KR102435453B1 - 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증성 질환과 관련된 사이토카인, 예를 들면 인터루킨 6(IL-6)의 발현을 억제할 뿐만 아니라 COX-2 및 PGE2 발현을 억제하고, MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase) 중 특히 c-Jun N-말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase: JNK)의 인산화를 억제시킨다. 또한, 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 연골 파괴를 약화시킬 수 있으므로, 염증성 질환 중에서도 퇴행성관절염에 특히 바람직하다.

Description

프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating inflammatory disease comprising prussian blue/pluronic nanoparticle complexes}
본 발명은 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증성 질환과 관련된 사이토카인, 예를 들면 인터루킨 6(IL-6)의 발현을 억제할 뿐만 아니라 COX-2 및 PGE2 발현을 억제하고, MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase) 중 특히 c-Jun N-말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase: JNK)의 인산화를 억제시킨다. 또한, 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 연골 파괴를 약화시킬 수 있으므로, 염증성 질환 중에서도 퇴행성관절염에 특히 바람직하다.
염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스티민(histamine), 세로토닌(serotonine), 브래드키닌(bradykinin),프로스타그랜딘류 (prostaglandins), 하이드 록실-에이코사테트라에노익산(Hydroxyl-eicosatetraenoic acid, HETE), 류코트리엔(leukotriene)과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다. 손상에 따른 초기에 발생하는 적당한 염증은 손상 부위에 대한 빠른 복구를 가져오기 위한 정상적인 반응이다. 그러나 장기간에 걸친 지속적인 염증반응은 손상부분에 대한 복구를 어렵게 하고 주위 세포에 대한 위해를 가하여 주변조직에 대한 방어력을 떨어뜨려 더욱 증세를 악화시킬 수 있다. 또한 장기간에 걸친 염증반응은 주변조직에 대한 지속적인 손상을 유도해 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 발생시킬 수도 있다. 따라서 염증 반응이 나타난 조직은 빠른 시간 내에 복구프로그램이 잘 작동하도록 적절한 항염증제를 처치해야 한다. 하지만, 염증성 질환을 치료하기 위해 사용되고 있는 스테로이드성 제제들은 여러 가지 많은 부작용을 나타내고 있어 그 사용을 제한하고 있다. 따라서, 항염증 효과가 탁월하며 부작용이 적은 항염증제의 개발이 요구 되고 있는 실정이다
염증성 질환 중에서도 퇴행성관절염(osteoarthritis, OA)은 노화나 유전적 요인과 같은 선천적 요인과 외상 및 비만과 같은 후천적 요인에 의해 유발되는 것으로 알려져 있지만 이와 같은 요인들은 연골세포내의 다양한 생화학적 신호전달에 영향을 주고 세포 내 물질대사의 불균형을 초래하게 된다. 퇴행성관절염은 연골의 퇴화로 인해 발생하며, 이는 물질대사의 불균형에 의해 발생한다. 관절 연골은 피브로넥틴, 황산화 프로테오글리칸 및 콜라겐과 같은 고밀도의 세포외매트릭스(ECM)로 구성된다. 분화된 연골세포의 표현형은 type II collagen 발현에 의해 확인된다. 퇴행성관절염이 발생하면 type II collagen 발현 감소와 탈분화가 일어난다. 염증반응은 관절 연골에서 중요한 역할을 한다. 염증은 퇴행성관절염의 발병기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Cyclooxygenase (COXs)는 COX-1과 COX-2의 두 가지 동형 단백질로 존재한다. 그 중에서도 COX-2는 유도성 효소의 결과이며 염증 반응의 조절에 주로 관여한다. COX-2의 발현은 전사, 전사 후 및 번역에서 조절되며 COX-2의 전사는 전사인자의 활성을 차례로 조절하는 세포 내 신호 전달 경로를 조절하는 다양한 외인성 자극에 유도된다. MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase) 신호전달경로는 cytokine, growth factor, hormone과 같은 외부 신호전달물질의 자극에 의해 유도되는 세포의 분화, 염증반응, 증식, 유전자 발현, 유사 분열, 세포 생존 및 세포 사멸을 포함하는 세포 기능을 조절하는 세포 내 신호전달 체계이다. 이는 모든 진핵세포에 존재하는 것으로 세포생명 유지에 있어 매우 중요한 역할을 하는 것으로 추측되고 있다. 이러한 신호전달은 처음에는 MAPK kinase(MAPKK)를 인산화시키는 단백질 kinase 그룹인 MAPK kinase kinase(MAPKKK)가 인산화 및 활성화시키고 MAPK kinase는 MAPKs의 인산화 및 활성화를 시킨다. 이러한 MAPKKK, MAPKK 효소는 세 가지 주요 MAPKs family인 p38 kinase, ERK-1/-2, c-Jun N-terminal kinase(JNK)를 인산화 시킨다.
퇴행성관절염의 기존 치료법은 정확한 치료제가 없으며 현재까지 비약물적인 치료가 약물적인 치료보다 큰 비중을 이루고 있다. 약물로는 염증과 통증 등의 증상을 완화시키는 NSAID 계열의 진통소염제나 스테로이드 제제, 글루코사민 등이 있고 관절내 주사로 윤활작용을 통해 관절을 보호하는 히알루론산 등의 치료법이 주를 이루고 있다. 퇴행성관절염 증세가 심한 경우 비약물적 치료인 인공관절대체술 같은 수술요법을 시행하나 재활기간이 필요하고 대체관절의 수명이 제한적(10년 이내)이며 비용 및 치환물의 부식에 의한 염증, 2차 감염 등의 부작용의 이유로 임상적 측면에서 가능한 수술을 최대한 지연시키는 치료법이 요구되고 있으며, 기존 치료법의 효능 및 부작용을 고려할 때, 안전하고 관절마모 방어에 효과적인 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 프러시안 블루 나노 입자들은 미국 식약처 (US FDA)의 승인을 받은 물질로 방사능 물질들을 제거할 수 있는 기능을 가지고 있으며 세포 독성이 전혀 없는 생체 내 안전성이 높은 물질이다. 또한 근적외선(NIR) 파장에서 강한 흡광도를 보임으로써 암 치료를 위한 photothermal ablation agent와 photoacoustic imaging contrast agent, MRI 조영제로 조명되고 있다. 하지만 프러시안 블루 나노입자 자체는 생체 내 안정성이 낮아 쉽게 뭉침 현상(aggregation)이 발생할 수 있어서, 유기물질들을(polyvinylpyrrolidone (PVP), polylactic acid(PLA), polydiallyldimethylammonium chloride(PDDA) 등) template로 첨가해 구조적인 안정성을 향상시키는 연구들이 많이 진행되고 있다.
선행문헌
특허문헌 1. KR101986774B1
이에 본 발명자들은 염증성 질환을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있는 신규물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체에 의해 COX-2 발현이 억제될 뿐만 아니라, MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase) 중 특히 c-Jun N-말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase: JNK)의 인산화가 억제되고, 또한 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체에 의해 연골 파괴가 약화될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
일 예로서 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 퇴행성관절염 치료 기전 도 1에 나타내었다.
본 발명은 프러시안 블루/플루로닉 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 프러시안 블루/플루로닉 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하는 경우 염증성 질환과 관련된 사이토카인, 예를 들면 인터루킨 6(IL-6)의 발현을 억제할 뿐만 아니라 COX-2 및 PGE2 발현을 억제하고, c-Jun N-말단 키나아제 (c-Jun Nterminal kinase, JNK)의 인산화를 억제시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하는 경우 연골 파괴가 약화될 수 있으므로, 염증성 질환 중에서도 퇴행성관절염에 특히 효과적이다.
본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체는 염증성 질환의 예방 또는 치료 효과가 향상될 수 있도록 하는 범위를 제공하여 부작용이 없으면서도 염증성 질환의 예방 또는 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 퇴행성관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 등 다양한 분야에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 퇴행성관절염 치료 기전을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 안정성 평가 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 세포독성을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 세포 침투력 평가 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 in vitro OA 모델에서의 치료 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 in vivo OA 모델에서의 치료 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 작용 메커니즘 확인 결과를 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “염증성 질환”은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루푸스, 섬유근통, 건선관절염, 퇴행성관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 및 만성 염증 등을 포함하며, 바람직하게는 퇴행성관절염이다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "퇴행성관절염(degenerative arthritis)"은 관절을 보호하고 있는 연골의 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 생겨 염증과 통증이 발생하는 질환으로서, 골관절염(osteoarthritis)이라고도 불린다. 일차성(특발성) 퇴행성 관절염의 확실한 원인은 밝혀져 있지 않으나 나이, 성별, 유전적 요소, 비만, 특정 관절 부위 등이 영향을 주는 것으로 생각되고 있으며, 이차성(속발성) 퇴행성 관절염은 관절 연골에 손상을 줄 수 있는 외상, 질병 및 기형이 원인이 될 수 있다. 가장 흔하고 초기에 호소하는 증상은 관절염이 발생한 관절 부위의 국소적인 통증이며 대개 전신적인 증상은 없는 것이 류마티스 관절염과의 차이점 중 하나이다. 퇴행성관절염은 관절 연골의 퇴행성 변화에 의해 발생되므로 이를 완전히 정지시킬 수 있는 확실한 방법은 아직까지 알려진 바 없으며, 본 질환의 치료 목적도 환자로 하여금 질병의 성질을 이해하도록 하여 정신적인 안정을 마련해 주면서, 통증을 경감시켜 주고, 관절의 기능을 유지시키며, 변형을 방지하는데 있다. 그러나 변형이 이미 발생한 경우에는 이를 수술적으로 교정하고 재활 치료를 시행하여 관절의 손상이 빨리 진행되는 것을 예방하고, 환자가 동통을 느끼지 않는 운동 범위를 증가시킴으로써 환자의 일상 생활에 도움을 주는데 목적이 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "퇴행성관절염(Osteoarthritis, OA)“및 "골관절염"은 혼용하여 사용되며, 동일한 의미로 이해되어야 할 것이다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "치료"는 본원의 조성물의 투여에 의해 퇴행성관절염 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "예방"은 본원의 조성물의 투여에 의해 퇴행성관절염 질환 또는 질환의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은 프러시안 블루/플루로닉 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에 있어서, 상기 플루로닉 고분자는 플루로닉 F127 (Pluronic F127)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 크기는 1 내지 500 nm인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루푸스, 섬유근통, 건선관절염, 퇴행성관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 또는 만성 염증인 것을 특징으로 한다. 상기 염증성 질환은 바람직하기는 퇴행성관절염일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 염증성 질환과 관련된 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다. 상기 염증성 질환과 관련된 사이토카인은 예를 들면, 인터루킨 6(IL-6)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 COX2, 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 연골이 손상되는 것을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 한다. 상기 MAP 키나아제는 예를 들면, c-Jun N-말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase: JNK) 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 담체는 환자를 자극하지 않고 본 발명에 따른 프러시안 블루/플루로닉 나노입자의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 프러시안 블루/플루로닉 나노입자를 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1 종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 고통받는 환자의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
제2구현예에 따르면,
본 발명은 프러시안 블루/플루로닉 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에 있어서, 상기 플루로닉 고분자는 플루로닉 F127 (Pluronic F127)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체의 크기는 1 내지 500 nm인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루푸스, 섬유근통, 건선관절염, 퇴행성관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 또는 만성 염증인 것을 특징으로 한다. 상기 염증성 질환은 바람직하기는 퇴행성관절염일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 염증성 질환과 관련된 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다. 상기 염증성 질환과 관련된 사이토카인은 예를 들면, 인터루킨 6(IL-6)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 COX2, 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 연골이 손상되는 것을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 한다. 상기 MAP 키나아제는 예를 들면, c-Jun N-말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase: JNK) 일 수 있다.
본 발명의 식품은, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 프러시안 블루/플루로닉 나노입자를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지, 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치츠 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 프러시안 블루/플루로닉 나노입자를 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 건강 기능식품 또한, 식품조성물로써 기능성 식품, 영양보조제, 건강식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 3'-시알릴락토오스를 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화 하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어유, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 프러시안 블루/플루로닉 나노 입자의 제조
플루로닉 고분자 F127을 50 mg/mL 농도로 3 mL의 탈이온수에 용해시키고, K3Fe(CN)6 수용액(1 mL, 5 mM)과 400 rpm에서 자기 교반 하에 30분 동안 반응시켰다. Fe3+가 고분자 사슬에 결합한 후, FeCl2·4H2O 수용액(1 mL, 5 mM)을 1시간 동안 교반하면서 반응 혼합물에 천천히 첨가하여 PB/Plu NP를 형성하였다. Amicon Ultra-15 원심분리 필터(분자량 컷오프=100kDa; Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 2000 rpm에서 10분간 회전 여과하여 불필요한 KCl을 제거하였다. 프러시안 블루 나노 입자(PB NP) 자체는 플루로닉 용액 대신 5 mLl의 탈이온수를 첨가하여 상기와 마찬가지의 방법으로 제조하였다.
실시예 2. 프러시안 블루/플루로닉 나노입자의 안정성 평가
PB/Plu NP의 안정성을 확인하기 위하여, NP를 수용액과 생물학적 완충액에서 유체역학적 직경과 PDI를 측정하여 평가하였다. 37℃의 수용액(DIW)에 0, 1, 2, 4주 동안 보관한 후 특성의 변화를 관찰하였다. 동일한 방법으로 37℃에서 생물학적 완충액(10% FBS-함유 PBS)에 0, 1, 3, 5일 동안 보관한 후 NP의 크기 및 PDI를 분석하였다.
그 결과, PB NP의 경우 37℃ 수용액에서 4주 보관한 후 부분 응집 현상을 나타낸 반면, PB/Plu NP는 거의 동일한 직경과 PDI를 나타냄으로써 4주 동안 안정한 것으로 확인되었다(도 2A). 또한, 생물학적 완충액에서 PB NP가 즉시 응집되는 반면 PB/Plu NP의 경우 직경과 PDI가 초기 값과 유사하게 유지되어 뛰어난 안정성을 나타내었다(도 2B). 따라서, PB/Plu NP는 장기간 안정성을 가지고 퇴행성 관절염 치료를 위한 의생명 분야에서 성공적으로 적용될 수 있음이 확인되었다.
실시예 3. In vitro cytotoxicity
PB NP 및 PB/Plu NP의 세포독성을 NP로 처리한 NIH 3T3 및 Raw264.7 세포에서 조사하였다. 상기 세포들을 1Ⅹ104 cells/well의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고, 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 최대 80% 밀집(confluency)될 때까지 밤새 배양하였다. 상이한 농도의 PB NP 및 PB/Plu NP(0-5 mg/mL)를 1일 동안 처리하여 세포 생존율에 대한 효과를 평가하였다. 10% DMSO를 처리하여 세포에서 세포독성을 확인하였다. 그 다음 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 용액(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 사용하여 인큐베이터에서 한 시간 반응시킨 뒤 상층액의 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
그 결과, PB/Plu NP는 NIH 3T3 섬유아세포와 Raw264.7 세포 모두에서 세포 독성을 나타내지 않으며, 심지어 고농도인 5 mg/mL로 처리한 경우에도 세포 독성을 거의 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 3).
실시예 4. In vitro anti-inflammatory activity
PB/Plu NP의 항염증 활성은 LPS로 자극된 Raw264.7 대식세포에서 평가하였다. 약 15,000개의 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음, PB/Plu NP 0-1 mg/mL 농도를 세포에 처리한 후 LPS(10 ng/mL)를 처리하였다. 세포 내의 원래의 NO 수준은 빼기 위하여 음성 대조군에서는 세포 배지만을 처리하였다. 처리 1일 후, 동일한 부피의 Griess 시약을 사용하여 샘플 그룹의 40 μL 상층액의 질산 농도를 분석하였다. 시험관 내 NO에 대한 반응으로 발현되는 분홍색 발색원의 감소된 흡광도는 PB/Plu NP의 항염증 활성을 결정하였다. 마찬가지로, PB/Plu NP의 NO 억제를 PB NP의 억제와 비교하였다. 세포 독성이 없는 100 μg/mL 농도의 NP를 상기와 동일한 절차를 사용하여 LPS로 자극된 Raw264.7 세포에 추가하였다. 질산 농도 측정을 위한 Griess 시약과 반응시킨 후 마이크로플레이트를 사용하여 540 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
실시예 5. In vitro cellular uptake
Raw264.7 세포로의 PB NP 및 PB/Plu NP의 세포 흡수를 분석했습니다. 96-well plate(1x104cells/well)의 세포를 10 μg/mL 농도의 NP로 1일 동안 처리하였다. 그 다음 PBS로 2회 세척하고 100 mM NaOH(200 μL)를 사용하여 용해시켰다. 세포에 로딩된 NP의 양은 colorimetric ferrozine-based assay에 의한 철 농도의 정량화를 통해 측정하였다. 구체적으로, 각각의 세포 용해물 100 μL, 10 mM HCl 및 철 방출 시약을 함께 반응시키고 60℃에서 2시간 동안 가열하였다. 철 방출 시약은 반응 전에 동일한 부피의 4.5%(w/v)와 1.4 M HCl을 새로 혼합하여 제조하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 96-웰 플레이트의 각 웰에 옮기고 철 검출 시약 50 μL를 첨가하였다. 물에 6.5 mM 페로진, 6.5 mM 네오쿠프로인, 2.5 M 암모늄 아세테이트 및 1 M 아스코르브산이 포함되어 있다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 562 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 흡광도로부터 철의 수준을 결정하기 위하여 PB NP 및 PB/Plu NP의 알려진 농도의 희석 시리즈를 사용하여 이전에 설명한 페로진 기반 분석을 수행하여 작성되었다. NP 처리 없이 세포 내 철 수준을 분석하여 세포의 자연적 철 농도를 고려하였다. 또한, 세포 내 단백질 함량은 정규화를 위해 Coomassie 단백질 분석 시약(Thermo Scientific)으로 정량화하였다.
실시예 6. 관절 연골 세포의 1차 배양
마우스 관절 연골 세포는 C57BL/6 마우스(생후 5일)의 연골에서 얻었다. 마우스를 해부하기 전에 안락사시키고 마우스의 대퇴과 및 경골 고원을 DMEM에서 0.2%(w/v) 콜라게나제 유형 II 및 0.1%(w/v) 트립신에 의해 3시간 동안 분해시켰다. 분해된 연골을 결합 및 기타 조직에서 분리하고 0.1%(w/v) 콜라게나아제 유형 II에서 2시간 동안 추가로 분해시켰다. 세포를 여과하고 DMEM 중 10% FBS 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 포함된 35mm 세포 배양 접시에 플레이팅(2.8 x 105 cells/mL)하였다. 배양 2일째의 세포를 각 실험에 표시된 바와 같이 처리하였다.
실시예 7. 세포 처리
마우스 관절 연골세포에 IL-1β(1 ng/mL), IL-6(50 ng/mL) 및 TNF-α(50 ng/mL)를 처리하고 PB/Plu NP를 다양한 농도의 각 사이토카인(0.1, 0.5, 1 μg/mL)과 공동 처리하였다. IL-1β, IL-6 및 TNF-α 재조합 단백질은 GenScript에서 구입하였다.
실시예 8. 세포 생존력 분석
PB/Plu의 세포 독성을 분석하기 위하여 LDH Colorimetric assay kit(BioVision Inc, Milpitas, CA, USA)를 사용하였다. 미처리 세포(100% 생존율) 및 Triton X-100 처리 세포(0% 생존율)를 함께 분석하여 세포 생존율을 정상화하였다. PB/Plu 처리된 세포의 상청액을 LDH 분석 키트에 사용하였다. 세포 독성의 백분율은 공식(샘플 LDH - 음성 대조군)/(최대 LDH - 음성 대조군)x100으로 계산하였다. 흡광도(450 nm 및 595 nm)는 마이크로플레이트 판독기(VICTOR X3; PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 측정하였다.
실시예 9. DMM(Destabilization of the medial meniscus)
실험적 OA를 10-12주령 수컷 마우스를 이용하여 DMM 수술로 유도하였다. 외과용 블레이드로 내측 반월상 연골 인대를 절개하여 내측 반월상 연골(DMM)의 불안정화시켰다. DMM 후 내측 반월상 연골의 내측 변위가 발생하고 더 작은 영역에 대한 체중 부하로 인해 국소 기계적 응력의 증가가 야기되었다. 마우스 무릎은 체중 부하 동안 구부러지기 때문에 후방 대퇴골과 중앙 경골, 주로 내측에서 더 큰 힘이 유도되었다. Sham 수술로는 대조 관절에 대해 인대가 가시화되었지만 절개되지는 않았다.
실시예 10. 연골 조직 이미지
마우스의 연골 샘플을 파라포름알데히드에 고정하고 2주 동안 석회화를 제거하였다. 석회화된 샘플을 잘라내어 파라핀에 포매하였다. 5-μm 두께의 절편을 수행하고 0.1% Safranin-O 및 0.025% Fast green 용액으로 염색하였다. 각 섹션 이미지는 OARSI 등급 시스템을 사용하여 점수화되었다.
실시예 11. 관절내(IA) 주사
PBS 및 PB/Plu NP(0.1, 0.5 및 1 μg)를 DMM 수술 후 4주 후에 IA 주사로 연골에 주사하였다. IA 주사는 6주 동안 주 1회 실시하였다. 조직학적 분석을 위해 DMM 수술 10주 후에 마우스를 희생시켰다.
실시예 12. 연골의 공초점 현미경 이미징
Cy5.5로 표지된 PB/Plu NP(10 mg/kg)와 Cy5.5(Cy5.5로 표지된 PB/Plu NP에서와 같은 양의 Cy5.5)를 Hamilton 주사기로 무릎 관절에 관절 내 주사하였다. 마우스의 무릎 관절을 4% PFA 용액에 고정된 다른 조직에서 분리하여 다듬었다. LSM980 NLO(ZEISS, Oberkochen, Germany)를 사용하여 연골 상단에서 이미지를 얻었습니다.
실시예 13. Western blotting
총 연골세포 용해물은 용해 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 50mM Tris, 5mM NaF)에서 제조하였다. 프로테아제 억제제와 포스파타제 억제제(Roche)의 혼합물을 용해 완충액에 첨가하였다. Anti-Cox-2, p-JNK, JNK, p-c-Jun 및 Erk 항체를 사용하여 세포 단백질 c-Jun N-말단 키나제(JNK)(#9252S; CST), 인산화된(p)JNK(#9251S; CST) p-c-Jun(#9261S; CST) 및 Erk(#sc514302; Santa cluz biotechnology)을 검출하였다.
실시예 14. PGE2/IL-6 분석
1차 마우스 연골세포를 96웰-플레이트(2 x 104 세포/웰)에 플레이팅하였다. PGE2 Immunoassay Kit(R&D System, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제품 매뉴얼에 기재된 바와 같이 전체 세포 용해물의 세포내 및 분비된 PGE2의 양을 측정하였다. 연골 세포에서 IL-6 발현을 조사하기 위해 IL-6 ELISA 키트(Koma Biotech, Seoul, South Korea)를 사용하였다.
실시예 15. 형광 분포 분석
무릎 관절에서 PB의 체류 시간을 결정하기 위해 Cy5.5-표지된 PB/Plu NP(10mg/kg) 및 Cy5.5(10mg/kg)를 C57BL/6(n = 3)의 무릎 관절에 시간 의존적으로 i.a. 주입하고, eXplore Optix system(ART Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada)을 사용하여 체류 시간을 관찰하였다.
실시예 16. 단백질 마이크로어레이
단백질 마이크로어레이 데이터는 HHuProt human proteome microarray v3.1 (CDI Laboratories)을 사용하여 생성하였다. 단백질 칩을 마이크로어레이 완충액(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 4.3 mM Na2HPO4; 1.8 mM KH2PO4 pH7.4; 0.05% Triton X-100)을 사용하여 실온에서 5분 동안 평형화한 다음 실온에서 1시간 동안 마이크로어레이 완충액에서 5% 여과된 탈지유로 구성된 차단 용액과 함께 인큐베이션했습니다. PB/Plu NP 결합 단백질을 스크리닝하기 위하여, 차단된 단백질 칩을 마이크로어레이 완충액으로 10분 동안 3회 세척한 후 실온에서 3시간 동안 인산완충식염수(PBS, pH7.4)에서 Cy5 또는 5 μg/mL Cy5 표지된 PB/Plu NP으로 인큐베이션하였다. 단백질 칩을 스캔하기 전에, 마이크로어레이 완충액으로 3회 세척하고 50mL 원추형 튜브를 사용하여 200xg에서 2분 동안 원심분리를 통해 드레인하였다. 마지막으로 GenePix 4000B 기기(Molecular Devices)에서 단백질 칩을 스캔하였다. GST 항체를 사용하여 Alexa Fluor goat-항 Rabbit 546-접합 이차 항체를 사용하여 칩에서 발견된 모든 단백질을 프로브하였다. 각 지점에 대한 신호-대-잡음비(SNR) 값은 전경과 배경 신호의 비율로 구하고, GST 신호 강도를 정규화하였다. 칩에 있는 모든 단백질의 신호 강도의 평균을 계산하였다.
실시예 17. 통계분석
모든 실험은 3회 수행하였다. 결과 데이터는 평균±표준 편차로 표시하였다. Student t-test는 그룹 간의 차이를 비교하는 데 사용되었으며 Dunnett의 사후 다중 비교 테스트와 일원 ANOVA로 분석하였다. 모든 조직학적 샘플은 두 명의 조사자에 의해 맹목적으로 독립적으로 평가되었다. p-value가 0.05보다 큰 경우, p-value가 0.05보다 작은 경우, p-value가 0.01 보다 작은 경우, 그리고 p-value가 0.001 보다 작은 경우는 차이의 유의성에 따라 각각 #, *, **, ***로 표시하였다.
<실험예>
실험예 1. 프러시안 블루/플루로닉 나노입자의 세포 침투력 평가
세포에 대한 PB/Plu NP의 침투력을 확인하기 위하여 PB/Plu NP로 표지된 Cy5.5 형광 염료를 사용하고 24시간 후 공초점 현미경으로 세포를 관찰하였다. 그 결과, DAPI로 염색된 핵 주변에서 분홍색 형광이 검출됨에 따라 세포외 기질에서 연골세포와 활막세포 모두의 세포질로 PB/Plu NP가 효율적으로 전달되었음이 확인되었다(도 4).
실험예 2. 프러시안 블루/플루로닉 나노입자의 in vitro OA 모델에서의 치료 효능 평가
OA 발병에 대한 PB/Plu NP의 효과를 알아보기 위하여 qRT-PCR 및 western blotting에 의해 OA 관련 단백질의 발현 수준을 조사하였다. PB/Plu NP를 관절 연골 세포에 대한 퇴행성 관절염의 대표적인 전염증성 사이토카인인 인터루킨 1 베타(IL-1β)로 24시간 동안 공동 처리하였다. 그 결과, 다양한 관련 단백질 중에서 PB/Plu NP는 농도에 따라 특이적으로 COX2의 발현을 감소시켰다(도 5A 및 5B). 또한, 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 인터루킨 6(IL-6) 생산량을 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 분석에 의해 평가한 결과, PGE2 및 IL-6의 생산량이 PB/Plu NP의 농도가 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났다(도 5C 및 5D). 따라서, PB/Plu NP가 연골 세포 및 활막 세포에서 OA-염증성 단백질을 조절할 수 있음이 입증되었다.
실험예 3. 프러시안 블루/플루로닉 나노입자의 in vivo OA 모델에서의 치료 효능 평가
내측 반월상 연골(DMM) 마우스 모델의 불안정화를 사용하여 마우스에서 자발적인 인간 퇴행성 관절염을 모방하였다. 마우스의 내측 반월상 연골을 인공적으로 칼날로 절단하고 대퇴골과 경골의 연골 사이에 불안정한 반월상 연골 지지를 생성하여 이들 연골 사이에 자발적인 접촉을 유발하였다. DMM 수술 후, 마우스는 안락사될 때까지 주 1회 PB/Plu NP 또는 PBS의 무릎 당 0.1-1 mg의 관절 내 주사로 치료하였다(도 6A). 마우스 관절을 파라포름알데히드로 고정하고, 석회를 제거하고, 파라핀에 포매한 후, 조직학적 분석을 위해 5-μm 두께로 절단하였다. Safranin-O 및 Fast Green 염색 결과, PB/Plu NP의 처리가 연골의 프로테오글리칸 손실 및 침식을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다(도 6B). 활막층의 조직학적 검사 결과, PB/Plu NP의 처리가 퇴행성 관절염 상태에 따른 전형적인 염증 상태를 용량 의존적으로 완화시켰으며, 면역 조직 화학적 염색 결과 관절 연골과 활액 조직 모두에서 COX2 발현이 PB/Plu NP에 의해 감소되는 것으로 확인되었다(도 6B). 또한, 무릎 관절의 섹션을 학생들이 반복적으로 각 퇴행성 관절염 등급 기준을 사용하여 맹목적으로 점수를 매긴 결과, PB/Plu NP를 처리하는 경우 OARSI 등급 현저히 감소하는 것으로 확인되었다(도 6C)
실험예 4. 프러시안 블루/플루로닉 나노입자의 OA 진행에 있어서의 작용 메커니즘 확인
OA 진행에 대한 PB/Plu NP의 작용 메커니즘을 특성화하기 위하여 21,000개 이상의 인간 단백질을 포함하는 HuProtTM 3.1 인간 프로테옴 마이크로어레이(CDI Laboratories, USA)를 활용하여 PB/Plu NP에 직접 결합하는 단백질을 식별하였다. GST 항체는 Alexa Fluor goat-항 Rabbit 546-접합 이차 항체로 칩에서 발견된 모든 단백질을 조사하는 데 사용하였다. 각 지점에 대한 신호 대 잡음비(SNR) 값은 전경 대 배경 신호의 비율로 얻고 GST 신호 강도로 정규화하였다. 그 결과, 본 프로테옴 마이크로어레이에서 신호 대 잡음비(SNR)>1.0을 나타내는 PB/Plu NP의 직접 상호 작용 파트너로서 19개의 단백질이 확인되었다(도 7A). 상기 19개의 단백질 중에서 Mitogen-Activated Protein Kinase 8인 MAPK8을 분석 데이터에서 공통인자로 선택하였다(도 7B). MAPK8은 c-Jun N-말단 키나제 1(JNK1)로도 알려져 있으며, JNK 신호 전달 경로의 핵심 키나제이다. 그 결과, PB/Plu NP가 JNK의 인산화를 특이적으로 차단하여, c-Jun의 발현 수준을 감소시켰으며(도 7C), 또한 JNK, p-JNK 및 c-Jun의 발현 수준도 억제하는 것으로 나타났다(도 7D 및 7E). 따라서, PB/Plu NP가 OA 염증과 깊은 관련이 있는 JNK 인산화 억제에 의한 JNK 신호전달 경로를 직접 조절할 수 있음이 입증되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 c-Jun N-말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase: JNK)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 것인, 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 프러시안 블루/플루로닉 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 c-Jun N-말단 키나아제의 인산화에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 c-Jun N-말단 키나아제의 인산화에 의해 유발되는 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 건선관절염, 퇴행성관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 급성 염증 또는 만성 염증인 것을 특징으로 하는 것인, c-Jun N-말단 키나아제의 인산화에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서,
    상기 c-Jun N-말단 키나아제의 인산화에 의해 유발되는 질환은 퇴행성 관절염인 것을 특징으로 하는 것인, c-Jun N-말단 키나아제의 인산화에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20200104465A (ko) * 2019-02-26 2020-09-04 한국세라믹기술원 활성산소 제거를 위한 프러시안 블루/키토산 나노입자 복합체 및 이의 용도
US20200315980A1 (en) * 2019-04-08 2020-10-08 Gwangju Institute Of Science And Technology Drug Delivery System Comprising Nanocarrier Loaded with Urate Oxidase and Metal-Based Nanoparticle Capable of Degrading Hydrogen Peroxide and Pharmaceutical Composition Comprising the Same

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Title
Acta PharmaceuticaSinicaB2019;9(3):604-614 *
Am J Transl Res 2021;13(5):3987-4006 *

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