身では完全に酵素を保護しなかったが、他の物はある程度の保護を与えた(表10〜14を参照)。しかしながら、該酵素のかなりの保護が該化合物を注意深く組み合わせて対とすることによって達成することができた(表16を参照)。該化合物は、以下のように組み合わせた:
それらの少なくとも1つはヒドロキシルラジカルとの高い反応速度を有し、そしてそれらの少なくとも1つは水和電子との高い反応速度を有した;
該化合物の少なくとも1つは実質的な非極性領域を含んだ;
該化合物の少なくとも1つは負電荷を有した(ほとんどの場合において、両方の化合物は負に荷電していたが、電荷の直接的な競合作用は該分子の少なくとも1つにおける実質的に非極性の部分の存在のために最小であった)。注意:該組み合わせの1つ(メトキシフェノールおよびマンニトール)は、該実験の条件下でいずれの負電荷をも含まなかった。
表17は、グルコースオキシダーゼ回復に及ぼす、様々な化合物の対の効果を示す。該組み合わせは、該化合物がガンマ線照射した水溶液中で発生する両方のフリーラジカルとの高い反応速度を有しないように選んだ。その結果、いくつかの対はフリーラジカルのいずれかとの高い反応速度を有しなかったが(例えば、プロリン/グリシン、アラニン/グリシン)、他の対はその重大なフリーラジカルの1つだけ(ヒドロキシルラジカルまたは水和電子)との高い反応速度を有した。該対のほとんどは、グルコースオキシダーゼへのいずれの保護をも全く与えなかった。1つの対(プロリン/ヨウ化物)は、非常に僅かな保護効果(<4%)を与えた。プロリン/マンニトールおよびプロリン/ヨウ化物の場合には、該プロリン側鎖上の正電荷の存在は更に、低い保護効果に寄与する。同様に、アラニン/ヨウ化物およびアラニン/マンニトールの場合には、実質的な非極性領域の不在は、低い保護効果全体への別の寄与因子であり得る。
表18は、ヒドロキシルラジカルおよび水和電子の両方との高い反応速度を有する、化合物の対を例示する。それにもかかわらず、ガンマ線照射の影響からグルコースオキシダーゼを保護するそれらの能力は、それらの分子構造によって損なわれる。従って、硝酸塩/マンニトールの場合には、保護の欠落はその非極性領域の不在に起因したが、一方で、グアニンを含有する該組み合わせは該グアニン環上の正電荷のために失敗したと考えられる。比較のため表15を参照。
表19は、ガンマ線照射の間の酵素カタラーゼの活性に及ぼす選択した単独化合物の保護効果を示す。該保護用化合物(すなわち、リン酸塩緩衝液、50mM、pH 6中に直接的に溶解したタンパク質)の不在の場合では、試料照射の後には、酵素活性は全く回復しなかった。該緩衝溶液中のプリン、トリプトファン、または乳酸塩の存在により、ある程度のカタラーゼ活性の保存を得た。該活性の回復は、プリンの場合にはかなり低く(コントロール試料中の活性からは明らかに識別可能であるが)、そしてトリプトファンおよび乳酸塩の場合にはより多大である。注意:2組の速度定数を乳酸塩について表19に示すが、その理由は乳酸塩は使用するpHで部分的にプロトン化され、そして乳酸および乳酸塩アニオンの混合物として存在するからである。
保護効果は、ガンマ線照射を受けた2個の異なるモノクローナル抗体の活性回復について選択した個々の化合物を研究した。該モノクローナル抗体の両方が抗−hCG(すなわち、ヒト絨毛性ゴナドトロピンと認識する)であった。第1抗体はhCGのα−鎖上のエピトープを認識するように発現するが、該第2抗体はhCGのβ−鎖上のエピトープを認識するように発現した。該第1抗体の活性回復に及ぼす選択した化合物の保護効果を表20に示す。該第2抗体の活性回復に及ぼす選択した化合物の保護効果を表21に示す。
保護効果は、ガンマ線照射を受けた水性西洋ワサビペルオキダーゼの活性回復について選択した個々の化合物を研究した。該選択した化合物の取り込みにより、水溶液中での該酵素のかなりの保護を与えた(表22)。該保護用化合物の不在下(すなわち、水中に直接に溶解する場合)では、ほとんど全く活性は試料照射後には回復しなかったが、プリン、乳酸塩、またはトリプトファンのいずれかの存在により、ある程度の活性の保存を得た。
Claims (24)
- タンパク質、並びに少なくとも5mMの濃度の特性:
(i)5×108Lmol−1s−1以上のヒドロキシルラジカルとの反応速度;および、
(ii)非極性領域、
を有する保護用化合物を含有する生理学的に許容し得る水性組成物を電離放射線に曝露することを含む、水性環境下でタンパク質を滅菌する方法。 - ヒドロキシルラジカルとの反応速度が109Lmol−1s−1以上である、請求項1記載の方法。
- 保護用化合物は中性pHで負に荷電する、請求項1または2記載の方法。
- 保護用化合物が108Lmol−1s−1以上の水和電子との反応速度の更なる特性を有する、請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 水和電子との反応速度が5×108Lmol−1s−1以上である、請求項4記載の方法。
- 水和電子との反応速度が109Lmol−1s−1以上である、請求項4記載の方法。
- 非極性領域がその上に直接に正電荷を有しない、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 非極性領域が、トリプトファン、リシン、またはヒスチジンを含む疎水性アミノ酸の側鎖との非共有疎水性結合を形成することができる脂肪族鎖、ヘテロ環、または芳香環の構造である、請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
- 非極性領域がそれと結合する極性基を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 保護用化合物の濃度は5mM〜1Mである、請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法。
- 保護用化合物の濃度は5〜200mMである、請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
- 保護用化合物の濃度は5〜100mMである、請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
- 保護用化合物の濃度は10mM〜1Mである、請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法。
- 周囲温度で行なう、請求項1〜13のいずれか1つに記載の方法。
- タンパク質は照射後に少なくとも80%活性を保持する、請求項1〜14のいずれか1つに記載の方法。
- タンパク質および保護用化合物は溶液状態である、請求項1〜15のいずれか1つに記載の方法。
- タンパク質は組み換えタンパク質である、請求項1〜16のいずれか1つに記載の方法。
- 組成物は1個のタンパク質を含む、請求項1〜17のいずれか1つに記載の方法。
- タンパク質、および少なくとも5mMの濃度の請求項1〜9のいずれか1つに記載の保護用化合物の水溶液を含有し、但し、該溶液は酵素、乳酸イオンの供給源、亜鉛イオンの供給源、および/またはアンモニウムイオンの供給源ではない、
治療学的な使用のための滅菌性の生理学的に許容し得る組成物。 - 保護用化合物の濃度は5mM〜1Mである、請求項19記載の組成物。
- 保護用化合物の濃度は5〜200mMである、請求項19記載の組成物。
- 保護用化合物の濃度は5〜100mMである、請求項19記載の組成物。
- タンパク質は組み換えタンパク質である、請求項19〜22のいずれか1つに記載の組成物。
- 1個のタンパク質を含む、請求項19〜23のいずれか1つに記載の組成物。
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