KR102135053B1 - 요산 산화효소 및 과산화수소 분해용 금속 나노입자가 나노 캐리어에 담지된 약물 전달체 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 요산 산화 효소 및 과산화수소 분해용 금속의 나노입자가 온도 민감성 나노 캐리어에 담지된 약물 전달체 및 이를 포함하는 고요산혈증 관련 질환의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약물 전달체에서 요산 산화효소와 과산화수소 분해용 금속 나노입자가 서로 근접하여 위치함으로써, 요산 분해시 발생되는 독성물질인 과산화수소(H₂O₂)를 매우 효과적으로 제거한다. 본 발명의 약물 전달체는 고요산혈증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 활성성분으로 개발될 수 있다.

Description

요산 산화효소 및 과산화수소 분해용 금속 나노입자가 나노 캐리어에 담지된 약물 전달체 및 이를 포함하는 약학 조성물{Drug Delivery System of Nanocarrier Loaded with Urate Oxidase and Metal Nanoparticle Capable of Degrading Hydrogen Peroxide and Pharmaceutical Composition Comprising the Same}

본 발명은 요산 산화효소 및 과산화수소 분해용 금속 나노입자가 나노 캐리어에 담지된 약물 전달체, 상기 약물 전달체를 포함하는 고요산혈증 치료용 약학 조성물, 및 상기 약물 전달체의 제조 방법에 관한 것이다.

치료용 단백질은 화학적 약물에 비해 생체 적합성, 선택성, 효능 등 유리한 특성으로 인하여 다양한 인간 질환의 임상 치료에 사용된다. 그러나 치료용 단백질은 두통, 설사, 일시적인 발진, 혈구 감소, 심장독성, 고혈압, 과민증, 박리성 피부염, 면역 원성 및 혈청 질환과 같은 부작용을 일으킬 수 있다. 약물의 부작용을 줄이는 것은 치료 효능 및 안정성을 향상시키는 것과 같은, 다른 기존의 문제와 함께, 치료용 단백질을 개발하는 데 중요한 문제이다. 지금까지, 치료용 단백질의 투여량을 줄이고 그에 따른 부작용을 감소시키기 위해 아미노산 조성의 변경 또는 생체 적합성 분자 (예: 폴리에틸렌 글리콜 [PEG])의 접합이 광범위하게 적용되었다. 그러나, 이러한 접근법은 치료용 단백질의 중요한 특성을 손상시킬 수 있으므로 대체 전략 개발이 필요하다.

요산 산화효소(urate oxidase, UOX)는 불용성 요산(uric acid, UA)을 용해성 5-히드록시이소아세테이트(5-HIU)로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. UOX는 급성 또는 만성통풍, 통풍성 발적, 통풍성 관절염, 신장 질환, 심혈관 질환, 및 종양 용해 증후군(tumor lysis syndrome, TLS)과 관련된 고요산혈증(hyperuricemia)을 치료하는 데 사용된다. 종양 용해 증후군(TLS)는 많은 종양 세포가 용해될 때 암 치료 중에 발생할 수 있다. 통풍은 관절과 연조직에서 요산 결정의 침착으로 인한 일반적인 염증성 관절염이다. 전 세계적으로 인구의 약 0.1 - 10%가 통풍에 시달린다. UOX에 의해 촉매화된 UA의 5-HIU로의 전환은 또한 H₂O₂를 생성하는데, 이는 독성물질이며 글루코스-6-포스페이트 탈수소 효소가 결핍된 환자에게 악영향을 미칠 수 있다.

금 나노입자(Au-Nanoparticle, AuNP)는 고도의 생체 적합성 금속이며, 카탈라아제(catalase)처럼 과산화수소(H₂O₂)를 분해하는 것으로 알려져 있다. 이러한 효소-모방 나노입자는 나노자임(nanozyme)이라고 불린다. 나노자임은 효소와 비교해서 높은 안정성과 비용 효율성 때문에 효소의 대안으로 주목 받고 있다. 그러나, 효소-나노자임 시스템은 생체 내 적용에 한계가 있기 때문에 주로 바이오 센서 영역에 사용되었다. 예를 들어, UOX와 함께 카탈라아제-모방 AuNP의 사용은 시험관 내에서 H₂O₂ 수준을 감소시켰지만, 생체 내에서의 적용은 어렵다. UOX와 AuNP를 혈액에 투여하면 농도가 매우 낮게 희석된다. 그러므로, 1) UOX에 의한 H₂O₂의 생성과 2) AuNP에 의한 H₂O₂의 제거반응으로 구성된 효과적인 캐스캐이드 반응(cascade reactions)을 달성하기 위해 서로 충분히 가까이 위치 할 수 없다. AuNP에 의해 효율적으로 제거될 부생성물인 H₂O₂를 접하기 위해서는, AuNP와 UOX를 하나의 운반체에 함께 운반되어야 한다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

WO 2009/120707

W. He, Y. Zhou, W. G. Wamer, X. Hu, X. Wu, Z. Zheng, M. D. Boudreau, J. Yin, Intrinsic catalytic activity of Au nanoparticles with respect to hydrogen peroxide decomposition and superoxide scavenging, Biomaterials 2012, 34(3), 765-773.

본 발명자들은 혈중 고요산증을 효과적으로 치료할 수 있는 약물 전달체를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 요산 산화 효소 및 과산화수소를 분해할 수 있는 촉매 금속의 나노입자를 온도 민감성 특성을 갖는 나노 캐리어에 함께 담지하여 생체내에 투여하면, 혈중 고요산 수치를 효율적으로 낮출 수 있음을 실험적으로 증명함으로써 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고요산혈증을 효과적으로 치료할 수 있는 약물 전달체를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 고요산혈증 또는 고요산혈증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약물 전달체의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 요산 산화효소(urate oxidase); (ⅱ) 과산화수소 분해용 금속의 나노입자; 및 (ⅲ) 상기 (i) 및 (ⅱ)가 담지된 온도 민감성 나노캐리어(nanocarrier)를 포함하는 약물 전달체를 제공한다.

본 발명에서 “요산 산화효소”는 요산(uric acid)을 보다 용해성 높은 산물, 즉 보다 쉽게 체외로 분비되는 5-히드록시이소아세테이트(5-HIU)으로의 전환을 촉매하는 효소이다.

본 발명에서 용어 “과산화수소 분해용 금속”은 과산화수소(H₂O₂)가 물(H₂O)과 산소(O₂)로 분해되는 반응을 촉진할 수 있는 촉매 금속을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 과산화수소 분해용 금속은 예를 들어 금(Au), 백금(Pt), 망간(Mn), 은(Ag), 또는 철(Fe)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 과산화수소 분해용 금속은 금(Au), 백금(Pt), 또는 은(Ag)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “온도 민감성”는 온도가 증가함에 따라 나노캐리어의 크기가 감소되고, 온도가 감소함에 따라 나노캐리어의 크기가 증가하는 특성을 의미한다.

본 발명에서, 온도 민감성 나노캐리어는 온도가 감소함에 따라 그 직경이 증가하며, 반대로 온도가 증가하면 그 직경이 감소한다.

본 발명에서 온도 증감에 따른 나노캐리어의 이러한 직경의 증감은 가역적이다.

본 발명에서 나노캐리어 직경의 증감에 따라 나노캐리어에 형성된 동공의 크기가 변하게 된다. 예를 들어, 저온(예컨대, 4℃)에서 동공의 크기가 증가된 나노운반체에 운반하고자 하는 약물을 포집(encapsulation)시킨 다음 이를 인체에 적용하게 되면 동공의 크기가 감소된다. 이와 같은 온도 민감성 특성으로 인해, 본 발명의 약물 전달체를 인체에 투여하면, 나노캐리어에 담지된 요산 산화효소와 과산화수소 분해용 금속 나노입자간의 거리가 감소되어 서로 근접하게 위치할 수 있다. 이러한 요산 산화효소와 금속 나노입자간의 근접은 과산화수소를 신속하고 효율적으로 분해하게 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 온도 민감성 나노캐리어는 플루로닉-기반 나노캐리어이다.

본 발명에서, 상기 “플루로닉(pluronic)”은 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드)(PEO-PPO-PEO)의 트리-블록 공중합체를 포함한다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 트리블록 PEO-PPO-PEO는 광가교결합 가능한(photo-crosslikable) 작용기를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 플루로닉은 디아크릴레이티드 플루로닉(diacrylated pluronic) F127 일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 온도 민감성 나노캐리어에 담지되는 상기 요산 산화효소와 과산화수소 분해용 금속의 나노입자의 중량 비율은, 요산 산화효소 : 과산화수소 분해용 금속 나노입자 = 1: 0.15 ― 1.5이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, (i) 요산 산화효소 및 과산화수소 분해용 금속의 나노입자가 온도 민감성 나노캐리어에 담지된 약물 전달체의 치료학적 유효량; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 고요산혈증 또는 고요산혈증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 용어“치료학적 유효량”은 상기 약물전달체를 환자에게 투여하여 생체 내에서 고요산혈증 또는 고요산혈증 관련 질환을 치료하기에 충분하고 적합한 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분인“약물 전달체”이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 멘톨 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물이 고요산혈증 또는 고요산혈증 관련 질환의 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 본 발명 약학적 조성물의 투여는 경구 또는 비경구의 다양한 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 유효성분인 약물 전달체의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 고요산혈증 관련 질환은 급성 또는 만성통풍, 통풍성 발적, 통풍성 관절염, 신장 질환, 심혈관 질환, 및 종양 용해 증후군(tumor lysis syndrome, TLS)으로 이루어진 군에서 선택된 질환일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 약물 전달체의 제조방법을 제공한다:

(a) 요산 산화효소 및 과산화수소 분해용 금속의 나노입자를 준비하는 단계; 및

(b) 상기 준비된 요산 산화효소 및 과산화수소 분해용 금속의 나노입자를 온도 민감성 나노캐리어에 담지하는 단계.

본 발명의 일 구현예 따르면, 본 발명의 약물전달체의 제조 방법에서 상기 단계 (b)는 온도 민감성 나노캐리어의 크기가 증가되도록 낮은 온도에서 행할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 온도 민감성 나노캐리어의 크기가 증가되는 낮은 온도는 1-10℃, 바람직하게는 2-8℃, 더 바람직하게는 3-5℃, 보다 더 바람직하게는 4℃에서 행할 수 있다.

본 발명의 효과 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 요산 산화 효소 및 과산화수소 분해용 금속의 나노입자가 온도 민감성 나노 캐리어에 담지된 약물 전달체 및 이를 포함하는 고요산혈증 관련 질환의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 약물 전달체에서 요산 산화효소와 과산화수소 분해용 금속 나노입자가 서로 근접하여 위치함으로써, 요산 분해시 발생되는 독성물질인 과산화수소(H₂O₂)를 매우 효과적으로 제거한다.

(ⅲ) 본 발명의 약물 전달체는 고요산혈증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 활성성분으로 개발될 수 있다.

도 1a는 요산(UA)가 요산 산화효소(UOX)에 의해 5-HIU로 전환될 때 독성물질 H₂O₂를 생성하는데, 생성된 H₂O₂가 고요산혈증 환자의 조직에서 세포손상을 야기할 수 있음을 보여주는 모식도이다.
도 1b는 UOX와 금 나노입자(AuNP) 사이의 캐스캐이드 반응(Cascade reaction)을 도시한 것이다.
도 1c는 UOX 및 AuNP을 나노캐리어(NC)에 담지 하여 캡슐화시켜 공동 운반(투여)할 경우, 효과적인 H₂O₂ 제거로 인해 생체 내에서 UA의 효율적인 분해가 일어날 수 있다는 것을 도시한다.
도 2a는 나노캐리어(NC) 내에 캡슐화된 AuNP의 다양한 농도의 존재 하에서 UOX에 의한 UA 분해율을 보여주는 그래프이다.
도 2b는 UOX 및 AuNP를 나노캐리어(NC)내에 로딩(loading)하여 약물 전달체(UOX-AuNP@NC)를 형성한 경우에서, 나노캐리어(NC)와 UOX-AuNP@NC의 크기 변화를 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 2c는 UOX 및 AuNP를 나노캐리어(NC) 내에 로딩한 후 NC와 UOX-AuNP@NC의 표면 전하 변화를 보여주는 그래프와 PDI 수치의 변화를 보여준다.
도 3a는 서로 다른 다양한 시스템들에서 UOX 및 AuNP의 캐스캐이드 반응을 비교하여, UA 분해에 관한 분석결과를 보여주는 그래프이다.
도 3b는 서로 다른 다양한 시스템들에서 UOX 및 AuNP의 캐스캐이드 반응 비교로서, 상대적인 H₂O₂ 생성에 관한 분석결과를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 UA가 없는 상태에서 UOX-AuNP@NC의 세포 독성을 보여주는 그래프이다.
도 4b는 H₂O₂에 유도되는 세포 독성을 평가하기 위해 UOX-AuNP@NC 시스템을 포함한 다양한 시스템에서의 세포 독성을 UA 존재 하에서 비교한 결과를 보여주는 그래프이다(#p > 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01, t-test 및 ANOVA).
도 5a는 마우스 모델을 사용한 생체 내(in vivo)에서의 UOX-AuNP@NC 시스템을 포함한 다양한 효소 시스템들의 고요산혈증 치료 효과 비교를 위한 실험 과정을 보여주는 개략도이다.
도 5b는 생체 내에서의 UOX-AuNP@NC 시스템을 포함한 다양한 다른 효소 시스템들과의 고요산혈증 치료 효과를 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 6는 UOX-AuNP@NC가 혈청 10% 함유 배지(37 ℃, 100 rpm)에서 7 일까지 유사한 입자크기를 보여주는 그래프이다.
도 7는 5 가지 효소 시스템을 투여한 후 18 시간 뒤 혈액 내의 잔류 UOX 활성을 보여주는 그래프이다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 재료

폴리(비닐피롤리돈)으로 코팅된 금 나노 입자(직경 5 nm)를 nanoComposix Inc. (San Diego, CA)에서 구입하였다. Ni-니트릴로트리아세트산(Ni-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA) 수지는 Qiagen (Valencia, CA, USA)에서 구입하였다. 분자량 컷오프(MWCO)가 50 kDa인 Vivaspin 원심 분리 농축기를 Sartorius Corporation (Bohemia, NY, USA)에서 구입했다. PD-10 탈염 칼럼은 GE Health Care (Piscataway, NJ, USA)에서 구입했다. 효모 추출물, 트립톤 및 한천은 DB Biosciences (San Jose, CA, USA)에서 입수하였다. 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드) (PEO-PPO-PEO) (PEO100-PPO65-PEO100, 분자량 : 12.6 kDa)의 플루로닉 F127 (Pluronic F127)은 BASF Corporation(서울, 한국)으로부터 받았다. 아크릴로일 클로라이드는 Tokyo Chemical Industry (TCI, Tokyo, Japan)에서 구입했다. 4-(2-하이드록시에톡시)페닐-(2-하이드록시-2-프로필) 케톤 (Irgacure 2959)은 Ciba Specialty Chemicals Inc.(Basel, Switzerland)로부터 입수하였다. 스핀 여과용 Nanosep® 원심 분리기 (MWCO 300 kDa)는 Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입했다. 별도의 표시가 없는 한, 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)에서 구입했다. 모든 시약은 분석 등급이었으며 더 이상의 정제없이 사용하였다.

2. 요산 산화효소(UOX) 정제 및 금 나노입자(AuNP)의 제조

UOX를 다음과 같이 준비하였다. 간략하게, 플라스미드를 코딩하는 UOX 유전자 (pQE80-UOX)를 TOP10 Escherichia coli 세포로 형질전환시켰다. 형질전환된 TOP10_pQE80-UOX 세포를 UOX의 발현을 위해 배양 하였다. UOX를 발현하는 세포를 수확하고 UOX에 부착된 헥사 히스티딘(hexahistidine) 친화성 태그를 사용하여 고정화된 금속이온 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. UOX의 순도는 95 % 이상이고, SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. 정제된 UOX의 촉매 활성은 요산 분해 분석법을 이용하여 확인하였다.

보다 상세하게 설명하면, T5 프로모터(pQE80-UOX)의 조절하에 Aspergillus flavus 유래의 재조합 요산 산화효소(UOX) 유전자를 암호화하는 플라스미드를 TOP10 대장균 세포로 형질전환시켰다. 전-배양된 형질전환 세포를 100 μg/mL의 암피실린을 함유하는 새로운 2xYT 배지에 접종하고, 37 ℃에서 진탕 배양 (220 rpm) 하였다. 600 nm (OD _600nm)에서 광학 밀도가 0.5에 도달하면, UOX 발현 유도를 위한 배양물에 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드를 첨가하고 5시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화 하였다. 세포 펠렛을 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하고, 용해 완충액 (50 mM 인산 나트륨, 0.3 M 소듐 클로라이드, 10 mM 이미다졸, pH 7.4)에 재현탁시키고 얼음에서 10분 동안 100 μg / mL의 리소자임으로 배양하였다. 재현탁된 세포 펠렛을 얼음 위에서 15 분 동안 초음파 처리하였다 (10 초 펄스 온 및 20 초 펄스 오프). 세포 용해물을 4 ℃에서 12,000 rpm으로 40 분간 원심분리 한 후 Ni-NTA 수지를 상층액에 넣고 4 ℃에서 30 분간 배양했다. Ni-NTA 수지로 배양된 상층액을 폴리프로필렌 컬럼에 로딩하고 세척 완충액(50 mM 인산나트륨, 0.3 M NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.4)으로 세척하였다. 세척 후, 용출 완충액(50mM 인산나트륨, 0.3M 소듐 클로라이드, 250mM 이미다졸, pH 7.4)에 의해 UOX를 용출시켰다. 용출된 UOX 용액을 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS 완충액(pH 7.4)으로 완충액 교환하였다. UOX 농도는 Beer-Lambert의 법칙에 따라 Synergy ™ 다중 모드 마이크로 플레이트 판독기 (BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 280 nm에서의 흡광도 측정에 의해 결정하였다. UOX의 흡광 계수는 53,520 M^-1cm^-1이었다.

나노캐리어(NC)로의 캡슐화 이전에, H₂O₂ 분해 분석법을 사용하여 AuNPs의 카탈라아제-모방 촉매 활성(catalase-mimic catalytic activities)을 확인하였다.

3.UOX(요산 산화효소)에 의한 UA(요산) 분해율의 결정

UOX와 AuNP의 비율을 최적화하기 위해 다양한 농도의 AuNP (1, 2.5, 5, 10, 15, 20 및 25 μg/mL)를 500 nM UOX와 혼합했다. UA의 분해 속도를 결정하기 위해 200μM UA를 PBS 완충액(pH 7.4)에서 UOX와 혼합하고 Synergy ™ 다중 모드 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 293 nm에서 흡광도를 모니터링했다. 293 nm에서 UA의 흡광 계수는 12,300 M^-1cm^-1이었다.

4. UOX-AuNP@NCs의 제조

플루로닉-기반 나노캐리어(NC)는 디아크릴레이티드 플루로닉 F127 (diacrylated pluronic F127, DA-F127)의 미셀 상태를 광가교결합시켜 합성하였다.

간략히 설명하면, 10 중량％ DA-F127 용액을 탈이온수 (DIW)에서 제조하였다. 그런 다음 0.154 mL의 DA-F127 용액을 0.057 중량％의 irgacure 2959를 포함하는 1.846 mL의 DIW에 첨가하여 DA-F127의 미셀 형성을 유도하였다. 자외선 (UV) 램프 (VL-4.LC, 8 W, Vilber Lourmat, France)를 사용하여, 1.3 mW/cm² 에서 15 분간 조사하여 NC 합성을 위한 광가교 공정을 수행하였다. 제조된 NC를 투석을 이용하여 1 일 동안 정제하고 동결 건조시켰다. UOX와 AuNP는 NC의 온도에 따른 크기 변화를 이용하여 나노캐리어(NC)에 공동 캡슐화하였다(UOX-AuNP@NCs).

간략히 설명하면, NC 1mg을 AuNP 50μg을 함유한 5μM UOX 용액 1 mL에 용해시켰다. 그 혼합물을 4℃에서 하룻밤 배양하여 NC의 크기 확장을 유도하였다. 그런 다음 혼합용액의 온도를 37 ℃로 올리고 10분간 유지하여 캡슐화를 위해 NC의 크기를 감소시켰다. 최종 용액을 nanosep® 원심 분리기를 사용하여 원심 분리하여 담지되지 않은 UOX 및 AuNP (11,000 rpm, 37 ℃, 10분)를 제거했다. 그런 후, 비신코닌산 단백질 분석 (Micro BCA 단백질 분석 키트, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 의해 UOX-AuNP@NCs 내의 UOX 양을 측정하였다. UOX-AuNP@NCs 내의 AuNPs의 담지량은 분광계 (Molecular Devices, Spectra-MaxM2e, Trenton, NJ, USA)를 사용하여 525 nm에서 AuNPs의 흡광도에 의해 계산하였다.

5. UOX-AuNP@NC의 크기 및 표면 전하

NC와 UOX-AuNP@NC의 크기와 표면 전하를 전기영동 광산란시스템 (ELS-8000, Otsuka Electronics Osaka, Japan)을 사용하여 37 ℃에서 분석하였다. 그런 다음, 37℃ 및 100 rpm 환경에서, 10% FBS(fetal bovine serum)을 포함한 세포 배양 배지 (RPMI 1640, Gibco, NY, USA)에서, 1 mg/mL의 UOX-AuNP@NCs의 크기 변화를 측정하여 UOX-AuNP@NCs의 안정성을 측정하였다. UOX-AuNP@NCs의 크기는 7일 동안 미리 결정된 시점에서 관찰하였다.

6. NC에서 시험관 내(in vitro) UA 분해율 측정

UA 분해 효율을 비교하기 위해, 4 가지 효소 시스템을 다음과 같이 제조 하였다 : (1) UOX, (2) NC 내의 UOX (UOX@NC), (3) AuNP를 갖는 UOX (UOX-AuNP), 및 (4) NC 내의 UOX-AuNP (UOX-AuNP@NC). 효소 샘플을 37 ℃에서 15 분 동안 배양하고, 10 nM의 UOX 효소 분석법을 수행하였다. 분석 완충액(50 mM 소듐 보레이트 완충액, pH 8.0, 100 μM UA) 200 μL를 사용하고 UA 분해 속도는 293 nm에서의 흡광도 변화를 측정하여 계산했다.

7. 시험관 내에서의 H ₂ O ₂ 수준 측정

UA를 샘플에 첨가할 때 UOX 시스템 (UOX, UOX@NC, UOX-AuNP 또는 UOX-AuNP@NC)에 의해 생성된 H₂O₂의 농도를, N, N-디메틸-4-니트로아닐린 (RNO)의 분해법를 사용하여 추산하였다. 0.25 M의 RNO 및 0.03 M의 히스티딘을 DIW에서 제조하고 함께 혼합하였다. 그 다음에, UOX, UOX@NC, UOX-AuNP 또는 UOX-AuNP@NC 용액을 RNO 용액에 첨가하였다. UOX 및 UA의 농도는 각각 200 nM 및 1 mM로 고정시켰다. 이어서, 샘플을 실온에서 10분 동안 배양시키고, 440 nm에서의 흡광도를 측정하여 N, N-디메틸-4-니트로아닐린(RNO) 농도를 관찰함으로써 각 샘플로부터의 H₂O₂ 생성을 측정하였다.

8. UOX-AuNP@NC의 시험관 내 세포 독성

American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 얻은 편평 세포 암종-7 (SCC7) 세포를 사용하여 UA가 없는 UOX-AuNP@NCs의 세포 독성을 조사 하였다. 먼저 SCC7 세포를 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토마이신을 포함하는 세포배양 배지 (RPMI 1640, Gibco, NY, USA)가 있는 96-웰 조직배양 플레이트에 각 웰당 5 x 10³ 세포 수로 분주되었다. 분주된 세포를 5 % CO₂ 조건 하에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이어서, PBS 완충액(pH 7.4)을 사용하여 세포를 세척하고, 제조된 UOX-AuNP@NC 샘플을 상이한 농도 (NC 농도 기준으로 0 내지 1 mg / mL)로 처리하였다. 샘플 처리된 세포를 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS 완충액으로 세척하고 UA가 없는 UOX-AuNP@NCs의 세포 독성을 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan)을 사용하여 계산하였다.

9. UOX 시스템에 의해 생성된 H ₂ O ₂ 의 시험관 내 세포 독성 측정

UOX 시스템에 의해 생성된 H₂O₂의 세포 독성을 조사하기 위해, UA의 존재하에서 UOX-AuNP@NC의 세포 독성이 UOX, UOX@NC 및 UOX-AuNP의 세포 독성과 비교하였다. SCC7 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 각 웰당 5 x 10³ 세포 수로 분주하고 37℃, 5% CO₂ 환경에서 하룻밤 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척하고 UOX, UOX@NC, UOX-AuNP 및 UOX-AuNP@NC와 같은 샘플 100 uL로 처리하였다. 각각의 샘플을 최종 농도 200 nM UOX 및 1 mM UA로 처리하였다. 그 중 UOX@NC는 음성 대조군이었다. 샘플 처리된 세포를 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하고 PBS로 세척하였다. UA 존재 하에서의 샘플군의 세포 독성은 Cell Counting Kit-8을 사용하여 측정하였다.

10. 생체 내(in vivo) 요산 수치 측정

생체 내 실험을 위해 8 주령의 C57BL/6 생쥐(Orient Bio Inc., 성남시, 한국)를 상용하였다. 생쥐에서 고요산혈증(hyperuricemia) 상태를 유도하기 위해 하이포크산틴(hypoxanthine)과 포타슘옥소네이트(potassium oxonate)로 처리하였다. 고요산혈증(hyperuricemia)을 유도하기 전에, 모든 생쥐는 하룻밤 금식시켰다. 하이포크산틴은 3％ 가용성 전분 용액에 용해시켰고, 475 μg/g의 용량으로 생쥐에게 위 내에 주입하였다. 이어서, 포타슘 옥소네이트를 라놀린과 액상파라핀(3 : 2, v/v)의 혼합물로 이루어진 공용매에 용해시켰고 하이포크산틴 처리된 생쥐에 95 μg / g의 양으로 피하 주사하였다.

다섯 그룹의 생쥐를 준비하였다: (1)정상 생쥐(대조군), (2) 치료받지 않은 고요산혈증 생쥐 및 (3) UOX, (4) UOX-AuNP 또는 (5) UOX-AuNP@NC로 치료받은 고요산혈증 생쥐. PBS, UOX, UOX-AuNP 또는 UOX-AuNP@NC의 샘플 용액 (UOX 농도는 1 μM으로 고정됨) 100 μL를 고요산혈증 생쥐의 꼬리 정맥 내로 주입 하였다. 미리 결정된 시점(사전 유도 및 주사후 1, 3, 6, 12, 및 18 시간 뒤 시점)에서 혈액은 레트로-오비탈 블리딩(retro-orbital bleeding)을 통해 샘플 처리된 생쥐로부터 수집하였다. 샘플 주입 18시간 후에, 심장에 구멍을 내어 혈액을 수집하였다. 수집한 혈액을 4 ℃에서 3,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 혈청을 얻었다. 샘플처리에 의한 UA 분해의 효과를 비교하기 위해 샘플 주입 후 혈청 내의 UA 농도를 분석하였다. 요산의 혈청 농도를 측정하기 위해 이전에 보고된 방법을 거의 변형없이 이용하여 샘플들을 분석하였다. 혈청 샘플들을 0.3 M 아세테이트 완충액(pH 3.6)과 혼합하고 분석할 때까지 4 ℃에서 보관했다. 혈청 UA를 측정하기 위한 시약 혼합물은 0.83 mM 2,4,6-트리 피리딜-s-트리아진(TPTZ)과 1.66 mM FeCl₃·H₂O의 농도로 0.3 M 아세테이트 완충액(pH 3.6)에서 제조하였다. 593 nm에서의 흡광도를 측정하여 UA 농도를 결정하였다. 또한, NC의 존재 또는 부재 하에서 UOX의 잔류 활성을 평가하기 위해 샘플주입 18 시간 후의 혈청 샘플의 UA 분해율을 측정하였다.

실험결과

1. NC에 캡슐화된 UOX와 AuNP의 물리 화학적 성질과 최적 비율

본 발명에서 플루로닉-기반 나노캐리어(NC)를 UOX와 AuNP를 동시에 전달하는데 사용하였다. UOX와 AuNP는 온도에 따른 크기 변화를 통해 NC에 공동 캡슐화시켰다. AuNPs의 존재하에서 UOX에 의한 효율적인 UA 분해를 달성하기 위해, UOX 대 AuNP의 최적 비율을 조사하였다. 다양한 농도의 AuNP (1, 2.5, 5, 10, 15, 20 및 25μg/mL)를 500 nM UOX와 혼합한 다음, NC로 캡슐화하였다. 모든 경우에, 포함(로딩)효율은 90％ 이상이었다.

샘플의 효소 활성 분석 결과, 효율적인 UA 분해를 위해 5μg/mL가 AuNP의 최적 농도임을 보여 주었다(도 2a 참조). 5μg/mL AuNP의 존재 하에서, UOX에 의해 분해된 UA의 양은 UOX 단독에 의한 것보다 2.5 배 더 높았다. 플루로닉-기반 NC에 여러 구성 요소를 간단하고 효율적으로 로딩함으로써 운반체내에서의 활성 구성 성분을 조절하고 UOX와 AuNP 사이의 최적의 비율을 쉽게 결정할 수 있었다. AuNP에 대한 UOX의 비율은 이후의 모든 실험에서 최적의 비율로 고정하였다. 이러한 조건에서, NC로의 UOX 및 AuNP의 로딩 효율은 90 % 이상이었다 (각각 92 ± 8 % AuNPs 및 93 ± 1 % UOX).

제조한 나노캐리어(NC)의 크기와 표면 전하는, 생체 내에서 NC의 크기를 예측하기 위해 37 ℃에서 전기영동 광산란 시스템을 사용하여 분석하였다. UOX 및 AuNP를 로딩하지 않으면, NC의 크기 및 표면 전하는 각각 67 ± 15 nm 및 -4.2 ± 0.8 mV였다(도 2b 및 도 2c 참조). UOX와 AuNP를 NC에 캡슐화(UOX-AuNP@NC)한 후에서, UOX-AuNP@NC의 크기와 표면 전하는 각각 65 ± 19 nm와 -5.1 ± 1.7 mV 였고(도 2b 및 도 2c 참조), 이는 UOX 및 AuNP의 로딩시 NC의 크기 및 표면 전하에 두드러진 변화가 없음을 나타낸다. NC의 표면에 흡착하는 대신에 NC 내로 AuNP를 효율적으로 로딩하는 것이 확인되었다. 게다가, pH 7.4에서 UOX의 예상 순 전하를 +1.4로 가정하면, UOX와 AuNP를 둘다 로딩한 후에 NC의 표면 전하가 증가하지는 않았지만 유사하다는 사실은 UOX가 NC 표면에 흡착하는 대신 AuNP와 함께 NC 내로 로딩되었음을 입증한다. 또한, UOX-AuNP@NC는 혈청 함유 배지 (10 % 혈청, 37 ℃, 100 rpm)에서 7 일까지 양호한 크기 안정성을 나타내었다(도 6). 이는 생체 내에서 콜로이드 안정성을 암시한다. 플루로닉-기반의 NC가 흡광도 변화와 같은 특징의 작은 변화없이 단백질 활성을 보존하고 금 나노 물질을 포집할 수 있다는 것을 고려할 때, UOX 및 AuNP의 물리 화학적 성질은 UOX의 캡슐화에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다고 추측되었다. 도 3a에서, NC에서의 UOX의 촉매 활성은 유리 UOX의 촉매 활성에 비해 실질적으로 감소되지 않았다. 유사하게, NC 내의 AuNP는 유리 AuNP와 동등한 촉매 활성을 보였다. 따라서, NC는 생체 내 환경에서 중요한 특성을 손상시키지 않으면서 UOX와 AuNP를 동시에 운반 가능할 것으로 예상되었다.

2. NC내에서 AuNP와 함께 캡슐화된 UOX의 향상된 촉매 활성

본 발명자는 NC 내로, AuNP와 공동 캡슐화시에 UOX의 촉매 효율 변화를 분석했다. 두 가지 요인에 의해 촉매 활성의 효율이 향상될 것이라는 가설을 세웠다. 하나는 AuNP를 첨가하면 부산물인 H₂O₂가 분해되어 UA 분해 반응이 촉진된다는 것이다. 다른 하나는 캐스캐이드 반응(cascade reactions)에서 다중 촉매의 근접 효과이다. NC 내에서 UOX와 AuNP를 함께 캡슐화하면 UOX와 AuNP 사이의 거리가 크게 줄어들어 인 시튜(in situ)에서 H₂O₂ 분해가 가속화될 것이다. 이러한 가설을 증명하기 위해 UOX 단독(UOX), NC내에 캡슐화된 UOX(UOX@NC), UOX와 AuNP의 유리 혼합물(UOX-AuNP), NC 내에 캡슐화된 UOX 및 AuNP (UOX-AuNP@NC)등의 4 개군의 효소 시스템을 제조하였다. UA와 H₂O₂의 분해된 양을 측정하였다. 도 3a에서 나타난 바와 같이, UOX와 UOX@NC는 유사한 UA 분해율을 나타내었다. AuNP의 존재 하에서, UOX에 의한 UA 분해는 UOX 단독에 의한 것보다 40% 더 높았다. 또한, UOX-AuNP@NC는 UOX 단독보다 UA를 70% 이상 더 분해시켰다. NC 내에서 UOX에 의한 UA 분해율이 UOX 단독에 의한 것과 유사한 분해 효과가 관찰되었다.

다음으로, 다른 효소 시스템이 시험관 내에서 UA이 분해되는 동안 상이한 H₂O₂ 수준을 유도하는지 조사했다. H₂O₂ 수준은 RNO 분해를 측정함으로써 추정하였다 (도 3b). UOX 단독의 경우, RNO의 20 % 대부분이 UOX에 의한 UA 분해로부터 생성된 H₂O₂를 통해 분해되었다. 동일한 반응 조건 하에서, UOX@NC에 의한 RNO 분해는 UOX 단독에 의한 것과 크게 다르지 않았다. 그러나, AuNPs (UOX-AuNP)의 존재 하에서 RNO의 약 14%가 분해되어 H₂O₂ 수준이 낮아졌다. 이러한 결과는 AuNP에 의한 H₂O₂의 인시튜(in situ) 분해에 대한 가설과 일치하였다. 흥미롭게도, UOX와 AuNP가 모두 NC에 로딩되었을 때(UOX-AuNP@NC), RNO의 약 5% 만이 분해되었는데, 이는 UOX-AuNP보다 H₂O₂의 제거가 더 효율적이라는 것을 의미한다. 이러한 RNO 분해 분석 결과(도 3b)는 UA 분해 분석 결과와 상당히 일치하였다(도 3a).

UOX 단독 및 UOX@NC에 의한 유사한 UA 분해 및 H₂O₂ 생성은 NCs 자체가 UOX의 효소 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 더 중요한 것은 이러한 결과는 NC 또는 NC 내에서 H₂O₂ 뿐만 아니라 UA의 운송을 방해하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, NC는 효소와 나노 입자의 효율적인 로딩을 제공할 뿐만 아니라, 운반체를 가로 질러 또는 내부에서 효소 반응을 위한 기질 및 생성물을 포함하는 저분자의 수송을 허용했다. 이는 생체 내에 존재하는 표적 분자에 대해 전달된 효소의 적절한 작용을 위한 중요한 필요조건이다. UOX-AuNP와 비교하여 UOX-AuNP@NC의 UA 분해율에서의 유의한 증가와 H₂O₂ 수준의 현저한 감소는 NC가 그들 사이의 캐스캐이드 반응(cascade reactions)을 방해하지 않았다는 것을 암시한다. 또한, 이러한 결과는 H₂O₂ 제거 및 UA 분해측면에서 NC 내에서의 UOX 및 AuNP를 동일 지역에 위치시킴으로써 만들어진 근접 효과에 대한 가설을 입증한다. 본 발명자들은 UOX와 AuNP 사이의 거리가 UOX와 AuNP의 유리 혼합물 사이의 거리보다 NC 내에서 더 가까웠다고 추측했다. 혈액량이 샘플 주입량보다 훨씬 크기 때문에 샘플은 투여시 생체 내에서 실질적으로 희석될 것으로 예상된다. 따라서, H₂O₂ 제거 및 UA 분해측면에서 NC 내에서 UOX 및 AuNP의 공동 캡슐화의 보다 현저한 효과는 생체 내에서 예상된다. 상기한 실험 결과를 통해, 본 발명자들은 향상된 효능을 가진 플루로닉-기반 운반 플랫폼의 유리한 특성을 확인했다.

3. UA 유무에 따른 UOX-AuNP@NC의 시험관 내 세포 독성

UOX-AuNP@NC를 이용한 생체 내 실험전에 UA가 없는 UOX-AuNP@NC의 세포 독성을 측정하여 SCC7 암세포를 이용한 나노시스템의 생물학적 안전성을 확인하였다(도 4a). 세포 독성은 세포 활성에서의 감소로 나타난다. 분석 결과는 UA 없이 UOX-AuNP@NC는 NC 농도를 기준으로 1 mg/mL 까지 세포 독성을 나타내지 않았음을 보여주었다. NC 자체는 시험관 내 독성이 없다는 것을 고려하면, AuNP는 심각한 독성 문제가 없으며, UOX는 UA의 존재 하에서만 H₂O₂와 같은 독성 물질을 생성할 수 있다. 따라서, 플루로닉-기반 NC 내에서 UOX 및 AuNP를 모두 포함하는, UOX-AuNP@NC는 UA가 없을 경우 심각한 독성 없이 안전할 것으로 기대된다.

H₂O₂ 관련 세포 독성을 평가하기 위해 UOX-AuNP@NC 시스템의 세포 독성을 UA 존재 하에서 다른 샘플의 세포 독성과 비교하였다(도 4b). 암세포는 H₂O₂ 축적과 같은 반응성 산소종에 정상 세포보다 더 민감하기 때문에 SCC7 암세포를 사용하였다. 예상대로, UA 단독 샘플(UA (+))는 UA가 없는 음성 대조 샘플(UA (-))와 유사한 유의적인 세포 독성을 나타내지 않았다. 대조적으로, UA가 존재할 때, UOX 샘플은 생성된 H₂O₂에 기인하여 상당한(약 70 %) 세포 사멸을 보였다. NC 내로의 UOX 캡슐화(UOX@NC)는 H₂O₂ 생산 결과(도 3b)와 유사하게 세포 독성을 유의적으로 감소시키지 못했다. 반면에, UOX 및 AuNPs 용해 용액 (UOX-AuNP) 샘플은 폐쇄 실험 설정에서 AuNP에 의한 H₂O₂ 제거로 인해 유의성 있게 감소된 세포 독성(약 40 %)을 나타냈다. 더 중요한 것은, UOX-AuNP@NC는 UOX-AuNP에 비해 세포 독성이 훨씬 크게 감소함을 보였다는 것이다. UOX-AuNP@NC 샘플의 세포 활성은 매우 높았으며, 대조군 UA(-)의 세포 활성과도 거의 동등하였다. 이러한 모든 결과는 UA 분해 분석(도 3a) 및 H₂O₂ 생성 분석(도 3b)의 결과와 상당히 일치한다. 또한, 이러한 결과는 UA 분해시 UOX에 의해 생성된 H₂O₂가 생체 내 임상 적용에서 잠재적인 부작용인 독성을 유발할 수 있음을 시사하지만, UOX-AuNP@NC에 의한 H₂O₂ 의 효율적인 제거는 UOX에 의해 생성된 H₂O₂의 독성 문제를 현저히 완화시킬 수 있다.

4. UOX와 AuNP를 담지한 NC의 생체 내 활성 평가

생체 내에서 UOX-AuNP@NC의 치료 효과를 분석하기 위해, 도 5a에 도시된 바와 같이, 고요산혈증 생쥐 모델을 사용하였다. 생쥐를 정상 대조군(Control), 고요산혈증군(Hyperuricemia), UOX 치료군(UOX), UOX-AuNP 치료군(UOX-AuNP) 및 UOX-AuNP@NC 치료군(UOX-AuNP@NC)으로 나누었다. C57BL/6 고요산혈증 생쥐에 동일한 양의 효소를 정맥 내 투여하는 방식으로 UOX, UOX-AuNP 또는 UOX-AuNP@NC를 주사하였다. 미리 결정된 시점에서 얻은 혈액 샘플을 분석하고 UA의 농도를 검량 곡선을 사용하여 결정했다(도 5b).

첫째, 실험군 중 고요산혈증군은 초기 고요산혈증 유도(0 시간) 또는 정상 대조(비 고요산혈증)군과 비교하여 1 시간 시점에서 혈청 내 UA 농도가 훨씬 더 높았다(3 배 이상)(도 5b). 고요산혈증 유도 후 3 시간 시점에는 고요산혈증군에서 유도 전(0 시간) 또는 정상 대조군에 비해 UA 농도가 2 배 이상 증가한 것으로 나타났다. 고요산혈증 유도 후 6 시간 시점에서 고요산혈증군은 대조군 또는 고요산혈증 유도 전 상태에 비해 혈청 내 UA 농도가 유사했다. 따라서, 고요산혈증 유도 방법은 UA 농도의 증가를 유도한 후 적어도 3 시간까지는 지속되었다. 고요산혈증에 대한 일시적인 효과는 유사한 유도 방법을 사용하는 이전 보고서에서도 보고되었다. 대조적으로, 생체 내에서 UOX에 의한 UA 분해를 확인하면서, UOX 처리군(UOX, UOX-AuNP 또는 UOX-AuNP@NC) 모두 1 시간 및 3 시간 시점에서 고요산혈증군보다 유의하게 낮은 UA 농도를 나타내었다. UOX 처리군 중 UOX와 UOX-AuNP는 매우 유사한 UA 농도를 나타내었으며(유사한 UA 분해), 반면에 UOX-AuNP@NC는 UOX와 UOX-AuNP보다 유의하게 낮은 UA 농도를 나타내어서 UOX 및 UOX-AuNP와 비교하여 우수한 UA 분해능을 보여주었다(도 5b). UOX와 UOX-AuNP의 유사한 효과는 UOX와 AuNP의 간단한 혼합 및 동시 주입이 생체 내에서 UOX와 AuNP의 캐스캐이드 반응(cascade reaction)을 달성하기에 충분하지 않았음을 시사한다. 따라서, 예상 한 바와 같이, 주사 후 희석은 생체 내에서 UOX 및 AuNP의 동일 지역화(co-localization)를 방지하는 것으로 보였다. 대조적으로, UOX 및 UOX-AuNP와 비교하여, UOX-AuNP@NC에 의한 UA의 훨씬 더 효과적인 분해는 NC 캡슐화에 의한 UOX 및 AuNP의 동시 운반을 통해 캐스캐이드 반응(cascade reaction)이 혈액 내에서 발생하기에 충분한 환경을 만들 수 있음을 입증했다.

또한, 6 시간 혹은 그 이상 경과시, UOX-AuNP@NC군이 보다 낮은 UA 농도가 유지되는 것과는 대조적으로, UOX와 UOX-AuNP 군은 정상 또는 고요산혈증군과 유사한 UA 농도를 나타내어, UOX-AuNP@NC 군만이 18 시간까지 효과적인 것으로 관찰되었다. 정맥 내 투여시, 투여된 NC가 이전 실험에서 1일 이상 주요 장기(주로 간에서)에 머물렀음을 보여 준 플루로닉-기반 NC의 생체 분포 결과를 고려하면, 보다 나중 시점에서 잔류 UA 분해 효과는 NC 내로의 캡슐화에 의한 생체 내 UOX 및 AuNP의 장기간 보존된 효과에 의한 것으로 보였다. 18 시간 시점에서 혈청 내 UOX-AuNP@NC에 의한 잔류 UOX 활성이 확인되었다(도 7).

독성 중간대사체인 H₂O₂의 제거는 UA 분해를 촉진시킬 수 있다. 또한, UOX-AuNP@NC에 의한 H₂O₂의 효과적인 제거는 H₂O₂와 관련된 독성 문제를 낮출 수 있다. 따라서, 생체 내에서 NC를 사용하여 UOX 및 AuNP를 공동 운반함(UOX-AuNP@NC)으로써 UA 분해 효과가 현저하게 향상되었으며, 본 발명의 운반 플랫폼은 UOX와 AuNP의 시너지 효과를 통해 고요산혈증 치료를 위한 확실한 임상 잠재력을 가지고 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

1. 요산 산화효소(urate oxidase); (ⅱ) 과산화수소 분해용 금속의 나노입자; 및(ⅲ) 상기 (i) 및 (ⅱ)가 담지된 온도 민감성 나노캐리어(nanocarrier)를 포함하며, 상기 온도 민감성 나노캐리어는 온도가 증가함에 따라 나노캐리어의 크기가 감소하고 온도가 감소함에 따라 나노캐리어의 크기가 증가하는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 과산화수소 분해용 금속은 금(Au), 백금(Pt), 망간(Mn), 은(Ag), 또는 철(Fe)인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 온도 민감성 나노캐리어는 플루로닉-기반 나노캐리어인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 플루로닉은 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드)(PEO-PPO-PEO)의 트리-블록 공중합체로 제조된 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 트리-블록 PEO-PPO-PEO는 광가교결합 가능한(photo-crosslikable) 작용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 요산 산화효소와 과산화수소 분해용 금속의 나노입자의 중량 비율은, 요산 산화효소 : 과산화수소 분해용 금속의 나노입자 = 1: 0.15 - 1.5인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
8. (i) 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항 기재의 약물 전달체의 치료학적 유효량; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 고요산혈증 또는 고요산혈증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 고요산혈증 관련 질환은 급성 또는 만성통풍, 통풍성 발적, 통풍성 관절염, 신장 질환, 심혈관 질환, 및 종양 용해 증후군(tumor lysis syndrome, TLS)으로 이루어진 군에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
10. 다음의 단계를 포함하는 약물 전달체의 제조방법:
    (a) 요산 산화효소 및 과산화수소 분해용 금속의 나노입자를 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 준비된 요산 산화효소 및 과산화수소 분해용 금속의 나노입자를 온도 민감성 나노캐리어에 담지하되, 상기 온도 민감성 나노캐리어의 크기가 증가되도록 1~10℃ 에서 행하는 단계;
11. 삭제

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