JP2009508468A - 細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、ビールは麦芽を主原料として糖化によって麦汁を得、この麦汁と酵母を用いて主発酵を行い、次いで若ビールを後発酵(貯酒)工程に付し、濾過、ビン詰め工程を経て製造される。このようにして製造されているビール等の醸造酒(特に色のうすいもの)は、製造されてから消費されるまでの間に濁りを生じないような、いわゆる「混濁安定性」が醸造酒の品質上きわめて重要な項目である。
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する細胞壁マンノプロテイン遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のヘイズの制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号:2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(f)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(g)配列番号:2のアミノ酸配列、あるいは配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(i)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(4)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(5)DNAである、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
(7a)以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記(7)に記載のベクター:
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向で結合した、上記(1)〜(5)に記載のポリヌクレオチド;及び
(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
(8)以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター。
(j)配列番号:4のアミノ酸配列又は配列番号:4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(k) 配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(l)配列番号:3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(10)上記(7)又は(8)に記載のベクターを導入することによって、ヘイズ生成能が低減された上記(9)に記載の酵母。
(11)上記(6)に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、ヘイズ生成能が低減された上記(10)に記載の酵母。
(12)上記(9)〜(11)のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
(13)醸造する酒類が麦芽飲料である上記(12)に記載の酒類の製造方法。
(14)醸造する酒類がワインである上記(12)に記載の酒類の製造方法。
(15)上記(12)〜(14)のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
(16a)上記(16)に記載の方法によって、ヘイズ生成能が低減された酵母を選別する方法。
(16b)上記(16a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類(例えば、ビール)を製造する方法。
(17)被検酵母を培養し、配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のヘイズ生成能を評価する方法。
(18a)被検酵母を培養して、ヘイズ生成能を測定し、目的とするヘイズ生成能の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
(19)基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、上記(18)に記載の酵母の選択方法。
(21)上記(9)〜(11)に記載の酵母および上記(18)〜(20)に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、ヘイズ生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
まず、本発明は、(a)配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び(b)配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来の細胞壁マンノプロテインをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質(細胞壁を構成するマンノプロテイン)が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個(1〜数個)、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列と約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質であるか否かは、例えば、サンプルをSDS-電気泳動により分子量的に分離し、そのサンプルに対して、コンカナバリンAというレクチンがマンノプロテインのマンノース部分を認識し、これに結合する性質を利用して、アフィノブロッティング (Faye L and Chrispeels MJ, Anal Biochem, 1985)という手法を用いることにより、検出することができる。
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(l)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質(本明細書中、単に「細胞壁マンノプロテイン」と称することもある)である。
このようなタンパク質としては、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA)を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA);及び(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子(G418r)、銅耐性遺伝子(CUP1)(Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984)、セルレニン耐性遺伝子(fas2m, PDR4)(それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991)などが利用可能である。
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類で、ヘイズ生成量が低減した酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、清酒などが挙げられる。
本発明は、配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のヘイズ生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、WO01/040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
あるいは、被検酵母を培養して、ヘイズ生成能の低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
特開2004-283169号公報に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子nonScCWP2を見出した(配列番号:1)。得られた塩基配列情報を基に、nonScCWP2全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScCWP2_for(配列番号:5)/nonScCWP2_rv(配列番号:6)を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株(「W34/70株」と略記することがある)の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScCWP2の全長遺伝子を含むDNA断片(約0.3kb)を取得した。
上記のようにして得られたnonScCWP2遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター(インビトロジェン社製)に挿入した。nonScCWP2遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69%
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(図1)、外観エキス濃度(図2)の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム(GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製)を用いて行った。nonScCWP2遺伝子の発現パターンを図3に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScCWP2遺伝子が発現していることが確認できた。
実施例1に記載のnonScCWP2/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製する。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScCWP2高発現ベクターnonScCWP2/pYCGPYNotを構築する。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製したnonScCWP2高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天)で形質転換体を選択した。
親株ならびに実施例3で得られたnonScCWP2高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 11.85%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 約 8 ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 10 g 湿酵母菌体 / 2L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(OD660)、エキス消費量の経時変化を調べた。醪中のヘイズの定量は、もろみを5,000rpm、10分の遠心をすることによって、浮遊酵母を沈殿させ、遠心上清を回収し、このサンプルを珪藻土濾過およびヘイズ測定に供した。上述したサンプルをポアサイズ50μmの金属製メッシュに乗せた珪藻土を用いて濾過した。濾過後、ヘイズを生じやすい環境にするため24時間氷水(0℃)で保持した。サンプルのヘイズをヘイズメーター(シグリスト社製、シグリスト光電計 KTL30)を用いて測定し、この値をT-haze(全混濁量)とした。また、28℃で冷凝固物を可溶化して測定した値をP-Haze(永続混濁量)、T-HazeとP-Hazeの差分を冷凝固物によるHaze値、C-Haze(冷凝固物混濁量)とした。単位はHelmを用いて表現できる(1 Helm=0.1 FTU(Formazin Turbidity Unit))(文献;P. W. Galesら:J. Am. Soc. Brew. Chem. 58, 101-107 (2000))。得られた結果を表1に示す。
なお、この実施例で得られた結果を、図4及び図5にも示す。図4は、この実施例のビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。図5は、この実施例のビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度(w/w%)を示している。
ScCWP2全長遺伝子を増幅するためのプライマーScCWP2_for(配列番号:7)/ScCWP2_rv(配列番号:8)を設計し、S. cerevisiae X2180-1Aの染色体DNAを鋳型としたPCRによってScCWP2の全長遺伝子を含むDNA断片(約0.3kb)を取得した。
上記のようにして得られたScCWP2遺伝子断片を、それぞれTAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター(インビトロジェン社製)に挿入した。ScCWP2遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69%
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(図4)、外観エキス濃度(図5)の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム(GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製)を用いて行った。ScCWP2遺伝子の発現パターンを図6に示す。この結果より、通常のビール発酵においてScCWP2遺伝子が発現していることが確認できた。
実施例5に記載のプラスミドTOPO/ScCWP2から、制限酵素XhoIおよびBamHI処理によってScCWP2遺伝子を含む約0.7 kbのDNA断片を調製した。これを制限酵素XhoIおよびBamHI処理したpUP3GLP2に連結させ、ScCWP2高発現ベクターpUP-ScCWP2を構築した。酵母発現ベクターpUP3GLP2は、相同組換え部位としてオロチジン5リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子URA3を含むYIp型(染色体組み込み型)ベクターであり、導入された遺伝子はグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子TDH3のプロモーター/ターミネーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとして、ガラクトキナーゼ遺伝子GAL1のプロモーター/ターミネーターの制御下に薬剤耐性遺伝子YAP1が組み込まれており、ガラクトースを含む培地で発現が誘導される。また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製したnonScCWP2高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でWeihenstephan Nr.164株を形質転換した。セルレニン1.0mg/Lを含むYPGal平板培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%ガラクトース、2%寒天)でセルレニン耐性株を選択した。
親株ならびに実施例7で得られたScCWP2高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 11.85%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 約 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 10 g 湿酵母菌体 / 2L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量(OD660)、エキス消費量の経時変化を調べた。醪中のヘイズの定量は、もろみを5,000rpm、10分の遠心をすることによって、浮遊酵母を沈殿させ、遠心上清を回収し、このサンプルを珪藻土濾過およびヘイズ測定に供した。上述したサンプルをポアサイズ50μmの金属製メッシュに乗せた珪藻土を用いて濾過した。濾過後、ヘイズを生じやすい環境にするため24時間氷水(0℃)で保持した。サンプルのヘイズをヘイズメーター(シグリスト社製、シグリスト光電計 KTL30)を用いて測定し、この値をT-haze(全混濁量)とした。また、28℃で冷凝固物を可溶化して測定した値をP-Haze(永続混濁量)、T-HazeとP-Hazeの差分を冷凝固物によるHaze値、C-Haze(冷凝固物混濁量)とした。単位はHelmを用いて表現できる(1 Helm=0.1 FTU(Formazin Turbidity Unit))(文献;P. W. Galesら:J. Am. Soc. Brew. Chem. 58, 101-107 (2000))。得られた結果を表2に示す。
また、この実施例で得られた結果を図7及び図8にも示す。図7は、この実施例のビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。図8は、この実施例のビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度(w/w%)を示している。
[配列番号:6] プライマー
[配列番号:7] プライマー
[配列番号:8] プライマー
Claims (21)
- 以下の(a)〜(f) からなる群から選択される記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(d) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(f)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 以下の(g)〜(i) からなる群から選択される請求項1に記載のポリヌクレオチド:
(g)配列番号:2のアミノ酸配列、あるいは配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(i)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 配列番号:1又の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター。
(j)配列番号:4のアミノ酸配列又は配列番号:4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(k) 配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(l)配列番号:3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 請求項7又は8に記載のベクターが導入された酵母。
- 請求項7又は8に記載のベクターを導入することによって、ヘイズ生成能が低減された請求項9に記載の酵母。
- 請求項6に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、ヘイズ生成能が低減された請求項10に記載の酵母。
- 請求項9〜11のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
- 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項12に記載の酒類の製造方法。
- 醸造する酒類がワインである請求項12に記載の酒類の製造方法。
- 請求項12〜14のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
- 配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のヘイズ生成能について評価する方法。
- 被検酵母を培養し、配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のヘイズ生成能を評価する方法。
- 被検酵母を培養し、請求項6に記載のタンパク質を定量または配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするヘイズ生成能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1又は配列番号:3の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、請求項18に記載の酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項6に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項18に記載の酵母の選択方法。
- 請求項9〜11に記載の酵母および請求項18〜20に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、ヘイズ生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
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