KR20080052556A - 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자 및 이의 용도

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KR20080052556A

Publication number: KR20080052556A
Application number: KR1020087002758A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가; 후미히코 오무라
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 2005-09-22
Filing date: 2006-09-21
Publication date: 2008-06-11
Also published as: CN1936006B; AU2006292992A1; US20090274794A1; EP1926745A1; CA2621328A1; JP4954203B2; AU2006292992B2; JP2009508468A; WO2007034986A1; CN1936006A

본 발명은 헤이즈 (haze) 수준을 저감시키는 능력을 가진 알콜성 음료를 제조하는 양조 효모, 상기와 같은 효모를 이용하여 제조된 알콜성 음료, 및 그러한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 양조 효모에서 세포벽 만노단백질 Cwp2p 를 인코딩하는 ScCWP2 유전자 또는 맥주 효모에 특유한 비(非)-ScCWP2 유전자의 발현 수준을 증가시켜 제품에서의 헤이즈의 수준을 저감시킬 수 있는 효모, 및 상기와 같은 효모를 이용하여 알콜성 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

양조 효모, 알콜성 음료, 헤이즈, 세포벽 만노단백질

세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자 및 이의 용도 {GENE ENCODING CELL WALL MANNOPROTEIN AND USE THEREOF}

본 발명은 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 헤이즈 (haze) 수준을 저감시키는 능력을 가진 알콜성 음료, 상기와 같은 효모를 이용하여 제조된 알콜성 음료, 및 그러한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 양조 효모에서 세포벽 만노단백질 Cwp2p 를 인코딩하는 ScCWP2 유전자 또는 맥주 효모에 특유한 비(非)-ScCWP2 유전자의 발현 수준을 증가시켜 제품에서의 헤이즈의 수준을 저감시킬 수 있는 효모, 및 상기와 같은 효모를 이용하여 알콜성 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

술에는, 예를 들어, 출발 물질로서 당분 및 전분 물질을 사용하여, 효모 등을 이용한 알콜 발효에 의해 만들어진 양조주, 예컨대 와인, 맥주, 사케 (sake) 등이 포함된다.

예를 들어, 맥주는 주요 물질로서 맥아를 이용한 당화에 의해 맥아즙을 수득하고, 상기 맥아즙을 효모를 이용한 주 발효에 적용하고, 발효된 맥아즙을 후 발효 (숙성) 에 적용한 후 여과 및 병에 채움으로써 제조된다. 발효에 의해 만들어 진 알콜성 음료 (특히 담색 음료), 예컨대 이렇게 제조된 맥주에 있어서, 생산에서부터 소비까지의 기간 중에 혼탁이 없거나 또는 알콜성 음료가 혼탁에 대해 안정한 품질이 매우 중요하게 요구된다.

맥주의 혼탁의 원인은 크게 생물학적 혼탁 및 비(非)-생물학적 혼탁으로 나뉜다. 생물학적 혼탁은 미생물에 의한 오염이 원인이다. 비(非)-생물학적 혼탁은 맥주 자체의 성분의 변성, 예를 들어 집합적으로 단백질 성분 및 폴리페놀의 결합에 의해 형성된 헤이즈-형성 단백질로 지칭되는 단백질 성분들의 형성 때문인 것으로 여겨진다(K. Asano 등, ASBC Journal, 40:147-154, 1982; J. A. Delcour 등, MBAA Technical Quarterly, 25:62-66, 1988). 흔히 형성되는 혼탁은 비(非)-생물학적 혼탁이다. 비(非)-생물학적 혼탁의 원인 물질 및 기작이 아직 해명되지 않았지만, 최근에는, 맥아, 홉 (hop) 에서 유래한 단백질 성분 및 폴리페놀이 효모에서 생긴 세포벽 성분 (만노단백질 등) 에 결합하여 점진적으로 커다란 입자를 형성하는 것으로 추측되었다.

최근, 효모로부터의 만노단백질의 박리 정도 및 헤이즈 수준 간의 관계가 밝혀졌다(F. Omura 등, 30^th EBC Congress, SUMMARIES PRESENTATION, 19, 2005). Cwp2p 는 세포벽을 구성하는 주요 만노단백질 중 하나로서, 세포벽의 안정화 및 낮은 pH 에서의 저항성에 기여한다(M Skrzypek 등, Curr Genet, 38, 191-201, 2000).

상기에서 주목한 바와 같이, 비(非)-생물학적 혼탁의 원인 물질 및 비(非)-생물학적 혼탁의 형성 기작이 아직 해명되지 않았지만, 이러한 비(非)-생물학적 혼탁을 저감시키는 것이 발효된 알콜성 음료의 품질 조절에 있어서 시급하게 요구되어 왔다.

본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위해 예의 연구하였고, 그 결과, 라거 양조 효모로부터 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자를 동정 및 분리하는데 성공하였다. 게다가, 상기 수득한 유전자를 도입하여 발현시킨 형질전환된 효모를 제조하여 헤이즈 생성량이 저감된 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 라거 양조 효모에 특이적으로 존재하는 세포벽 만노단백질, 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, 상기 유전자의 발현이 조절되는 형질전환된 효모, 상기 유전자의 발현이 조절되는 효모를 이용하여 제품에서 헤이즈의 양을 조절하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 효모, 상기 형질전환된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질로서 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 가진 단백질로서 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(2) 상기 (1) 에 있어서 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질이 세포벽 만노단백질로서 기능하는 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이고 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(3) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 1 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(4) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 2 로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.

(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(7a) 상기 (7) 에 있어서, 하기 성분들을 포함한 발현 카세트를 포함한 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 상기 프로모터에 센스 (sense) 방향으로 연결된, 상기 (1) 내지 (5) 에 기재된 폴리뉴클레오티드; 및

(z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대하여 효모에서 작용할 수 있는 신호.

(8) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터:

(j) 서열번호: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질이 세포벽 만노단백질로서 기능하는 폴리뉴클레오티드;

(k) 서열번호: 4 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이고 및 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(l) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 3 에 혼성화하거나 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고, 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(9) 상기 (7) 또는 (8) 의 벡터가 도입된 효모.

(10) 상기 (9) 에 있어서, 상기 (7) 또는 (8) 의 벡터를 도입함에 의해 헤이즈-생성 능력이 감소된 효모.

(11) 상기 (10) 에 있어서, 상기 (6) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 헤이즈-생성 능력이 감소된 효모.

(12) 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나의 효모를 이용함에 의한 주류의 제조 방법.

(13) 상기 (12) 에 있어서, 양조주가 맥아주 (malt liquor) 인 주류의 제조 방법.

(14) 상기 (12) 에 있어서, 양조주가 와인인 주류의 제조 방법.

(15) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 주류.

(16) 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 헤이즈-생성 능력 평가 방법.

(16a) 상기 (16) 에 기재된 방법을 사용함으로써 헤이즈-생성 능력이 낮은 효모를 선별하는 방법.

(16b) 상기 (16a) 에 기재된 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 주류 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(17) 하기를 포함하는 시험 효모의 헤이즈-생성 능력 평가 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함.

(18) 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 상기 (6) 의 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 헤이즈-생성 능력에 따른 상기 단백질 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.

(18a) 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 헤이즈-생성 능력을 측정함; 및 표적 헤이즈-생성 능력을 가진 시험 효모를 선별함.

(19) 상기 (18) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 참조 효모에 비해 상기 유전자가 더 많이 발현된 시험 효모를 선별함.

(20) 상기 (18) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (6) 의 단백질을 정량함; 및 참조 효모에 비해 상기 단백질을 더 많은 양으로 가진 시험 효모를 선별함. 즉, 상기 (18) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 복수의 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (6) 의 단백질을 정량함; 및 이들로부터 많은 양의 상기 단백질을 가진 시험 효모를 선별함.

(21) 하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 따른 효모 또는 상기 (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 방법으로 선별된 효모를 이용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 헤이즈의 생성량을 조절함.

상기 형질전환된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법에 따르면, 효모의 세포벽 구조가 안정화될 수 있으므로, 맥주 발효 및 완성된 제품에서 헤이즈 수준이 저하될 수 있는 알콜성 음료를 제조하는 것이 가능하다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 실시예 2 에서의 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 실시예 2 에서의 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 당 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 3 은 실시예 2 에서의 맥주 발효 시험 시의 효모 내의 비(非)-ScCWP2 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 검출된 신호의 강도를 나타낸다.

도 4 는 상기 실시예에서의 발효 시험 시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 5 는 상기 실시예에서의 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 당 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 6 은 실시예 6 에서의 맥주 발효 시험 시의 효모에서의 ScCWP2 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 검출된 신호의 강도를 나타낸다.

도 7 은 상기 실시예에서의 발효 시험 시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 8 은 상기 실시예에서의 맥주 발효 시험 시의 시간에 따른 당 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

발명의 실시를 위한 최선의 양식

본 발명자들은 효모의 세포벽 만노단백질을 증가시킴으로써 효모의 세포벽을 안정화하는 것이 가능하다는 생각을 품었다. 본 발명자들은 상기 개념에 기초하여 연구한 결과, 일본특허출원 공개공보 제 2004-283169 호에 개시된 방법에 따라 맵핑 (mapping) 된 라거 양조 효모 게놈 정보에 기초하여 라거 양조 효모에 유일한 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 비(非)-ScCWP2 유전자를 분리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호: 1 및 서열번호: 2 로 표시된다. 본 발명자들은 일본특허출원 공개공보 제 2004-283169 호에 개시된 방법에 따라 맵핑된 라거 양조 효모 게놈 정보에 기초하여 라거 양조 효모에 유일한 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 ScCWP2 유전자를 분리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호: 3 및 서열번호: 4 로 표시된다. ScCWP2 의 서열 정보는 S. 세레비지애의 게놈 데이터베이스로부터 수득할 수 있다(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/).

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

먼저, 본 발명은 (a) 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호:2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 대상 폴리뉴클레오티드는 라거 양조 효모로부터 유래한 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 한정되지 않으며, 이에는 상기 단백질에 대한 등가의 기능을 가진 단백질을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 등가의 기능을 가진 단백질로서는, 예를 들어, (c) 서열번호:2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가지며 세포벽 만노단백질 (세포벽을 구성하는 만노단백질) 로서 기능하는 단백질을 들 수 있다.

이러한 단백질로서는, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서, 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내지 수 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어지며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질이 포함된다. 일반적으로, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수가 더 적은 것이 바람직하다. 또한, 이러한 단백질에는, (d) 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열과의 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열을 가지며, 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질이 포함된다. 일반적으로, 백분율 일치성이 더 높은 것이 바람직하다.

특정 단백질이 세포벽 만노단백질로서 기능하는지 아닌지는, 예를 들어, 시료를 SDS 전기영동에 의해 분자량에 따라 분리하고, 상기 시료로부터 분리된 단백질을 렉틴 (lectine, 만노단백질의 만노오스 부위를 인식하여 그에 결합하는 콘카나발린 A) 을 이용하는 친화블럿팅 (affinoblotting) 검출로 불리는 기술에 적용하여 판단할 수 있다(Faye L 및 Chrispeels MJ, Anal Biochem, 1985).

나아가, 본 발명은 또한 (e) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (f) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 염두에 둔다.

여기서, "엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드"란, 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 (southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1987-1997] 에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

혼성화를 위해 시판중인 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 를 사용할 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 탐침자와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후, 막을 0.1% (w/v) SDS 가 함유된 55℃ 의 1차 세정 완충액으로 세정하여, 혼성화된, DNA 등의 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드에는, 기본 매개변수를 사용한 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 검색 소프트웨어로 산출한 바, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열들 간의 일치성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용하여 결정할 수 있다(Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc . Natl Acad . Sci . USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘에 기초한 BLASTN 및 BLASTX 로 불리는 프로그램들이 개발되었다(Altschul SF 등, J. Mol . Biol . 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열을 BLASTN 을 사용하여 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 100 및 단어 길이 = 12 이다. 아미노산 서열을 BLASTX 로 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 50 및 단어 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램에 대한 기본 매개변수가 이용된다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (l) 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 포함하며, 세포벽 만노단백질로서 기능한다(이는 본원에서 단순히 "세포벽 만노단백질"로 지칭될 수 있음).

이러한 단백질에는, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 상기 언급한 수의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가지며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 것들이 포함된다. 또한, 이러한 단백질에는, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에 대해 상기 기재된 바와 같은 상동성을 가지며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 것들이 포함된다.

이러한 단백질은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Nuc . Acids . Res ., 10: 6487 (1982), Proc . Natl. Acad . Sci . USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc . Acids . Res ., 13: 4431 (1985), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 488 (1985)] 에 기재된, 위치지정 돌연변이를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는 상기 동일 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 것을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 중 2 개 이상의 유형이 동시에 일어날 수도 있다.

이하에, 상호 치환가능한 아미노산 잔기의 예를 열거한다. 동일한 그룹 내의 아미노산 잔기는 상호 치환가능하다. 이하 상기 그룹들을 제시한다.

그룹 A: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; 그룹 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 (2-aminosuberic acid); 그룹 C: 아스파라긴, 글루타민; 그룹 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; 그룹 E: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; 그룹 F: 세린, 트레오닌, 호모세린; 및 그룹 G: 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학적 합성 방법으로 제조할 수도 있다. 또한, 예를 들어, Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp. 로부터 구매가능한 펩티드 합성기를 또한 화학적 합성에 사용할 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 효모

이어서 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (l) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것이 포함된 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 하기가 성분으로서 포함된 발현 카세트를 포함한다: (x) 효모 세포에서 전사할 수 있는 프로모터; (y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (a) 내지 (l) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 (z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 관하여 상기 효모에서 기능하는 신호.

효모에 도입된 벡터는 다중복제(multicopy)형 (YEp 형), 단일복제형 (YCp 형), 또는 염색체 통합형 (YIp 형) 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, EXPERIMENTAL MAMPULATION OF GENE EXPRESSION, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 형 벡터로 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 는 YCp 형 벡터로 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 형 벡터로 알려져 있고, 이들 모두 용이하게 입수가능하다.

효모에서 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 이들이 양조 효모에서 기능하며, 발효액 중의 구성성분에 의해 영향받지 않는 한 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데히드류 3-포스페이트 탈수소효소 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 유전자들은, 예를 들어, 문헌 [M. F. Tuite 등, EMBO J., 1, 603 (1982)] 에 상세히 기재된 바와 같이 사전에 클로닝된 것이며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 수득가능하다.

영양요구성 마커는 양조 효모에 대한 형질전환시 선별 마커로 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네티신(geneticin)-저항성 유전자 (G418r), 구리-저항성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌(cerulenin)-저항성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각, Junji Inokoshi 등, Biochemistiy, 64, 660, 1992; 및 Hussain 등, Gene, 101 : 149, 1991) 가 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예로서는, 양조하는데 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인 및 사케용 양조 효모를 들 수 있다. 구체적으로, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속(屬)과 같은 효모를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70, 사 카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453 또는 NCYC456, 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 를 사용할 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 NCYC90 와 같은 위스키 효모, 일본양조협회 (Brewing Society of Japan) 로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있으나 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법으로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 전기천공 방법 (Meth . Enzym ., 194: 182 (1990)), 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 (Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 75: 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)), 및 문헌 [Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기재된 방법을 들 수 있다.

더욱 구체적으로, 숙주 효모를 표준 효모 영양 배지 (예컨대, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 에서 OD600 nm 가 1 내지 6 이 되도록 배양한다. 상기 배양 효모를 원심분리로 수집하고, 세정한 후, 약 1 내지 2 M 의 농도의 알칼리 이온 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 예비-처리한다. 상기 세포를 약 30℃에서 약 60 분간 방치되도록 한 후, 도입시킬 DNA (약 1 내지 20 ㎍) 와 함께 약 30℃에서 약 60 분간을 더 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 최종 농도가 약 20% 내지 50% 가 되도록 첨가한다. 약 30℃에서 약 30 분간 방치한 후, 상기 세포를 약 42℃에서 약 5 분간 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁물을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 소정의 양의 새로운 표준 효모 영양 배지에 첨가한 후, 약 30℃에서 약 60 분간 방치한다. 그 후, 이를 항생물질 등이 선별 마커로서 함유된 표준 한천 배지에 시딩 (seeding) 하여 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판], 및 문헌 [METHODS IN YEAST GENETICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾아볼 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알콜성 음료의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 알콜성 음료

상기 기재된 본 발명의 벡터를 표적 알콜성 제품을 양조하기에 적합한 효모 내로 도입한다. 상기 효모를 사용하여 헤이즈의 양이 저하된 목적하는 알콜성 음료를 제조할 수 있다. 또한, 후술되는 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 선별되는 효모를 또한 사용할 수 있다. 표적 알콜성 음료에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 맥주, 맥주맛 음료와 같은 유탄산 (sparkling) 술 (happoushu), 와인, 사케 등이 포함된다.

이들 알콜성 음료를 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 양조 효모를 모 균주 (모 균주) 대신 사용하는 것을 제외하고는 공지의 기술을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장비, 제조 관리 등이 종래의 것과 정확히 동일할 수 있으므로, 헤이즈의 양이 저하된 알콜성 음료의 제조 비용을 증가시킬 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 기존의 설비를 사용하여 비용 증가 없이 혼탁의 안정성 등이 우수한 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여 시험 효모의 헤이즈-생성 능력을 평가하는 방법에 관한 것이다. 이러한 평가 방법을 위한 일반적인 기술은 공지되어 있으며, 예를 들어, WO01/040514, 일본 공개 특허 출원 제 8-205900 호 등에 기재되어 있다. 상기 평가 방법은 하기 기술된다.

먼저, 시험 효모의 게놈을 준비한다. 상기 준비를 위해, Hereford 방법 또는 포타슘 아세테이트 방법과 같은 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다(예컨대, METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여, 상기 수득한 시험 효모 게놈에서 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재 여부를 결정한다. 상기 프라이머 또는 탐침자는 공지의 기술에 따라 설계될 수 있다.

상기 유전자 또는 상기 특이적 서열의 검출은 공지의 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 특이적 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로 사용하고, 상기 서열의 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 또 다른 프라이머로 사용하여 PCR 방법으로 상기 효모의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 산물의 존재 여부 및 상기 증폭된 산물의 분자량을 결정한다. 프라이머에 사용된 폴리뉴클레오티드의 염기의 수는 일반적으로 10 염기쌍 (bp) 이상, 및 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 상기 프라이머들 사이의 염기의 수는 적당하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 의 반응 조건으로는 특별한 제한이 없으나, 예를 들어, 변성 온도는 90 내지 95 ℃, 어닐링 (annealing) 온도는 40 내지 60℃, 신장 온도는 60 내지 75℃, 및 사이클 횟수는 10 이상일 수 있다. 결과적으로 생성된 반응 산물을, 예를 들어, 아가로오스 겔을 이용한 전기영동으로 분리하여, 증폭된 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 상기 방법은, 증폭된 산물의 분자량이 상기 특정 부분의 DNA 분자를 포함하는 크기인지의 여부로 결정되는 효모의 헤이즈 생성 능력의 예측 및 평가를 가능하게 한다. 또한, 증폭된 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 상기 능력을 더욱 정확히 예측 및/또는 평가할 수 있다.

나아가, 본 발명에서는, 시험 효모를 배양하여 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 시험 효모의 헤이즈-생성 능력을 평가한다. 상기 유전자의 발현 수준을 측정함에 있어서, 상기 시험 효모를 배양한 후, 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자로부터 생성된 mRNA 또는 단백질을 정량한다. mRNA 또는 단백질의 정량은 공지의 기술을 이용함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 (Northern) 혼성화 또는 정량적 RT-PCR 로 정량할 수 있고, 단백질은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅 (Western blotting) 으로 정량할 수 있다(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003). 시험 효모에서의 상기 유전자의 발현 수준은 시험 효모를 배양할 때 수득되는 발효주 내에서의 헤이즈의 함량을 측정함으로써 예측할 수 있다.

또한, 시험 효모를 배양하고, 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 표적 헤이즈 생성 능력에 따른 유전자 발현 수준을 가진 시험 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 유리한 효모를 선별한다. 또한, 참조 효모 및 시험 효모를 배양하여 각 효모에서의 상기 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교하여, 유리한 시험 효모를 선별할 수도 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들어, 참조 효모 및 하나 이상의 시험 효모를 배양하고, 각 효모에서 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정한다. 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 많이 발현되는 시험 효모를 선별함으로써, 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

다르게는, 시험 효모를 배양하고, 헤이즈 생성 능력이 더 낮은 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

이들 경우에, 시험 효모 또는 참조 효모는, 예를 들어, 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 증가된 효모, 본 발명의 단백질의 발현이 증가된 효모, 인공적으로 변이유발된 효모 또는 자연적으로 변이유발된 효모일 수 있다. 헤이즈 생성 능력은, 예를 들어, 문헌 [P. W. Gales 등：J. Am. Soc. Brew. Chem. 58, 101-107 (2000)] 에 기재된 방법으로 측정가능하다. 돌연변이 처리는, 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약품으로의 처리와 관련된 화학적 방법을 비롯한 임의의 방법을 이용할 수 있다(예컨대, 하기 참조: Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP).

또한, 참조 효모 또는 시험 효모로 사용된 효모의 예로서는, 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 사케 등을 위한 양조 효모를 들 수 있다. 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 속과 같은 효모를 사용할 수 있다(예컨대, S. 파스토리아누스, S. 세레비지애 및 S. 칼스버겐시스). 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70; 사카로마이세스 칼스버겐시스 NCYC453 또는 NCYC456; 또는 사카로마이세스 세레비지애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 를 사용할 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 NCY90 과 같은 위스키 효모, 일본양조협회로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모; 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 참조 효모 및 시험 효모는 상기 효모들로부터 임의 조합으로 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세히 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 후술되는 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1: 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자 (비(非)- ScCWP2 ) 의 클로닝

라거 양조 효모로부터의 특이적인 신규한 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자 (비(非)-ScCWP2) (서열번호: 1) 는 일본특허출원 공개공보 제 2004-283169 에 기재된 비교 데이터베이스를 이용한 검색의 결과로서 발견되었다. 획득한 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 프라이머들인 비(非)-ScCWP2_for (서열번호: 5) 및 비(非)-ScCWP2_rv (서열번호: 6) 를 비(非)-ScCWP2 전장 (full-length) 유전자들을 증폭하도록 설계하였다. 게놈 서열분석 균주인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 균주 (이는 "W34/70 균주"로 약기될 수 있음) 의 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하여, 비(非)-ScMET17 의 전장 유전자가 포함된 DNA 절편 (약 0.3 kb) 을 수득하였다.

이렇게 수득한 비(非)-ScCWP2 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 삽입하였다. 비(非)-ScCWP2 유전자의 뉴클레오티드 서열들을 Sanger 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 에 따라 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2: 맥주 발효 동안의 비(非)- ScCWP2 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan W34/70 균주를 사용하여 맥주 발효 시험을 수행한 후, 발효 동안 효모 세포로부터 추출한 mRNA 를 DNA 마이크로어레이로 분석하였다.

맥아즙 (wort) 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입율 (pitching rate) 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

발효주를 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장 양 (도 1) 및 겉보기 추출물 농도 (도 2) 의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포의 표본추출을 수행하고, 준비된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 이를 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 제조) 을 사용하여 신호를 검출하였다. 비(非)-ScCWP2 유전자의 발현 패턴은 도 3 에 나타나 있다. 그 결과, 일반적인 맥주 발효에서 비(非)-ScCWP2 유전자가 발현된다는 것이 확인되었다.

실시예 3: 비(非)- ScCWP2 유전자의 고도 발현

실시예 1 에 기재된 비(非)-ScCWP2/pCR2.1-TOPO 를 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 절단하여, 그의 단백질-인코딩 영역의 전체 길이를 포함한 DNA 절편을 제조하였다. 상기 절편을 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 처리된 pYCGPYNot 에 결찰하여, 비(非)-ScCWP2 고도 발현 벡터 비(非)-ScCWP2/pYCGPYNot 를 구축하였다. pYCGPYNot 는 YCp-형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 피루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고도 발현된다. 상기 효모에는 제네티신-저항성 유전자 G418^r 이 선별 마커로 포함되고, 대장균 (Escherichia coli) 에는 선별 마커로서 암피실린-저항성 유전자 Amp^r 가 포함된다.

상기 방법으로 제조된 비(非)-ScCWP2 고도 발현 벡터를 사용하여, 상기 균주 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephaner 34/70 을 일본특허출원 공개공보 제 H07-303475 호에 기재된 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 제네티신 300 mg/L 이 함유된 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 포도당 및 2% 한천) 에서 선별하였다.

실시예 4: 맥주 시험 양조에서 생성된 헤이즈의 양 분석

모 균주 및 실시예 3 에서 수득한 비(非)-ScCWP2 고도 발현 균주를 사용하여 하기 조건 하에서 발효 시험을 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도 11.85 %

맥아즙 함량 2 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 대략 8 ppm

발효 온도 15 ℃ (고정)

효모 주입율 맥아즙 2L 당 젖은 효모 세포 10 g

상기 발효액을 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장 속도에서 시간에 따른 변화 (OD660) 및 소비된 추출물의 양을 측정하였다. 상기 액에서의 헤이즈의 정량적 측정을 위해, 상기 액을 5,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 부유 효모를 침전시키고, 상청액을 회수하여 규조토로 여과하고, 여과액을 헤이즈 측정에 사용하였다. 공경이 50 μm 인 금속 메쉬 (metal mesh) 상에 놓인 규조토를 사용하여 상기 기술한 시료를 여과하였다. 여과 후, 헤이즈의 출현을 용이하게 하기 위해 여과액을 얼음-물 (0℃) 상에 24 시간 동안 유지시켰다. 탁도계 (haze meter) (상표명: Siglist 광전비색계 (electrophotometer), Siglist Co. 제조) 를 사용하여 상기 시료의 헤이즈 수준을 측정하고, 측정된 값을 T-헤이즈 (총 탁도) 로 사용하였다. 냉각된 응고제를 28℃ 에서 가용화하여 측정한 값을 P-헤이즈 (영구 탁도) 로 사용하고, T-헤이즈 및 P-헤이즈 간의 차를 상기 냉각된 응고제에 의한 헤이즈 값, 또는 C-헤이즈 (냉각된 응고제에 의한 탁도) 로 사용하였다. 상기 헤이즈 값은 Helm 단위로 표현된다(1 Helm = 0.1 FTU (Formazin Turbidity Unit; Formazin 탁도 단위): 문헌; P. W. Gales 등, J. Am. Soc. Brew. Chem., 58, 101-107, 2000). 수득한 결과를 표 1 에 나타내었다.

표 1 로부터, 발효 완료시 생성된 T-헤이즈의 양이 모 균주에 있어서는 64 Helm 인 반면, 비(非)ScCWP2 고도 발현 균주에 있어서는 41 Helm 이었다. P-헤이즈의 양은, 모 균주에 있어서는 46 Helm 이었고, 비(非)ScCWP2 고도 발현 균주에 있어서는 31 Helm 이었다. C-헤이즈의 양은, 모 균주에 있어서는 18 Helm 인 반면, 비(非)ScCWP2 고도 발현 균주에 있어서는 10 Helm 이었다. 상기 결과로부터, 헤이즈의 생성량이 비(非)-ScCWP2 유전자의 고도 발현에 의해 약 34-45% 감소된 것이 명백하다.

또한, 실시예들에서 수득한 결과를 도 4 및 5 에 나타내었다. 도 4 는 본 실시예에서의 발효 시험 시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다. 도 5 는 본 실시예에서의 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 당 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

실시예 5: 세포벽 만노단백질 -인코딩 유전자 ( ScCWP2 ) 의 클로닝

프라이머들인 ScCWP2_for (서열번호: 7) 및 ScCWP2_rv (서열번호: 8) 를 ScCWP2 전장 유전자들을 증폭하도록 설계하였다. S. 세레비지애 X2180-1A 의 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하여, ScCWP2 의 전장 유전자가 포함된 DNA 절편들 (약 0.3 kb) 을 수득하였다.

이렇게 수득한 ScCWP2 유전자 절편들을 TA 클로닝에 의해 각각 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 삽입하였다. ScCWP2 유전자의 뉴클레오티드 서열들을 Sanger 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 에 따라 분석하여, 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 6: 맥주 발효 동안의 ScCWP2 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70 균주를 사용하여 발효 시험을 수행한 후, 발효 동안 효모 세포로부터 추출한 mRNA 를 DNA 마이크로어레이로 분석하였다.

맥아즙 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입율 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

발효주를 시간에 따라 표본추출하고, 세포 성장 양 (도 4) 및 겉보기 추출물 농도 (도 5) 의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 표본추출하여 mRNA 를 준비하고, 준비된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 이를 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co 제조) 을 사용하여 신호를 검출하였다. ScCWP2 유전자의 발현 패턴은 도 6 에 나타나 있다. 그 결과, 일반적인 맥주 발효에서 ScCWP2 유전자가 발현된다는 것이 확인되었다.

실시예 7: ScCWP2 -고도 발현 유전자의 제조

실시예 5 에 기재된 플라스미드 TOPO/ScCWP2 를 제한효소들인 XhoI 및 BamHI 로 절단하여 ScCWP2 유전자가 포함된 약 0.7 kb 의 DNA 절편을 제조하였다. 상기 절편을 제한효소들인 XhoI 및 BamHI 로 처리한 pUP3GLP2 에 연결하여, ScCWP2 고도 발현 벡터인 pUP-ScCWP2 를 구축하였다. 효모 발현 벡터인 pUP3GLP2 는 상동성 재조합 부위로서 오로티딘-5'-인산 탈탄산효소 유전자 URA3 을 갖는 YIp 형 (염색체 통합형) 벡터이다. 상기 삽입된 유전자는 글리세르알데히드-3'-인산 탈수소효소 유전자인 TDH3 의 프로모터/종결자에 의해 고도 발현된다. 갈락토키나아제 유전자 GAL1 의 프로모터/종결자의 제어 하에 효모에서의 선별 마커로서 약물-저항성 유전자 YAP1 을 도입시키고, 갈락토오스가 함유된 배지에서 발현을 유도한다. 대장균에서의 선별 마커로서 암피실린-저항성 유전자 Amp^r 이 포함된다.

상기 방법으로 제조된 비(非)ScCWP2 고도 발현 벡터를 사용하여, 일본특허출원 공개공보 제 H7-303475 호에 기재된 방법에 의해 균주 Weihenstephan Nr . 164 를 형질전환시켰다. 1.0 mg/L 세룰레닌이 함유된 YPGal 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 갈락토오스, 2% 한천) 에서 세룰레닌-저항성 균주를 선별하였다.

실시예 8: 맥주 양조 시험에서 생성된 헤이즈의 양 분석

모 균주 및 실시예 7 에서 수득한 ScCWP2-고도 발현 균주를 사용하여 하기 조건 하에서 발효 시험을 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도 11.85 %

맥아즙 함량 2 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 대략 8 ppm

발효 온도 15 ℃ (고정)

효모 주입율 맥아즙 2L 당 젖은 효모 세포 10 g

상기 발효액을 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장 속도에서 시간에 따른 변화 (OD660) 및 소비된 추출물의 양을 측정하였다. 상기 액에서의 헤이즈의 정량적 측정을 위해, 상기 액을 5,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 부유 효모를 침전시키고, 상청액을 회수하여 규조토로 여과하고, 여과액을 헤이즈 측정에 사용하였다. 공경이 50 μm 인 금속 메쉬 상에 놓인 규조토를 사용하여 상기 기술한 시료를 여과하였다. 여과 후, 헤이즈의 출현을 용이하게 하기 위해 여과액을 얼음-물 (0℃) 상에 24 시간 동안 유지시켰다. 탁도계 (상표명: Siglist 광전비색계, Siglist Co. 제조) 를 사용하여 상기 시료의 헤이즈 수준을 측정하고, 측정된 값을 T-헤이즈 (총 탁도) 로 사용하였다. 냉각된 응고제를 28℃ 에서 가용화하여 측정한 값을 P-헤이즈 (영구 탁도) 로 사용하고, T-헤이즈 및 P-헤이즈 간의 차를 상기 냉각된 응고제에 의한 헤이즈 값, 또는 C-헤이즈 (냉각된 응고제에 의한 탁도) 로 사용하였다. 상기 헤이즈 값은 Helm 단위로 표현된다(1 Helm = 0.1 FTU (Formazin Turbidity Unit; Formazin 탁도 단위): 문헌; P. W. Gales 등, J. Am. Soc. Brew. Chem., 58, 101-107, 2000). 수득한 결과를 표 2 에 나타내었다.

표 2 로부터, 발효 완료시 생성된 T-헤이즈의 양이 모 균주에 있어서는 33 Helm 인 반면, ScCWP2 고도 발현 균주에 있어서는 24 Helm 이었다. P-헤이즈의 양은, 모 균주에 있어서는 23 Helm 이었고, ScCWP2 고도 발현 균주에 있어서는 18 Helm 이었다. C-헤이즈의 양은, 모 균주에 있어서는 10 Helm 인 반면, ScCWP2 고도 발현 균주에 있어서는 7 Helm 이었다. 상기 결과로부터, 헤이즈의 생성량이 ScCWP2 유전자의 고도 발현에 의해 약 22-33% 감소된 것이 명백하였다. 증식 속도 및 맥아 추출물 소비 속도에 있어서는 모 균주 및 형질전환된 균주 간에 실질적 차이가 관찰되지 않았다.

또한, 실시예들에서 수득한 결과를 도 7 및 8 에 나타내었다. 도 7 은 본 실시예에서의 발효 시험 시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다. 도 8 은 본 실시예에서의 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 당 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

본 발명의 알콜성 음료의 제조 방법에 따르면, 맥주 발효 및 완성된 제품에서 헤이즈의 양이 저하될 수 있으므로, 헤이즈의 양이 적은 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

<110> Suntory Limited <120> Gene encoding cell wall mannoprotein and use thereof <130> PCT06-0087 <150> JP2005-276423 <151> 2005-09-22 <150> JP2005-375016 <151> 2005-12-27 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 atgcaattct ctactgtcgt ttccgtcgct ttcgtcgcct tggccaactt tgttgccgct 60 gaatctgctg ccgccatctc tcaaattact gatggtcaaa tccaagctac cactgctacc 120 accactgctc catccaccac tgccgctcca tccaccactg ctgctccatc ttcttcccac 180 gttgaaaccg tttctgcttc cagcactgaa accatttctc aacaaactga aaatggtgct 240 gctaaggccg ctgtcggtat gggtgccggt gctctagctg ccgctgctat gttgttgtaa 300 300 <210> 2 <211> 99 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 2 Met Gln Phe Ser Thr Val Val Ser Val Ala Phe Val Ala Leu Ala Asn 1 5 10 15 Phe Val Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly 20 25 30 Gln Ile Gln Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Thr Thr Ala 35 40 45 Ala Pro Ser Thr Thr Ala Ala Pro Ser Ser Ser His Val Glu Thr Val 50 55 60 Ser Ala Ser Ser Thr Glu Thr Ile Ser Gln Gln Thr Glu Asn Gly Ala 65 70 75 80 Ala Lys Ala Ala Val Gly Met Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Met Leu Leu <210> 3 <211> 279 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 3 atgcaattct ctactgtcgc ttccgttgct ttcgtcgctt tggctaactt tgttgccgct 60 gaatccgctg ccgccatttc tcaaatcact gacggtcaaa tccaagctac taccactgct 120 accaccgaag ctaccaccac tgctgcccca tcttccaccg ttgaaactgt ttctccatcc 180 agcaccgaaa ctatctctca acaaactgaa aatggtgctg ctaaggccgc tgtcggtatg 240 ggtgccggtg ctctagctgc tgctgctatg ttgttataa 279 <210> 4 <211> 92 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 4 Met Gln Phe Ser Thr Val Ala Ser Val Ala Phe Val Ala Leu Ala Asn 1 5 10 15 Phe Val Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly 20 25 30 Gln Ile Gln Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Glu Ala Thr Thr Thr Ala 35 40 45 Ala Pro Ser Ser Thr Val Glu Thr Val Ser Pro Ser Ser Thr Glu Thr 50 55 60 Ile Ser Gln Gln Thr Glu Asn Gly Ala Ala Lys Ala Ala Val Gly Met 65 70 75 80 Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala Met Leu Leu 85 90 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gagctcatag cggccatgca attctctact gtcgtttccg 40 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggatcctatg cggccgcagg taaaaaggaa tcaaacactt ac 42 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gagctcatgc aattctctac tgtcgcttcc gttgct 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggatcccatt cgaagagaaa tcacaggaac atcgtt 36

비(非)ScCWP2 고도 발현 균주

하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질로서 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 가진 단백질로서 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질이 세포벽 만노단백질로서 기능하는 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이고 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 1 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 2 로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터:

(j) 서열번호: 4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질이 세포벽 만노단백질로서 기능하는 폴리뉴클레오티드;

(k) 서열번호: 4 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이고 및 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(l) 고도로 엄격한 조건 하에서 서열번호: 3 에 혼성화하거나 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고, 세포벽 만노단백질로서 기능하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 7 항 또는 제 8 항의 벡터를 포함한 효모.
제 9 항에 있어서, 제 7 항 또는 제 8 항의 벡터를 도입함에 의해 헤이즈-생성 능력이 감소된 효모.
제 10 항에 있어서, 제 6 항의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 헤이즈-생성 능력이 감소된 효모.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 효모를 배양하는 것을 포함하는, 알콜성 음료의 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 알콜성 음료의 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 알콜성 음료의 제조 방법.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 알콜성 음료.
서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 헤이즈-생성 능력 평가 방법.
하기를 포함하는 시험 효모의 헤이즈-생성 능력 평가 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함.
하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 제 6 항에 따른 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 가진 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 헤이즈-생성 능력에 따른 상기 단백질 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.
제 18 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포벽 만노단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 참조 효모에 비해 상기 유전자가 더 많이 발현된 시험 효모를 선별함.
제 18 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 제 6 항에 따른 단백질을 정량함; 및 참조 효모에 비해 상기 단백질을 더 많은 양으로 가진 시험 효모를 선별함.
하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 효모 또는 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 선별된 효모를 이용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 헤이즈의 생성량을 조절함.